CN101084237B - 用于治疗、诊断和色谱层析的泛蛋白或γ晶体缀合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在一种或多种基于γ-晶体蛋白或泛蛋白的多肽分子和一种或多种功能成分之间含有共价连接键的缀合物。此外,本发明涉及制备这样的缀合物的方法以及所述缀合物在诊断、治疗和层析中的应用。
Description
本发明涉及在一种或多种基于γ-晶体蛋白或泛蛋白的多肽分子和一种或多种功能成分之间含有共价连接键的缀合物。并且,本发明涉及制备这种类型的缀合物的方法,以及应用所述缀合物进行诊断、治疗和色谱层析的方法。
γ-II-晶体蛋白属于β-γ-晶体蛋白家族,并且是在脊椎动物中广泛分布的眼睛晶状体的结构蛋白(Jaenicke和Slingsby,2001)。β-γ-晶体蛋白形成高度同源性的蛋白家族,其特征在于两个结构相同的结构域,并且主要由β折叠结构组成(Wistow和Piatigorsky,1988)。β-γ-晶体蛋白的重叠结构基序是所谓的希腊钥匙拓扑结构。它由4个反平行β折叠链组成,其中两个——一个位于另一个之上——形成晶体蛋白的结构域(Blundell等.,1981)。
晶体蛋白的天然功能是基于在眼睛的晶状体中产生高折射率,这通过达到860mg/ml的极高的局部蛋白浓度而获得(Kumaraswamy等.,1996)。由于它们的立体结构,晶体蛋白是具有高蛋白酶抗性的非常稳定的和易于溶解的蛋白质。此外,在眼睛晶状体内部的位置具有使γ-晶体蛋白不受蛋白周转的作用。因此,β-γ-晶体蛋白具有一种关于蛋白的已知的最高的半衰期(Jaenicke,1996)。
这一蛋白家族最有代表性的成员是牛γ-晶体蛋白。对于野生型蛋白以及对于整个范围的点突变,可以确定不同分辨率的立体结构(Najmudin等.,1993;Kumaraswamy等.,1996;Norledge等.,1996)。这表明,所述蛋白通过在两个结构域之间的疏水裂口而稳定。这一裂口由N端结构域的3个残基和C端结构域的3个拓扑相同的残基组成的6个疏水残基的分子内相互作用而形成(Wistow等.,1983)。针对化学试剂的die稳定性在很大程度上不依赖于连接这两个结构域的短肽(Mayr等.,1994)。
牛γ-晶体蛋白具有20kDa左右的大小,并且特征在于格外高的稳定性。它在中性pH下抗8M尿素。在1-9的pH范围中它以其天然状态存在(Rudolph等.,1990;Sharma等.,1990),并且甚至在达到75℃的温度时,所述蛋白在7M尿素中是稳定的(Jaenicke,1994)。γ-晶体蛋白在大肠杆菌(E.coli)中的重组细胞质表达是成功的,具有很高的产量(Mayr等.,1994)。
Die蛋白-化学特性——高稳定性,低分子量,高细胞质表达率——使得γ-晶体蛋白的蛋白种类成为产生备选结合分子的有吸引力的候选。
基于作为构架蛋白的牛γ-II-晶体蛋白,Fiedler和Rudolph建立了噬菌粒文库(GCUC1),其中将在位置2,4,6,15,17,19,36和38(没有起始甲硫氨酸)的8个外露表面氨基酸在DNA水平上随机化。通过噬菌体展示的方式经过几轮选择后,可以检测具有特异性结合雌二醇和μM范围的亲和力的变化。这些结果表明,可以在牛γ-II-晶体蛋白上从头产生先前不存在的结合特性,并且γ-晶体蛋白一般适于作为分离备选结合分子的构架蛋白(scaffold)(参见专利DE19932688A1)。
在随后的工作中,基于人γ-II-晶体蛋白,建立的新的文库。人γ-II-晶体蛋白作为构架的选择以及伴随的新文库的构建具有重要的优点:1.与牛蛋白相比,人γ-II-晶体蛋白对于变性影响具有显著更高的稳定性。2.所述蛋白的人源性应该导致各自的变化在治疗应用中的很低的免疫原性,和3.最近构建的具有更高复杂性的文库应该可以分离具有更高亲和力的结合分子(Ling2003)。与GCUC1文库相似,选择相同的8个氨基酸位置(没有起始甲硫氨酸,位置2,4,6,15,17,19,36,38)进行随机化处理。基于人γ-II-晶体蛋白按照所述方法(专利DE19932688A1)建立的新文库CR20具有5x108种独立变体的理论大小,每种变化在所述文库中出现大约130次。在对大于200个独立的变体进行测序,发现所有的变体中大于80%只在所述的8个随机化位置具有取代。此外,除第三个密码子位置外变体在取代位置的序列表现出几乎相同的所有可能的核苷酸的分布。因此,在8个随机化位置具有所有32种可能的密码子的这一文库是高质量的。
作为用于产生备选结合分子应用的第二构架蛋白由人泛蛋白制成。泛蛋白是一种小的、单体的和细胞质蛋白,其——在其序列上高度保守——存在于从原生动物(protozoa)到脊椎动物的所有已知的真核细胞中。在生物体中,它在调控细胞蛋白的可控降解中起基本作用。
泛蛋白的多肽链由76个氨基酸组成,它们折叠成极端紧密的α/β结构(Vijay-Kumar,1987):几乎87%的多肽链通过氢键参与形成二级结构元件。作为主要的二级结构,可以提及三个半α-螺旋转角以及由5条链组成的反平行β折叠。这些元件的特征性排列——反平行β折叠暴露于蛋白表面,在所述蛋白背面充满了垂直位于蛋白顶端的α螺旋——通常被视作所谓的泛蛋白样折叠基序。另一种结构特征是在α螺旋和β折叠之间的蛋白内部的显著的疏水区域。
由于它的小的大小,可以通过化学合成和通过生物技术方法进行泛蛋白的人工制备。由于有利的折叠特性,泛蛋白可以通过使用微生物诸如例如大肠杆菌的遗传工程以相对大的量在细胞质或者在壁膜间隙中产生。
由于简单和有效的细菌制备,泛蛋白可以用作其它要被制备的其生产有难度的外源蛋白的融合伴侣。通过于泛蛋白融合的方法,可以获得提高的溶解性和由此提高的产量(Butt等.,1989)。
基于可获得的关于晶体结构的数据(PDB数据库登录1UBI),使用计算机化的分析,这些氨基酸在泛蛋白构架中的位置可以位于暴露于表面,即,暴露于溶剂和潜在的结合伴侣的侧链上。选择的位置分别在第一氨基端β折叠链(pos.2,4,6)的起始处以及在环(pos.62,63)中和在羧基端β折叠链(pos.64,65,66)的起始处彼此在空间上靠近,与它们的氨基酸侧链在泛蛋白的表面形成连续的区域。以这种方法,通过在仍然完整的泛蛋白的蛋白结构上的分析区域进行随机的氨基酸取代而产生暴露于表面的超变区域(PCT/EP2004/005730,未出版)。
在β折叠蛋白上产生人工结合表面代表了常规抗体的一种新型有趣的备选方案。获得了这样的证据,即,在γ-晶体蛋白或泛蛋白样蛋白上人工产生的结合位点形成功能性结合分子(DE19932688A1)(PCT/EP2004/005730,未出版)。
然而,直到现在还没有这样的建议或指示,即,将这些多肽分子偶联到另一种成分上,形成一种缀合物,使得它们用于诊断、治疗和分析应用,而没有这两种成分之一或二者的功能损失。
因此,本发明潜在的目的是提供基于γ-晶体蛋白或泛蛋白的多肽和功能成分之间的缀合物,其中各自的多肽分子与野生型多肽相比,具有与改变的配体特异性结合的结合特性,其中所述缀合物的两种成分在它们彼此偶联之后保留它们的功能性或者甚至通过这样的偶联而使它们的功能性增强。
本发明的另一个目的是提供这样的缀合物可以被鉴别、制备并且检验它们的功能特性的方法。
这些目的通过独立权利要求的主题而实现。优选的实施方案可见于从属权利要求。
本发明涉及将基于γ-晶体蛋白和泛蛋白的新型结合蛋白位点特异性的和选择性的、没有针对性的偶联到各种分子上,诸如例如蛋白(生色蛋白和酶)、基质(诸如葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、琼脂糖、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯衍生物和纤维素)以及小分子(其中例如荧光标记、生物素、洋地黄毒苷、放射性同位素、抗生素)。这些所谓的AffilinTM分子特征在于在蛋白β折叠结构中从头设计结合区。因此,它们不同于天然最主要的结合蛋白种类一一抗体,其中结合区位于所述蛋白的柔性环区域(CDR’s)。AffilinTM和抗体之间的另一种差异在于分子大小。用作按照本发明的缀合物的第一成分的基础的两种多肽分别具有20(γ-晶体蛋白)和10kDa(泛蛋白)的分子量,而抗体具有150kDa(IgG)的分子量。
本发明包括从这些多肽和各自的偶联伴侣制备缀合物的方法,以及所述缀合物在不同应用中的应用,并且令人惊讶地表明,这些偶联方法既没有导致偶联伴侣生物活性的损失,也没有导致所述多肽与其配体结合特性的损失。
为了示例本发明,描述了多肽成分与在BIACORE系统中的葡聚糖基质的偶联,与荧光染料556的偶联,与生色蛋白藻红蛋白(PE)的偶联,和与辣根过氧化物酶的偶联,以及将多肽固定到支持物质上用于亲和层析。按照本发明,偶联直接针对多肽分子进行,例如针对蛋白的亲核侧链进行,或者以靶向方式针对C端肽接头进行。令人惊讶地,偶联方法可以应用到两种构架上,并且不导致对这些分子结合特性的损害。特别出乎意料地是相对小的多肽分子(分别10和20kDa)可以偶联到大蛋白上,诸如例如藻红蛋白(240kDa),同时保留它们的结合活性。
令人惊讶地,以这种方式获得的缀合物不限制AffilinTM分子的结合能力,相反地,对于某些缀合物,可以观察到宏观解离常数(亲和力作用)的增加,这赋予了应用所述多肽分子的其它可能性,例如用于治疗。此外,发现在与水不溶性基质偶联后这些多肽分子还表现出结合活性,并且在用变性剂诸如尿素、胍盐、乙醇、氢氧化钠或盐酸处理后,它们可以再生,即,它们的结合特性可以恢复。
基于γ-晶体蛋白和泛蛋白的分子的结构数据的详细分析提供了通过特异性靶向赖氨酸残基而赋予非特异性偶联选择性的可能性。结构分析表明,在γ-晶体蛋白中,赖氨酸存在于蛋白的C端,并且因此应该适于偶联(图1)。此外,在泛蛋白中,可以鉴定这样的赖氨酸残基。然而,在进行这些偶联策略之前,必须保证在所述结合区没有其它的赖氨酸。
对于本发明,与IgGFc(人源的)或proNGF特异性结合的多肽选自人γ-晶体蛋白文库(CR20),和NGF-结合多肽选自人泛蛋白文库(UB10),并且随后将它们纯化。通过引入包含半胱氨酸的确定长度的特异性C端肽接头,可以以获得选择性偶联而不损害结合活性的方式修饰多肽分子。为了有效地偶联,需要消除所有剩余的可及半胱氨酸。通过多肽分子的非特异性偶联方法,令人惊讶地,可以保留多肽的结合活性,并且通过亲和方式获得亲和力的增加,并且因此制备用于诊断和治疗的基于多肽的非常有吸引力的分子缀合物。
这样的备选结合分子用于治疗、诊断和层析。通过将多肽偶联到各种伴侣上,将为这些新型结合分子提供甚至更广的应用领域。
本发明特别包括下述方面和实施方案:
按照第一方面,本发明涉及包括下述成分的缀合物:
一种或多种基于γ-晶体蛋白或泛蛋白的多肽分子(I)与相应的野生型多肽相比,每种分子具有新产生的或改变的与配体特异性结合的结合特性,和共价地与其连接的一种或多种功能成分(II)其中在(I)与(II)偶联后,所有成分的功能性得到保留。
换句话说,按照本发明的缀合物不包括以其野生型形式的泛蛋白或γ-晶体蛋白,但是只以适合特异配体的形式。当与野生型形式相比时,这种特异性适合的形式提供针对各自配体的改变的(提高的)或重新产生的结合特性。作为基于γ-晶体蛋白或泛蛋白的多肽分子的普遍原理,应该指出,在两种蛋白中,在β折叠结构上产生的人工结合表面,以赋予与目的配体的特异性结合。因此,至少存在一个β折叠结构以提供人工结合表面是本发明的主要特征。
在这种情形中,缀合物是指多肽分子与另一种成分的翻译后共价连接,并且因此,例如在遗传水平上不同于多肽的融合。融合多肽是所谓的融合的结果。
按照本发明,基于泛蛋白的多肽分子优选地选自由下列各项组成的组:“泛蛋白样蛋白”蛋白超家族的蛋白,具有泛蛋白样折叠基序的蛋白以及其具有泛蛋白样折叠基序的片段或融合蛋白,其中由于在包括β折叠区的至少一个β折叠链和任选地非β折叠区的蛋白的至少一个表面暴露区的一个或多个氨基酸修饰,所述蛋白具有分别与预先确定的结合伴侣或配体的结合亲和性,这种结合亲和性是先前不存在的,同时保留了泛蛋白样的折叠基序。
因此,本发明包括通过取代、插入、删除、化学修饰或它们的组合而修饰的蛋白,其选自由下列各项组成的组:“泛蛋白样蛋白”蛋白超家族的蛋白,具有泛蛋白样折叠基序的蛋白以及其每种具有泛蛋白样折叠基序的片段或融合蛋白,其中所述蛋白由于这样的修饰而表现出对于预先确定的结合伴侣的结合亲和性,这种亲和性是先前不存在的,其通过下述方法获得:
a)选择要被修饰的蛋白;
b)确定结合伴侣;
c)在蛋白的至少一个表面暴露区选择氨基酸,所述蛋白包括β折叠区的至少一个β折叠链和任选地非β折叠区;
d)通过取代、插入、删除和/或化学修饰而修饰所选氨基酸,同时保留泛蛋白样折叠基序;
e)将所修饰的蛋白与在步骤b)中确定的结合伴侣相接触;
f)检测具有与步骤b)中确定的结合伴侣的结合亲和性的那些蛋白。
此外,描述了制备上文提及的基于泛蛋白的修饰蛋白和应用这些修饰蛋白的各自的方法。
因此,用于按照本发明的缀合物的基于泛蛋白的多肽分子(I)优选地通过分别修饰具有本申请中定义的泛蛋白样折叠基序的蛋白或多肽而制备。这些蛋白包括“泛蛋白样蛋白”蛋白超家族的蛋白,具有泛蛋白样折叠基序的所有蛋白以及这些蛋白的片段或融合蛋白,条件是它们也具有泛蛋白样折叠基序。分别起始于这些蛋白或多肽,分别修饰了在初始蛋白或多肽中的一个或多个氨基酸。所述修饰特别包括氨基酸的取代,而且包括一种或多种氨基酸的插入和删除,以及氨基酸的化学修饰。这些修饰在要被修饰的蛋白的至少一个表面暴露区进行。至少一个氨基酸的修饰包括β折叠区的至少一个β折叠链,其中所述β折叠链必须位于蛋白表面,以便它分别接近结合伴侣或配体,所述结合伴侣或配体能够以可以确定的亲和力与所修饰的蛋白结合。在本发明的另一个实施方案中,除了在β折叠区的β折叠链的修饰,还修饰了非β折叠区,其优选是暴露于表面的,以影响,特别是增加与预定的结合伴侣的结合亲和性,并且因此增强特异性。
本领域的技术人员可以利用目前已知的各种用于修饰一种或多种氨基酸的技术。这些技术将在下文中更详细地描述。另外,可以参考Ausuebel等.,1994以及Sambrook等.,1989的出版物。
对泛蛋白的非表面暴露核区域的氨基酸的修饰已经为人所知(Finucane等.,1999;Lazar等.,1997)。其中进行的改变针对这样的位置,即,由于它们位于疏水核心内,它们不接触溶剂或可能的结合伴侣,所以,它们不参与结合。
在本发明的情形中,术语“先前不存在的结合特性”和从头产生的人工结合位点,以及“与野生型蛋白相比与改变的配体特异性结合的结合特性”的意思,将分别在下文中得到解释。这些术语意欲意指,在修饰区域修饰的蛋白先前没有表现出针对预定的结合伴侣或针对泛蛋白的天然结合伴侣的结合特性。
也可以定义为配体的结合伴侣具有针对按照本发明的修饰蛋白的可测的亲和性。按照本发明,对于可量化的结合特性的存在,即与伴侣结合的亲和力的存在,由KD=10-5M或更小的KD形成的复合体解离常数可以视为是最小的值。10-5M以及低于10-5M的值可以视为可量化的结合亲和力。取决于应用,优选10-6M—10-12M的值,例如对于层析应用,更优选10-7—10-11M,或者例如对于诊断或治疗应用更优选10-9—10-12M。更优选的结合亲和力在10-7—10-10M范围,优选地达到10-11M。确定结合亲和力的方法目前是已知的,并且在下文中进一步描述。
按照本发明的修饰意欲意指氨基酸的取代、插入、删除或化学修饰。
作为要按照本发明进行修饰的蛋白,可以应用“泛蛋白样蛋白”超家族蛋白。按照本发明,这一超家族包括在Murzin等.(1995)中列出的亚组。例如,这些包括“泛蛋白相关的蛋白”、“UBX结构域”、“GABARAP样”、“RAS-结合结构域”等蛋白家族。优选地,应用“泛蛋白相关的蛋白”蛋白家族的蛋白。按照本发明,那些蛋白还包括具有泛蛋白样折叠基序的那些。这些蛋白的实例为SUMO-1,FAU,NEDD-8,UBL-1,和GDX以及Rub1,APG8,ISG15,URM1,HUB1,延伸蛋白B,PLIC2(N端结构域),human帕金蛋白(N端结构域)。
按照本发明可以应用的来自泛蛋白样蛋白超家族的蛋白已经得到了高度的特征性描述。只是实例的方式,参考下列互联网网址:htm://bip.weizmann.ac.il/scop/index.html。依据这一网址,泛蛋白样蛋白家族被定义为超家族,泛蛋白相关蛋白属于这一家族。这一超家族的所有成员主要特征在于反向平行方式排列并且细分成α和β片段的β折叠。折叠定义为β-Grasp,并且因此定义为泛蛋白样的。核心区定义如下:β(2)-α-β(2),其中数字表示形成β折叠的链的数目和链的总数。如果从顶部从左向右看(氨基端在底部,羧基端在顶部),关于链的位置,混合的β折叠的排列是2143。因此,泛蛋白样蛋白成员的典型特征是暴露于蛋白的一个表面的反向平行β折叠,在蛋白的背面充满了α螺旋,其垂直地位于蛋白的顶部。这种泛蛋白样折叠基序是蛋白的典型特征,其可以按照本发明应用和修饰,并且清楚地区分所述家族的成员与其它蛋白。考虑到这一定义,本发明还包括PLIC-2的泛蛋白样N端结构域和帕金蛋白的泛蛋白样结构域。
本领域的技术人员可以通过应用序列比较,所谓的序列比对,或者通过结构重叠的方式,预先判断蛋白是否是泛蛋白样蛋白的蛋白超家族的一员。自然地,最后的证据总是由结构分析提供,例如,通过X射线结晶学或多维核磁共振谱的结构分析。最近,应用遗传法则的结构分析也获得了良好的预测。
例如,关于泛蛋白超家族的其它信息可以在Larsen等.,2002的出版物中找到。另外,还可以参考Buchberger等.,2001的出版物。Buchberger描述作为泛蛋白样蛋白的典型特征的典型的βGrasp折叠,其具有β-β-α-β-β-α-β组成的二级结构,即,以21534排列的“混合折叠”形式的5个β链的排列。在这一方面,必须指出,UBX在其一级序列上与例如泛蛋白(Buchberger等.,2001)没有显著的同源性,但是不论这一事实——由于它与例如泛蛋白的三维结构相同的三维结构——被归类在泛蛋白样蛋白中。在这方面,应该提及,在泛蛋白中,在位置48和49的氨基酸也被视作独特的β链(Vijay-Kumar,1987)。然而,在泛蛋白结构中位于螺旋后并且以21534排列提供“混合的折叠”的第五链仅由2个氨基酸组成,并且实际上这种两个氨基酸的链是否可以被叫作β折叠链是有疑问的。然而,按照Buchberger等.(2001)在上文解释的那样,具有21534排列的蛋白也可以毫无疑问地归类于泛蛋白样蛋白超家族。对于本发明,选择在上文更详细地描述的21543定义用于泛蛋白中β链的排列。
上文提及的家族和超家族的蛋白通常是高度保守的。例如,按照目前已知的,在所有哺乳动物中,泛蛋白具有相同的氨基酸序列。酵母菌的泛蛋白只在3个氨基酸与该序列不同。人泛蛋白和哺乳动物的泛蛋白分别由76个氨基酸组成,并且具有在开始时描述的结构。
按照本发明所用的修饰蛋白在其氨基酸序列上与被修饰的起始蛋白如人泛蛋白,应该具有至少30%,优选地至少40%或50%,更优选地至少60%,至少70%,至少80%,至少90%,或至少95%的相同性,其中在任何情形中,所述蛋白具有上文详细描述的泛蛋白样折叠基序。
按照本发明,选择用来制备修饰蛋白的蛋白优选地是人泛蛋白或不同来源的泛蛋白,例如不同的哺乳动物泛蛋白。在哺乳动物领域中,作为哺乳动物泛蛋白,特别可以应用啮齿动物、家畜和农业动物泛蛋白。如果应用按照本发明制备的蛋白的领域是已知的,即,例如,如果修饰蛋白要用作治疗人类疾病的药物组合物,那么人蛋白可以优选地用作要被修饰的起始蛋白;这以类似的方式应用于其它应用领域。
人和哺乳动物泛蛋白分别具有76个氨基酸。按照PDB数据库中的结构1UBQ(http://www.rcsb.org/pdb/index.html),形成反向平行β链的4个β链的氨基酸是下述按照本发明的氨基酸位置:
第一链(氨基端):2-7;第二β折叠链:12-16;第三链:41-45;第四链(羧基端):66-71。如果从顶端(氨基端在底部,羧基端在顶部)从左向右看,链的位置为:第二链,第一链,第四链,第三链,其中在第一和第四链之间的多肽链形成α螺旋。
要被修饰的氨基酸的选择和修饰:
基于对应的结构数据,诸如例如在蛋白数据库TM(Berman等.,2000;http://www.rcsb.org/pdb)中可以免费获得的那些结构数据,可以通过计算机化分析而定位起始蛋白如在泛蛋白蛋白构架中的那些氨基酸的位置,其侧链是暴露于表面的,即指向溶剂和潜在的结合伴侣。可以通过计算机化分析而鉴定起始蛋白如泛蛋白中的那些氨基酸,推测它们的随机取代对所述蛋白构架的稳定性没有或者只有微弱的副作用。
这一信息可以提供关于作为结合位点成分的每一单一氨基酸的适合性的第一指示,然后其需要实践检验。在本发明的一个优选实施方案中,例如,由于它们暴露于表面,并且耐受它们随机取代的综合结构,所以,选择在人泛蛋白位置2,4,6,62,63,64,65和66的氨基酸。
分别在第一氨基端β折叠链的起始(位置2,4,6)以及在环(位置62,63)或在羧基端β折叠链的起始(位置64,65,66),上文提及的位置在空间上彼此接近,并且与它们的氨基酸侧链一起在泛蛋白表面形成邻近的区域(图1)。通过在分析区域的随机氨基酸取代(“随机化”)的方式,这样可以另外在泛蛋白完整的蛋白结构上产生——以与抗体的抗原结合位点相似的方式——超变的表面暴露区。
例如,应用ProSAII软件(″ProteinStructureAnalysis″;ProceryonBiosciences,Salzburg),与泛蛋白(WT)相比较,可以确定104种变异和等量的随机采取的变异样品的蛋白稳定性,所述变异样品中“对照表位”的残基(随机化位置24,28,31,32,35,37,38,39)被取代。在这一情形中,大约19%的在结合位点区域随机取代而产生的变体具有至少与泛蛋白(WT)稳定性一样高的稳定性,而大约90%的变体比携带“对照表位”的那些更稳定(图2)。然后,这种基于计算机的结果可以用作选择适当的氨基酸的基础。
从可获得的人泛蛋白结构数据开始,首先优选地选择在要产生的结合位点区域的8个氨基酸位置。通过随机改变这一区域的一级序列(随机诱变)以及随后特异性选择的方式,获得表现出分别与预定的半抗原或抗原或者通常与预定的结合伴侣的理想的结合活性。尽管在这种方式中,对于得到的修饰蛋白赋予从头结合特性,但是,它们的结构和蛋白质-化学特性保持与起始蛋白的特性高度相同。因此,它们发挥这样的优点,诸如例如小的大小,高稳定性,经济的制备以及容易的修饰,与对于先前确定的配体的高亲和性和特异性。在这方面,由于1)由于泛蛋白的小的大小,不能预测所述构架关于广泛的氨基酸取代的耐受性,和2)包括被视作严紧的和不易改变的β折叠的人工结合位点的功能性,先前似乎是不可能的,所以不能预测泛蛋白作为产生人工结合蛋白的构架结构的适用性。
备选地,按照本发明应用基于γ-晶体蛋白的多肽分子。
如在开始时提及的那样,γ-晶体蛋白,一类脊椎动物晶体蛋白,是具有大约22kDa分子量的单体蛋白。γ-晶体蛋白的主要结构基序是反向平行的β折叠(Hazes和Hol,1992,Richardson等.,1992,Hemmingsen等.,1994)。γ-晶体蛋白由两个非常相似的球状结构域组成,一个是N端结构域,一个是C端结构域,通过V形接头肽彼此连接。γ-晶体蛋白的特有的折叠模式(,,希腊钥匙″基序,Slingsby,1985,Wistow和Piatigorsky,1988)最可能是本质热稳定性以及针对变性剂的稳定性的原因(Mandal等.,1987)。
在其正常折叠的状态,γ-II-晶体蛋白没有表现出任何结合特性。在所选择的由β折叠结构基序组成的这一蛋白的溶剂暴露区域的改变(诱变)令人惊讶地导致表面结构和蛋白的电荷模式的变化,并且由此产生新的结合特性。在这一情形中,只选择了基本上不参与维持蛋白结构的区域或氨基酸位置。小的β折叠蛋白的诱变(Riddle等.,1997)表明,不管实质上的序列改变,高百分数的蛋白仍然可以形成天然的β折叠结构。
在本文所述的方法中,靶点诱变在β折叠严紧区域中缺乏任何结合特性的蛋白上进行。在这种方式中,产生了具有与抗体分子相当的实质稳定性和特异的结合特性的蛋白。
噬菌体展示系统作为分离具有新产生的结合特性的诱变的β折叠蛋白的适当系统。所述系统可以非常有效地筛选蛋白变体巨大的所有成分的特异的结合特性(Smith,1985)。为了这一目的,将每种蛋白变异制备在丝状噬菌体的表面上,并且可以与固定在固相上的靶点分子相互作用。与靶点分子结合的蛋白可以通过洗脱噬菌体而获得。在分离噬菌体DNA后,可以确定特异性结合的蛋白变体的DNA序列。除了噬菌体展示系统,还可以应用其它的选择系统,诸如例如细菌展示(Stahl和Uhlen,1997)或核糖体展示(Hanes等.,1997)。
通过所述的方法,令人惊讶地,可以改变非常稳定的β折叠蛋白γ-II-晶体蛋白,例如,通过在表面的β折叠中进行靶点位点-特异性诱变,以非结合蛋白被变成具有特异性结合特性的蛋白的方式而改变。因此,通过8个氨基酸位置的随机化处理,第一次在蛋白相对严紧的区域内的构架分子中进行诱变。因此,“抗体样”蛋白种类——关于它们特异的结合特性——从β折叠蛋白γ-II-晶体蛋白制备而来。应用上述方法,γ-II-晶体蛋白或其它小的、稳定的β折叠蛋白通常可以用作设计新的结合特性的新的构架分子。在不同应用中,模拟的β折叠蛋白可以取代例如重组抗体。
在这一方面,其它和更详细的信息可以在WO01/04144中找到,其通过参考完全结合于此。
当在本文中定义时,术语“配体”是指由基于γ-晶体蛋白或泛蛋白的多肽分子特异性结合的物质。
所有生化、生物技术、诊断和治疗相关的分子可以用作这种结合伴侣——所谓的配体。可能的配体的列表包括一些物质种类,诸如多肽和蛋白(例如,免疫球蛋白和免疫球蛋白衍生物,可以从血浆中获得的蛋白,血液凝结因子和抑制剂,生长因子,白介素,细胞因子,受体蛋白,病毒蛋白和细胞表面标记诸如CD14、CD25、CD34),肽(例如,亲和性标记,诸如S-标记、T7-标记、His-标记、Strep-标记、Myc-标记、FLAG-标记,和病毒源性的肽),低分子量物质(例如,类固醇、胆固醇和有害物质诸如卤代氢),脂质(例如,细菌脂多糖、脂质体和脂蛋白),糖(例如,细胞表面标记诸如LewisY),核酸(DNA、RNA),有机和无机聚合物,以及这些物质的衍生物。在这方面,还可以参见本文在下文中所述的优选实施方案。
当用于本文时,术语“功能成分”定义缀合物的第二成分,其与基于γ-晶体蛋白或泛蛋白的多肽分子共价结合。术语“功能性”意指,适合用于诊断、治疗、层析以及分析的成分,并且可能已经已知。一般说来,“功能成分”定义为具有可测定的特性如酶活性、光谱可测的特性或毒性特性的任何成分。除了上述特性,所述功能成分在所述缀合物中的结构和功能是不受限制的。唯一的要求是,在多肽分子与功能成分共价结合后,要保留所有成分的功能性。在多肽分子的情形中,这种功能性是与特异性配体结合的能力,在功能成分的情形中,例如,这种功能性是其作用染料的作用。
按照本发明,一种或多种如两种功能成分可以与多肽分子结合(如上文所述那样)。为了实现所述成分与多肽分子的特异性结合,例如,一种成分可以形成与赖氨酸残基特异性结合,另一种成分可以形成与多肽分子中的半胱氨酸残基特异性结合。这种类型的两种成分的示例是荧光染料,其中一种作为荧光供体,另一种作为荧光受体。
下文描述所述成分彼此结合的性质以及优选应用的结合成分的详细内容。
如上文提及的那样,多肽分子与配体结合活性以及偶联伴侣(功能成分)的活性的检测是重要的特征。与配体结合活性的检测可以通过不同方法进行。在ELISA技术中,结合通过抗体-过氧化物酶缀合物方法检测,而Biacore系统应用表面胞质基因组共振现象进行检测。其它的技术,诸如荧光滴定、荧光偏振或荧光相关光谱学(FCS)是基于AffilinTM的荧光团特性。对于偶联伴侣(也就是所谓的功能成分)的活性检测,其已知的特性是重要的。因此,通过它们光谱特性,分析发色团或荧光团分子,诸如荧光染料或藻红蛋白。酶诸如过氧化物酶或碱性磷酸酶通过它们对模式底物的转换而检测。其它分子诸如毒素可以直接在细胞培养实验中检测它们的生物活性。在放射性同位素的情形中,可以使用适当的计数仪测定放射活性。对于其它分子范围,诸如糖和核酸,存在商购的检测试剂。
按照一个实施方案,如上文提及的那样,相对于野生型多肽新产生的或改变的结合特性是基于多肽分子(I)β折叠的表面暴露区中的一个或多个氨基酸取代。为了这一目的,每个多肽分子(I)中大约6-10个优选8个氨基酸数目被取代。这同等地适用于基于泛蛋白和基于γ-晶体蛋白的多肽分子(I)。
应该指出,(I)与(II)的偶联优选在多肽分子(I)要与配体特异性结合的β折叠的表面暴露区以外的区域进行。已经发现,在这种方式中,实现了对于按照本发明的缀合物的重要要求,即保留所有成分的功能性。
这里,提及与泛蛋白的Lys29,33偶联作为实例,其位于配体结合表面外,并且更精确地,甚至位于负责与den配体结合的β折叠外(Lys29,33位于α螺旋内)。通过在空间上隔开结合位点与配体的这一氨基酸侧链的偶联没有导致对缀合物成分的功能性的损害。
在这一点上,特别优选在具有新产生的或改变的与配体特异结合的结合特性的多肽分子(I)的β折叠外的区域进行(I)与(II)的偶联。在上文提及的情形中,例如,这一区域是泛蛋白分子的α螺旋,或者关于γ-晶体蛋白是另一条β折叠,即不参与同配体结合的β折叠。这在图1中特别清楚,其中晶体蛋白的N端结构域(β折叠)具有新产生的配体结合表面,其中位于C端部分的赖氨酸残基(突出表示的)适于与功能成分(II)偶联。
按照一个实施方案,(I)与(II)的偶联或连接分别通过(I)的氨基酸残基而发生。换句话说,这里偶联通过本身存在于多肽分子(I)中的氨基酸残基而实现。
在这一情形中,偶联位点特异性地或以通过(I)中半胱氨酸或赖氨酸侧链无方向性的选择性地进行。术语“位点特异的”在这里意指在分子(I)中存在半胱氨酸或赖氨酸,或者在精确确定的位点引入半胱氨酸或赖氨酸,以定义准确预先确定的结合位点。“无方向性的选择性地”意指存在一些这样的残基,以致由于它们的数目,尽管选择性地发生,但是与这些残基的结合还要服从某些随机因素。
关于按照本发明的缀合物的两种成分的偶联,即,它们的共价连接,给出下列解释:
蛋白含有多个官能团,通过这些官能团可以实现与其它分子的偶联。下文将提及这些的独特实例。通过伴侣的共价连接,例如,通过适当的交联试剂,可能在一个分子中组合不同的活性。作为实例,提及通常与染料分子偶联的蛋白,并且已经发现其以这种方式提供易于检测的检测试剂,所述试剂随后可用于诊断。
以一种相似的方式,抗体也与其它蛋白偶联,优选地与所谓的报道酶诸如碱性磷酸酶或过氧化物酶偶联。这些报道酶转化底物,因而获得可以通过吸收、荧光或发光检测的信号。
通过选择适当的交联试剂,蛋白,即也就是按照本发明的多肽,还可以与来自许多其它物质种类的其它功能成分偶联:多种有机的和无机聚合物、蛋白、肽、核酸、脂质、糖以及低分子量物质可以用于这一目的。来自聚合物种类的优选的偶联伴侣为,例如,葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、琼脂糖凝胶、琼脂糖、聚苯乙烯、聚乙烯、硅胶、纤维素或聚乙二醇(PEG)。例如,后者修饰用于调控生物治疗剂的药物代谢动力学特性。具有适用于偶联并且已经预先偶联活化的官能团的PEG衍生物的大量选择品可以商购(NektarTher即eutics)。提及的其它聚合物物质在许多生化、生物技术和诊断方法中作为载体物质。这里应该特别提及,层析应用,特别是亲和层析,其中这些聚合物物质用作凝胶基质。为了这一目的,携带适当的化学基团的聚合物珠粒的表面被功能化并且活化,例如,以使蛋白以理想的活性偶联。以这种方式,具有针对具体配体的特异性的结合蛋白也可以被固定,然后,得到的凝胶基质可以用于从复合物质混合物中有效地并且快速地富集所述配体。这种富集可以通过柱层析或者在滤器表面进行。此外,具有磁性特性(磁性BEADS)并且因此可以有效地从混合物中分离的那些聚合物珠粒可以有利地用于亲和性富集。
一个重要的实例是从真核细胞上层清液中大规模纯化用于治疗目的的抗体,其通过与偶联到介质上的蛋白质A(一种具有针对抗体分子的固有亲和性的细菌蛋白)的亲和层析进行。
除了上文提及的抗体-报道酶融合以外,还有许多将两种蛋白成分偶联的实例。因此,在一种最容易的情形中,可以通过将两种和多种相同的蛋白分子偶联而产生同源二聚体或同源多聚体。
在结合蛋白的情形中,亲和性作用可以通过多聚化实现,即,与单体结合蛋白的亲和性相比,多聚体对于靶点物质的亲和性显著增加。然而,通过将具有针对不同靶点物质的特异性的两种结合蛋白偶联,可以获得所谓的双特异性结合分子,例如,其可以用作使得各自的靶点物质在空间上彼此接近的连接物。
此外,具有针对活细胞的毒性特性的蛋白,所谓的毒素(例如,其中蓖麻毒蛋白、霍乱毒素、假单胞菌外毒素)代表针对抗体或其它结合分子的有趣的偶联伴侣。偶联后,这种双功能缀合物可以通过所述结合蛋白选择性地停靠在特异的靶点物质,例如,在肿瘤细胞表面上,并且后来靶点细胞将通过细胞毒性活性而被破坏。
蛋白本质的其它相关的偶联伴侣是蛋白生色团,诸如例如GFP及衍生物,或者含有色素的蛋白诸如藻红蛋白。作为很好检测的报道物质,得到的生色或荧光偶联产物本身是用于研究或诊断的有价值的工具。
然而,如上文以及提及的,生色或荧光蛋白缀合物还可以通过偶联低分子量染料分子而获得。多种具有交联基团的适当的染料分子可以商购,例如从Invitrogen公司购得。其它产生用于诊断和治疗的蛋白缀合物的低分子量偶联伴侣为,例如,生物素、洋地黄毒苷、重金属衍生物、螯合剂、放射性同位素、细胞毒性物质和抗生素。
蛋白中以及在按照本发明的多肽分子中,以及在适于偶联的功能成分中所包含的官能团主要是氨基、羧基、羟基和巯基,而且酪氨酸的苯酚官能团和芳香环系统可以作为偶联剂攻击的位点。适于偶联的氨基酸残基特征在于特异的特性:一方面它们必须具有偶联剂可及的活性侧链。在理想的情形中,这种官能团位于蛋白表面,并且暴露于溶剂。此外,这一残基的修饰不应该干扰蛋白的功能。优选地,要被修饰的残基距离酶的活性位点或距离按照本发明的多肽分子的结合表面有显著的距离;并且,这些区域还应该没有相同类型的氨基酸残基,相同类型的氨基酸残基在修饰后可能导致蛋白功能的损失。因此,在各自的蛋白中稀有的氨基酸残基也是有利的。
如同上文已经提及的那样,对于基于泛蛋白的多肽分子(I),优选考虑通过泛蛋白分子的赖氨酸残基29和33的偶联。较不优选但是仍然可能的是通过赖氨酸残基11和48偶联,赖氨酸残基11和48与残基29和33相比,都位于距离所述配体的结合表面的更短的距离。
在基于γ-晶体蛋白的多肽分子(I)的情形中,与野生型多肽相比,具有新产生的或改变的与配体特异性结合的结合特性的肽结构域是N端结构域,并且(I)与(II)的偶联通过C端结构域进行。这也适用于C端肽融合的可能,其优选地含有半胱氨酸,和存在于C端结构域并且可用于偶联功能成分的氨基酸侧链诸如赖氨酸。优选使用γ-晶体蛋白的的残基91和163(参见图1)。
在蛋白原性氨基酸中,必须主要指出在其侧链中具有ε氨基的赖氨酸以及具有其巯基功能的半胱氨酸。这些官能团特别有活性,并且因此非常适于作为按照本发明的多肽分子与功能成分特异性偶联的伴侣。因此,在文献中描述了特异性只与巯基反应并且因此可以按照本发明进行应用的试剂,其中例如,顺丁烯二酰亚胺、碘代乙酸酯、羟基汞基苯甲酸酯、Ellman′s试剂。在各自的课本诸如Voet&Voet(1995)或Lottspeich&Zorbas(1998)中可以找到其它的实例。
这些还描述了许多赖氨酸-特异性侧链试剂,诸如例如酸酐(其中乙酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺,其也用于本发明)。除了它们的反应性,赖氨酸具有其它的偶联有利特性:由于侧链是带电的,所以它通常位于蛋白表面,即,是溶剂可及的,在生物系统中溶剂主要是水。这种可及性也是偶联试剂必需的,并且因此应该存在。
在蛋白中,暴露于表面的游离半胱氨酸相对稀少,在胞外蛋白中,这些半胱氨酸主要参与通常稳定二聚体相互作用的二硫键。然而,二硫键可以通过还原而分解,以致所包含的半胱氨酸是可以进行修饰的。如果按照本发明的多肽分子不含对偶联试剂敏感的半胱氨酸残基,那么可以通过诱变在适当的位点引入这样的残基。在这一方面,由于这有助于预测适于偶联的暴露于表面的氨基酸位置,所以关于蛋白空间结构的知识是有利的。然而,如果在蛋白中存在一些半胱氨酸残基,这使得不可能进行位点特异的偶联(与确定的半胱氨酸残基的偶联,参见上文),那么这些可以通过定点诱变的方法而消除。在这一情形中,优选用具有相似特性的丝氨酸残基取代所述板冠苷酸残基。
然而,通常不可能通过诱变在目的蛋白序列中获得适于偶联的氨基酸残基。如果蛋白在N或C端耐受氨基酸残基插入或者融合,那么可以在遗传水平上在这些位点引入含有适于偶联的氨基酸残基的肽序列。
因此,按照另一个实施方案,(I)与(II)的偶联通过与(I)融合的另外的末端肽中的氨基酸残基进行。
这些末端肽融合体的可及性的检验,例如,可以通过使用具有生色团特性的侧链特异性偶联试剂如针对半胱氨酸的Ellmann′s试剂进行(也可以参见实例)。其中,这些末端肽融合体的可及性可以通过它们的长度而调节。例如,要被偶联的氨基酸侧链的可及性的增加可以通过在要被偶联的氨基酸侧链和蛋白之间插入所谓的间隔而实现,在肽融合体的情形中,这些是附加的、惰性的氨基酸残基。由于它们小的大小并且因此可以呈现非常灵活的结构,甘氨酸和丝氨酸残基是特别适用的。
取决于蛋白中偶联试剂可及的官能团的数目以及其特异性,可以区别不同的偶联类型。例如,如果使用半胱氨酸特异的偶联试剂,那么只有半胱氨酸残基将选择性地反应;然而,例如,如果存在一些半胱氨酸残基,那么不能预先确定精确的偶联位点;这叫作选择性的但是非定向的偶联。然而,如果只有一个偶联试剂可及的半胱氨酸存在,那么偶联位点特异性地发生。
多种适宜的偶联试剂可以商购(例如,从Pierce公司)。按照本发明可以应用的偶联试剂的具体形式是指交联剂或只是接头(Herrmann&Morse,1973;Takamiya等.,1975;Reichlin,1980)。
接头定义为通过共价键连接两个(或多个)分子的物质。接头含有两个(或多个)活性(活化的)官能团,它们的空间距离可以通过其它连接它们的化学基团而调节。具有相同功能团的接头叫作同源-双功能接头,相反具有不同官能团的叫作异源-双功能接头。因此,通过接头物质的适当选择,还可能将完全不同的物质种类彼此连接在一起。
作为按照本发明可以应用的接头的实例,参考SPC-1-A7-Cys的C端部分,参见下述表2。
然而,蛋白偶联的一个具体情形不需要活化的接头:例如,在蛋白二聚体化中二硫键的形成。在氧化条件下,巯基残基具有足够高足以形成二硫键即在两个硫原子之间形成共价键的反应性。
按照本发明,偶联反应可以作为一步反应或几步反应进行。在每种只有一个活性残基的两种相同分子的简单二聚体化的情形中,充分地温育偶联成分和同源-双功能接头以获得确定的缀合物。在还携带不同活性基团的不同偶联伴侣的情形中,只可能使用适当的异源-双功能接头进行一步反应。
备选地,具有相同活性基团的不同偶联伴侣(反应物)之间的偶联还可以在多步骤过程中进行。对于这一目的,在大多数情形中,开始只温育一种反应伴侣和过量的接头,并且在它通过所述接头其余的游离官能团连接到第二反应物上之前,将得到的单价反应物-接头缀合物分离。生物化学和生物技术中应用的多种化学物质可以以所谓的活化形式即已经与活性接头连接的形式商购获得(Pierce公司、Invitrogen公司)。
如果存在多于一种的活性基团,那么,偶联的程度,即缀合物中单个成分的相对比例可以通过化学计量所用的反应物而调节到一定程度。与不同偶联伴侣的确定的多个偶联可以通过顺序偶联或者通过应用不同的偶联化学,例如通过将第一功能成分与半胱氨酸偶联,同时将功能成分2附着到各自多肽的赖氨酸上。典型的实例是附着用于FRET检测的荧光供体/受体对。适于这一目的的染料分子组合可从Invitrogen公司获得。
不依赖于形成按照本发明的缀合物的所选择的偶联机制,应该再次指出,所述缀合物的功能活性是出乎意料和令人惊讶的。因此,还可以参考本文在上文中所解释的内容。
此外,应该提及,本领域的技术人员没有预料到可以产生本发明中公开的缀合物,同时单个成分的全部功能性得到保留或者甚至被增强。
在一方面按照本发明的多肽分子和另一方面的功能成分之间的大小比例是非常不同的。有时,要被结合的分子,例如藻红蛋白,比多肽分子大10-12倍,但是有时也是小的,诸如荧光染料Oyster。令人惊讶地,多肽分子的结构以及针对配体的结合亲和力都得以保留,特别是在更大的结合分子中。在这种方式中,这是不可能预料到的。
如上文已经解释的那样,与功能成分偶联的侧链优选地位于(I)与配体的结合表面之外,以便与配体的结合功能性不被破坏。
按照另一个优选的实施方案,与(I)融合的末端肽包含——如上文提及的——一个或多个半胱氨酸残基或一个或多个赖氨酸残基,其中这些氨基酸残基优选地不参与(I)与配体的相互作用。
功能成分(II)优选地选自由下列各项组成的组:多肽和蛋白、有机和无机聚合物、核酸、脂质、糖、低分子量物质、肽以及这些物质的衍生物。关于结合和偶联试剂的原理参见上文的解释。
按照优选的实施方案,功能成分(II)是肽、多肽或蛋白、优选蛋白生色团、酶、免疫球蛋白、免疫球蛋白衍生物、毒素或按照I的多肽。
如果功能成分(II)是聚合物,那么它优选地选自葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、琼脂糖凝胶、琼脂糖、聚乙烯、聚苯乙烯、硅胶、纤维素或聚乙二醇、或聚合物衍生物。
如果功能成分(II)是低分子量物质,那么它优选为染料、生物素、洋地黄毒苷、重金属、螯合剂、放射性同位素、抗生素或细胞毒性物质。
按照一个优选的实施方案,与成分(I)特异结合的配体优选地选自由下列各项组成的组:多肽、肽、低分子量物质、脂质、糖、核酸、有机和无机聚合物以及这些物质的衍生物。
如果这种配体是多肽或蛋白,那么优选应用免疫球蛋白及免疫球蛋白衍生物,获得于血浆的蛋白,血液凝固因子和抑制剂,生长因子,白介素,细胞因子,受体蛋白,病毒蛋白和细胞表面标记,优选CD14、CD25、CD34。
如果所述配体是肽,那么它优选为亲和标记,优选S-标记,T7-标记,His-标记,Strep-标记,Myc-标记或FLAG-标记,或病毒源性的肽。
所述配体还可以是低分子量物质,优选为类固醇、胆固醇和毒性物质诸如例如卤代氢、或脂质或脂质衍生物、优选细菌脂多糖、脂质体和脂蛋白。
按照优选的实施方案,按照本发明的缀合物的成分(II)是一种或多种基于γ-晶体蛋白或泛蛋白的多肽,其与(I)相同并且共价与(I)连接,其中针对(I)的配体的亲和性的增加通过亲和作用的方法而实现。对于详细的解释,参加上文所述。
此外,成分(II)优选地是成分(I)与之以多种方式共价连接的多肽、蛋白或聚合物,其中针对(I)的配体的亲和性的增加通过亲和作用的方法而实现。备选地,成分(II)是这样的多肽或聚合物,即,在与成分(I)共价连接后,其与这一类型的其它缀合物共价或非共价结合,其中针对(I)的配体的亲和性的增加通过亲和作用的方法而实现。
按照一个优选的实施方案,成分(I)是分子SPC1-A1(SEQIDNO:2),SPC1-A7(SEQIDNO:3),SPU11-3-A1(SEQIDNO:12和13),SPC1-G3(SEQIDNO:4),和SPC7-E9(SEQIDNO:8)中的一种。
然而,本发明不仅包括正确的氨基酸序列,还包括其变异。按照本发明,“变异”特别是这样的核酸,即,与在SEQIDNO.中定义的核酸相比,其中存在一个或多个取代、插入和/或删除。在这些变异中,在核酸的一端或两端,或者在核酸的内部部分,优选至少1个和2、3、4个或更多个核苷酸被删除,或者被其它核苷酸取代。
因此,本发明的核酸还包括具有基本上与各自的SEQIDNO.的核酸相等的序列的核酸。例如,按照本发明的核酸可以具有同SEQIDNO.的核酸至少约80%,典型地至少约90%或95%的序列同一性。
术语“核酸序列”涉及核苷酸的异源聚合物或者涉及这些核苷酸的序列。当用于本文时,术语“核酸”包括RNA、DNA两种,DNA包括cDNA、基因组DNA和合成的(例如化学合成的)碱基以及与其它聚合物诸如PNA结合的碱基。
本发明还包括这样的变异,即,其在中等严紧条件下与按照本发明的核酸杂交。
严紧杂交和洗涤条件通常是指这样的反应条件,在所述条件下,只形成寡核苷酸和理想的靶点分子之间的双联体分子(完美杂化物),或者只检测理想的靶点生物体。在这一方面,严紧的杂交条件特别是指在65℃0.2×SSC(0.03MNaCl,0.003M柠檬酸钠,pH7)。在更短的片段的情形中,例如达到20个核苷酸的寡核苷酸的情形中,杂交温度低于65℃,例如,高于55℃,优选地高于60℃,但是无论如何低于65℃。严紧杂交温度分别取决于核酸的大小或长度,并且取决于它们的核苷酸组成,并且可以由本领域的技术人员通过手工实验而确定。例如,中等严紧条件在42℃并且通过在42℃用0.2×SSC/0.1%SDS洗涤而实现。
各自的温度条件可以是不同的,其取决于所选的实验条件,并且取决于要检验的核酸样品,并且在这种情形中必须适当地调节。例如,在放射性标记的分子的情形中,杂交产物的检测可以通过放射性自显影而进行,或者如果应用荧光-标记的分子,杂交产物的检测通过荧光测定法而进行。
本领域的技术人员可以以本身已知的方式使所述条件适应所选的检验方法,以真正获得中等严紧条件,并且能够进行特异的检测方法。例如,适当的严紧条件可以通过参考杂交的方法而确定。必须应用适当的核酸或寡核苷酸浓度。杂交必须在适当的温度进行(温度越高,杂化物的结合越弱)。
按照第二方面,本发明涉及从具有已知序列的成分(I)起始制备上文定义的缀合物的方法,所述方法包括下述步骤:
通过分析蛋白的空间结构,优选地在(I)与配体相互作用表面之外的残基的空间结构,而鉴定适用于偶联的氨基酸残基;
通过适当的偶联试剂活化偶联伴侣;
进行偶联反应;
分离缀合物;和
检测所述缀合物的两种成分的功能性。
一种制备本发明的缀合物的改良方法——从具有已知序列的成分(I)起始,在成分(I)中没有鉴定出适于偶联的氨基酸残基——包括下述步骤:
通过取代、插入或融合而引入适于偶联的氨基酸残基,优选地引入在(I)与配体相互作用的表面之外暴露于表面的残基;
检测引入的氨基酸残基的可及性;
检测以这种方式改变的成分(I)的功能性;
通过适当的偶联试剂活化偶联伴侣;
进行偶联反应;
分离缀合物;和
检测所述缀合物的两种成分的功能性。
对于偶联方法等的更详细的解释参加上文。
按照第三方面,本发明提供可以按照上文提及的方法制备的缀合物。
此外,本发明包括含有上文定义的缀合物的诊断试剂盒。
本发明的另一方面是药物组合物,其包括按照本发明的缀合物和药用载体。
在所述药物组合物中,所述缀合物治疗或者至少减轻疾病的剂量与适当的载体或载体物质混合。这种类型的组合物可以包含(除了活性剂和载体之外)稀释剂、填充物质、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂和本领域公知的其它物质。术语“药用”定义分别不损害活性成分或活性剂的生物活性功效的无毒物质。载体的选择取决于给药途径。
所述药物组合物可以另外含有增强活性剂活性或者补充其在治疗中的活性或应用的其它药剂。这样的其它因子和/或药剂可以包含在药物组合物中,以分别获得协同作用或者将副作用或不利作用最小化。
分别关于配制和制备的技术,以及本申请的缀合物的施用,可以在″Remington′sPharmaceuticalSciences″,MackPublishingCo.,Easton,PA,最新版本中找到。此外,治疗有效量涉及足以实现症状的改善如治疗、治愈、预防或改善这样的病症的化合物的量。适当的给药途径可以包括,例如,口服、直肠、跨黏膜或肠内给药和肠胃外给药,肠胃外给药包括肌内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内或鼻内注射。优选对患者进行静脉内给药。
按照另一方面,本发明涉及本文定义的缀合物、试剂盒或组合物在诊断、治疗和亲和层析中的应用。
描述的偶联方法和用所述方法获得的数据使得缀合物的各种应用成为可能,包括将所述缀合物用于亲和层析。关于这种应用的实例分别是取代蛋白质A纯化抗体,和通过亲和层析纯化血浆蛋白、生长因子或流感疫苗,以及纯化通过遗传加工具有亲和标记而制备的蛋白,或者去除内毒素和白蛋白。此外,通过与基质偶联,可以考虑用于血浆提取法或生物去污法。
另一个应用领域是诊断。在这方面,可以考虑在血库中筛选细菌或病毒感染的应用,或者在经典检测技术诸如ELISA,或新的研发诸如在Luminex系统中的应用。在诊断和治疗中,这样的缀合物可以用于细胞分离物中。
按照本发明的缀合物在治疗中的应用可以是可能的,特别是作为转运分子的一般应用。治疗中的其它应用在基因治疗中,指导按照本发明的多肽分子的靶向和与基因转移系统的偶联。通过指导靶向并且偶联到细菌毒素上,还可以获得在治疗中作为免疫毒素的应用。
在下文中,本发明将考虑到一些附图和附属实施例进行解释,然而,这些附图和实施例并不是意欲显著本发明的范围,而仅仅是举例说明本发明。
图1:γ-II-晶体蛋白的空间结构。在N端结构域从新产生的结合表面绘成黄色。位于所述结合表面外的赖氨酸残基的C端位置用红色半球突出表示。
图2:关于AffilinTM变体SPC1-A1(A),SPC1-A7(B)和SPC-1-G3(C)与具有固定的IgGFc的CM5芯片竞争结合的Biacore实验的传感图。对于本实验,180RU的多克隆IgGFc固定。对于结合竞争,使用变体和IgGFc的指示浓度。流速30μl/min的HBS-EP用作运行缓冲液。
图3:检测SPC7-E9与proNGF结合的浓度-依赖性ELISA。将微量滴定平板用10μl/mlproNGF包被。1:1000稀释的抗-人-γ-II-晶体蛋白抗体-POD缀合物作为检测抗体。表示的吸收值为两次平行检测的平均值。可以计算出200nM的表观KD值。
图4:检测SPC1-A7_Cys与人IgGFc结合的浓度-依赖性ELISA。将微量滴定平板用10μl/mlIgGFc包被。1:1000稀释的抗-人-γ-II-晶体蛋白抗体-POD缀合物作为检测抗体。表示的吸收值为两次平行检测的平均值。可以计算出233nM的表观KD值。
图5:SPC1-A7BB-PE缀合物与具有固定的IgGFc的CM5芯片结合的Biacore实验的传感图。3000RU的IgGFc固定,并且将浓度为121nM(红色),75nM(绿色)和6nM(蓝色)的SPC1-A7BB-PE流过芯片。缔合相是1min,然后是3min解离相。流速30μl/min的HBS-EP用作运行缓冲液。从曲线可以计算出15nM的宏观KD值。
图6:检验SPC1-A7Oyster556与具有固定的IgGFc的CM5的结合的Biacore实验的传感图。将1000RUIgGFc固定在芯片上,并且将浓度为1μM(蓝色)和5μM(红色)的SPC1-A7Oyster556流过所述芯片。每种情形中缔合相和解离相为3min。流速30μl/min的HBS-EP用作运行缓冲液。
图7:通过ELISA检测AffilinTM-POD缀合物与IgG的结合。将10μg/ml的人IgG固定在微量滴定平板上。将AffilinTM-POD缀合物在PBS中的不同稀释液在微量滴定平板上温育1h。在洗涤步骤后,通过TMB底物溶液检测结合的POD活性。
图8:SPU11-3-A1_Cys与NGF结合的Biacore实验的传感图。将200RU的SPU11-3-A1_Cys通过PDEA方法偶联到CM5芯片上,并且将不同浓度的NGF流过芯片。流速30μl/min的PBS(1mMEDTA,0.005%表面活性剂P20)作为运行缓冲液。从曲线可以计算出46nM的KD值。
图9:SPC7-E9与具有proNGF的CM5芯片的结合的Biacore实验的传感图。将280RU的proNGF固定,并且将不同浓度的proNGF流过芯片。流速30μl/min的PBS-EP作为运行缓冲液。从曲线可以计算出1.4nM的KD值。
图10:从SPC7-E9亲和柱上洗脱proNGF。使用400μg纯化的proNGF(0时刻,粉色虚线),随后用20柱体积的运行缓冲液进行润洗。洗脱用0,1M甘氨酸pH2.2进行(绿线)。运行以1ml/min的流速进行。在280nm处进行蛋白检测(蓝线)。
图11:从BSA溶液和从大肠杆菌粗提取物中分离proNGF的SDSPAGE。(从左到右)泳道1:标记蛋白,泳道2:BSA标准物,泳道3:proNGF标准物,泳道4:BSA和proNGF标准物的混合物(起始),泳道5:穿透峰,泳道6:使用0.2M甘氨酸(pH2.2)的洗脱液,泳道7:空白,泳道8:大肠杆菌粗提取物(B121)和proNGF标准物的混合物,泳道9:穿透峰,泳道10:使用0.2M甘氨酸(pH2.2)的洗脱液。
实施例1
从人-γ-II-晶体蛋白文库筛选与IgGFc和proNGF结合的AffilinTM变体,表达并且纯化所述AffilinTM变体
从人-γ-II-晶体蛋白文库CR20起始,通过噬菌体展示系统进行筛选过程。甚至在第一轮筛选后,可以选到和分离一些在单一噬菌体ELISA中表现出与IgGFc特异结合的AffilinTM变体。应该意识到,当用于本文时,术语″AffilinTM″对应缀合物按照本发明的多肽分子成分,所述缀合物基于泛蛋白或γ-晶体蛋白,并且相对野生型,具有关于与配体特异结合的改变的结合特性。在将基因克隆到pET20b表达载体(Novagen)中后,AffilinTM变体以重组方式在大肠杆菌(BL21(DE3),Stratagene)中过量表达,并且随后在两步层析(IMAC和凝胶过滤)中纯化。在蛋白浓度-依赖性ELISA中,和在BIACORE实验中,可以确定具有nM范围的解离产生的与IgGFc的特异性结合。
对于筛选与IgGFc结合的AffilinTM变体,将1mlCR20文库(6.5x1010cfu)在37℃和220rpm在11具有2%葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基中温育,直到光学密度OD600=0.4。然后,将细菌培养物与10倍过量的辅助噬菌体M13KO7(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)一起在37℃和100rpm温育感染1h。然后,将细菌混悬液在1000xg离心20min,并且将沉淀重悬在11具有8mMGSH、100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2xYT培养基中。噬菌体生产或噬菌体释放分别在30℃和200rpm进行过夜。对于噬菌体分离,使用由Kay,Winter和McCafferty(1996)所述的流程。
在室温(RT)下,将1ml分离的噬菌体(1.4x1014cfu)用1ml在PBS中的6%BSA封闭1h。同时,将用100μl在PBS中的10μg/mlIgGFc单克隆溶液(Roche)在RT封闭过夜的10孔微量滴定平板(NUNC)用PBS;0.1%吐温20洗涤3次。然后,将每个孔中的游离结合位点用300μlPBS(3%BSA,0.5%Tween20)在RT封闭2h,然后将孔用PBS(0.1%Tween20)洗涤3次。在每孔加入100μl封闭的噬菌体后,在RT和20rpm温育1h。通过用2xPBS洗涤2次,用2xPBS,3%BSA洗涤2次,最后用2xPBS洗涤2次,分别移除未结合的和弱结合的噬菌体。通过加入100μl/孔100mM的三乙胺并且在RT温育10min,而洗脱仍然结合的噬菌体。对于洗脱在碱性培养基中的噬菌体的中和,向其中(总共1ml)加入500μl1MTris/HClpH7.4。随后将孔用PBS洗涤3次。
在37℃,将尽管用三乙胺洗脱仍然保留在微量滴定平板上的紧密结合的噬菌体直接用100μl指数生长的XL1-Blue细胞培养液(OD600=0.4)温育,重感染30min。对于XL1-Blue细胞与洗脱在碱性培养基中的噬菌体的重感染,将750μl中和的洗脱液与9ml具有OD600=0.4的XL1-Blue细胞一起在37℃温育30min。然后,将洗脱在碱性培养基中的噬菌体的重感染细胞和紧密结合的噬菌体的重感染细胞组合,涂布在含有SOBAG培养基(包括氨苄青霉素)的16x16cm平板上,并且在37℃温育过夜。在淘选过程后,获得大约2000个克隆,用大约12.5ml2xYT培养基;20%甘油将其从平板上浮选下来,并且保存在—80℃。
对于单个噬菌体的培养,将在第一轮淘选后得到的细胞库接种在选择培养基(SOBAG)上,并且在37℃温育过夜。将92个单一克隆从SOBAG平板上转移到24x5ml深孔平板上,每孔含有2ml/孔具有2%葡萄糖和100μg/mlamp的2xYT培养基,并且在37℃和180rpm温育过夜。另外,每个平板上有一个含有在噬菌粒载体中的人野生型γ-晶体蛋白基因的单克隆(Xl1-blue)作为对照。将含有2.5ml/孔具有2%葡萄糖和100μg/mlamp的2xYT培养基的无菌24x5ml深孔平板分别用1%的过夜培养物接种体接种,并且将细菌培养物在37℃和180rpm培养到OD600约0.4。然后,将所述培养物每孔用2.5μl1013cfu/ml的辅助噬菌体M13K07感染,并且在37℃和100rpm温育1h,随后将细菌通过离心沉淀,倒掉上层清液,并且将沉淀重悬在每孔2.5ml2xYT培养基,8mMGSH,100μg/ml氨苄青霉素,50μg/ml卡那霉素中,并且在30℃和200rpm温育过夜。微量获得噬菌体上层清液,将平板在4600rpm离心。噬菌体的沉积(Precipitation)和沉淀(pelleting)按Kay,Winter和McCafferty所述进行,并且将噬菌体沉淀重悬在大约200μlPBS,3%BSA,pH7.4中。通过这一流程,噬菌体可以浓缩,并且随后用于ELISA。
为了这一目的,将NUNC平板的孔用100μl抗原溶液(分别10μg/ml人单克隆IgGFc或BSA)在4℃包被过夜。第二天,将ELISA平板用封闭缓冲液(PBS,3%BSA,0.5%Tween20,pH7.4)在室温下温育2h。在将孔用洗涤缓冲液(PBS,0.1%吐温20,pH7.4)洗涤后,将100μl每种封闭的噬菌体制备物加入到孔中,并且在RT温育1h。在用洗涤缓冲液(PBS,0.1%吐温20,pH7.4)再洗涤一次后,应用在PBSpH7.4中的1:5000稀释的单克隆抗-M13抗体(POD-缀合的;MoBiTec,)(100μl/孔),并且再在RT下温育1h。然后,将孔用洗涤缓冲液(PBS,0.1%吐温20,pH7.4)洗涤3次,和PBS洗涤3次,并且使用TMBPlus(Kememec,DK)开始颜色反应(100μl/孔)。20分钟后,加入0.2MH2SO4终止颜色反应。得到的黄色颜色在450nm处读取(参考波长:620nm)并且记录。
使用引物pCAN700,测序来自表现出关于与单克隆IgGFc结合的明显信号并且几乎不能检测到与BSA的结合的那些噬菌体制备物的γ-II-晶体蛋白变异的基因。使用限制性位点NcoI和BstEII,将从中得到的3个克隆,SPC1-A1,SPC1-A7和SPC1-G3亚克隆到pET20b表达载体中,并且引入表达菌株BL21(DE3),pUBS520(Stratagene)。
将细胞37℃和200rpm在具有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2xYT培养基中培养直到光学密度OD600=0.6-0.8,随后用IPTG(1mM终浓度)诱导重组蛋白表达。在30℃和200rpm生长4小时后,通过离心(6000xg,20min,4℃)收集细胞。在存在5mMβ-巯基乙醇下,通过溶菌酶(0.1mg/ml)和超声(6x15sec,在用冰冷却下)方法在NPI-10缓冲液(Qiagen)中进行细胞分解。离心(40.000xg,30min,4℃)后,将上层清液上样到IMAC柱(HiTrapChelatingHP,AmershamBioscience)上,并且用NPI-20(Quiagen,+5mMβ-巯基乙醇)(20个柱体积)洗涤。洗脱通过用30个柱体积的NPI-500(Quiagen,+5mMβ-巯基乙醇)线性梯度进行。含有γ-II-晶体蛋白的级分通过SDSPAGE进行分析,将各自的样品收集到一起,并且上样到凝胶过滤柱(1.6x60,Sephadex75,AmershamBiosciences)上。流速为0.75ml/min的PBS作为运行缓冲液。凝胶过滤的分析通过SDSPAGE方法进行,将含有γ-II-晶体蛋白的级分组合在一起,并且保存在4℃。在这一纯化流程后,AffilinTM变体具有>95%的纯度(SDSPAGE)。
现在,按照上文所述在浓度-依赖性ELISA中检测纯化蛋白的结合特性。对于这一目的,使用不同浓度的(100nM-10μM)的AffilinTM变体,并且将抗-γ-II-晶体蛋白抗体(具有POD的单克隆抗体缀合物)用作检测抗体。发现检测到的所有3种AffilinTM变体表现出与人IgGFc的特异结合,并且与BSA或与微量滴定平板的非特异结合是不可检测的。用作对照的人野生型γ-II-晶体蛋白没有表现出与IgGFc,BSA或微量滴定平板的结合。
在BIACORE实验中,确定三种AffilinTM变体的解离常数。对于这一目的,将大约180RU人IgGFc(50μg/ml,在50mM柠檬酸钠中,pH5.0)固定在CM5芯片上。游离的结合位点最终用1M乙醇胺(pH8.5)灭活。
然后,以30μl/min的流速,6种不同浓度(166nM-1μM)流过所述芯片180sec。然后,将所述芯片以相同的流速用HBS,0.005%表面活性剂P20(Biacore)润洗180sec。使用BiaEvaluation软件(Biacore,Uppsala,Sweden)从得到的传感图中,可以确定下列AffilinTM变体与IgGFc的解离常数:SPC1-A1230nM,SPC1-A7280nM和SPC1-G3800nM。在竞争实验中,可以检测到AffilinTM变体与IgGFc特异结合,但是不与芯片基质特异结合(图2)。
以与变体SPC1-A1、SPC1-A7和SPC1-G3筛选相似的方法,分离针对靶点分子proNGF的AffilinTM变体SPC7-E9。通过BIACORE-Messungen方法,可以确定解离常数为1-6nM(图3)。
实施例2
从人泛蛋白文库(UB10)筛选针对半胱氨酸结蛋白(cysieineknotprotein)的AffilinTM变体—表达并且纯化所述变体
提供用于筛选具有新产生的结合亲和性的修饰蛋白的合成的泛蛋白基因
按照本领域技术人员已知的标准流程,诸如例如Sambrook等(1989)的那些标准流程,进行遗传加工工作。
对于制备作为制备人工结合蛋白起点的修饰的泛蛋白蛋白构架的DNA序列(SeqIDNo.2),所述修饰的泛蛋白蛋白构架具有取代Ile44Ala,Lys48Arg,Arg54Leu,Val70Ala,Arg72Leu,Gly75Ala以及Gly76缺失,方法如下:对于基因合成,在50μl体积中进行PCR反应,其中六种寡脱氧核苷酸(SeqIDNo.26,SeqIDNo.27,SeqIDNo.28,SeqIDNo.29,SeqIDNo.30,SeqIDNo.31;每种0.1μM)每种2.5μl作为模板存在,它们的碱基对序列在一起代表要合成的基因。所用的寡脱氧核苷酸的序列每种分别对应人工基因的编码和非编码DNA链的片段,所述人工基因具有40—50个碱基对的长度,备选地在它们的3′和5′末端重叠大约15个碱基。另外,样品含有2.5μl每种旁侧引物(flankingprimers)(SeqIDNo.32,SeqIDNo.33;10μM)以及5μl10×Taq缓冲液(100mMTris/HClpH9.0,500mMKCl,1%(v/v)TritonX-100),3μl25mMMgCl2,和4μldNTP混合物(dATP,dCTP,dGTP,dTTP每种2.5mM)。用H2O补足后,将反应样品在热循环仪中加热2min达到94℃进行变性。然后,在加热过程中加入2.5UTaq聚合酶(Promega)(热启动),并且开始PCR程序。温育进行25个循环,每个循环在94℃1min,55℃1min,和72℃1.5min。最后的温育在72℃进行5min。
需要的PCR产物通过分析性琼脂糖凝胶电泳的方法进行鉴定,并且使用MinEluteReactionCleanup试剂盒(Qiagen)从样品中纯化出来。将1.0ng分离的DNA用作第二次扩增的模板,第二次扩增这次使用Pfu聚合酶(Promega)进行,也是50μl的体积。为了这一目的,使用5μl提供的10×Pfu缓冲液(200mMTris/HCl,pH8.8,20mMMgCl2,100mMKCl,100mM(NH4)2SO4,1%(v/v)TritonX-100,1mg/mlBSA)以及4μldNTP混合物,并且用H2O补足。另外,样品含有旁侧引物(SeqIDNo.32,SeqIDNo.33;10μM),以引入适当的限制性位点。需要的PCR产物通过制备琼脂糖凝胶电泳方法分离,并且使用Zero PCR克隆试剂盒(Invitrogen),按照制造者的用法知道,将其插入到克隆载体 中。将提供的化学感受态细胞转化相应的连接反应样品,并且涂布到LB/amp/kan培养基的琼脂平板上。将平板在37℃温育16hrs,并且对于理想的连接产物分析生长的菌落。为了这一目的,使用Quiagen公司的质粒分离试剂盒,按照制造者的用法指导,少量制备质粒DNA,并且由于识别序列已经通过旁侧引物的方法而引入到PCR产物中,所以,使用NdeI和XhoIDNA核酸内切酶(NewEnglandBiolabs)进行限制性消化。对于表现出期望的切割模式的质粒,使用TaqDNA聚合酶在插入的基因盒区域进行DNA序列分析。对于这一目的,按照制造者的用法指导,使用CycleReaderTMAutoDNA测序试剂盒(Fermentas),以及0.5μg质粒DNA和1.0pM的每种荧光—标记的引物。在聚合酶反应过程中新合成的DNA链被标记,并且通过结合双脱氧核苷酸而统计学性地但是以碱基-特异性方式而终止。然后,通过聚丙烯酰胺—尿素凝胶电泳,将得到的荧光DNA片段在溶液测序装置中分离,并且在相邻的泳道中可见A,C,G,T的条带模式。
通过制备性NdeI/XhoI限制性消化,将具有正确的DNA序列的基因盒从克隆载体上切下,并且通过制备性琼脂糖凝胶电泳分离。将修饰的泛蛋白构架的基因分别插入到表达载体pET20B(-)(Novagen)中,以产生相应的蛋白,或者插入到质粒载体pMUBI-1中,以构建方便变体的文库。
制备泛蛋白变体文库
对于分别在合成的泛蛋白基因氨基端和羧基端的8个密码子的随机位点—特异性诱变,进行两次连续的PCR反应。第一扩增步骤使用Pfu聚合酶(Promega)在10x50μl的体积中进行。为了这一目的,每份样品使用5μl提供的10xPfu缓冲液以及4μldNTP混合物,并且用H2O补足。此外,每种样品含有2.5μl旁侧引物(SeqIDNo.34,SeqIDNo.35;10μM),以引入需要的碱基对取代。使用1.0ngpMUBI-1作为模板,其携带没有突变的合成泛蛋白基因。在加入2.5UPfu聚合酶后(参见上文),进行25个循环的温育,每个循环在94℃1min,60℃1min,和72℃1.5min。最后的温育在72℃进行5min。对于所用的模板DNA的选择性降解,每份反应样品中加入10UDpnI,并且在37℃温育1小时。需要的PCR产物通过制备性琼脂糖凝胶电泳的方法和QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)分离。
第二扩增步骤在1,000μl的样品体积中进行,其中使用在第一PCR反应中获得的大约1.0ng产物,并且使用Taq聚合酶。吸取反应样品——调整到20倍体积——如上文详细所述那样,其由下列各项组成:10xTaq缓冲液,25mMMgCl2,dNTP混合物以及旁侧引物(SeqIDNo.36,SeqIDNo.37;10μM),所述引物在它们的5′末端被生物素化,并且每一引物携带SfiI核酸内切酶的识别位点,引物之间彼此不匹配。用H2O补足之后,在加热时加入2.5UTaq聚合酶,并且起始PCR程序。进行25个循环的温育,每个循环在94℃1min,60℃1min,和72℃1.5min。最后的温育在72℃进行5min。
直接在PCR反应样品中对得到的扩增产物进行随后的切割。为了这一目的,在4,000μl的总体积中,将完全的PCR反应溶液与相应体积的提供的10x缓冲液II(100mMTris/HCl,pH7.9,100MgCl2,500mMNaCl,10mM二硫苏糖醇),10XBSA溶液和H2O混合。此外,加入4,000U限制性酶SfiI(NewEnglandBiolabs),并在50℃温育16hrs。使用MinEluteReactionCleanup试剂盒(Qiagen)将DNA从样品中分离,并且重悬在400μl无菌H2O中。为了分离没有被SfiI切割的PCR产物,将分离的DNA与等体积的“结合溶液”(Dynal)混合并且在室温(RT)下在滚筒混合器上温育4.5hrs,其中所述“结合溶液”含有使得链霉抗生物素蛋白偶联于其表面的1.0mg/ml磁珠(″DynabeadsKilobaseBinder″)。与任选地仍然存在生物素化的DNA结合的珠子被沉淀下来,而完全被SfiI切割的DNA应该不再具有生物素化的末端,并且保留在上层清液中,并且过夜被沉淀下来。将得到的由SfiI切割并且在需要位置诱变的泛蛋白基因溶解在无菌H2O中,使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)再次脱盐,并且最后在H2O中具有200fmoles/μl的浓度。
为了制备受体载体,将质粒pMUBI-1按照制造者的用法指导用莎I切割,并且通过制备性琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)的方法分离大的(载体—)片段。为了避免分子内部的连接,将其5′末端去磷酸化处理。为了这一目的,在200μl的总体积中,使用0.5U来自甲壳类动物(shrimp)的碱性磷酸酶(Pandalusborealis)以及提供的缓冲液。将混合物在37℃温育90min,将DNA用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)从样品中分离,并且再次脱盐(QIAquickPCR纯化试剂盒)。最后,载体片段的DNA在H2O中具有50fmoles/μl的浓度。
对于连接,在1,600μl(50mMTris/HCl,pH7.6,10mMMgCl2,1mMATP,1mMDTT,5%(w/v)PEG-8,000)的总体积中,将1.6pmolPCR片段和8.0pmolpMUBI-1载体片段在2UT4DNA连接酶(GibcoBRL)的存在下在16℃温育3天。在将样品加热到65℃15min后,将DNA沉淀下来。为了这一目的,将100μl的每种反应溶液与100μl的乙醇以及10μl5MNaAc,pH3.0混合,并且在-20℃保存16hrs。随后,进行离心(60min,12,500g),将样品用乙醇(70%v/v,-20℃)洗涤,再次离心,并且最后将沉淀的DNA溶解在60μl无菌H2O中。
对于电穿孔,在冷室中在4℃使用GeneII系统(Biorad)以及具有1.0mm电极间隔的杯子(Biozym)。使用3.5μl每种上述获得的溶液,按照制造者的用法指导,转化电感受态大肠杆菌XL1Blue(Stratagene)。将得到的细胞混悬液涂布在5个含有LB/氯霉素培养基的琼脂平板(20x2℃m)上。将平板在-37℃温育16hrs,并且计数生长的菌落。因此,构建的文库包括2.8x107种独立的克隆,每种克隆应该在文库中出现10,000次。然后,将菌落浮选在100ml含有10%(v/v)甘油的SOC培养基中,并且以1.0ml的等分保存在-80℃。从得到的克隆中,使用Qiagen公司出售的DNAMiniprep试剂盒从12个随机选择的克隆中分离质粒载体,并且分析在诱变的泛蛋白基因区域的DNA序列。所有这些克隆都表现出功能性序列——即,没有通过插入或删除引起的阅读框移码——以及在诱变位置上性质完全不同的取代。在诱变区之外不存在随机取代。
以这种基于人泛蛋白的文库为基础,以与实施例1相似的方法进行选择,通过本领域技术人员已知的噬菌体展示系统方法的方式进行。引入小的修饰仅仅是为了选择所用的抗生素(氯霉素而不是氨苄青霉素)。
来自半胱氨酸knot蛋白家族的生长因子作为靶点。泛蛋白AffilinTMSPU11-3-A1具有通过ELISA确定的nM范围的解离常数,并且在BIACORE系统中用于偶联研究。
使用限制性位点NdeI和XhoI,将从中选择的一种变体,SPU11-3-A1,克隆到pET20b表达载体中。培养条件和纯化方法与实施例1中所述用于SPCAffilinTM(IMAC,凝胶过滤)的培养条件和纯化方法相同。为了检测结合特性,进行浓度-依赖型ELISA。为了这一目的,将不同浓度(10nM-1μM)的AffilinTM变体应用到用靶点分子包被的微量滴定平板(MTP)上,并且将多克隆抗-泛蛋白抗血清(Sigma)用作一级检测试剂。在RT温育(1h)后,将MTP的孔用PBS洗涤3次,并且在第二步中,使用具有POD的单克隆抗体缀合物(抗-IgqSigma)作为检测抗体。发现检测的AffilinTM变体表现出与人NGF的特异性结合,并且没有检测到与BSA或与微量滴定平板的非特异性结合。作为对照的人野生型泛蛋白没有表现出与NGF、BSA或与微量滴定平板的结合。
实施例3
AffilinTM与含有半胱氨酸的肽接头的C端融合用于与不同分子选择性偶联
下述实例证明与IgGFc结合的AffilinTM变体SPC1-A7可以通过C端半胱氨酸选择性地与不同分子偶联。
除了位于蛋白内部的7个半胱氨酸之外,所用的AffilinTM变体SPC1-A7已经在可变位置4携带溶液—可及的并且因此是游离的半胱氨酸。这首先应用QuickPCR用丝氨酸取代。用这种修饰的AffilinTM(SPC1-A7BB)起始,除了已经存在的6个组氨酸外,2个甘氨酸和1个半胱氨酸以及4个其它的组氨酸通过QuickPCR方法插入到C端。亲和标记延长到10个组氨酸的目的是可以进行提高的纯化。使用Ellmann′s试剂的滴定实验表明,由于与在AffilinTM变体中存在的其它半胱氨酸的半胱氨酸改组(shuffling)事件,引入的半胱氨酸不适于偶联实验。由于这一原因,所述半胱氨酸在DNA水平上被丝氨酸(TCT)取代,并且从这一构建体开始,在Gly4Ser接头后引入新的半胱氨酸。这起到加大插入的半胱氨酸与蛋白中半胱氨酸的距离并且抑制半胱氨酸改组的作用。最后,将得到的构建体测序,并且使用Ellmann′s试剂的滴定实验表明它适用于偶联实验。
对于在AffilinTM变体SPC1-A7中位置4用丝氨酸取代半胱氨酸,使用QuickPCR方法(Stratagen,LaJolla,USA),其使用引物A7Cys4Ser_for和A7Cys4Ser_rev。对于PCR反应,使用5μl10x反应缓冲液(100mMKCl,100mM(NH4)2SO4,200mMTris-HCl,pH8.8,20mMMgSO4,1%X-100,1mg/mlBSA),125ng两种引物的每种,1μlPfuTurboDNA聚合酶,1μldNTP混合物和H2O,达到总体积50μl。在pET20b载体中的AffilinTM变体SPC1-A7的基因作为模板DNA。反应以在95℃3min的变性步骤起始,之后是18个重复循环的变性、引物退火和合成。在95℃的变性进行30sec,引物退火在60℃进行1min。合成步骤的持续为在68℃5min。在PCR末期,进行在68℃5min的最后合成。扩增通过琼脂糖凝胶电泳监测。在成功扩增后,通过限制性酶DpnI进行对所用的模板DNA的限制性消化。将1μl所述酶(10U/μl)吸入到PCR样品中,混合并且在37℃温育1h。然后通过电穿孔方法将载体引入到感受态菌株(Xl-1blue,Stratagene)中。为了这一目的,将在冰上的1μlDpnI-处理的限制性样品吸入到50μl电感受态XL-1blue细胞中,混合并且在2.5kV,25μF和200Ω在冰冷的电穿孔杯(0.1mm)中进行脉冲。将细胞重悬在1mlSOC培养基中,并且在500rpm的摇动下在37℃培养60min。然后,将细胞涂布到选择培养基(2xYt100μg/ml氨苄青霉素)上,并且在37℃培养16h。将12个得到的克隆分别用pETTerm引物测序以检验正确的插入。将正确的克隆的载体用作下一次PCR的模板DNA,其中在C端引入1个半胱氨酸和4个另外的组氨酸。如上文所述,进行使用引物A7Gly2Cys_for和A7Gly2Cys_rev的QuickPCR,随后进行DpnI消化,并且通过电穿孔方法转化XL1-Blue菌株。为了控制正确的引入,再一次测序12个克隆。将正确克隆的质粒(SPC-1-A7JJ)引入到携带质粒pUBS520的BL21表达菌株中,以便随后表达并且在两步层析步骤(在Ni-NTA上的亲和层析和在交联葡聚糖75上的凝胶过滤)中纯化AffilinTM变体SPC1-A7BB,如上文所述那样(实施例1)。
为了检验引入的半胱氨酸残基的可及性(Haber,1972),所有的游离SH基团应该通过Ellmann′s试剂(DTNB溶液)的方法进行滴定。为了这一目的,向1mlAffilinTM变体SPC1-A7JJ的蛋白溶液(50-350μg蛋白,在100mMTris/HCl;pH8.0中)加入30μlDTNB溶液(4mg/mlDTNB,在100mMTris/HCl;pH8.0中)。1ml蛋白溶液和30μl缓冲液(100mMTris/HCl;pH8.0)作为空白值1。1ml缓冲液(100mMTris/HCl;pH8.0)和30μlDTNB溶液作为空白值2。将样品在室温下温育15min,并且测定在410nm处的吸收。从测试样品的吸收中减去空白值1和2的吸收。使用DTNB-SH的消光系数(ε410[DTNB-SH]=13,600M-1cm-1)从得到的吸收值计算游离SH基团的摩尔浓度,并且除以所用的蛋白浓度。结果得到每个蛋白分子游离的硫醇基团数目。游离的半胱氨酸残基可以在构建的AffilinTM变体SPC1-A7JJ3—4中进行滴定。由于使用AffilinTM变体SPC-1-A7Cys4Ser滴定的对照表明蛋白中存在的半胱氨酸是不可及的,所以预计有1个游离的半胱氨酸。这表明引入的C端半胱氨酸与包埋在蛋白内的半胱氨酸的半胱氨酸改组,并且因此表明引入的半胱氨酸与蛋白的距离太短。由于这一原因,如上文所述,使用引物A7Gly2Ser_for和A7Gly2Serrev,在QuickPCR中将AffilinTM变体SPC-1-A7JJ的C端半胱氨酸用丝氨酸取代。在检验了正确的引入之后,这一构建体作为PCR模板以引入其后接着半胱氨酸的Gly4Ser-接头。PCR使用引物Gly4SerCys_HindIII和A7Cys4Ser_Nde进行。对于PCR反应,使用5μl10x反应缓冲液(100mMKCl,100mM(NH4)2SO4,200mMTris-HCl,pH8.8,20mMMgSO4,1%X-100,1mg/mlBSA),125ng两种引物的每一种,1μlPfuTurboDNA聚合酶,1μldNTP混合物和H2O,达到总体积50μl。此外,向反应混合物中加入2μlDMSO,以分解引物的二级结构。与上述步骤相反,在不同的引物退火温度58℃进行25个重复步骤的变性、引物退火和合成。这一AffilinTM变体(SPC1-A7_Cys)的PCR产物的扩增通过琼脂糖凝胶电泳的方法进行检验。表2给出本文所述的构建体的概述(表2)。引物A7Cys4Ser_Nde含有酶NdeI的结合的限制性位点,并且引物Gly4SerCys_HindIII含有酶HindIII的位点,由此可以在其纯化和通过这两种酶限制性消化后将PCR产物连接到也用NdeI和HindIII处理的载体pET20b中。这两种酶的限制性消化以双消化的方式同时进行。对于这一目的,将大约1μgAfffilinTM变体SPC1-A7_Cys的PCR产物或1μg的载体pET20b分别与1μl限制性酶NdeI(NewEnglandBiolabs,FrankfurtamMain,Germany,20U/μl)和1μl限制性酶HindIII(NewEnglandBiolabs,FrankfurtamMain,Germany,20U/μl)以及10μl10x反应缓冲液NEB缓冲液2(50mMNaCl,10mMTris-HCl,pH7.9,10mMMgCl2,1mMDTT)在100μl的总体积中在37℃温育4h。将得到的片段分别通过制备性琼脂糖凝胶电泳进行纯化。对于连接,在20μl的总体积中,使用20ng纯化的NdeI/HindIII处理的载体pET20b片段,和120ng相似处理的AffilinTM变体SPC1-A7Cys的片段,以及2μl10x反应缓冲液(300mMTris-HCl,pH7.8,100mMMgCl2,100mMDTt10mMATP)和0.5μlT4DNA连接酶(Promega,Mannheim,Germany,1—3U/μi)。将反应样品在16℃温育16h,并且如上文所述,将得到的载体通过的电穿孔引入到XL-1blue细胞中。在转化后通过用引物pETTerm测序检验12个克隆的所述基因的正确引入。随后,将大肠杆菌细胞(BL21(DE3),+pUBS520)用具有正确序列的载体AffilinTM变体SPC1-A7_Cys转化。在如上文所述,表达并且纯化AffilinTM变体SPC1-A7(实施例1)后,对于AffilinTM变体SPC1-A7_Cys,通过上文所述的Ellmann′s试剂方法再次滴定游离的半胱氨酸残基。如预计的那样,只可能检测到1个半胱氨酸残基,这证实在与蛋白充分的距离处成功引入了溶剂可及的C端半胱氨酸,以用于与适当的伴侣偶联(表1)。单一可及半胱氨酸的这种检测是AffilinTM与适当的偶联伴侣和基质的选择性偶联的基础。
为了提供具有1个C端半胱氨酸的AffilinTMSPU11-3-A1,将SPU11-3-A1基因通过NcoI和XhoI限制性位点克隆到为AffilinTMSPC1-A7修饰的pET20b中(参见上文)。AffilinTMSPU11-3-A1_Cys的表达和纯化与SPC1-A7_Cys的步骤相同。
实施例4
分脚接头(C端半胱氨酸)修饰的AffilinTM变体SPC1-A7_Cys的结合特性
在浓度—依赖型ELISA中检测在实施例3中纯化的AffilinTMSPC1-A7_Cys的结合特性。为了这一目的,将NUNC平板的孔用100μl抗原溶液(10μg/ml人单克隆IgGFc片段,Roche)在4℃包被过夜。第二天,将ELISA平板用PBS(3%BSA,0.5%吐温20)在室温下封闭2h。在将孔用PBS(0.1%吐温20)洗涤后,将修饰的AffilinTM以浓度—依赖性方式(浓度范围10μM-0μM)加入,并且在RT温育1h。在将孔用PBS(0.1%吐温20)再次洗涤后,以1:1000的稀释应用单克隆抗-hGC抗体(POD-缀合的;Biogenes,Berlin)(50μl/孔),并且再在RT下温育1h。然后,将孔用PBS(0.1吐温20)洗涤3次,用PBS洗涤3次,并且用TMBPlus(Kementec,DK)开始颜色反应(50μl/孔)。在室温下温育20分钟后,加入0.2MH2SO4(50μl/孔)终止颜色反应。得到的黄色在450nm处读取(参考波长:620nm)并且记录下来。(图4)测定值的评估表明233nM的表观KD值,其大致等于未修饰的AffilinTMSPC1-A7和SPC1-A7BB(280nM)。因此,用包括半胱氨酸的肽接头对AffilinTMSPC1-A7进行C端修饰对于所述变体的结合能力没有影响。
实施例5
IgG-结合的AffilinTMSPC1-A7Cys与藻红蛋白(PE)的选择性偶联
结合IgG的AffilinTMSPC1-A7Cys与活化的PE的偶联进行如下:
将1mg/ml的SPC1-A7Cys(在PBS)中在室温下用10mMDTT还原30min。在还原期间,将PD-10柱(AmershamBiosciences)用5个柱体积的PBS润洗。在还原进行之后,将反应混合物上样到平衡的PD-10柱上,以便分离过剩的DTT。将以这种方法还原的SPC1-A7_Cys以5:1的摩尔比加入顺丁烯二酰亚胺-活化的藻红蛋白(Prozyme),并且在轻微的摇动下在室温温育1h。然后,通过加入NEM(N-乙基顺丁烯二酰亚胺),将AffilinTM没有反应的巯基基团在RT封闭20min。随后,将反应混合物通过凝胶过滤(SephadexS-200HR)的方法纯化,并且将相应的级分组合在一起并保存在4℃。分光光度法进行缀合物的分析。为了这一目的,检测在250-750nm范围的吸收光谱,并且分别通过确定的或提供的消光系数确定PE和AffilinTM的浓度。将得到的AffilinTMSPC1-A7_Cys和PE(SPC1-A7CysPE)缀合物在BIACORE中检测其与IgGFc的结合特性。为了这一目的,在30μl/min的连续流下并且使用HBS-EP作为运行缓冲液,使用与IgGFc偶联的CM5芯片。将不同浓度的SPC1-A7_Cys_PE相继流过所述芯片,并且用BIACORE评估软件分析得到的传感图。发现通过偶联得到亲和作用,其导致宏观解离常数从KD=10-7M下降到KD=10-8M(图5)。
实施例6
荧光染料556与IgG-结合的AffilinTMSPC1-A7BB的非特异性偶联
荧光染料556(MolecularProbes)与IgG-结合的AffilinTMSPC1-A7BB偶联(无游离半胱氨酸!),并且进行关于结合的检验。
偶联步骤进行如下:将在10mM磷酸缓冲液(pH8.5)中的1mg/mlSPC1-A7BB以1:2的摩尔比加入荧光染料556(溶解在20μl干DMF中),并且在RT温育30min。偶联反应通过加入1体积的10%甘油溶液终止,并且将样品通过PD-10柱进行纯化。然后,偶联的程度通过分光光度法定量。为了这一目的,缀合物的浓度通过280nm处的吸收而确定,并且用提供的校正因子(MolecularProbes)校正。然后,偶联程度从556和缀合物浓度的商获得,并且可以确定为1摩尔AffilinTM/0.8摩尔556。得到的缀合物的结合能力的分析通过浓度—依赖型ELISA(如在实施例1中进行的那样)以及通过Biacore检测(图6)进行。发现在与荧光染料偶联后,AffilinTMSPC1-A7BB的结合能力没有受到影响。
实施例7
辣根过氧化物酶(POD)与IgG-结合的AffilinTMSPC1J7BB的非特异性偶联
AffilinTM变体SPC1-A7BB可以与POD酶非特异性地偶联,并且结合研究表明AffilinTM的结合活性和POD的酶促活性得到保留。所述缀合物按照下述流程制备:
将5mg冻干的辣根过氧化物酶(POD,Sigma)溶解在250μl纯水中,加入37,5μl0,1M的高碘酸钠溶液,并且在20℃温育10min。然后,加入25μl乙二醇并且在20℃进一步温育5min。将过氧化物酶通过凝胶过滤(G25,NAP-5柱)针对纯水进行透析。
将250μl纯化的AffilinTMSPC1-A7BB(IMAC,凝胶过滤,4mg/mlPBS)加入100μl0.1M的碳酸缓冲液(pH9.6),并且加入1mg活化的过氧化物酶(Sigma)(约100μl)。将偶联混合物在20℃在摇动下温育2h。然后,每ml偶联混合物中加入10μl0.5M的氢硼化钠,简单混合并且在4℃不搅动再温育2h。使用G25柱将反应样品针对PBS进行缓冲。加入乙基汞硫代水杨酸钠(Roth),0,1%用于保存。所述缀合物与人IgG的结合活性的研究进行如下:
将标记的AffilinTM稀释在PBS(0.5%BSA,0.05%吐温20,0.01%乙基汞硫代水杨酸钠)中,并且将溶液应用到用人IgG(10μg/ml,100μl/ml)包被的微量滴定平板上。在室温下温育时间是1h。然后,将孔每次用250μlPBS(0.1%吐温20,0.01%乙基汞硫代水杨酸钠)洗涤3次,并且在室温下再用100μlTMB温育10-20min。通过加入100μl0.5M的硫酸而终止反应。在微量滴定平板光度计中测定吸收(450nm相对620nm作为参考)(图7)。直到反应样品1:10,000稀释还可以检测到POD活性,这表明POD与SPC1-A7BB的成功偶联。通过对照检测排除了未偶联的POD干扰信号。
实施例8
基于γ-II-晶体蛋白和泛蛋白的AffilinTM与基质的特异性和非特异性偶联
AffilinTM与基质的偶联可以通过下述方法获得:
1.)AffilinTMSPU3-A1_Cys通过C端半胱氨酸与葡聚糖基质偶联,2.)AffilinTMSPC7-E9通过一级氨基基团与BIACORE系统的葡聚糖基质偶联,和3.)AffilinTMSPC7-E9通过EDC/NHS方式与聚甲基丙烯酸酯基质非特异性偶联。
1.)SPU3-A1_Cys与BIACORE系统的葡聚糖基质的偶联通过引物的C端半胱氨酸而选择性地进行。为了这一目的,在2min的接触时间内将葡聚糖基质的羧基基团用NHS/EDC活化,并且随后加入硫醇偶联剂PDEA(2-(2-吡啶基二硫代)乙酰胺(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine),在0,1M硼酸缓冲液pH8.5中)。在4min的反应时间后,将纯化的SPU3-A1_Cys(在20mM磷酸缓冲液中,pH6.0)加入到以这种方式修饰的葡聚糖芯片中,并且反应继续进行7min。未反应的PDEA基团的灭活使用50mML-半胱氨酸(1MNaCl)进行4min。使用这种方法,350个单位(RU)的SPU3-A1_Cys可以固定在芯片中,并且用于进一步的动力学分析。动力学检测后,将芯片用0.1甘氨酸(pH2.2),6MGua/HCl,6M尿素和20%乙醇进行再生。在这种方法中,即使在20一30个再生循环后,AffilinTM芯片的结合能力仍然没有改变(图8)。
2.)此外,SPC7-E9可以以下述方式通过NHS/EDC方法经由暴露于表面的氨基(赖氨酸)与BIACORE葡聚糖基质的羧基非特异性地偶联:将CM5芯片用NHS/EDC活化7min,然后再将纯化的SPC7-E9(在20mM磷酸钠缓冲液中,pH6.0)流过所述芯片7min。在进行偶联之后,用1M的乙醇胺(pH8.5)将剩余的活性基团灭活7min。为了分析靶点的解离常数,将proNGF以不同浓度流过所述芯片,在线监测结合(图9),并且随后,使用BiaEvaluation软件评估曲线。在这种方法中,KD值可以确定为1.4nM。在动力学检测之后,将芯片用0.1甘氨酸(pH2.2),10mMHCl,10mMNaOH,6MGua/HCl,6M尿素和20%乙醇进行再生。在这种方法中,即使在一些再生循环之后,AffilinTM芯片的结合活性仍然没有改变。
3.)将纯化的SPC7-E9蛋白(4mg)在PD-10柱(Amersham)上缓冲到0,1M硼酸缓冲液(0.5MNa2SO4,pH9)中,并且偶联到EMDEpoxy(M)上。为了这一目的,将凝胶(0.5g)在RT在0,1M硼酸缓冲液(0.5MNa2SO4,pH9)中温育2h,然后用这种缓冲液洗涤几次。偶联反应通过向epoxy基质中加入SPC7-E9而起始,并且在连续的搅动下在RT温育24h。没有SPC7-E9的参照柱作为对照,并且以相同的方法处理。通过RT下1M乙醇胺(pH9.5)处理48h而终止反应,并且将凝胶基质用乙酸钠缓冲液(0.1M,pH4.0),1MNaCl和PBS(每次50个柱体积)洗涤。将以这种方式生成的AffilinTMSPC7-E9亲和基质填满C柱(AmershamBiosciences,1x10cm),并且连接到层析系统(Explorer,AmershamBiosciences)。在所有的情形中,流速1ml/min的PBS(0.5mMEDTA)用作运行缓冲液。为了检验以这种方法生成的AffilinTM柱的结合能力,应用纯化的proNGF。在用10—20个柱体积的运行缓冲液润洗所述柱后,用0.1M甘氨酸(pH2.2)洗脱结合的proNGF(图10)。此外,可以从与BSA的物质混合物和从大肠杆菌粗提取物中分离proNGF。为了这一目的,将1mlBSA溶液(5mg/ml,Sigma)与0.5mlproNGF(1.3mg/ml)混合,并且应用到AffilinTM柱上。在用20个柱体积的运行缓冲液润洗所述柱后,用甘氨酸(0.1M,pH2.2)洗脱结合的proNGF。此外,在用10个柱体积的6MGua/HCl将柱再生后,将1ml大肠杆菌粗提取物(50mlB121过夜培养物的细菌沉淀的细胞分解(溶菌酶/benzonase/超声)后的可溶上层清液)和0.5mlproNGF(1.3mg/ml)的混合物应用到AffilinTM柱上。在用20个柱体积的运行缓冲液润洗所述柱后,也用甘氨酸(0.1M,pH2.2)洗脱结合的proNGF。随后将柱用0.1M甘氨酸(pH2.2),10mMHCl,10mMNaOH,6MGua/HCl,6M尿素和20%乙醇进行再生。通过凝胶电泳的方法分析来自从BSA和大肠杆菌提取物的分离物的洗脱级分(图11)。在10次检测运行后,可以观察到proNGF与SPC7-E9柱的未改变的结合。
表2:
SPC-1-A7
5′-ATGGGTCTGATCTGTCTCGAGCACCACCACCACCACCAC-3′
SPC-1-A7BB
5′-ATGGGTCTGATCTCTCTCGAGCACCACCACCACCACCAC-3′
SPC-1-A7JJ
5-ATGGGTCTGATCTCTCTCGAGTGCGGCGGCCATCACCATCACCACCACCACCACCACCAC-3′
SPC-1-A7_Cys
5-ATGGGTCTGATCTCTCTCGAGTCCGGCGGCGGGGGGGGAGGATCTTGCCATCACCATCACCACCACCACCACCACCAC
人γ-II-晶体蛋白文库的DN序列
CR20(SEQIDNO:1)
ATGGGTNNKATCNNKTTCNNKGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGT
NNKTACNNKTGCNNKACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCT
CCCGTTGCAACTCCATCNNKGTTNNKTCCGGTTGCTGGATGATCTA
CGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCGTCACCAGTACTTCCTGCGG
CGTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGAC
TCCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAG
AATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGA
GCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACT
GAAATT
CACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGC
CCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACA
GGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCT
TAGACGAGTCATGGATTTGTACGCG
基于γ-II-晶体蛋白的AffilinTM的DNA-序列
SPC1-A1(SEQIDNO:2)
ATGGGTTTTATCTGGTTCATGGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTA
GGTACGATTGCGGTACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTC
CCGTTGCAACTCCATCAAGGTTAAGTCCGGTTGCTGGATGATCTAC
GAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCGTCACCAGTACTTCCTGCGGC
GTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACT
CCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAG
AATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGA
GCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACT
GAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATG
AGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGG
AGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGG
CTCTCTTAGACGAGTCATGGATTTGTACGCG
SPC1-A7(SEQIDNO:3)
ATGGGTCTGATCTGTTTCTCTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTA
GGTACATGTGCCTGACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTC
CCGTTGCAACTCCATCAATGTTTGGTCCGGTTGCTGGATGATCTAC
GAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCGTCACCAGTACTTCCTGCGGC
GTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACT
CCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAG
AATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGA
GCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACT
GAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATG
AGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGG
AGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGG
CTCTCTTAGACGAGTCATGGATTTGTACGCG
SPC1-G3(SEQIDNO:4)
ATGGGTTCTATCATTTTCCTTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTAT
TTACGGTTGCACTACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCC
CGTTGCAACTCCATCGTGGTTCAGTCCGGTTGCTGGATGATCTACG
AACGTCCGAACTACCAGGGTCACCGTCACCAGTACTTCCTGCGGCG
TGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTC
CATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGA
ATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAG
CTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTG
AAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGA
GATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGA
GTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGC
TCTCTTAGACGAGTCATGGATTTGTACGCG
SPC1-A7BB(SEQIDNO:5)
ATGGGTCTGATCTCTTTCTCTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTA
GGTACATGTGCCTGACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTC
CCGTTGCAACTCCATCAATGTTTGGTCCGGTTGCTGGATGATCTAC
GAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCAGTACTTCCTGCGGCGTGGG
GAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCC
GCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAA
GATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCAC
AGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATT
CACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGC
CCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACA
GGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCT
TAGACGAGTCATGGATTTGTACCTCGAGCACCACCACCACCACCAC
SPC1-A7JJ(包括His10)(SEQIDNO:6)
ATGGGTCTGATCTCTTTCTCTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTA
GGTACATGTGCCTGACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTC
CCGTTGCAACTCCATCAATGTTTGGTCCGGTTGCTGGATGATCTAC
GAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCAGTACTTCCTGCGGCGTGGG
GAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCC
GCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAA
GATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCAC
AGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGTTCCACCTCACTGAAATT
CACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGC
CCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACA
GGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCT
TAGACGAGTCATGGATTTGTACCTCGAGTGCGGCGGCCATCACCAT
CACCACCACCACCACCACCAC
SPC1-A7_Cys(包括His10)(SEQIDNO:7)
ATGGGTCTGATCTCTTTCTCTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTA
GGTACATGTGCCTGACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTC
CCGTTGCAACTCCATCAATGTTTGGTCCGGTTGCTGGATGATCTAC
GAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCAGTACTTCCTGCGGCGTGGG
GAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCC
GCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAA
GATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCAC
AGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATT
CACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGC
CCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACA
GGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCT
TAGACGAGTCATGGATTTGTACCTCGAGTCCGGCGGCGGGGGGGG
AGGATCTTGCCATCACCATCACCACCACCACCACCACCAC
SPC7-E9(包括His6)(SEQIDNO:8)
ATGGGTTTTATCTGTTTCTTGGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTTC
TTACGCTTGCGATACTGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCC
CGTTGCAACTCCATCAGTGTTCTGTCCGGTTGCTGGATGATCTACG
AACGTCCGAACTACCAGGGTCACCAGTACTTCCTGCGGCGTGGGG
AGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCG
CTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAG
ATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACA
GACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTC
ACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCC
CAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTgCTGAGGCCGGGGGAGTACAG
GAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTT
AGACGAGTCATGGATTTGTACCTCGAGCACCACCACCACCACCAC
人泛蛋白文库的DNA序列
泛蛋白野生型(SEQIDNO:9)
ATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACCGGCAAGACCATCACTCTGG
AGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAAAATGTGAAGGCCAAGATCC
AAGATAAAGAAGGCATTCCCCCCGACCAGCAGAGGCTCATCTTTG
CAGGCAAGCAGCTGGAAGATGGCCGCACTCTTTCTGACTACAACAT
CCAGAAAGAGTCGACCCTGCACCTGGTCCTCCGCCTGAGGGGCGG
C
修饰的泛蛋白(MUBI)(SEQIDNO:10)
ATGCAAATCTTCGTTAAAACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGG
AGGTAGAACCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCC
AAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCTAGCTTTCG
CAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGACTACAACA
TCCAAAAAGAATCCACCCTCCACCTGGCACTCCTCCTGCGGGCC
UB10(文库)(SEQIDNO:11)
ATGNNKATCNNKGTTNNKACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTG
GAGGTAGAACCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATC
CAAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCTAGCTTTC
GCAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGACTACAAC
ATCNNKNNKNNKNNKNNKCTCCACCTGGCACTCCTCCTGCGGGCC
基于泛蛋白的AffilinTM的DNA序列
SPU11-3-A1(包括His6)(SEQIDNO:12)
ATGCGGATCCGTGTTGCTACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGG
AGGTAGAACCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCC
AAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCTAGCTTTCG
CAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGACTACGACA
TCCGTCATGGTACGTCGCTCCACCTGGCACTCCTCCTGCGGGCCCT
CGAGCACCACCACCACCACCAC
SPU11-3-A1_Cys(包括His10)(SEQIDNO:13)
ATGCGGATCCGTGTTGCTACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGG
AGGTAGAACCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCC
AAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCTAGCTTTCG
CAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGACTACGACA
TCCGTCATGGTACGTCGCTCCACCTGGCACTCCTCCTGCGGGCCCT
CGAGTCCGGCGGCGGGGGGGGAGGATCTTGCCATCACCATCACCA
CCACCACCACCACCAC
引物
pCAN700(5’-CCATGATTACGCCAAGCTTTGGAGCC-3’)(SEQIDNO:14)
A7Cys4Ser_for(5’-CCATGGGTCTGATCTCTTTCTCTGAAGACCG-3’)(SEQIDNO:15)
A7Cys4Ser_rev(5’-CGGTCTTCAGAGAAAGAGATCAGACCCATGG-3’)(SEQIDNO:16)
pETTerm(5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGC-3’)(SEQIDNO:17)
A7Gly2Cys_for(5’-GGATTTGTACCTCGAGTGCGGCGGCCATCACCATCACCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGC-3’)(SEQIDNO:18)
A7Gly2Cys_rev(5’-GCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGATGGTGATGGCCGCCGCACTCGAGGTACAAATCC-3’)(SEQIDNO:19)
A7Gly2Ser_for(5’-GGATTTGTACCTCGAGTCCGGCGGCCATCACC-3’)(SEQIDNO:20)和A7Gly2Serrev(5’-GGTGATGGCCGCCGGACTCGAGGTACAAATCC-3’)(SEQIDNO:21)
A7Gly2Ser_rev(5’-GGTGATGGCCGCCGGACTCGAGGTACAAATCC-3’)(SEQIDNO:22)
Gly4SerCys_HindIII(5’-GGGGGAAGCTTTTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGATGGTGATGGCAAGAT-3’)(SEQIDNO:23)
A7Cys4Ser_Nde(5’-GGAGATATACAATATGGGTCTGATCTCTTTCTCTG-3’)(SEQIDNO:24)
SEQIDNO:25:
ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTAT
TACTCGCGGCCCAGCCGGCC60
ATGGCCATGCAAATCTTCGTTAAAACCCTGACGGGAAAGA
CTATCACCCTGGAGGTAGAA120
CCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCCAAG
ACAAAGAAGGAATTCCACCT180
GACCAGCAACGCCTAGCTTTCGCAGGACGACAACTAGAGG
ACGGGCTCACCCTGTCTGAC240
TACAACATCCAAAAAGAATCCACCCTCCACCTGGCACTCC
TCCTGCGGGCC291
SEQIDNO:26
ATGCAAATCTTCGTTAAAACCCTGACGGGAAAGACTATCA
CCCTGGAGGT50
SEQIDNO:27
GGATTTTAGCTTTGACATTTTCGATGGTGTCGGACGGTTC
TACCTCCAGGGTG53
SEQIDNO:28
GTCAAAGCTAAAATCCAAGACAAAGAAGGAATTCCACCTG
ACCAGCAACGCCT53
SEQIDNO:29
GGGTGAGCCCGTCCTCTAGTTGTCGTCCTGCGAAAGCTAG
GCGTTGCTGG50
SEQIDNO:30
GACGGGCTCACCCTGTCTGACTACAACATCCAAAAAGAAT
CCACCCTCCA50
SEQIDNO:31
GAGTGCTCGCAGCAGGAGTGCCAGGTGGAGGGTGGATTC
39
SEQIDNO:32
GATATACATATGCAAATCTTCG22
SEQIDNO:33
GTGGTGCTCGAGTGCTCG18
SEQIDNO:34
CCAGCCGGCCATGGCCATGNNKATCNNKGTTNNKACCCTG
ACGGGAAAGACTATC55
SEQIDNO:35
CAGGAGGAGTGCCAGGTGGAGMNNMNNMNNMNNMNNGATG
TTGTAGTCAGACAGG55
SEQIDNO:36
GTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCATG
34
SEQIDNO:37
GAGTTTTTGTTCGGCCTCGAGGGCCCGCAGGAGGAGTGCC
AGGTGGAG48
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<170>PatentInversion3.3
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<213>人工的
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<223>人γ-II-晶体蛋白文库-CR20的DNA序列
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<223>基于γ-II-晶体蛋白的Affilin-SPC1-A7的DNA序列
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<212>DNA
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<223>基于γ-II-晶体蛋白的Affilin-SPC1-G3的DNA序列
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<212>DNA
<213>人工的
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<223>基于γ-II-晶体蛋白的Affilin-SPC1-A7BB的DNA序列
<400>5
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<223>基于γ-II-晶体蛋白的Affilin-SPC1-A7JJ的DNA序列
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<212>DNA
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<223>基于γ-II-晶体蛋白的Affilin-SPC1-A7-Cys的DNA序列
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<212>DNA
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<223>基于γ-II-晶体蛋白的Affilin-SPC7-E9的DNA序列
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<212>DNA
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<211>32
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<220>
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Claims (19)
1.制备缀合物的方法,所述缀合物包括下述成分:
一种或多种基于人泛蛋白的多肽分子(I),每种分子具有新产生的与配体特异性结合的结合特性,和共价地与其连接的
一种或多种功能成分(II),其选自由下列各项组成的组:多肽、肽、蛋白、有机聚合物、脂质、糖、低分子量物质、以及这些物质的衍生物,
其中在(I)与(II)偶联后,所有成分的功能性得到保留,
并且其中所述方法包括下述步骤:
a)选择要被修饰的多肽分子,其中所述多肽分子是人泛蛋白;
b)确定配体,其中所述配体选自多肽、肽或蛋白;
c)选择人泛蛋白的氨基酸2,4,6,62,63,64,65和66;
d)通过取代修饰所选氨基酸,同时保留泛蛋白样折叠基序;
e)将所修饰的人泛蛋白与在步骤b)中确定的配体相接触;
f)检测适于与步骤b)中预先确定的配体的特异性结合的那些修饰的人泛蛋白,与相应的野生型泛蛋白相比,其对于形成的复合物解离常数KD=10-6M-10-12M;
g)在意欲与配体特异性结合的多肽分子(I)的β折叠的表面-暴露区之外的区域偶联成分(I)和(II),所述偶联通过与(I)融合的其它末端肽中的氨基酸残基进行,所述其它末端肽含有一个或多个半胱氨酸残基或者一个或多个赖氨酸残基,或其中(I)与(II)的偶联通过(I)的半胱氨酸或赖氨酸进行;
h)分离缀合物;和
i)确定成分(I)和(II)的功能性。
2.按照权利要求1的制备缀合物的方法,其中成分(I)和(II)的偶联通过泛蛋白分子的赖氨酸残基11、29、33或48进行。
3.按照权利要求2的制备缀合物的方法,其中与(I)融合的其它末端肽含有一个或多个半胱氨酸残基或者一个或多个赖氨酸残基,其中这些氨基酸残基不参与(I)与配体的相互作用。
4.按照权利要求1的制备缀合物的方法,其中所述功能成分(II)是蛋白生色团、酶、免疫球蛋白、免疫球蛋白衍生物、毒素或按照I的多肽。
5.按照权利要求1的制备缀合物的方法,其中所述功能成分(II)是聚合物,所述聚合物选自葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、琼脂糖凝胶、琼脂糖、聚乙烯、聚苯乙烯、硅胶、纤维素或聚乙二醇、或聚合物衍生物。
6.按照权利要求1的制备缀合物的方法,其中所述功能成分(II)是低分子量物质,所述低分子量物质选自染料、生物素、洋地黄毒苷、重金属、螯合剂、放射性同位素、抗生素或细胞毒性物质。
7.按照权利要求1的制备缀合物的方法,其中所述成分(I)表现出新产生的关于与配体特异性结合的结合特性,所述配体是多肽或蛋白,所述多肽或蛋白选自免疫球蛋白及免疫球蛋白衍生物,获得于血浆的蛋白,血液凝固因子和抑制剂,生长因子,白介素,细胞因子,受体蛋白,糖蛋白,病毒蛋白和细胞表面标记。
8.按照权利要求7的制备缀合物的方法,其中所述细胞表面标记是CD14、CD25、CD34。
9.按照权利要求1的制备缀合物的方法,其中所述成分(I)表现出新产生的关于与配体特异性结合的结合特性,所述配体是肽,所述肽选自亲和标记或病毒源性的肽。
10.按照权利要求9的制备缀合物的方法,其中所述亲和标记是S-标记,T7-标记,His-标记,Strep-标记,Myc-标记或FLAG-标记。
11.按照权利要求1的制备缀合物的方法,其中所述成分(II)是一种或多种基于泛蛋白的多肽,其与(I)相同并且共价与(I)连接,从而由于亲和作用实现针对(I)的配体的亲和性的增加。
12.按照权利要求1的制备缀合物的方法,其中所述成分(II)是多肽、蛋白或聚合物,成分(I)与其共价连接几次,从而由于亲和作用实现针对(I)的配体的亲和性的增加。
13.按照权利要求1的制备缀合物的方法,其中所述成分(II)是多肽或聚合物,在与成分(I)共价连接后,其与这一类型的其它缀合物共价或非共价结合,从而由于亲和作用实现针对(I)的配体的亲和性的增加。
14.可以按照权利要求1-13的方法制备的缀合物。
15.按照权利要求14的缀合物,其包括下述成分:
一种或多种基于人泛蛋白的多肽分子(I),与相应的野生型多肽相比,每种分子具有新产生的与选自多肽、肽或蛋白的配体特异性结合的结合特性,其对于形成的复合物解离常数KD=10-6M-10-12M,和共价地与其连接的
一种或多种功能成分(II),其选自由下列各项组成的组:多肽、肽、蛋白、有机聚合物、脂质、糖、低分子量物质、以及这些物质的衍生物,
其中在(I)与(II)偶联后,所有成分的功能性得到保留,
其中与野生型多肽相比较新产生的结合特性是基于多肽分子(I)位置2,4,6,62,63,64,65和66中的氨基酸取代,并且
其中(I)与(II)的偶联在意欲与配体特异性结合的多肽分子(I)的β折叠的表面-暴露区之外的区域进行,并且
其中(I)与(II)的偶联通过与(I)融合的其它末端肽中的氨基酸残基进行,所述其它末端肽含有一个或多个半胱氨酸残基或者一个或多个赖氨酸残基,或其中(I)与(II)的偶联通过(I)的半胱氨酸或赖氨酸进行。
16.一种诊断试剂盒,其含有按照权利要求14或15中一项或多项的缀合物。
17.一种药物组合物,其包括按照权利要求14或15中一项或多项的缀合物和药用载体。
18.一种用于亲和富集的组合物,其包括按照权利要求14或15中一项或多项的缀合物,其中所述功能成分是膜、聚合物珠子或层析支持物质。
19.按照权利要求14或15的缀合物在制备用于诊断、治疗和亲和层析的诊断试剂盒、药物组合物或试剂中的应用。
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