CN101074446A - 光学活性叔亮氨酸的拆分方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光学活性叔亮氨酸拆分方法，将RS－叔亮氨酸与苯乙酰氯反应，生成RS－苯乙酰基叔亮氨酸；利用固定化米曲霉氨基酰化酶，选择性水解S－苯乙酰基叔亮氨酸的苯乙酰基，生成S－叔亮氨酸；加入有机溶剂，使未反应R－苯乙酰基叔亮氨酸，分相分离；水相中S－叔亮氨酸经浓缩，结晶；油相中R－苯乙酰基叔亮氨酸中加入酸，水解，得R－叔亮氨酸。本发明采用的酶，价格适中，便于工业化生产，整个生产过程简单，有利于对环境的保护。
Description
技术领域
本发明涉及一种从叔亮氨酸的消旋体拆分制备光学纯的S-叔亮氨酸或R-叔亮氨酸的方法。更具体地说，本发明涉及一种通过生物酶从衍生的消旋体叔亮氨酸拆分制备光学纯的S-叔亮氨酸和R-叔亮氨酸的方法。
背景技术
叔亮氨酸是一种非蛋白原的手性氨基酸，是一种重要的医药中间体，在手性合成、多肽的合成等方面有广泛的应用。
有关光学纯叔亮氨酸的合成，主要有化学合成法与生物酶法，生物酶法又有两种方法，酶催化和酶拆分。文献中如《氨基酸与生物资源》(2003，25(4)，14-19)有详细的报道。
常采用的叔亮氨酸的拆分方法为：
未衍生的或经过衍生的(RS)叔亮氨酸，比如特丁酰衍生化(RS)叔亮氨酸，加入适当的化学拆分剂，如手性苯乙胺、10-樟脑磺酸、衍生的苯基乙磺酸。
以苯乙胺拆分特丁酰基叔亮氨酸举例说明拆分过程，(RS)特丁酰基叔亮氨酸，加入(S)-苯乙胺反应生成(RS)特丁酰基叔亮氨酸(S)-苯乙胺盐，重结晶，得(R)特丁酰基叔亮氨酸S-苯乙胺盐，酸性条件下分离除去S-苯乙胺，(R)特丁酰基叔亮氨酸，继续水解，脱特丁酰基，得(R)叔亮氨酸。
(RS)特丁酰基叔亮氨酸，加入(R)-苯乙胺反应，生成(RS)特丁酰基叔亮氨酸(R)-苯乙胺盐，重结晶，得(S)特丁酰基叔亮氨酸R-苯乙胺盐，酸性条件下分离除去R-苯乙胺，(S)特丁酰基叔亮氨酸，继续水解，脱特丁酰基，得(S)叔亮氨酸。
按照上述方法对叔亮氨酸的拆分，虽然光学纯度可达95％以上，但产率仅23％，而且过程较长，操作繁琐，有机溶剂用量大，不适于工业化生产。
生物酶催化合成光学纯叔亮氨酸，是利用酶的高度选择性，反应条件温和，操作步骤短，有机溶剂用量小等优点。但只能得到一种构型的光学纯叔亮氨酸-(S)叔亮氨酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过生物酶从叔亮氨酸的消旋体拆分制备光学纯叔亮氨酸，即S-叔亮氨酸和R-叔亮氨酸的方法。本发明采用的酶，价格适中，便于工业化生产，整个生产过程简单，环境污染小。
本发明的方法，包括以下步骤：
1)RS-叔亮氨酸与苯乙酰氯反应，生成RS-苯乙酰基叔亮氨酸；
2)利用米曲霉氨基酰化酶，选择性水解脱去S-苯乙酰基叔亮氨酸的苯乙酰基，生成S-叔亮氨酸，反应温度10-50℃，反应时间6-240小时；
3)过滤分离出固定化酶，反复使用；
4)加入有机溶剂，使未反应R-苯乙酰基叔亮氨酸，分相分离；
5)水相中S-叔亮氨酸经浓缩，结晶；
6)油相中R-苯乙酰基叔亮氨酸后加入酸，水解，得R-叔亮氨酸。
本发明的方法中，采用固定化米曲霉氨基酰化酶(EC3.5.1.14)。
本发明的方法中，未反应的R-苯乙酰基叔亮氨酸，在碱性条件下，原位消旋，生成RS-苯乙酰基叔亮氨酸，再经上述酶水解，生成S-叔亮氨酸。
本发明的方法中，所述的有机溶剂为乙酸乙酯、苯、甲苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚，优选为乙酸乙酯。
本发明的方法中，所述的酸为硫酸、盐酸、磷酸。优选为盐酸。
本发明的方法中，所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、碳酸钾、碳酸钠、碳酸锂、氢氧化钙。
本发明与现有技术相比，有以下优点：
1)本发明中采用固定化米曲霉氨基酰化酶，有高的选择性，使得S-叔亮氨酸的收率达到96％，光学纯度达到99％ee以上。
2)本发明中采用固定化米曲霉氨基酰化酶，可以多次循环使用50次以上，活性降低少，适用于工业化生产。
3)本发明中充分利用R-苯乙酰基叔亮氨酸，在碱性条件下，原位消旋，生成RS-苯乙酰基叔亮氨酸，再经上述酶水解，生成S-叔亮氨酸。S-叔亮氨酸的市场需求量比R-叔亮氨酸大，使得生产成本降低。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 固定化米曲霉氨基酰化酶(EC3.5.1.14)，固定化条件为：固定液中含明胶1％，戊二醛0.5％，60mg氨基酰化酶用50ml固定液；固定时间为2小时。固定化后，酶活性2800U/g(干固定化酶)，酶保留活性保留80％。
实施例2 RS-叔亮氨酸200g，加入至2000毫升三颈瓶中，加入2N氢氧化钠溶液850ml，冰浴搅拌下，滴加乙酰氯240g的丙酮溶液400ml，温度不超过20℃，滴加完后反应2小时，浓缩除去丙酮，用6N的盐酸溶液中和至PH＝4，1000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并乙酸乙酯，无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂，得RS-苯乙酰基叔亮氨酸305g，收率85％。
实施例3 于2000ml反应瓶中，加入将实施例2的RS-苯乙酰叔亮氨酸120g(510.6mmol)和水1500ml，固定化米曲霉氨基酰化酶10-30g，选择性水解脱S-苯乙酰基叔亮氨酸的苯乙酰基，生成S-叔亮氨酸，反应温度37℃，反应时间6小时；过滤分离固定化酶，乙酸乙酯3×300ml萃取未反应R-苯乙酰基叔亮氨酸，水相经浓缩，结晶，得S-叔亮氨酸63g，收率96％，光学纯度99.2％ee；乙酸乙酯无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得到R-苯乙酰基叔亮氨酸。
实施例4 于2000ml反应瓶中，加入将实施例2的RS-苯乙酰叔亮氨酸120g(510.6mmol)和水1500ml，固定化米曲霉氨基酰化酶10-30g，选择性水解脱S-苯乙酰基叔亮氨酸的苯乙酰基，生成S-叔亮氨酸，反应温度50℃，反应时间2小时；过滤分离固定化酶，乙酸乙酯3×300ml萃取未反应R-苯乙酰基叔亮氨酸，水相经浓缩，结晶，得S-叔亮氨酸51g，收率90％，光学纯度99.0％ee；乙酸乙酯无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得到R-苯乙酰基叔亮氨酸。
实施例5 于2000ml反应瓶中，加入将实施例2的RS-苯乙酰叔亮氨酸120g(510.6mmol)和水1500ml，固定化米曲霉氨基酰化酶10-30g，选择性水解脱S-苯乙酰基叔亮氨酸的苯乙酰基，生成S-叔亮氨酸，反应温度10℃，反应时间37小时；过滤分离固定化酶，加入乙酸乙酯3×300ml分三次萃取未反应R-苯乙酰基叔亮氨酸，水相经浓缩，结晶，得S-叔亮氨酸53g，收率91％，光学纯度99.1％ee；乙酸乙酯无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得到R-苯乙酰基叔亮氨酸。
实施例6 将实施例3中的97.2％ee的R-苯乙酰基叔亮氨酸61.3g(258.6mmol)、20.7g(517.2mmol)NaOH加入到水和异丙醇中，加热回流2小时，冷却，加入43ml 6M盐酸搅拌中和，用3×100ml乙酸乙酯萃取，合并有机溶剂，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂得到消旋的苯乙酰基叔亮氨酸，其光学纯度为1.3％ee，收率92.4％。
实施例7 将实施例3中的97.2％ee的R-苯乙酰基叔亮氨酸61.3g(258.6mmol)、20.7g(517.2mmol)NaOH加入到水中，加热回流5小时，冷却，加入43ml 6M盐酸搅拌中和，用3×100ml乙酸乙酯萃取，合并有机溶剂，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂得到消旋的苯乙酰基叔亮氨酸，其光学纯度为51％ee，收率87.6％。
实施例8 将实施例3中的97.2％ee的R-苯乙酰基叔亮氨酸61.3g(258.6mmol)、20.7g(517.2mmol)NaOH加入到水和丙三醇中，加热回流4小时，冷却，加入43ml 6M盐酸搅拌中和，用3×100ml乙酸乙酯萃取，合并有机溶剂，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂得到消旋的苯乙酰基叔亮氨酸，其光学纯度为5.3％ee，收率89.3％。
实施例9 将实施例3中的R-苯乙酰基叔亮氨酸61.3g(258.6mmol)，加入250ml 6M的盐酸，搅拌回流8小时，冷却，用5M氢氧化钠溶液中和，溶液浓缩，结晶，得到R-叔亮氨酸30.1g，其光学纯度为99％ee，收率90.4％。
实施例10 将实施例6-8中消旋的苯乙酰基叔亮氨酸，100g和水1500ml，固定化米曲霉氨基酰化酶10g，选择性水解脱S-苯乙酰基叔亮氨酸的苯乙酰基，生成S-叔亮氨酸，反应温度37℃，反应时间48小时；过滤分离固定化酶，乙酸乙酯3×300ml萃取未反应R-苯乙酰基叔亮氨酸，水相经浓缩，结晶，得S-叔亮氨酸56g，收率97％，光学纯度99.2％ee；乙酸乙酯无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得到R-苯乙酰基叔亮氨酸。
Claims (6)
1.一种光学活性叔亮氨酸拆分方法，包括以下步骤：
1)RS-叔亮氨酸与苯乙酰氯反应，生成RS-苯乙酰基叔亮氨酸；
2)利用米曲霉氨基酰化酶，选择性水解脱去S-苯乙酰基叔亮氨酸的苯乙酰基，生成S-叔亮氨酸，反应温度10-50℃，反应时间1-240小时；
3)过滤分离出固定化酶；
4)加入有机溶剂，使未反应R-苯乙酰基叔亮氨酸，分相分离；
5)水相中S-叔亮氨酸经浓缩，结晶；
6)油相中R-苯乙酰基叔亮氨酸中加入酸，水解，得R-叔亮氨酸。
2.按照权利要求1所述的光学活性叔亮氨酸拆分方法，其中，所述的米曲霉氨基酰化酶，是固定化。
3.按照权利要求1所述的光学活性叔亮氨酸拆分方法，其中，油相中未反应R-苯乙酰基叔亮氨酸，加入碱，原位消旋，生成RS-苯乙酰基叔亮氨酸，再经酶水解，生成S-叔亮氨酸。
4.按照权利要求1所述的光学活性叔亮氨酸拆分方法，其中，所述的有机溶剂为乙酸乙酯、苯、甲苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚。
5.按照权利要求1所述的光学活性叔亮氨酸拆分方法，其中，所述的酸为硫酸、盐酸、磷酸。
6.按照权利要求3所述的光学活性叔亮氨酸拆分方法，其中，所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、碳酸钾、碳酸钠、碳酸锂、氢氧化钙。
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