CN101092450A - 与人mhc－ⅰ类分子结合的肝素酶多肽表位 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与人细胞膜表面主要组织相容性复合物I类分子结合的肝素酶多肽表位，以及编码这些多肽表位的DNA序列，这些多肽表位通过与人MHC－I类分子结合，从而产生肝素酶特异性细胞毒性T淋巴细胞，杀死肝素酶阳性的肿瘤细胞，因此可作为多肽药物疫苗来治疗进展期肿瘤。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，包括筛选获得与人主要组织相容性复合物I(MHC-I)类分子结合的肝素酶多肽分子，以及编码这些多肽的DNA、RNA，由于这些多肽与人MHC-I类分子的结合位点进行结合，可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)，从而有效杀伤肝素酶阳性的肿瘤组织，达到治疗进展期肿瘤的目的。
背景技术
目前的研究表明，CD8+T细胞所识别的靶抗原需先经抗原提呈细胞处理，之后以“抗原肽-MHCI类分子”复合物的形式呈现在抗原提呈细胞或靶细胞表面，相应的与MHC-I类分子结合的抗原肽即为CTL表位。
1999年，澳大利亚的Parish和以色列的Voldavsky同时首次克隆并鉴定出与肿瘤转移密切相关的肝素酶基因，其表达产物属内β-D-葡萄糖苷酶，能特异性识别、切断硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)的硫酸肝素(HS)侧链。HSPG是细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)的主要成分之一，在组织构成、血管形成和细胞粘附等诸多方面发挥重要的生理作用。高度水化的HS侧链及所带的负电荷形成结构致密的选择性分子筛，是阻止肿瘤细胞侵袭扩散的首要屏障之一，同时，伸展的HS侧链还储备着大量生长因子、趋化因子和酶类等生物大分子。肝素酶促肿瘤转移的机制一方面在于它能降解HSPG，破坏ECM和BM的完整性，另一方面又间接地释放和活化HS结合的多种生长因子，如bFGF、EGF等，促进肿瘤血管形成，为发生转移的肿瘤细胞在局部定植提供营养。体外实验发现，不同转移潜能的乳腺癌细胞株其肝素酶基因表达是不同的，低转移细胞株中测不到肝素酶mRNA表达和蛋白活性，而高转移株中则明显表达。将肝素酶全长cDNA转染至低转移潜能的鼠淋巴瘤和黑色素瘤细胞株后，肿瘤细胞转移能力明显增强，而肝素酶的抑制剂如PI88、硫酸昆布多糖或反义分子则能明显降低肿瘤细胞的转移能力。将肝素酶cDNA转染至低转移潜能的鼠淋巴瘤和黑色素瘤细胞株后，其肿瘤细胞转移能力明显增强，而肝素酶的抑制剂如PI88、硫酸昆布多糖或反义分子则能明显降低其转移能力。综上所述，肝素酶作为肿瘤相关抗原，与肿瘤的转移密切相关，因此临床上可对肝素酶表达阳性且人类白细胞抗原(HLA)配型的进展期肿瘤有一定的杀伤效果。而将肝素酶作为肿瘤相关抗原，采用生物信息学手段，研究其CTL表位，并将其作为肿瘤免疫治疗的一个新靶点，到目前为止，未见有文献报道。
随着对免疫应答分子机制研究的深入，人们已逐渐认识到机体的免疫细胞并不是对应于各种各样的病原体或天然抗原的整体分子，而是针对各种各样抗原分子的抗原表位。蛋白质抗原是通过其表位来体现其免疫特异性。
发明内容
本发明的目的是提供能与人MHC-I类分子的结合位点进行结合、可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞的多肽表位。
本发明的另一目的是提供所述多肽表位在制备用于临床治疗和检测肿瘤性疾病疫苗中的用途。
本发明根据抗原肽与MHC-I分子相互作用的机理，从肝素酶的全长基因序列中筛选出侯选多肽表位，最终得到能有效与MHC-I类分子结合并能激活特异性T淋巴细胞的多肽表位，该多肽表位长度仅9个氨基酸序列，体外容易合成，方便临床应用。
既往的研究表明，肝素酶mRNA的表达水平与胃癌的生长、浸润及转移密切相关。在此研究的基础上，将肝素酶全长基因序列构建到pDC315腺病毒载体中，并在293细胞内同源重组及扩增后，感染树突状细胞，将负载了肝素酶全长基因的DC细胞作用于T细胞，可以激发特异性的CTL反应。因此，在肝素酶的全长基因序列中，一定存在可以激活T细胞的特异的CTL表位。
根据上述研究，为实现本发明第一目的而采用的技术方案是这样的，即能与人MHC-I类分子的结合位点进行结合、可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞的多肽表位，筛选自序列号为：SEQ NO：1的人肝素酶，为与SEQ NO：1的人肝素酶具有同源性的下列氨基酸序列，包括：
SEQ No.68，Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe Phe Val；
SEQ No.46，Pro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala；
SEQ No.37，Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala；
SEQ No.53，Pro Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu；
SEQ No.54，Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu。
本发明涉及的多肽表位，还可以为选自SEQ No.68、SEQ No.46、SEQ No.37，、SEQ No.53、SEQ No.54中的游离型多肽、融合型多肽和嵌合型多肽；以及以所述5条多肽之一为单体的各种形式的聚合体。
本发明所涉及的多肽表位与功能或性质已知的蛋白质融合或嵌合，即这些蛋白质分子或嵌合分子包含了本发明涉及的多肽氨基酸序列，具有这些多肽的相同或相似活性。
与本发明有关的多肽序列，可通过任何已有的体外多肽合成设备和不同技术原理人工合成。其获得方法主要有以下步骤，包括多肽的合成，纯化以及最后产品的收集，这些技术已经成熟并程式化，在相关领域被广泛应用。
本发明的积极效果：本发明使用计算机模拟技术与实验相结合的方法，进一步提高了预测多肽表位的准确性，不单纯考虑分子结合位点对多肽表位的预测影响，同时从空间构象上，预测了多肽表位。而且本发明的多肽物质，仅为9肽的短肽，体外容易合成，经静脉给药后容易被机体吸收，因此具有非常大的商业产业化价值。
附图说明
图1为SEQ No.68多肽表位的空间结构模拟图；
图2为SEQ No.68多肽表位和MHC分子结合的空间结构模拟图；
图3为SEQ No.46多肽表位的空间结构模拟图；
图4为SEQ No.46多肽表位和MHC分子结合的空间结构模拟图；
图5为SEQ No.37多肽表位的空间结构模拟图；
图6为SEQ No.37多肽表位和MHC分子结合的空间结构模拟图；
图7为SEQ No.53多肽表位的空间结构模拟图；
图8为SEQ No.53多肽表位和MHC分子结合的空间结构模拟图；
图9为SEQ No.54多肽表位的空间结构模拟图；
图10为SEQ No.54多肽表位和MHC分子结合的空间结构模拟图；
图11为SEQ No.68多肽表位的质谱分析图；
图12为SEQ No.46多肽表位的质谱分析图；
图13为SEQ No.37多肽表位的质谱分析图；
图14为SEQ No.53多肽表位的质谱分析图；
图15为SEQ No.54多肽表位的质谱分析图；
图16为5个筛选出的多肽对效应细胞杀伤效果线图。
具体实施方式
实施例1多肽表位的筛选方法
本发明所获得的多肽序列是通过超基序法与量化基序法结合的方法，从肽库中直接调取，保持了与MHC-I类分子结合特性。通过对这些多肽序列进行概率统计分析，获得多肽与MHC-I类分子的结合模型。
1、人肝素酶氨基酸序列的获得
自国际开放共享基因库NCBI GeneBank中查找出天然人肝素酶的全长氨基酸序列(共543个氨基酸)表示为：SEQ No.1：Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro ProLeu Met Leu Leu Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro Gly Ala Leu Pro Arg ProAla Gin Ala Gin Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gin Glu Pro Leu His Leu ValSer Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe LeuIle Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu Arg Thr Leu Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr LeuArg Phe Gly Gly Thr Lys Thr Asp Phe Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr PheGlu Glu Arg Ser Tyr Trp Gin Ser Gin Val Asn Gin Asp Ile Cys Lys Tyr Gly Ser IlePro Pro Asp Trp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Pro Tyr Gin Glu Gin Leu Leu LeuArg Glu His Tyr Gin Lys Lys Phe Lys Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp ValLeu Tyr Thr Phe Ala Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu LeuArg Thr Ala Asp Leu Gin Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gin Leu Leu Leu Asp Tyr Cys SerSer Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro Asn Ser Phe Leu Lys LysAla Asp Ile Phe Ile Asn Gly Ser Gin Leu Gly Glu Asp Phe Ile Gin Leu His Lys LeuLeu Arg Lys Ser Thr Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gin Pro ArgArg Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile Asp SerVal Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu AsnPro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile Ser Ser Val Gin Lys Val Phe Gin Val Val Glu SerThr Arg Pro Gly Lys Lys Val Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly AlaPro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu SerAla Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gin Val Phe Phe Gly Ala Gly Asn Tyr HisLeu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys LysLeu Val Gly Thr Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gin Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu ArgVal Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys Glu Gly Asp Leu Thr LeuTyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser AsnLys Gin Val Asp Lys Tyr Leu Leu Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys SerVal Gin Leu Asn Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gin Thr Leu Pro Pro Leu MetGlu Lys Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe PheVal Ile Arg Asn Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile
2、多肽表位预测的超基序的获得
超基序法是基于在同一人白细胞抗原(HLA)家族，甚至不同家族的HLA同种异性分子接纳的抗原肽具有相同或相似的锚点残基构成的肽基序，超基序主要作用的锚点残基是位于肽链2位(P2)氨基酸残基及羧基末端9位(P9)氨基酸残基。当P2、P9的残基为A、I、L、M、V、T时，且第二位为芳香族氨基酸，第九位为疏水性氨基酸，与HLA-A2分子有较高的亲和力。这些氨基酸的特定序列是多肽分子与MHC分子结合的活性位点或关键性氨基酸，决定了与MHC-I类分子结合多肽的活性特征。超基序预测CTL表位虽然克服了以往采用简单基序法易产生的假阴性结果，但由于此预测法与基序法具有相同的弱点，即在预测中仅仅考虑了二、九位残基的影响而忽略了其它位点的残基结合情况，易出现假阳性结果，故应联合量化基序法提高CTL表位预测的准确性。
应用
www.bimas.com提供分析软件对上述人肝素酶氨基酸序列进行分析，得到以下69个超基序SEQ No.2-SEQ No.70：Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu(1～9)，ProAla Leu Pro Pro Pro Leu Met Leu(7～15)，Ala Leu Pro Pro Pro Leu Met Leu Leu(8～16)，Leu Met Leu Leu Leu Leu Gly Pro Leu(13～21)，Leu Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu(16～24)，Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro Gly Ala(20～28)，Gly Ala Leu Pro Arg Pro Ala GinAla(27～35)，Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr(37～45)，Phe Thr Gin Glu Pro LeuHis Leu Val(44～52)，Leu Val Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val(51～59)，Ser Val Thr Ile AspAla Asn Leu Ala(58～66)，Val Thr Ile Asp Ala Asn Leu Ala Thr(59～67)，Asn Leu AlaThr Asp Pro Arg Phe Leu(64～72)，Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe Leu Ile(65～73)，Ala ThrAsp Pro Arg Phe Leu Ile Leu(66～74)，Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu(72～80)，LeuLeu Gly Ser Pro Lys Leu Arg Thr(74～82)，Lys Leu Arg Thr Leu Ala Arg Gly Leu(79～87)，Thr Leu Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr Leu(82～90)，Pro Ala Tyr Leu Arg Phe GlyGly Thr(89～97)，Tyr Leu Arg Phe Gly Gly Thr Lys Thr(91～99)，Ser Val Asp Val LeuTyr Thr Phe Ala(169～177)，Tyr Thr Phe Ala Asn Cys Ser Gly Leu(174～182)，Phe AlaAsn Cys Ser Gly Leu Asp Leu(176～184)，Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu(183～191)，Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu(184～192)，Gly Leu Asn Ala Leu Leu Arg ThrAla(187～195)，Asn Ala Leu Leu Arg Thr Ala Asp Leu(189～197)，Asp Leu Gin Trp AsnSer Ser Asn Ala(196～204)，Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe Ile(229～237)，Asp Ile PheIle Asn Gly Ser Gin Leu(234～242)，Gin Leu Gly Glu Asp Phe Ile Gin Leu(241～249)，Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val(260～268)，Asp Val Gly Gin Pro Arg Arg Lys Thr(267～275)，Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu(275～283)，Lys Met Leu Lys Ser PheLeu Lys Ala(277～285)，Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile(282～290)，Ser Val ThrTrp His His Tyr Tyr Leu(292～300)，Arg Thr Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu(303～311)，Phe Leu Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile(310～318)，Val Leu Asp Ile Phe Ile Ser Ser Val(315～323)，Ser Val Gin Lys Val Phe Gin Val Val(322～330)，Lys Val Phe Gin Val ValGlu Ser Thr(325～333)，Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala Pro Leu(346～354)，Pro Leu Leu SerAsp Thr Phe Ala Ala(353～361)，Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu(363～371)，TrpLeu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala(365～373)，Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val(372～380)，Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gin Val(376～384)，Val Met Arg Gin Val Phe Phe GlyAla(380～388)，Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro Leu(393～401，Pro Leu Pro Asp TyrTrp Leu Ser Leu(400～408)，Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu(405～413)，Leu LeuPhe Lys Lys Leu Val Gly Thr(408～416)，Lys Leu Val Gly Thr Lys Val Gly Thr(412～420)，Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg Val Tyr(413～421)，Gly Thr Lys Val Gly Thr Lys ValLeu(415～423)，Lys Leu Arg Val Tyr Leu His Cys Thr(430～438)，Phe Val Ile Arg AsnAla Lys Val Ala(432～440)，Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu(449～457)，Tyr Ala IleAsn Leu His Asn Val Thr(453～461)，Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu(456～464)，Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gin Leu(487～495)，Ser Val Gin Leu Asn Gly Leu Thr Leu(492～500)，Gin Leu Asn Gly Leu Thr Leu Lys Met(494～502)，Thr Leu Lys Met Val AspAsp Gin Thr(499～507)，Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe Phe Val(525～533)，Phe Val Ile ArgAsn Ala Lys Val Ala(532～540)，Val Ile Arg Asn Ala Lys Val Ala Ala(533～541)。
3.CTL表位预测的量化基序方案
量化基序法是基于IBS假设，即在抗原肽与HLA-A2分子的结合中，抗原肽的侧链效应(锚定、抑制或中性)主要依赖与相应的氨基酸残基在肽中所处的位置受相邻的氨基酸残基影响较小。这在一定的范围内可以假设在一个多肽序列中，每个氨基酸残基相互独立且影响整个肽与MHCI类分子的结合，而该抗原肽的结合能就是每个位置氨基酸残基结合能的综合。基于这种假设，1993年Parker等用肽结合实验分析154个九肽与HLA-A2分子的亲和力，并得到一个包含180个系数的结合矩阵，其中每一个系数反应了相应氨基酸残基在该位置时的相应结合能。结合能越大，多肽表位与HLA-A2分子结合越紧密。对于某测定多肽各位置相应氨基酸残基结合系数相乘再乘标准系数0.151，即为该肽与HLA-A2的结合力，当结合系数大于或等于5时，可以确定为与HLA-A2分子结合稳定，反之认定为结合不稳定。
用于分析与HLA-A2分子结合力的矩阵为：
FLA-A*0201分子限制性九肽结合系数
| Amindacid | Residue position witlriu the peptide | ||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | |
| ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY | 1.0000.5970.0410.5781.0000.5780.0441.0003.4651.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000 | 1.0000.5000.5002.8400.5000.5000.50010.15120.524103.18357.9200.5420.50010.0060.5000.5006.0805.9190.5000.500 | 1.0001.0000.7260.05411.3830.0881.0001.8490.0243.6851.0001.0001.2611.0000.0331.0001.0002.17312.9787.613 | 1.0001.0001.0001.0000.0271.0001.0000.0781.0000.6461.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000 | 1.0001.0001.000.7566.0040.8041.0001.0002.0851.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0002.6808.002 | 1.0001.0001.0003.2464.3691.0601.0001.0000.2391.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0002.5880.2513.470 | 1.0001.0001.0000.8206.3830.1051.0001.0000.6031.0001.0001.0001.0001.0000.2771.0001.0001.1205.9511.000 | 1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.2931.0001.000 | 1.0000.0100.0100.0150.0090.0090.0100.5340.0152.3751.5010.0090.0100.0100.0100.0090.0094.8840.0100.009 |
采用上述的结合矩阵分析法，对超基序法预测出的CIL表位进一步采用量化基序法进行验证，以寻求结合最好的表位。在量化基序结果中，高于50分的基序共有5个，即包括以下多肽表位：
SEQ No。68：Pro Aa Phe Ser Tyr Ser Phe Phe Val：
该序列位于人肝素酶氨基酸序列中第525位与第533位之间，与HLA-A2分于的结合矩阵分析法评分为428.78分。
SEQ No.46：Pro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala；
该序列位于人肝素酶氨基酸序列中第353位与第361位之间，与HLA-A2分子的结合矩阵分析法评分为359.37分。
SEQ No.37：Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala；
该序列位于人肝素酶氨基酸序列中第277位与第285位之间，与HLA-A2分子的结合矩阵分析法评分为140.81分。
SEQ No.53：Pro Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu；
该序列位于人肝素酶氨基酸序列中第400位与第408位之间，与HLA-A2分子的结合矩阵分析法评分为91.21分。
SEQ No.54：Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu；
该序列位于人肝素酶氨基酸序列中第405位与第413位之间，与HLA-A2分子的结合矩阵分析法评分为61.29分。
实施例2多肽表位与人MHC-I结合的三维结构分析和分子动力学模拟分析
对上述所得多肽表位用Silicon graphics工作站及Insight11软件建立预测多肽表位与HLA-A2.1结合的三维结构并进行分子动力学模拟，包括以下方法：①分子模型构建，运用Insight II软件包中的Discover 3模块(采用CVFF力场)，对来自HPA的几个九肽与HLA-A2.1的复合物进行分子动力学模拟。HLA-A2.1的初始坐标来自于蛋白质晶体结构数据库中HLA-A0201与流感病毒蛋白M1(58～66)复合物(Protein Data Bank entry1HHI)，各九肽分子运用Bioploymer模块对1HHI中的多肽表位进行氨基酸替换而得。模拟过程如下：首先将HLA与β2m固定，运用最陡下降法对九肽进行2000步优化计算，然后用共扼梯度法优化，直到能量RMS小于0.1kcal/mol·A；第二步，在复合物周围加一层7.5A的水分子，固定HLA复合物对水分子进行2000步能量优化，消除水分子之间以及水分子与蛋白质之间的不合理接触；第三步，对溶液状态下的复合物进行能量最小化计算，非键相互作用采用9.5A的截断值，先后运用最陡下降法和共扼梯度法优化，直到能量RMS小于0.1kcal/mol·A；第四步，在恒定温度下进行20PS的分子动力学计算；最后，对动力学优化得到的构象进行5000步分子力学优化，得到HLA-A2.1与九肽复合物的最终构象。通过分子动力学模拟，以已知的HLA-A2.1限制性CTL表位九肽为基础，分析出MHC-肽复合物的可能结构，构建并分析HLA-A2限制性CTL表位多肽的三维模型，可发现大部分HLA-A2限制性CTL表位多肽的两个锚定残基间的距离为15～19A。第一位氨基酸残基侧链指向溶液，第二位氨基酸残基定位于HLA-A2分子肽结合槽的凹槽B附近，羧基末端氨基酸残基侧链指向HLA-A2分子肽结合槽的凹槽F，符合这些条件的多肽与HLA-A2.1分子间有较好的亲和力。②结合特征参数计算，借助Homology模块，计算HPA的几个多肽表位中各残基的溶剂可及表面积、锚点间距、非键作用能及氢键数等结合特征参数。在对各残基溶剂可及表面积的计算中，我们选择水分子作为探针分子，溶剂半径选为0.14nm。分子的溶剂可及表面积是指蛋白质分子暴露到溶剂中的面积，将其定义为溶剂球(又称探针分子)中心在蛋白质分子表面滚过的面积。上述5条多肽的空间构象图可参见图1、3、5、7、9。而上述5条多肽与人MHC-I类分子结合的模拟图可参见图2、4、6、8、10。从以上各图可以看出，SEQ No.37的多肽表位其侧链指向MHC-I类分子，其余4肽的侧链均指向溶液。
分子动力学结合特征参数计算结果如下所示：
| peptide | Position | Distance/A | H-bondnumber | nonbond | SAS of anchor Residue/A | |
| P2 | P9 | |||||
| SEQ No. 68 | 525-533 | 17.62 | 4 | -17158.9 | 3.6 | 4.9 |
| SEQ No.46 | 353-361 | 18.23 | 3 | -16144.5 | 15.6 | 18.7 |
| SEQ No.37 | 277-285 | 17.81 | 6 | -19237.5 | 5.4 | 6.98 |
| SEQ No.53 | 400-408 | 19.58 | 4 | -16276.2 | 2.9 | 8.7 |
| SEQ No.54 | 405-413 | 18.94 | 5 | -18324.7 | 3.7 | 4.6 |
MHC-肽复合物模型中多肽各残基的溶剂可及表面积(SAS of anchor Residue/A)直观反映了肽与MHC分子的嵌合情况，各残基尤其是锚点的溶剂可及表面积越小，说明两者嵌合越紧密。抗原肽与MHC分二于之间主要通过疏水作用、氢键(H-bondnumber)、盐键等弱相互作用进行分子间的识别。这些非键作用越强，相应分子间的非键作用能就越低，结合则越紧密。从以上表格可以看出，上述5条多肽的锚点残基距离均在15-19之间，5条多肽均能与MHC-I类分子很好的结合，尤其是SEQNo.68、SBQ No.37、SEQ No.54的多肽表位，与MHC-I类分子的结合尤其紧密。实施例3
本发明多肽表位的获得
(1)多肽的合成
多肽的合成在美国PE公司生产的ABI431A型多肽合成仪上进行，简述如下：采用标准Fmoc方案，精氨酸两次偶联，按照多肽序列使肽链从羧基端向氨基端延伸。多肽合成后，选用相应的切割酶进行切割，同时去除多种保护基团得到的多肽粗产品，在-20℃条件下储存、备用。
(2)多肽表位的纯化和分子量分析
将上述实施例获得的多肽表位通过RP-HPLC纯化和分析：即将各肽用DMSO溶解，浓度为20mg/mL，经0.22μm纤维膜过滤后，在美国Waters公司产品Delta 600型HPLC上纯化和进行纯度分析。流动相选用含0.1％TFA的乙氰溶液。各肽的纯化选用C18制备柱(美国Waters公司，7.0μm，100A，7.8mm×150mm)，各肽的纯度分析选用C18分析柱(美国Waters公司，5μm，100A，3.9mm×150mm)。各纯化后多肽的相对分子质量测定在API 2000型(美国Waters公司)质谱仪上安常规方法进行。其质谱分析图参见图11至图15，可以看出5条多肽的理论值均与实测值相近，在允许误差范围之内，且纯度均在95％以上，说明合成效果好，可用于下步实验。
(3)多肽产品的收集
纯化上述多肽表位通过将收集液在常温下减压干燥至1～2mL后用至少50mL预冷后乙醚沉淀，G6玻砂漏斗过滤收集沉淀，再次完全真空干燥，所得的便是多肽表位纯品，-70℃保存、备用。
实施例3本发明多肽表位与人MHC-I亲和力检测
1、抗人MHC-I单克隆抗体的获得
T2细胞培养于含10％胎牛血清的IMDM培养液中，培养条件为37℃、5.0％CO2、饱和湿度，每隔2～3天传代一次。分泌鼠抗人HLA-A2.1单抗的BB7.2杂交瘤细胞株培养于含10％FCS的DMEM培养液中，培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度，每隔2～3天传代一次，1000rPmin离心并收集其培养上清液作为抗HLA-A2.1的单克降抗体。
2、多肽表位与人MHC-I分子结合力的检测
本实施例为利用T2细胞系的特点，检测多肽表位的亲合力的实验。T2细胞表而积空载的HLA-A2分子表达极不稳定，呈递后很快降解。抗原肽与之结合后稳定了HLA-A2的表达，抗原肽与HLA-A2的结合力越强，则T2细胞表面HLA-A2分子的表达量就越高。因T2细胞的内源性抗原呈递途径中必需的抗原多肽转运蛋白(TAP)缺陷，所以T2表面HLA-A2分子表达量的增加直观地反映了外来抗原肽与HLA-A2的结合力，能够进一步证明本发明的多肽的有效性。利用BB7.2杂交瘤细胞系产生的抗HLA-A2的单克隆抗体，间接荧光免疫法检测HLA-A2的表达量，结果以平均荧光强度为检测指标，以荧光系数(FI)为衡量指标。
实施例中，采用流式细胞仪检测T2细胞表面的HLA-A2.1分子：T2细胞经PBS洗涤2次后，在96孔培养板上按1×106/孔的密度种植，各九肽用50％乙醇稀释后以10μg/mL的浓度加入到T2细胞的培养液中，并设置空白对照孔。T2细胞在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养18～24h后收集用作流式细胞仪检测。孵育好的T2细胞用1000rpm离心10min后，沉淀细胞用冰PBS洗涤3次，同样条件离心后在细胞沉淀中加入100μL BB7.2来源的鼠抗人HLA-A2.1单抗，4℃孵育1h，用同样的方法PBS洗涤3次后加入100μL稀释度为1∶50的FITC-羊抗鼠IgG，4℃孵育30min后洗涤3次，用1mL冰PBS稀释，在流式细胞仪上检测平均荧光强度，波长488nm，以单纯的T2细胞加二抗为阴性对照，T2细胞加一抗和二抗为背景对照。
结果以FI作为衡量指标，计算公式为：荧光系数(FI)＝(样本平均荧光强度-背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度，判断标准：FI＞1.5为多肽与HLA-A2.1分子结合力高，1.0＜FI＜1.5为中等结合力，FI＞0.5为低结合力。
亲和力实验结果如下所示：
| epitope | Position | MFI | FI |
| SEQ No.68 | 525-533 | 70.10 | 1.02 |
| SEQ No.46 | 353-361 | 55.94 | 0.61 |
| SEQ No.37 | 277-285 | 97.53 | 1.8 |
| SEQ No.53 | 400-408 | 51.69 | 0.49 |
| SEQ No.54 | 405-413 | 75.52 | 1.18 |
| No peptide | - | 34.65 | - |
实验结果表明：SEQ No.37的多肽表位与MHC-I类分子的亲和力最高，其次为SEQNo.68与SEQ No.53的多肽表位，SEQ No.46和SEQ No.53的多肽表位与MHC-I类分子的结合力较差。实施5多肽表位对胃癌细胞KATOIII的杀伤效果
采用标准的51Cr释放法进行。
1、效应细胞的制备：在人的DC细胞培养基中加入10ug/ml的人HPA抗原肽，调节所培养的DC细胞数为1×109/L，培养于含100mL/L FCS的RPMI1640培养基中。于培养第2天加入10mg/L的各候选肽，第3天加入3×104U/L的重组人IL-2。以后每周细胞全量换液1次，保持各候选肽和重组人IL-2的浓度，刺激3次后，于最后1次刺激的3d内收集细胞作为效应细胞。
2、靶细胞的制备：复苏KATOIII细胞，培养于含100ml/L FCS的RPMI 1640培养基中。
3、51Cr释放实验：采用标准的51Cr释放实验，将靶细胞浓度调整到1×106个/mL加入100U CiNa51CrO4，37℃，5％CO2孵育90min，将标记好的靶细胞以1×104个/100ul加入96孔板，各靶细胞孔中加入不同稀释度的效应细胞，每孔100ul，使相应的效/靶比分别为25∶1、50∶1和100∶1，每组设立3个复孔。对照组的效应细胞用重组人II～2刺激的DC。最大杀伤采用2N的HCL，自释放为靶细胞加培养基，于37℃、5％CO2孵育4h，以1000rpm离心10min，各取上清液10μL，用γ计数器分别测定脉冲数(CPM)。
51Cr特异释放率按如下公式计算：51Cr特异释放率=(实验组的CPM 平均值一自释放的CPM平均值)/(最大释放的CPM平均值一自释放的CPM平均值)×100％。
5条多肽对效应细胞的杀伤作用如下：
| 杀伤比率 | SEQ No.68 | SEQ No.46 | SEQ No.37 | SEQ No.53 | SEQ No.54 | 阴性肽 |
| 25∶150∶1100∶1 | 0.320.4l0.57 | 0.240.290.31 | 0.430.470.48 | 0.120.200.33 | 0.520.530.55 | 0.0080.170.28 |
Claims (4)
1、能与人MHC-I类分子的结合位点进行结合、可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞的多肽表位，为筛选自序列号为：SEQNO：1的人肝素酶，且与SEQ NO：1的人肝素酶具有同源性的下列氨基酸序列，包括：
SEQ No.68，Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe Phe Val；
SEQ No.46，Pro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala；
SEQ No.37，Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala；
SEQ No.53，Pro Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu；
SEQ No.54，Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu。
2、如权利要求1所述的多肽表位，其特征是：为选自SEQ No.68、SEQ No.46，、SEQ No.37、SEQ No.53、SEQNo.54中的游离型多肽、融合型多肽和嵌合型多肽；以及以所述5条多肽之一为单体的各种形式的聚合体。
3、权利要求1中的多肽表位，其特征是：所述的多肽表位通过原核细胞或真核细胞表达纯化获得，或人工合成。
4、权利要求1、2所述的多肽表位在制备用于临床治疗肿瘤性疾病疫苗中的用途。
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|---|---|---|---|---|
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| CN105504015A (zh) * | 2016-02-02 | 2016-04-20 | 中国医科大学 | 一种mhc-i类限制性抗肿瘤ctl表位肽 |
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- 2007-01-10 CN CN 200710078115 patent/CN101092450A/zh active Pending
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