CN101080628B - 用于微晶晶体学的样品支架 - Google Patents

Abstract

通过使用具有被施加的曲率的、有图形的聚酰亚胺薄膜(12)、并将该薄膜附加于小金属杆(16)的弯曲外表面为X射线晶体学备制用于安装生物大分子的微晶体的试样支架。有图形的薄膜(12)较佳地包括用于保持晶体的锥形末端(24)。较佳地，在该薄膜内设置用于接纳晶体的小试样孔。还可提供通过排液通道连接于试样孔的一第二较大的孔，允许排除过多的液体和在粘性溶性中较容易的操作。施加于薄膜(12)的曲率增加了薄膜的刚度和允许用于取出晶体的方便的勺状作用。聚酰亚胺最少地影响本底和吸收，并可被处理成得到所需的疏水性或亲水性。

Description

用于微晶晶体学的样品支架

相关申请的交叉参考

本申请在35U.S.C119(C)之下要求2003年3月20日提交的美国申请号60/455,853的权益。

技术领域

本发明总体上涉及用于安装和操纵大分子的和病毒晶体和用于X射线晶体学的其它样品的样品支架，以及利用该样品支架的方法。

发明背景

安装用于X射线数据收集和结构测量的晶体的最普通方法之一是将它们插入薄壁(通常10微米)玻璃或石英毛细管。这些薄毛细管是X射线可透过的，并产生较少的本底散射。它们可以在两端被密封、并提供用于晶体的稳定环境。对于含有大于溶剂(主要是水)和必须保持在恒定的湿度环境下以保持它的结构和序列的蛋白质和其它生物大分子的晶体，这是特别重要的。能够改变毛细管内部的晶体环境。例如，通过将少量的饱和盐溶液射入毛细管内可以使晶体受控地脱水。还可以将结晶浸泡在毛细管内部的含有药分子、小分子配合基、以及重原子化合物的溶液中。可以使用安装晶体的毛细管从晶体溶剂的融化至远在室温之下的温度收集数据。对于不引入过多的晶体紊乱进行数据收集不能被闪冻的晶体它们是特别重要的。

在用于毛细管内安装蛋白质和其它生物分子晶体的一已知技术中，首先选择其直径与晶体直径相差不大的毛细管，以便最后安装的晶体位于毛细管的中央，用于简化在X射线束中的对齐。其次，将毛细管的密封端划痕和折断，以及用于产生附连于某些结构的另一、较大直径端的吸口。将毛细管的敞开端插入晶体位于其中的液滴中，并将少量该液体吸入毛细管内。从该液体取出毛细管，并将少量空气引入，用于从端部除去该液体。其次，将毛细管插回入液滴内，并仔细地使用毛细管吸入。利用纸芯去除晶体周围的多余液体，并用蜡、油脂等密封毛细管的敞开端。从大直径端拆去吸入装置，将毛细管划痕和折断到所需长度，密封端部，然后通常使用模型粘土将毛细管安装在一针杆或测角器上，用于X射线测量。

其中采用晶体安装和操作的另一领域是在于X射线低温晶体学，X射线低温晶体学广泛地用于蛋白质晶体、蛋白质核酸合成物和病毒以及易于被X射线辐射损坏的其它晶体。低温晶体学技术的发展和应用对于能够溶解生物大分子和大分子化合物的结构的速度有很大影响。在辐射损坏变得显著之前能够吸收很大的X射线剂量，以致通常使用单个晶体能够收集许多完整的数据组。

已采用许多不同方法操纵安装晶体，用于闪冷和低温晶体学数据收集。较早的试验将晶体连接于玻璃纤维的端部或者将它们放置在小型玻璃刮刀的顶部上。使用用于圈的低X射线吸收材料的圈安装方法现在是用于操纵和安装晶体的最广泛的使用方法。圈低温架包括小(10～20微米)直径尼龙(或金属)丝，该丝被加捻形成圈，然后对它螺旋状加工成为小的空心金属杆。然后将该杆插入金属或塑料测角器相容的基底。从母液取回晶体，在母液中通过将它们保持在该圈内使它们生长，然后使用在一个或多个溶液之间的圈转移它们，这些溶液包括稳定溶液、重原子化合物溶液、包含小分子、药物或配合基的溶液、或低温防护剂溶液。比该圈较大的晶体能够位于它的表面之上，同时较小晶体能够被保持在跨越该圈或者还粘附于该圈的侧边的液体薄膜内。通过浸入液体氮或丙烷内或者通过插入在冷气流内，对圈安装的晶体闪冷。

诸圈提供了方便的晶体操纵。通过将晶体保持在圈的液薄膜中，与硬表面(例如那些可替换选用的安装工具)的可能的损坏性被减少到最少。该圈自身是柔性的，足以由于不大严重的偶然接触造成损坏。诸圈有助于使热物质减至最小，使用于热传递的表面最大，增加了冷却表面，从而减少了防止在晶体内的晶体周围的六角冰生形所需的低温防护剂浓度。由于这些原因，在全世界选择圈基架作为同步加速器X射线束线处关于高生产率的自动低温晶体学的标准。

关于在晶体学应用中安装试样的上述已知技术具有许多缺点。尤其，毛细管安装技术要求毛细管被密封的和大直径的敞开端必须被切割，然后被密封。这些操作增加了毛细管会断裂和内部晶体损坏的可能性。此外，能够使用的和仍旧提供用于切割的适当坚牢度的最小的毛细管壁厚被限制到约10微米。这又使毛细管有助于本底X射线散射，这在测量很小晶体时能显著地恶化整个信号对干扰的比值。

对于很小晶体(＜50微米)，通过毛细作用吸去多余的液体又不干扰晶体是很困难的。在晶体和毛细管之间的剩余液体可能具有与晶体容积相差不大的容积(因为小晶体的较大的表面对容积的比值)，这将增加X射线的本底散射。在晶体和毛细管之间的任何剩余液体还与作为畸变透镜的弯曲的毛细管壁一起作用，这使X射线束中的准确的晶体对齐较困难。虽然要求某些液体以依靠着毛细管壁将晶体操作在适当位置中，如果有过多的液体，那么在绕射测量期间晶体可能相对于壁滑动，这可能增加在数据分析中的误差。

为了保证晶体终止在毛细管的径向中心附近，毛细管直径必须与晶体尺寸匹配。因此，必须储存许多直径的毛细管。甚至对于一有正确尺寸的毛细管，晶体相对于X射线系统的轴线的垂直和水平位置也是被控制得较差，并对于各晶体都要求耗费时间的对齐。例如离开测角器头部中安装的基部一特定距离处定位晶体要求仔细地操作晶体和仔细地切割毛细管，这些都可能很耗费时间。在晶体取回期间吸取装置中调节压力也要求相当的技能。因为它们的较大尺寸，毛细管能够妨碍观察被安装的晶体，并使小滴中的操作困难。在取出期间与毛细管端部和壁的接触经常损坏晶体(尤其是带有板类几何形状的那些晶体)，增加了它们的嵌镶性和恶化了它们的X射线绕射性能。虽然为了进一步处理或测量可以从毛细管取出晶体，但这种取出晶体是极其困难的。在原来结构的数据收集之后在毛细管中可以进行将晶体浸泡在配合基、药物或重原子化合物中。但是这操作不方便和经常移动晶体。

在低温晶体学中，使用圈架也是有问题的。尤其，圈是很柔性的，尤其是用10微米直线尼龙丝制成的那些圈。因此，在从溶液取出晶体期间，在液体和表面张力作用下圈可能弯曲，一旦安装了晶体在晶体和周围液体的重量作用下它们也可能弯曲。因为它们不规则的空气动力学外形，所以在低温流的拖拉力作用下它们能够弯曲和颤振，稍许加宽了对于最低的嵌镶性和入射来扩散匹配时所实现的最大的绕射信号对干扰比值。

此外，圈提供了较差的晶体定位精度和相对于X射线主轴线的可再现性。对于某一标定的圈直径的圈形状是不规则的和不可再现的。相对于金属柱的圈取向是不规则的通过该金属柱它们被螺旋状加工，部分是由于在它们基部为改进刚度所需的对尼龙的加捻所产生。晶体在圈内的定位是不可再现的，尤其是对于很小的晶体。晶体和圈自射(从冷冻液体获得刚度)在现场晶体“退火”或“回火”原始记录期间可能移动，这将样品温度上升到周围溶剂的融化点/玻璃化转换点附近或之上，需要在X射线束中再对齐晶体。

圈还能在晶体周围保持较多液体。这液体可能难以吸去，尤其是如果晶体比圈的内部区域较小时。保留的液体增加了本底散射、减小了绕射信号对干扰的比值、增加热质量、从而减少了冷却速度。并且，周围液体比晶体具有不同的冷冻性能和热扩散性能，又在冷却期间施加破坏力。冷冻的周围液体还能使小(小于50微米)晶体难以成像和接合。

随着通过在X射线源、镜片、检测器方面的不断改进可以用越来越小的晶体进行晶体学试验结构研究，圈的限制性变得越来越显著。最初的结晶试验-尤其是基于高生产率的自动操纵筛的那些试验-通常产生很小晶体。从这些晶体收集X射线数据能够提供在生长优化过程中早期的有价值的反馈，并有时立即产生有用的结构信息。甚至在晶体质量基本优化之后晶体尺寸可以保持较小，尤其是在大分子化合物和膜蛋白质的情况下。尽管减小了信号对干扰的比值和增加了辐射损坏，因为它们闪冷更迅速，从而更早地低温保护，所以较小的晶体可以甚至是更希望得到的；比较大的晶体它们能够产生较好的绕射数据组，除非仔细地优化对于较大晶体的低温保护状态。

对于尺寸在50微米之下的晶体，圈变得极其难以使用。柔性制约限制了最小的尼龙直径，这又限制了最小的内圈直径。较小的晶体通常必须保持在较大容积的液体弯液面内，减少了绕射信号对干扰的比值和使接合更困难。较大的液体对晶体容量比还限制在热物质和冷却时间方面的减小。

按照以上观点，仍然需要关于用在X射线晶体学和低温晶体学应用中的安装微晶体的改进技术。

发明内容

本发明旨在通过提供微晶体试样支架满足上述需要，在该支架中使用塑料薄膜，以支持将分析的晶体。该薄膜具有50微米或以下的厚度，并较佳地由聚酰亚胺制造。本发明的关键特征是对薄膜施加曲率，以显著地增加它的结构刚性。刚性的增加就能够使用约3～15微米(或甚至更薄，只要相应地减小其它支架尺寸)厚度的较薄的薄膜，这较薄厚度减少了X射线的本底散射。

为了提供必需的曲率，可以采用许多技术，这取决于晶体学应用类型。在诸低温晶体学应用场合，其中不采用毛细管，较佳地将聚酰亚受薄膜安装于杆或针的外弯曲表面、中空杆或套筒的内弯曲表面、或者在套筒和杆之间。在这些实施例中，杆和/或中空套筒较佳地具有倾斜顶端，以使试样位置的观察角最大，以致当杆、套筒和支架相对于水平面倾斜时，能够看到晶体和任何晶体孔。或者，可以将薄膜附连于具有锥形端的杆，以致塑料支架相对于该杆倾斜，从而较容易地刮取一晶体、脱离平表面，并使该晶体位于轴线上，这样使接合更加容易。

在使用毛细管的晶体学应用中，通过使薄膜足够大以致在将薄膜插入毛细管中时毛细管自身将施加必要的细率，也能够施加曲率。在这变化型式中，可以使用例如一对镊子的适当工具首先对薄膜施加曲率，以致能够将它插入毛细管或管子内。

聚酰亚胺是用于薄膜材料的良好选择，这是因为它的极好机械性能；因为它具有较低的密度和由低原子数成分组成，以致它很微弱地散射X射线；以及因为它的金黄色提供了与大分子晶体的良好光学对比度、微加工聚酰亚胺薄膜，使它具有用于保持被检测的晶体的锥形末端。这锥形使在薄膜平面的方位平行于光束(它的尺寸通常与晶体尺寸一致或较小)时于X射线束中的薄膜容积最小。较佳地，在末端设置用于接纳晶体的一第一试样孔，不过该孔不是必不可少的。这孔允许晶体精确的被定位，进一步使X射线束中的薄膜容积最小，从而使从薄膜的本底散射最小。对于用于大分子的低温晶体学的或在溶液中生长的病毒晶体的支架，较佳地在薄膜中设置将试样孔连接于较大孔的小通道，便于从试样孔通过毛细作用吸去任何多余液体，同时几乎没有接触晶体的风险。该较大孔还减小了聚酰亚胺的总面积，从而减小了该支架移动通过含晶体的液滴时的液体阻力和流动扰动。通道和较大孔对于无机的或小分子有机材料的、其中过多液体不是一问题的“干”晶体不是必不可少的。

薄膜较佳地具有围绕试样孔的较小的固定不变的宽度(5～100微米，这取决于被检查的晶体的尺寸)，这减少了当薄膜平面的方位平行于X射线束时从聚酰亚胺薄膜(和任何吸附的液体)的散射。用于延伸超过它所附连的杆或套筒的薄膜顶部的整个三角形提供了良好的空气动力学外形，这外形使试样在气体冷却流中的试样“颤振”最小(与最低的嵌镶性晶体有关)。

这样本发明提供了对于传统的圈的可替换选用方案，该方案保持了它们的全部优点(包括与用于高生产率晶体学的现有的和研制的技术的完全相容性)，但是解决了在安装较小晶体方面的如果不是全部问题也是大部分问题。它们潜在的优点包括如果使用带有较大曲率的较薄、较短薄膜完全可再现小到3微米或甚至更小的试样“圈”尺寸、准确的和可再现的试样定位、良好的试样-支架对比度、较容易地去除多余液体、使热物质最小和更迅速闪冷、减少本底散射、以及较容易设计定制和大量生产。此外，支架的颜色、刚度和再现能力应该能使用自动装置提取晶体、显著地节省劳动力，相反，使用圈型支架要求通过手从结晶液滴取出全部晶体，这是因为圈是松软的和具有与液滴溶液的很小对比度。

附图简述

从以下结合附图对本发明的多个实施例进行的叙述，本发明的特征和优点将变得更明显，在附图中：

图1A-1D是按照本发明的诸较佳实施例构造的四个微晶试样支架的视图；

图2A和2B是尤其使用一个较佳试样支架将一微晶定位在受控环境的毛细管或使用与标准X射线设备差不多的基底的管子内的一组件的分解立体图和组装立体图；以及

图3是在本发明的诸较佳实施例中形成有效的晶体支架的有图形的聚酰亚受薄膜的视图。

具体实施方式

参阅图1A-1D，示出了微晶支架10的若干变化形式，它们按照本发明的四个较佳实施例构造，各个微晶支架尤其被设计成与在X射线晶体学中使用的测角器或其它标准的试样保持件/定位件一起使用。在各实施例中，支架10包括微加工的塑料薄膜12，将该薄膜附连于具有曲面的一结构，以致将曲率施加于薄膜12。在图1A的实施例中，用任何合适的措施、例如粘接剂、胶带、热粘合等将薄膜12附连于小直径圆筒形塑料或金属柱16。如图2A所示，柱16的尺寸被确定为可插入标准的塑料或金属磁测角器头架18，例如由HamptonResearch销售的或大分了晶体学团体为高生产率自动晶体学所研制的头架，或者插入允许薄膜12和柱16相对于测角器头部(未示出)高精度接合的那样关键的变化型式内。薄膜12具有呈锥形至末端24的和当连接于杆16时形成勺形的锥形端。

在图1B所示的实施例中，还使用中空的金属或塑料套筒或杆14与杆16相结合，以致薄膜12被保持在这两件之间。套筒14牢固地将薄膜12连接于杆16的外侧弯曲表面26，并迫使薄膜12与该杆的曲率相一致，同时允许易于装配。较佳地，使用少量的胶水密封在套筒14和杆16之间的区域，相对于杆16固定套筒14。或者，可以使用可热皱缩的管子制成套筒14，将薄膜12夹持在套筒14与杆16之间。或者，如图1C所示，可以使用中空套筒14自身，以致例如通过粘接剂、胶带、热粘合等将薄膜12连接于中空套筒14的内侧弯曲表面28。也可以通过坍塌套筒的一侧使薄膜12被压接于套筒14的内侧弯曲表面，以致它依靠于另一弯曲侧挤压薄膜。

在图1A和1B所示的两实施例中，套筒14和杆16较佳地分别具有倾斜的顶端20和22，使位于聚酰亚胺薄膜12的末端24处的试样位置的观察角最大，如后面结合图3更详细讨论的那样。在图1D中示出了实现相同目标的另一实施例，其中杆16具有薄膜12连附于其的锥形顶端29。如图所示，薄膜12相对于杆16的垂直纵向轴线以一角度安装，以致薄膜的末端24直接位于该轴线之上。因此，使薄膜12的接合更加容易。更重要地，薄膜12的倾斜以使晶体刮离平表面更加容易的方式定位它的勺形末端。

由任何较佳实施例施加的聚酰亚胺薄膜12的曲率显著地增加了它的弯曲刚度；纸的圆筒状弯曲件比平的纸件较难于弯曲。在允许薄膜12制得很薄、约3～15微米方面这附加的刚度是很关键的，因此使从聚酰亚胺薄膜12的本底散射最小，并允许膜薄图形达到安装最小的晶体所要求的小侧向尺寸。如刚刚所述的，这曲率还产生在取出晶体时和用于在溶液之间传送晶体的方便的适度的勺状作用，这使晶体损坏的机率最小。

对于其中试样晶体将被保持在受控环境的室温晶体学应用场合，塑料管或玻璃X射线毛细管30在支架10上滑动，然后将管30的末端32密封，如图2B所示。在这实施例中，如果希望，可以不需要使用中空套筒14和杆16。代之以，由在薄膜12上施加所需曲率的一对镊子可以保持聚酰亚胺薄膜12。然后利用镊子将薄膜12插入X射线毛细管30。当释放镊子时，薄膜12的曲率松弛。选择薄膜宽度比毛细管内径稍大，以便通过它的弹簧状作用将薄膜12保持在毛细管中尖附近的适当位置中。然后使用油脂或蜡可以密封毛细管30的端部32。如果希望，在密封之前可以将附加液体引入毛细管内。

在使用套筒14和/或杆16支持薄膜12的情况中，带有切断的窄端的X射线毛细管30仔细地在晶体上被拉动和下降到基底18上。可以用油或油脂润滑基底18和在毛细管的端部上拉动的橡胶或硅酮垫圈/O形环提供与毛细管的气密的密封。毛细管在其上被拉动的圆筒形部分可以是连接于X射线设备的基底的一整体部分，或者可以是带有通过其将该杆插入基底的一通孔的单独的圆筒形件，并在杆和用油脂密封的孔的内径之间有任何间隙。然后利用油脂、蜡、胶水等密封该窄端。或者，可以用薄膜塑料管代替玻璃毛细管30。例如，新罕布什尔州、Salem现代聚合物公司制造了带有0.0002英寸或5微米壁厚的有规律的和低温热皱缩半刚性透明管。在这情况下，在晶体上拉动该管和到达基底上。用油脂或油可以进行两端密封，和/或在低温热皱缩管的情况下使用带有定制的弯曲末端的可变温度焊接的铁可以进行两端密封。在密封之前可以将任何材料的小塞子插入敞开端，以改进该密封。在该两种情况下，在密封之前可以将附加的液体引入毛细管/塑料管。并且在这两种情况下，毛细管或塑料管的直径可以比试样支架的宽度大得多，使在试样上滑动毛细管或塑料管较容易，而不会干扰试样。

在所有以上三种情况下，在X射线数据收集或受到其它操作、例如浸泡在配合基、药物或重原子溶液之后可以从毛细管/管子取出晶体，尤其在较佳的第二和第三方法中较容易取出，然后较容易地再插入，用于另外的数据收集。

图3示出了聚酰亚胺薄膜12的典型的图形。应该注意还可以由聚酰亚胺之外的、在X射线束上临时窗口广泛使用的(KAPTON带形式的)、具有它的组成成分的低密度、低原子数、以及因此低X射线吸收和散射的任何其它合适的塑料或其它材料制造薄膜12，使用微电子工业的微石版印刷技术它易于被形成图形，是较佳的选择。在金黄的聚酰亚胺薄膜和晶体之间的良好对比度使放置和接合晶体较容易。薄膜12较佳地包括在窄末端24处的一小试样孔50，用于保持将被分析或检测的试样晶体。较佳地通过通道52将试样孔50连接至大得多的孔54。这结构允许一纸芯插入较大孔54，用于通过通道52从晶体周围去除多余的液体，而几乎没有接触晶体的风险。较大的孔54还减小了聚酰亚胺的总面积，从而减小随着通过含晶体的液滴移动该支架所引起的液体阻力和流动扰动。或者，因为要被检测的晶体还可以例如通过一小液滴或一聚合物直接连接于薄膜12的末端24，可以不使用孔50和54，不需要通道52。

薄膜12具有围绕试样孔50的较小宽度的边缘56，它在薄膜12的平面被定向成平行于X射线束时减少了离开聚酰亚胺薄膜12(和任何被吸收的液体)的散射。较佳地，边缘56具有取决于被检测的晶体的尺寸的在5和100微米之间的一固定宽度。小十字形孔58位于试样孔52和大孔54之下的薄膜内的中央处，它可以用于帮助自动接合。可以使用其它的诸接合孔，以适合于将使用的接合规则系统。延伸越过柱16的薄膜的顶部60的整个三角形与柱的锥形一起提供了良好的空气动力外形，使在气体冷却流中的试样“颤振”(与最低的嵌镶性晶体有关)最小。可以将试样孔52定制成任何形状，以便简化例如杆形晶体的安装。薄膜的厚度也可以改变，例如用于围绕试样孔52产生隆起部分，用于提供较刚性的基部，或者用于改进空气动力学，但是均匀的厚度提供了更加适合的性能。

为了组装方便，尤其是附连至中空套筒14的内侧，薄膜12包括带有锥形端64的延伸尾部62，该锥形端允许将薄膜12易于插入套筒14，或者在应用毛细管的情况下易于插入塑料管或毛细管。当薄膜12插入套筒14时一对小翼部66伸出和限制薄膜进入套筒14的运动距离，提供了可再现的定位。对于附连于杆16的外侧的薄膜，可以使用带有方形端的较短、较宽的尾部。在这两种情况下，尾部可以穿有诸小孔68，以改进胶合强度。此外，在受控的大气毛细管实施例中，当将薄膜12放在含晶体的一液滴中时诸小孔68保持诸小液滴，后来这些小液滴用于保持毛细管30内的湿气环境。对于最薄的聚酰亚胺，在设计中的全部直角切割-是应力集中的诸位置-可以由有限半径的曲线代替，以改进防止撕裂的薄膜坚牢度。

为了制造有图形的聚酰亚胺薄膜，可以采用许多不同的加工过程，这取决于所需的晶体孔尺寸和薄膜厚度。一第一、较佳的薄膜制造加工是基于光可定界的聚酰亚胺，并可产生很小的孔尺寸。首先，将用作为在薄膜拉起期间的防蚀层的1/2微米二氧化硅层设置在清洁的硅晶片的表面上。用正色调光可暴露的PWDC 1000聚酰亚胺旋转涂复晶片。例如带有粘接促进剂的预涂复或在蒸汽带水炉内预焙烘的标准加工保证在晶片和聚酰亚胺之间的良好粘接。在简要焙烘之后，聚酰亚胺是通过含有支架的图形的铬-玻璃面罩露出的软接触面，然后浸在显像剂中去除被暴露的聚酰亚胺。然后在氮气氛炉中固化留下的有图形的聚酰亚胺。最后，将晶片浸在稀释的HF中，以去除防蚀的二氧化硅层，允许有图案的聚酰亚胺薄膜浮起，脱离晶片。这加工过程适合于制造带有3-15微米厚度的聚酰亚胺薄膜，然后该薄膜可以形成图案、达到5微米的孔尺寸，该尺寸适合于安装最小的大分子晶体，从该晶体通常能够获得绕射。能够得到较薄的薄膜和较小的尺寸，同时通过减小薄膜的横向尺寸和增加它的曲率保持适当的薄膜刚度。在使用3英寸硅晶片和有图形的聚酰亚胺薄膜的一试验装置中，一次能够生产130个试样支架。对于8英寸晶片，这个数目能够增加到1000个之上，使各个支架的生产很便宜。也能够使用例如接触打印和喷射(“喷墨”)印刷的其它普通微制造加工，尤其是对于带有大孔尺寸的诸支架。

对于比50微米较大的试样孔，能够使用用于柔性电子电路的基于铜-聚酰亚胺-铜片材上的制造加工过程。用光致抗蚀剂旋转涂复硅晶片，并利用一块玻璃将与晶片尺寸匹配的一件该片材加压在顶部上，以保证一平表面。然后焙烘这组件，以固化光致抗蚀剂，并将铜-聚酰亚胺-铜牢固地连接至晶片。然后将光致抗蚀剂的一第二层第二次施加在焙烘过的铜和晶片的顶部上。将该层通过含有试样支架图形(为复盖晶片面积而复制的)铬玻璃面罩暴露于宽带紫外线接触校准器中，然后被显像以去除暴露的光致抗蚀剂。利用氯化铁将该图形蚀刻进入顶部铜层，然后利用O₂CHF₃气体等离子体蚀刻将该图形蚀刻进入聚酰亚胺，在该蚀刻之后将有图形的铜-聚酰亚胺-铜薄膜与晶体分离。将这有图形的片放在Shipley 1165池中，以去除剩余的光致抗蚀剂，然后放入一第二氯化铁池中，用于蚀刻掉在聚酰亚胺薄膜的顶部和底冲的所有剩余的铜。不垂直的蚀刻外形和商业上可得到的柔性电路材料的最小的铜厚度(9微米)和聚酰亚胺厚度(25微米)将由该主体加工过程方便地得到的最小结构特征(例如孔)尺寸限制到约50微米。

可选地，能够修改所制造的聚酰亚胺薄膜的表面性能，以改进在许多不同溶液中的该支架的性能。聚酰亚胺是自然地亲水性的。在这情况下，试样支架趋于排斥可溶解的蛋白质的母液，以及能够引起含蛋白质晶体的小滴的损坏。已研发了很多种技术修改聚酰亚胺的表面性能。为了使主体聚酰亚胺薄膜有亲水性，较佳的加工过程是在提起和干燥之后，将它们简短地暴露于氧气等离子体蚀刻。这处理使液滴损坏减至最少，并允许晶体较容易地取出。但是，用实际未处理的支架也显示出差不多一样地进行，并减小了多余的液体，并且对于含洗涤剂的诸液滴它们的亲水性能可以是很有用的。

进行了许多试验，以比较由现行技术20微米尼龙圈支架和按照本发明的较佳实施例构造的9微米厚聚酰亚胺支架产生的扩散X射线本底与分辨率。该诸试验确认较刚性的聚酰亚胺支架提供了较少的本底散射-尤其是在重要的2-5埃分辨率范围。通常，勺状作用与试样孔尺寸、形状和方位的可再现能力一起使主体支架比圈更加容易使用，尤其是对于小晶体。作为一个例子，已使用该支架安装和得到了来自5-7微米大分子晶体的一完整的数据组。对于几百微米尺寸的大晶体也能够使用该主体支架，只要使用较厚的聚酰亚胺薄膜(10-25微米)。因为对于所有试样和支架方位在射线束路径中的聚酰亚胺的小容积和聚酰亚胺的低密度和原子数成分，所以甚至对于很小的晶体与来自无序的内和外溶剂的后果比较它对于本底散射的影响是较小的。通过优化在薄膜厚度(它决定了弯曲刚度)和试样孔周围的聚酰亚胺的宽度之间的差异，能够减小这容积。由薄膜加工产生的相同的基本设计应该可应用于几微米或很小的试样孔，只要减小薄膜的厚度，以考虑蚀刻外形，并减小横向支架尺寸，以防止弯曲。对于极小的晶体，可以不用该孔，能够使用在末端处的小弯曲的实心区域，以取出和支持晶体。

按照较佳实施例构造的支架的另一主要优点是它们比圈有大得多的刚性。当浸泡在含晶体的液滴中时它们保持刚性，简化了晶体取出。在用于改进绕射质量的“回火”或“退火”步骤期间它们不坍塌，并显示出没有由于在低温流中的颤振而产生的嵌镶性加宽的迹象。最后，应该注意这些制造的支架应该较普遍地应用于所有类型、有机和无机的小晶体。对于“干”晶体，如以上所指示可以不用毛细作用吸孔，使用胶水或油脂、或利用在数据收集之后可洗去的乙苯纤维素-乙酸乙酯的一小滴能够牢固地连接晶体。

对于诸较佳实施例可以作出许多附加的变化或修改。例如，能够利用其它聚合物制造该薄膜，或者利用两层或多层不同的聚合物，以赋予较好的刚性。薄膜的表面可以形成图形，以产生有肋的结构，用于较好的刚性和弯曲特性，并带有最小的总质量。此外，可以化学处理该表面，例如，使试样孔有排水性和“毛细作用吸液”孔有吸水性。在薄膜上、试样孔周围可以设置图案对齐标记，以便于晶体的自动对齐。为方便诸不同尺寸的晶体，可以将试样孔制成任何尺寸，并可以在一片聚酰亚胺上制造多个尺寸。对于各晶体尺寸然后可以使孔周围的聚酰亚胺的宽度最小，使从该孔散射的X射线量最少。在其中支持件包括使用一圆筒杆的场合，可以将该杆制成中空状和低比热的、为高热传导材料，以使热质量和在插入冷却期间氮的蒸发最少。最后，薄膜连接的杆端可以成锥形，以致薄膜弯曲进入圆锥部分内，而不是圆筒部分内。通过对于某一试样尺寸正确选择孔尺寸和通过选择杆的锥体的角度，可以将晶体放置在试样支架/测角器的转动轴线上。

总之，本发明包括用于大分子低温晶体学的安装晶体的一新方法，它保留了目前广泛使用的尼龙圈的许多优点，同时解决了它们的大部分的许多缺陷。微加工的聚酰亚胺薄膜试样支架较好的适合于处理很小晶体，这些很小晶体现在能够特征为同步加速器束线的技术发展水平，并通过在结构基因中心处的自动结晶大量生产。这些支架应该简化了X射线数据收集的自动化，并比用于从液滴自动取出晶体的现有的可替换方案更加适合。因为它们的制造是基于标准的微电子工业加工过程，所以这些支架应该容易地和便宜地每年生产几百万的数量，这些数量不久将被世界范围的结构基因工作所要求。它们应该更普遍地用于所有类型的小有机/无机晶体，尤其是从用于X射线数据收集的低温冷却得益的那些小有机/生物分子。

虽然以许多较佳实施例和在其上的许多变化揭示了本发明，但是应该理解在不脱离如以下权利要求书所规定的本发明范围的情况下，能够作出许多附加的修改和变化。

Claims (13)

1.一种保持使用X射线晶体学进行检测的一晶体的一支架，所述支架包括：

具有用于接纳晶体的锥形末端的薄膜；以及

用于对所述薄膜施加曲率、以增加所述薄膜的结构刚度的结构。

2.如权利要求1所述的支架，其特征在于，所述薄膜由塑性材料形成。

3.如权利要求2所述的支架，其特征在于，所述塑性材料是聚酰亚胺。

4.如权利要求1所述的支架，其特征在于，将曲率施加于所述薄膜的所述结构包括具有弯曲外表面的杆，所述薄膜附连于该弯曲外表面。

5.如权利要求1所述的支架，其特征在于，用于对所述薄膜施加曲率的所述结构包括具有弯曲外表面的一杆，将所述杆插入具有弯曲内表面的一中空套筒，其中将所述薄膜插入在所述杆的所述弯曲外表面和所述中空套筒的所述弯曲内表面之间。

6.如权利要求1所述的支架，其特征在于，所述薄膜具有50微米或以下的厚度。

7.如权利要求6所述的支架，其特征在于，所述薄膜具有15微米或以下的厚度。

8.如权利要求1所述的支架，其特征在于，一第一试样孔设置在所述薄膜的所述末端处  。

9.如权利要求8所述的支架，其特征在于，所述薄膜还包括与所述第一试样孔分开的和通过一通道连接于所述第一试样孔的一第二试样孔，用于从所述第一试样孔通过毛细作用吸去多余液体。

10.如权利要求8所述的支架，其特征在于，由在所述薄膜的所述末端 处的边缘围绕所述第一试样孔，所述边缘具有100微米或以下的宽度。

11.如权利要求1所述的支架，其特征在于，所述薄膜包括与所述末端相对的一第二尾端，所述尾端为锥形，以便于所述薄膜插入安装套筒内。

12.如权利要求1所述的支架，其特征在于，所述薄膜被包含在一密封的管内，以控制晶体在其中暴露的环境。

13.如权利要求12所述的支架，其特征在于，所述薄膜包括用于保持诸小滴液体的多个孔，用于控制所述晶体在其中暴露的环境。

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