CN101069115B - 显微镜照明装置及其适配器 - Google Patents

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Abstract

一种用于显微镜的照明系统(10)，包括光源(32)，用于产生光以照射用于显微观察的样本，至少一个准直透镜(50，52)，用于准直由该光源产生的光，以及一暗视场聚光镜(14)，用于接收经准直的光并将中空锥形光导向待观察的样本上。该系统可任意包括一适配器(100)，用于提高从光源到标本的光传输的节省，该适配器具有一中心设置的衬垫和环绕该衬垫的多根光纤，以产生中空光柱，用于向该暗视场聚光镜传输。该系统提供提高了的分辨率和对比度，并还适于匹配荧光显微技术。

Description

显微镜照明装置及其适配器
本申请要求于2004年4月16日提交的美国临时专利申请序号No.60/563,175、2004年12月10日提交的美国临时专利申请序号No.60/634,850、2005年2月7日提交的美国临时专利申请序号No.60/650,607、2005年2月24日提交的美国临时专利申请序号No.60/655,805以及2005年3月10日提交的美国临时专利申请序号No.60/660,484的权益，并在此引入其全文作参考。
技术领域
本发明主要涉及暗视场显微术领域，更特别地涉及一种用于提高分辨率的能够与荧光显微术任意结合的装置和方法。
背景技术
所有活的生物，包括人类，都是由细胞组成的。大多数的生命形态以单细胞存在，单细胞执行个体生命的延续所必要的全部功能。大部分细胞都极小，以至于裸眼根本无法看到，需要使用高倍显微镜来观察它们的行为。自发明高倍显微镜以来，在随后的1500年里，光学显微镜逐渐提高了我们对生物、人体生理学和解剖学的了解，生物医学研究，医学诊断，以及材料科学。显微镜学科学已经发展到包括多种用以提高分辨率的技术。
微生物学的持续发展要求对在细胞和细胞内级别上的生化活动进行越来越精密的研究。当今，显微术中的挑战不仅仅在于提高越来越细的分辨率，还在于开发实时观察生化活动(若发生时)的技术，而不破坏处理中的生物标本。
分辨率是显微镜镜区分两个相互非常靠近在一起的物体的能力。例如，(1000埃；等于100纳米或100×10-9米)分辨率的显微镜，能够使靠近在一起达100纳米的物体独立地可见。小于100纳米的物体和特征不能够被分辨(即，区别)。目前可用的几类显微镜的典型分辨率或实际分辨能力对于可见光显微镜大约是
Figure G200580019890XD00012
对于紫外线显微镜大约是
Figure G200580019890XD00013
对于扫描电子显微镜大约是至对于透射电子显微镜大约是
Figure G200580019890XD00016
至
紫外线显微镜比普通光学显微镜提供更精细的分辨率和更好的放大率，但它对于活体标本的研究具有严重的缺点。紫外线光会损坏或杀死许多种活的生物标本，从而不能实现许多生物过程的观察。当紫外线光入射到标本时，它激发标本分子内的荧光，从而标本自身发出荧光。如果标本不会天然地产生荧光，那么它必须要用荧光染料着色。许多荧光染料能够强烈地粘合在活细胞内的元素例如酶上，改变它们的品质并显著改变细胞生物化学。其它染料会产生太多的荧光或吸收太多的有用紫外线。
紫外线显微镜的操作要求大量的技能。因为紫外线光会损害人眼，所以图像只能用紫外线摄像机或专门配备的静止照相机进行观察。另外，紫外线显微镜所需要的石英光学系统通常也比可见光显微镜中使用的玻璃元件要贵得多。
由于大多数细菌和病毒太小而不能用光学显微镜看到，通常使用电子显微镜来观察这种生物.虽然电子显微镜可以提供非常精细的分辨率，但是标本通常必须经过高真空脱水、冷冻、注入重金属来制备，并利用电子束接受高温，使得不可能进行活体标本的观察.脱水处理还改变了标本，留下了实际上并不会出现的假象和细胞损坏.另外，为了观察生物过程中的步骤，许多标本也必须在各个阶段进行观察，以在该过程中获得每个期望的步骤.然后，必须使用能够花费达每个标本两个小时的过程来制备好每个所选择的标本.
电子显微镜的高成本还成为其在生命科学中使用的障碍。电子显微镜很大并且经常占据着整个房间。电子显微镜-例如紫外线显微镜的操作和调整要求高度熟练的技术人员，从而还带来另外的有关维修和给电子显微术设施提供人员的成本。因此，当今可用的电子和紫外线显微镜通常不提供实时观察活的、未改变的生物标本的技术。
许多生物属性只能在活细胞中观察到。这些属性包括输运、流动、布朗运动、扩散、吞噬作用、胞饮作用、有丝分裂、免疫荧光性、以及细胞交互作用。生物医学技术包括但不限于基因治疗、人工受精、新药物发展、细胞培养和克隆、细胞再生、培植、生物检测、以及生物治疗，它们都要求活细胞和细胞过程的可视化。虽然这些现象的性质有时能够在这些过程发生之前以及之后通过检查电子显微照片推断出，但更优选地是在这些过程发生时更深入地加以研究。
荧光显微镜对于细菌、动物和植物细胞的研究是有用的，因为它们在用紫外线光照射时显现出原始的荧光(自身荧光)。荧光显微镜是一种用于利用它们的荧光对小物体观察的显微镜。与具有较长寿命的磷光相比，荧光是一种寿命约为10-8-10-9秒的短时间发光。荧光最通常是由光激发产生。发出的荧光通常具有比激发光更长的波长。可以用三个重要的步骤来划分荧光产生过程。首先，在最初的几个飞秒(10-15秒)内，分子被入射光子激发。在接下来的几个皮秒(10-12秒)期间，分子经历激发态电子的振动弛豫，到达中间态的最低能量级。最后，在几个纳秒(10-9秒)期间，产生较长波长的光子发射，并且该分子回到基态。利用激发光(EL)激发分子以发出较长波长荧光(FL)这样的整个过程被用于荧光显微术中。
在二十世纪早期，August Kohler和Carl Reichert对荧光显微术进行了最初研究。Otto Heimstadt和Heinrich Lehmann在1911年论证了第一个实用荧光显微镜。短时间后，Stanislav von Provazek和Alfred Coles使用称作“荧光染料”的有机染料来得到次生荧光。Max Haintinger彻底调查了可以用于组织部分以及荧光染料着色的器官的研究的次生荧光。然而，在1941年，当Albert Coons研制了一种利用荧光染料标记抗体(“荧光标记抗体”)的技术时，荧光显微术的真正革命才出现，并由此引入了荧光免疫检验法领域，这在现在是一种标准方法。
荧光显微镜的主要功能是利用特定波长(激发光)光照射标本，利用荧光激发该标本的分子，接着从该激发光中分离出微弱发射的荧光，从而能够观察该发射的荧光。特定光源和存在的两个滤光器的典型特征在于该荧光显微镜的光路：一个滤光器设置在聚光器前，而另一个滤光器设置在物镜之后。该第一个滤光器仅仅透过激发的辐射，而第二滤光器仅仅透过发射的荧光。因此，入射到标本上的激发光被去除，同时荧光被导向到观察者眼睛或者被导向到记录装置。该光源应当提供短波长光，例如UV和/或蓝紫光。目前，在一般的使用中有两种荧光显微镜的不同光学设计：一个使用透射光照明(“完全荧光显微术法”)，另一个利用反射光(“上荧光显微术”)。
荧光激发需要的波长光用激发滤光器选择，其仅透射激发光并抑制所有其它波长的光.激发光的一些部分被样本吸收，并几乎立即重发射较长波长作为荧光.阻挡滤光器透射荧光(发射光).穿过标本或从样本反射的激发光的剩余部分被阻挡滤光器吸收.结果，观察到(或记录)以黑色背景为对照的样本的彩色图像.
早期的荧光显微镜通常是配备有激发和阻挡滤光器的明视场透射光显微镜。该透射光荧光显微镜通过使用暗视场聚光器被大大改进。暗视场聚光器将光以倾斜的角度投射到样本上，这样避免了激发光直接进入物镜。常规的透射光荧光显微镜存在的一些难题使反射光荧光显微镜成为许多使用者选择的仪器。虽然透射光荧光显微镜已经被证实在许多应用中是有价值的，但该技术具有一些缺点，其包括以下方面：(1)物镜的数值孔径需要减小，以防止激发光进入该物镜，这反过来减小了光的强度和分辨率；(2)常规的暗视场方法非常浪费光(即，不是非常高效)；(3)一些使用者发现很难对准暗视场聚光器；(4)发出的荧光在到达物镜前穿过了样本，从而该光被部分吸收并散射，其导致了散射和强度降低的图像；以及(5)传统的暗视场技术排除了同时利用相位显微术或Nomarski微分干涉对比显微术进行荧光观测。由于使用暗视场透射荧光显微术(完全荧光显微术)的所有这些问题，所以通常优选明视场反射荧光显微术(上荧光显微术)。
自然光
光有时被称作一类电磁辐射，因为光波包括了电场和磁场形式的能重。除了我们能够看见的光之外，电磁频谱还包括频率低于可见光的无线电波、微波、和红外光。在该频谱的上端是以高于可见光的频率传播的紫外线辐射、X射线、和伽马射线。
波长是在连续光波上任何两个相应点之间的距离。波长以距离单位测得，通常是十亿分之一米。人眼能够看到的波长在400和700十亿分之一米之间。频率是在任何时间间隔之间在空间中经过一点的波数，该时间间隔通常是一秒。频率以每秒波数为单位测得，或者是赫兹(Hz)。可见光的频率被称为颜色。例如，以430万亿Hz传播的光被视作红色。
光的波长与频率的关系由一次方程给出：
f＝c/L
其中c为真空中的光速(每秒299，792，458米)，f为以赫兹(Hz)或每秒周期为单位的频率，以及L为以米为单位的波长。
显微镜分辨率
光学显微镜的分辨率或分辨能力可用Abbe的公式计算出：
D＝L/2NA
其中，D为以米为单位的显微镜的分辨能力，L为以米为单位的入射光的波长，以及NA为显微镜的数值孔径。该数值孔径通常表示入射到观察标本上的光的角度。
光散射
当光波穿过标本时，大部分光沿其原始方向继续，但少部分光被散射到其它方向上。用于照射该标本的光被称作入射光。穿过各标本的入射光的散射被Lord John William Strutt、在随后的1800年代被三世Baron Rayleigh(LordRayleigh)、之后被Albert Einstein等人研究。
Lord Rayleigh观察到小部分散射光显现出与入射光相同的波长。由于这个观察，以与入射光相同波长被散射的光被称作瑞利散射(也称作共振散射或弹性光散射)现象。
在1922年，Arthur H.Compton观察到一些散射光具有与入射光不同的波长.Compton发现，当光穿过标本时，一些光使标本分子的电子散射离开，产生X射线范围频谱的散射光.
Raman散射
在1928年，Chandrasekhara V.Raman教授和K.S.Krislman教授发现，由Compton观察到的散射光是由标本分子中的振动引起的。由于他的发现，由标本分子中的振动引起的散射的光现象被称作Raman散射(也称作非谐振或无弹性光散射)。1930年，Raman由于其发现获得了诺贝尔物理奖。
当标本被入射光穿透时，光和标本分子之间的能量被交换。分子振动，产生通常所说的Raman散射现象。分子振动导致标本自身发出散射光，其中一些以比入射光频率(f)更高的频率(f+Δf)散射，一些以较低的频率(f-Δf)散射。Δf代表由Ranan散射产生的频率变化(有时也称作频移)。
总之，当入射光穿透标本时，散射光包括与入射光相同频率(f)的瑞利散射光、较高频率(f+Δf)的Raman散射光、和较低频率(f-Δf)的Raman散射光。
依赖于标本的强度
由于Raman散射光是由标本内的分子振动产生的，因此Raman散射光的强度依赖于所观察到的标本类型。例如，血液细胞标本可产生高强度的Raman散射光，而皮肤细胞标本可产生低强度的Raman散射光。控制Raman散射光的分辨能力的一种方法是通过使用暗视场聚光器来将入射光聚焦在标本上。
暗视场显微术
显微术中的暗视场观察使用聚光器将入射光成形为其顶点或焦点被引导朝向标本的锥形光。暗视场聚光器通常包括在中心设置的不透明光圈和一个或多个内透镜或反射镜，以将该光成形为期望的中空锥形。该不透明光圈阻挡大部分的入射光，仅仅允许中空柱形的光进入该聚光器。
在暗视场显微术中，如果在显微镜工作台上没有标本，并且聚光器的数值孔径高于物镜的数值孔径，那么锥形光线聚焦在工作台上或其附近，然后发散到工作台之外，从而它们不进入该物镜，因此观察到的视场显现为黑暗。当存在标本时，锥形光线穿透标本并被标本产生光学不连续的各种特征散射、衍射、反射、和/或折射。这些光线中的一些进入物镜，显现出标本的特性，这些特性以黑暗背景出现。
许多类型的聚光器是可以得到的，并且今天还在使用。在心形暗视场聚光器中，入射光从中心不透明的光圈周围穿过，穿透凸镜，然后穿透具有球形表面和心形表面的内凹镜。抛物面暗视场聚光器与心形暗视场聚光器作用大体相似，除了内反射镜的形状是抛物面外。在Abbe暗视场聚光器中，入射光从中心不透明的光圈周围穿过，然后穿过普通的凸透镜，最后穿过一第二透镜。Abbe暗视场聚光器可以包括可变内孔径。其它类型的暗视场聚光器包括双心、双球状(bispheric)、卡塞格林、双心光斑环(spot-ring)、和纳尔逊-卡塞格林。
在入射光从中心不透明光圈周围穿过后，光被成形为类似薄壁的中空柱形.该中空柱形光接着穿透该内透镜或反射镜，在那里光被折射成期望的中空锥形光.光的折射通常在内透镜元件的周边附近发生，在那里的光学修正常常是最差的.因此，为了获得精确的中空锥形光，该内透镜被高精度地制成，以避免产生畸形.透镜和反射镜的精确研磨大大提高了暗视场聚光器的成本.
暗视场聚光器中的不透明光圈被仔细地与中心对准，以产生均匀的中空柱形光。较差居中的光圈会歪斜中空锥形光，导致不均匀的照射和其它不期望的影响图像质量的光学效果。由于聚光器需要非常精确的对准，因此它通常由高熟练的操作者对准暗视场显微镜系统。该对准灵敏度也使暗视场系统会因微小振动而损坏。
由于该不透明的光圈阻挡了大部分的入射光，因此通常需要强光源。除了浪费之外，高能光源的操作和维修还是很昂贵的，并且产生的过多热量还导致了不期望的对聚光器体、显微镜工作台、和标本的加热。
因此，可以看出，存在改进装置、系统和方法以利用较好的分辨率实时观察活生物标本的需求，包括实时地观察它们的细胞结构和功能。本发明首先是要提供满足这些和其它需要的这种装置、系统和方法。
发明内容
本发明以不同的形式提供了一种用于显微镜的改进的照明系统，它提供出色的分辨率和图像对比度，并且对样本照明提供非常有效的光利用。在本发明的一个实施形式中，该照明系统包括具有与暗视场聚光器耦合的光源的照明装置，该暗视场聚光器用于将中空的锥形光聚焦到处于观察的标本上。本发明还包括用于提高到该标本的光传输的节省的适配器。该照明装置的元件优选容纳在一个整体的外壳内，和/或基本上刚性地与另一个耦合以保持对准并使得安装和使用高效。本发明的该系统和方法特别适于与荧光显微术技术配合。
在一个方面，本发明是一种用于显微镜的照明装置。该照明装置优选包括至少一个光源用于产生光以照明用于显微观察的标本，至少一个准直透镜用于准直由该光源产生的光，以及一暗视场聚光器，用于接收经准直的光并将中空锥形光导向待观察的样本上。
在另一方面，本发明是一种用于显微镜的照明系统中的光传输的光导或适配器。该适配器优选包括相对于该适配器纵轴中心设置的并在其一端具有总体平面的衬垫面的衬垫。该适配器还优选包括定位在该衬垫周围的多根光纤，该多根光纤中的每根具有一端面基本上垂直于该适配器的纵轴并定位成靠近该衬垫表。
在又一个方面，本发明是一种用于显微观察标本的系统。该系统优选包括一透射光显微镜，和一照明装置，用于利用该显微镜将光聚焦到待观察的标本上，该照明装置优选包括一光源、准直透镜和暗视场聚光器。
在另一方面，本发明是一种显微观察标本的方法，该方法包括将照明装置耦合到透射光显微镜的步骤，其中该照明装置包括用于将中空锥形光聚焦到标本上的暗视场聚光器和用于将光透射到该暗视场聚光器以便该照明装置产生内反射光的光源。
在又一个方面，本发明是一种显微观察标本以诊断存在的病原体的方法。该方法包括将照明装置耦合到透射光显微镜，其中该照明装置包括用于将中空锥形光聚焦到标本上的暗视场聚光器和用于将光透射向该暗视场聚光器的光源。
在另一方面，本发明是一种用于显微镜的照明装置，该显微镜具有至少一个光源，用于产生光以照明样本用于显微观察，至少一个准直透镜，用于将由光源产生的光准直，一暗视场聚光器，用于接收经准直的光并将中空锥形光导向待观察的标本上，以及一适配器，用于提高光从光源透射到暗视场聚光器的效率.
在另一方面，本发明是一种产生待显微观察的样本的全色荧光图像的方法。该方法包括利用具有至少一个强度峰值波长的光照射样本、以及利用该光在待照明的样本内诱发荧光。
在又一个方面，本发明是一种显微观察样本的方法，包括该样本的同时荧光观察和超分辨率成像。
在另一方面，本发明是一种样本实时成像的方法。该方法包括将多个荧光标签加到该样本上，并同时观察由该荧光标签所标记的多个细胞特征。
在又一个方面，本发明是一种产生衰减驻波的方法，其包括将照明引导通过高孔径聚光器，并使光内反射以比临界角更大的角度离开界面。
在另一方面，本发明是一种减少待照明样本中的光致褪色的方法，其包括选择性激发样本中的荧光。
在又一个方面，本发明是一种用于提高显微分辨率的方法。该方法包括利用导向通过高孔径聚光器以产生全内反射的光观察待照明样本。
本发明的这些和其它方面、特征和优点将参照附图和这里的详细说明被理解，并借助于在所附权利要求中特别指出的各个元件和组合加以实现。应当理解，前述的发明内容和随后的附图说明以及具体实施方式都是对本发明示范性实施例的说明，而并非对如权利要求所述的本发明的限制。
附图说明
本专利或申请文件包括至少一个彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的拷贝将通过向专利局请求并支付必要的费用被提供。
图1示出了根据本发明一个示例实施例的用于显微镜系统的照明装置的透视图。
图2示出了图1中的该照明装置的侧视图并以虚线示出了内部光学元件。
图3示出了根据本发明另一个示例实施例的照明装置的截面图。
图4示出了根据本发明又一示例实施例的照明装置的截面图。
图5示出了根据本发明又一示例实施例的照明装置的截面图。
图6示出了结合有根据本发明的照明装置的显微镜系统的透视图。
图7示出了用于与根据本发明一示例实施例的照明装置结合使用的适配器的透视图。
图8示出了图7的适配器的顶视图。
图9示出了图7的适配器的内部衬垫部分的透视图。
图10示出了图7的适配器的部分图示顶视图。
图11示出了根据本发明另一示例实施例的适配器的一部分的局部说明。
图12示出了图11的适配器的部分透视图。
图13A和13B示出了利用现有技术的照明系统产生的神经胶质瘤细胞的图像。
图14A和14B示出了利用本发明的照明系统产生的图13A和13B中的神经胶质瘤细胞的提高了分辨率的图像。
图15A示出了使用现有技术的照明系统、对用三种光学查询标签着色并三次照相产生的牛肺动脉内皮细胞的所得图像，每种着色使用一滤光器，该所得图像是相互重叠的三幅图像.
图15B示出了利用本发明的照明系统成像时图15A的移动，并示出了提高的分辨率。
图16示出了BPAE细胞的图像，该BPAE用用于标记F-肌动蛋白的红色-荧光Texas红色闪毒蕈环肽、与用于标记微管的绿色-荧光BODIPY FL山羊抗体-鼠lgG和用于标记原子核的兰色-荧光DAPI结合的鼠单克隆抗体-微管蛋白着色。
图17示出了利用H(hemoloxylin)和E(四溴萤光素)着色石蜡嵌入组织的第一牙齿的显影图像。
具体实施方式
通过接下来参看作为本公开一部分的附图的详细说明，本发明将更容易被理解。应当理解，本发明不限于这里描述和/或示出的这些特定装置、方法、条件或参数，这里所用的术语仅仅是用于示范性说明特殊实施例的目的，而不是要限制权利要求的发明。同样，如同包括在随后的权利要求中使用的术语，单数形式“一”、“一个”和“该”包括多个，并且涉及的特定数值包括至少该特定值，除非上下文明确给出相反规定。这里的范围可以表示成从“大约”或“近似”的一个特定值和/或到“大约”或“近似”的另一个特定值的形式。当表示该范围时，另一个实施例包括从该一个特定值和/或到另一个特定值。类似的，当数值以近似值表示时，使用“大约”作为前提，应当理解该特定数值形成了另一个实施例。
图1示出了根据本发明一示例实施例，用在暗视场显微术的显微镜系统12上的照明装置10的透视图。如从图1的透视图和图2的侧视图中所更加清楚地看到的，该照明装置10包括加接在光束导向器16的输出端口的暗视场聚光器14。优选地，该暗视场聚光器是心形暗视场聚光器，例如可从尼康公司买到的Nikon#12000暗视场聚光器(浸油的)，其内部的光学元件为本领域技术人员熟知的。优选地，该心形暗视场聚光器的数值孔径为约1.2至约1.4。可替换地，还可以使用其它形式的暗视场聚光器。该暗视场聚光器优选接收来自光源穿过其输入侧的环形狭缝的入射光，并将中空锥形光从其输出侧聚焦并导向到待显微观察的样本上，如接下来更详细说明的。光束导向器16可以是可从EdmundIndustrial Optics买到的C-固定架板(C-mounted plate)分束器#R54-825，或者其它构成为以预期的方式改变光路方向的合适的光束导向器。
在该光束导向器16的输入端口处的是一简单透镜固定架18，例如简单透镜固定架(12.5mm保持器)，可从Edmund Industrial Optics买到的#R55-246，在其中容纳一短传滤光器，例如可从Edmund Industrial Optics买到的的Tech Spec短传滤光器450nm Y478-286。优选地，该短传滤光器阻挡波长比大约450nm更长的光。可变光圈筒20，例如可从Edmund Industrial Optics买到可用的可变光圈筒#R03-623，连接到该透镜固定架18。高对比度UV偏振器22，例如来自Edmund Industrial Optics的高对比度UV偏振器(12.5mm)#R47-327，连接到该可变光圈筒20。微视频成像透镜24，例如可从Edmund Industrial Optics买到的有限共轭MVO微视频成像透镜#R54-854，以及相关联的筒固定架26，例如可从Edmund Industrial Optics买到的30mm筒/C-固定架、15mm延长#R54-630，连接到该高对比度UV偏振器22。热吸收玻璃28，例可从Edmund Industrial Optics买到的tech spec热吸收玻璃(12.5mm直径)#R45-720，连接到该微视频成像透镜24。光导安装适配器30，例如可从Edmund Industrial Optics买到的C-螺纹光导安装适配器#R53-047720，连接到该热吸收玻璃。该光导安装适配器30将光源32通过光导34连接到该照明系统。该光导34或光传输管道可以包括用于容纳并将光从光源传输到目的地的任何不同的部件，包括但不限于简单的管、腔、位于光学元件之间的开放路径、或光缆例如光纤光缆。
优选地，该照明装置10构成为当入射光穿透标本时可以激发拉曼类型光散射。本发明的照明装置10可包括单光源或多光源。优选地，光源32包括金属卤化物光源，例如21瓦特金属卤化物光源。如果该照明装置10包括单个光源，那么优选地，该光源发射以多频率传播的光。当该多频率光穿透标本时，组合现象会激发拉曼散射光，产生高分辨率图像。2004年2月10日出版的U.S专利No.6,690,509和2004年1月15日的U.S.专利申请公开No.US2004-0008522A1，二者在此都被引入作参考，可被参考用于进一步理解由来自单光源的光激发的散射、由来自双光源的入射光激发的散射、和得到的组合现象。
另外，本发明的照明装置10可包括两个光源，它们可以是相同类型或不同类型，例如，但不限于金属卤化物光源、激光器、或紫外线(UV)光源。优选地，使用低功率光源，例如21瓦特金属卤化物光源，以节省能量并减少杂光量。在该实施例中，照明装置10可包括光组合器，例如在U.S.专利No.6,690,509中所述的。该光组合器将由两个光源发出的光组合并产生单一的能够向显微镜传输的组合光。当该组合光中不同频率的光穿透标本时，该组合现象激发拉曼散射光，其产生高分辨率图像，如U.S.专利No.6,690,509中较详细描述的。
如同在图2的侧视图中更加清楚看到的，装置10优选地具有带外壁42和内壁44的壳40。为了清楚的说明，图2以虚线绘制了一些内部光学元件。该内壁44在其中限定了一腔46，用于容纳来自光源32的光。来自光源34的光48A通过光导34进入该照明装置10的腔46，并穿过第一准直透镜50和第二准直透镜52。该第一和第二准直透镜50和52用来准直光，或换句话说，产生平行光线。在这个方面，该准直过程去除了或过滤了非平行光线。通过准直用于照明标本的光，能够提高所得到的图像的分辨率。另外，准直光不容易受显微镜系统中任何光学元件的极小的缺陷影响而变形。优选地，准直透镜50和52中的一个或二者都可在平行于光路的方向上调整或移动，以将光聚焦在希望的位置上。该透镜50和52和/或该壳40还可以包括用于调整该透镜对准的机构。
该准直光48B被引导到该光束导向器16的平面镜56上，并反射到暗视场聚光器14中。在该描述的实施例中，该平面镜56以大约45°角定位，以将光48C沿着90°光路反射到暗视场聚光器14中。该暗视场聚光器14自身具有内部光学元件，用于控制光路以输出中空锥形光。例如，在该描述的实施例中，该暗视场聚光器14具有一凸镜58，其将光反射到凹周边反射镜，该凹周边反射镜依次又向外引导光锥，使其顶点导向导向标本55。接着，该光照射通过激发拉曼散射而观察的该样本或标本55。该照明系统10的精细聚焦允许该焦点定位在标本内的任何深度处。而且，光被导向标本的角度可被调整以产生提高的分辨率。
由于光与标本的交互作用引起的特殊光学效应产生了额外的对比机制.该照明装置10在一些方面与差动干涉对比显微镜(“DIC”)类似，但该照明装置不要求必要的定位条件，具有较好的对比度，能够用于显现非常小的微粒，并能够以双折射标本使用.
图3绘制了根据本发明另一示例实施例的照明装置10’。该照明装置10’基本上与照明装置10类似，但除了这里所记录的外。该照明装置10’具有三透镜的准直器，包括透镜50’、52’和54’，用于准直来自光源32的光。来自光源的光透射穿过适配器100，适配器100的功能和结构接下来将更详细地说明，并进入该壳40’的内腔46’。由透镜50’、52’和54’准直的光接着被光束导向器16’反射进该暗视场聚光器14’，该光束导向器16’具有以大约45°角定向的平面镜56’。
图4绘制了根据本发明又一示例实施例的照明装置10”。该照明装置10”基本与照明装置10类似，除了这里所记录的外。来自光导34”的光进入该壳40”的内腔46”，并接着穿过定位在靠近光束导向器16”的两个准直透镜50”和52”，该光束导向器16”具有以大约45°角定向的平面镜56”，以将该光反射向该暗视场聚光器14”。进入该暗视场聚光器14”的光接着被该暗视场聚光器的内部光学元件处理，并且从该暗视场聚光器出来的光形成具有其顶点被导向该标本的中空锥形。虽然未示出，但是该照明装置10”壳可以包括一个或多个定位元件，用于改变该准直透镜50”和52”的位置。
图5绘制了根据本发明的另一示例实施例的照明装置10’”。该照明装置10’”基本上与照明装置10”类似，除了这里所描述的外。来自光源34’”的光透过适配器100，并进入壳40’”的内腔46’”。该适配器100提高了光的节省，从而允许使用低瓦特的光源，接下来以更详细的方式描述根据本发明的适配器的实施例形式。来自该适配器100的光接着被光束导向器16’”反射向该暗视场聚光器14’”，该光束导向器16’”具有以大约45°角定向的平面镜56’”，以将该光反射朝向该暗视场聚光器。一旦反射，该光穿过定位靠近光束导向器16’”的输出端口处的两个准直透镜50’”和52’”。接着，进入该暗视场聚光器14’”的光被该暗视场聚光器的内部光学元件所处理，并且从该暗视场聚光器出来的光具有其顶点被导向标本的中空锥形。如图5中所绘制的，该照明装置10’”可包括一个或多个定位元件68，用于改变准直透镜50”和52”的一个或两个的位置以在该入口处将光聚焦到该暗视场聚光器。其它定位元件也可用于调整这里所描述的任何元件，例如光束导向器16’”中的内反镜56’”，适配器100相对于该暗视场聚光器14’”或其它元件的对准，以及光在其路径中传播传输的任何元件的一般对准。在上述示例实施例中，照明装置的准直透镜或透镜的焦距，不管使用的是一个还是多个透镜，大约为10mm。
图6绘制了一种能够结合根据本发明的包括上述说明的照明装置10、10’、10”和10’”中的任一个的照明装置使用的显微镜系统12。该系统12优选包括定位在设计成抑制振动的抗振动台或平台72上的显微镜70。例如，该显微镜70可以是可从Olympus Corporation买到的Olympus BX51显微镜，不过本发明设计考虑到了使用任何不同的透射光显微镜。该抗振动工作台72可以是例如可从Technical Manufacturing Corporation买到的抗振动工作台TMC型号#66-501。另外，该系统12包括计算机系统74，其包括处理器76、监视器78、和输入装置，例如键盘80和鼠标82。在一示例实施例中，该计算机系统74是PC IBM商业系统，P4-3.2Ghz/1GB/120GB/DVD-CD-RW/IEE 1394 PCI/XPP。例如，该系统12还优选包括摄像机84，具有关联的控制面板在靠近目镜处连接到该显微镜70，用于记录标本的细胞过程。该摄像机84经由接口86连接到该计算机处理器76，以便能够在该显示屏上显示图像。在一示例实施例中，该摄像机84是可从AVA Astro Corporation买到的Astrovid StellaCam-EX。该接口模块86，例如可从Canopus Corporation买到的高级数字视频转换器(Advance Digital VideoConverter)ADVC100，能够提供位于该摄像机84和计算机系统74之间的接口，不过本发明设计考虑到了其它兼容接口。
如这里说明的，本发明的照明装置的结构提供了比以前周知的系统独特的优点。第一，该照明装置提供照明，例如科勒照明，适于非常高分辨率的成像。并且该照明装置通过分辨与大约100-250nm一样小或更小的细胞特征并探测小于60nm的特征，可以提供“超分辨率成像”。同时，还提供了超高空间分辨率(＜150nm)和对比度，并且探测极限小于60nm。因此，与相位对比度显微镜相比，本发明的照明装置具有较好的分辨率而没有任何显著的图像变形。该照明装置允许在实时出现的同时观察活细胞和细胞过程(与电子显微镜相比，例如，其要求非活细胞，并且在该细胞被“杀死”时改变细胞结构)。此外，使用本发明的照明装置还可避免标本/样本准备技术，例如冷冻、脱水、着色、标记、和金属沉积。利用本发明的照明系统产生的示例性图像示于图14A和14B，与利用现有技术的系统产生的图13A和13B的图像相比，其示出了分辨率相当好的神经胶质瘤细胞。
另外，从不需要被高熟练的操作者对准，不管是相对于样本上下对准还是沿着标本之下的水平轴侧并行地对准来看，暗视场聚光器14是本发明的照明装置的一个固定的、整体元件。然而，本发明的整个照明装置能够向上或向下移动朝向或离开该样本，以将大量光按希望聚焦到样本上。本发明的照明系统的元件优选地在一个基本刚性的组件中与彼此地连接，例如通过在基本刚性的壳中固定这些元件和/或将这些元件直接或间接相互连接。此外，本发明的该照明装置自包含的、便携的，并能够容易安装到各种可买到的透射光显微镜上。本发明的照明装置能够构成为与现有的显微镜一起良好运行而不需要对该显微镜基础作任何修改。换句话说，该照明装置还能构成为孤立的，不需要任何附件固定到正在使用的显微镜上。该照明装置可随意包括一个或多个专门定尺寸和成形以使该装置适合于任何类型的显微镜的底部的支架或环，从而有利于方便改装现有的显微镜。
图7示出了适合于例如结合本发明的照明装置(包括任何上述说明的照明装置10、10’、10”、和/或10’”的示例实施例)使用的光导或适配器100，以提供较好的光节省。此外，该适配器100能够与暗视场聚光器(本发明的照明装置具有或没有的额外元件)组合使用，以便该适配器被定尺寸和成形以适合该暗视场聚光器的腔，由此在该光源和聚光器之间提供符合尺寸。在这种实施例中，该适配器100优选地具有普通的圆柱壳，该圆柱壳包括尺寸与该暗视场聚光器中的腔的内壁上的螺纹匹配的外螺纹，不过其它特征可用于提供可释放的附件。在可选择的实施例中，该适配器100可永久附连到该暗视场聚光器，以形成单独的整体单元。
当结合本发明的照明装置使用时，适配器100优选定位在光源和光束导向器之间，并被相应地定尺寸和成形，例如如图5所示.该适配器100可以是单独的元件或与该照明装置的一个或多个其它元件为一整体或相耦合.在该适配器和照明装置之间基本刚性的耦合(直接或间接地)，例如通过提供在整体壳内的两个、其间的螺纹连接、压配合连接等，能够有利于保持穿过本发明的系统的光路的对准，从而有利于有效的安装和操作.如同图7-12中更加清楚看到地，在不同的形式中，该适配器100优选包括壳102和内部衬垫104，该内部衬垫104定位用以将入射光引导向该壳102的周边.一根或多根光纤106位于壳102的周边，以致于使该入射光能够传播穿过该一根或多根光纤106.优选地，该光纤106或细丝捆在一起成为光纤光缆108.该光缆108将来自光源32的光透射向该壳102，其中单个光纤106被分离并分散在该衬垫104周围以形成环形的光纤端部束.
如图7所示，中心轴110在与使用中的暗视场聚光器和显微镜的定向基本平行的方向上延伸穿过该适配器100。优选地，光纤106被分离并定向成环绕该衬垫104，以产生环形光线，在与该中心轴110基本平行的方向上传播。环形的直径和厚度优选构成为近似匹配该照明装置的暗视场聚光器的环形入口狭缝的尺寸。该环形光线从而形成中空圆柱光，其优选与照明装置的暗视场聚光器的环形狭缝精确对准，由此基本上来自光源的全部光被有效的传送到标本，进一步提高了光利用效率并使得低瓦特的光源能够提供改进的照明。该适配器与照明系统的其它元件的对准优选由在基本上刚性壳中容纳的元件、和/或在其间直接或间接耦合来保持，例如利用一个或多个螺纹耦合。
该壳102包括第一端部分112、中间部分114、和第二端部分116。入口118位于第一端部分112的远端120，出口122位于第二端部分116的近端124。优选地，该壳102在远端120的方向上具有锥形剖面。同样优选地，第一部分112通常是圆柱形并成形为接收光纤束106。该中间部分114优选地为平滑弯曲的或呈阶梯状的，从其与该第一端部分112的交叉处的最小直径逐渐膨胀至其与第二端部分116的交叉处的最大直径。该第二端部分116优选通常是圆柱形，具有足够容纳该光纤106和内部衬垫104的直径，以及具有足够允许该光纤106在朝向该壳102的出口122上更平行于该中心轴110地定位的长度。
如同图7和8中更清楚示出的，光纤106在衬垫104周围展开，形成环带140。优选地，光纤106的分离通常是辐射状的，不过由于光纤的内反射特性不需要精确的辐射定向。光纤106可利用适配器100内部的摩擦力和弹力被适当的保持，利用或不用粘胶或其它固定装置都可以。光纤106优选在或靠近壳102的出口122处终止在该适配器100的端面126中。每个端面126优选几乎垂直于光纤106的纵轴被切割，以减少来自光纤体部分的光的任何不平行干涉。另外，该端面126可被平滑抛光以进一步提纯将要发射的光。该壳102和内部衬垫104优选构成为帮助引导该光纤106朝向相对于该中心轴110基本平行的定向。另外，该衬垫104在靠近该衬垫104的顶部优选包括基本上圆柱形的侧面，以更好地定向该光纤。
图9是内部衬垫104的透视图说明。优选地，该衬垫104具有基本上半球形部分130，和具有平面端面134的基本上圆柱形部分132。该基本上圆柱形部分132具有外壁136，用以帮助保持光纤106在靠近端面134处在基本上平行的方向上对准。该基本上圆柱形部分132具有长度L1，足够允许该光纤106变成更平行于该中心轴110的定向。该衬垫104可由半刚性塑料或任何其它合适的具有足够的硬度以保持分离的光纤106并足够弹性以适当保持该光纤的材料制成。优选地，该衬垫104按照光纤106的尺寸和数量来定尺寸和成形，从而该衬垫104和光纤106一起有效地充满壳102内的有用空间。在一示例实施例中，该衬垫104的直径近似于暗视场聚光器的不透明光圈的直径。在一变形实施例中，该衬垫104的直径可稍微大于该不透明光圈的直径，从而产生的中空圆柱形光等于或小于聚光器的入口孔径。采用该方式，被导向到该适配器100外围的大部分光进入该暗视场聚光器，用于在照射标本中使用，因此提高了效率。
本发明还包括一种利用数学模型确定希望的衬垫尺寸和光缆束尺寸用以充填可用空间的方法.利用图10中示出的参数，该方法从计算在该适配器100的出口122处该环形开口的表面面积(S)开始：
S = π 4 × ( D 2 - d 2 ) = 2 πρδ - - - ( 1 )
其中D为壳102的第二部分116的内部直径；d为衬垫104的基本上圆柱形部分132的外部直径；ρ为该环形开口140的平均半径；δ为环形开口140的宽度；以及df为光纤106的直径。进入到该暗视场聚光器中的光束的面积(SL)可被记成：
SL＝πD2/4             (2)
该光纤可以六边形阵列或晶格排列以最优化该空间。在该情况下，充填密度(f)等于：
f = π 3 / 6 ≈ 0.907 - - - ( 3 )
从公式(1)和(3)，由密集捆扎的光纤占据的表面面积(Sf)可近似为：
Sf＝2πfρδ          (4)
具有直径df的需要去充填该适配器的光纤数目(Nf)等于Sf与由单根光纤占据的面积(pidf 2/4)的比。因此，
N f = δfρδ / d f 2 - - - ( 5 )
如果光纤束的直径为db，那么该束的截面面积(Sb)可表示成：
Sb＝πdb 2/4          (6)
从公式(1)和(6)，该束的直径可被计算出：
d b = 2 2 ρδ - - - ( 7 )
因此，本发明还包括一种利用计算出的直径db来确定束或光缆希望的尺寸的方法。
适配器100的效率(K)可被描述成穿过具有适配器的暗视场聚光器14的光能量与没有适配器的能量的比。忽略光纤和透镜中的少量损耗，该效率K可近似利用公式(1)和(2)得出：
K＝D2/(D2-d2)       (8)
例如，在暗视场适配器100中，其中该壳102的第二部分116具有等于16毫米的内部直径D，并且衬垫104的基本上圆柱形部分132具有等于14mm的外部直径，下列参数可被近似：
·壳内部半径，R＝D/2＝8mm。
·衬垫外部半径r＝d/2＝7mm。
·环形开口平均半径，ρ＝(R+r)/2＝7.5mm。
·环形开口宽度，δ＝R-r＝1mm。
假定光纤具有0.1mm的直径(df)，并使用公式(5)，束中的光纤数量(Nfz)可被估算为：
Nf＝8×0.907×7.5×1/(0.1)2＝5442根光纤。
该束的直径，根据公式(7)，可被表示成：
d b = 2 × ( 2 × 7.5 × 1 ) = 7.75 mm ≈ 8 mm
以及该适配器的效率K可被计算为：
K＝162/(162-142)＝4.27
在此例子中，与没有使用适配器的能量传输相比，具有上述所示参数的适配器100透射大约四倍或更多倍的光能量到该暗视场聚光器14中。
适配器100’的一替代实施例描述于图11和12中。在该实施例中，适配器100’包括准直腔150。代替光纤106在与衬垫130的面134共面的端面126中终止，如上述说明的实施例，光纤106’在中间端面152处终止，如图12中更清楚示出的。在该实施例中，该准直腔150通常由中间端面152的平面、衬垫的外壁136’、壳102的第二部分132的内壁154、和出口122’的平面限定。在一些实施例中，光纤106’被捆在一起形成光纤光缆108’。在一些实施例中，如在图11和12中所示，光纤106’绕衬垫104’相互分离且定向以便产生以基本上平行于中心轴110’的方向穿行的环形光线。
如图11的截面图所示，从中间端面152发出的光线156包括平行光线156A和非平行光线156B。优选地，内壁154和外壁136’具有深色或不透明颜色，或以其它方式处理成吸收非平行光线156B。在该方面，该准直腔150有助于进入显微镜70或照明装置10(依赖于该系统是如何构成的)的光准直。优选地，任何非平行光线156B被吸收或被以其它方式阻止进入该暗视场聚光器，而平行光线156A穿过该出口122’并进入聚光器。该准直腔150具有足够允许吸收非平行光线156B的长度L2。所示该长度L2通常比衬垫104’的基本上圆柱形部分132’的长度L1短；然而，其它结构也考虑到了，并也可足以实现本发明的适配器100’的准直效果。在具有准直腔的该实施例中，光纤106’的端面152的精度和抛光在由适配器100’产生的准直度方面不是关键的，因为来自非完美抛光表面的、没有垂直导向的任何光线将不会进入该聚光器。然而，光纤优选是经过抛光的。如果壳154的内表面和衬垫104的外表面被抛光并被镜面化，那么光的透射将达到最大化，这是因为来自光纤的倾斜光利用镜面之间的反射将还被导向该聚光器。在该情况中，光效率非常高，能够在不是全黑(即，略微混浊的背景)的背景上观察到图像。对于一些应用，上述布置是可接受的。然而，如果壳154的内表面和衬垫的外表面变黑，那么即使该光传输降低，该图像的背景还会非常黑。这种布置对于获得高对比度和高分辨率是有用的。
对配备或没有配备本发明的适配器的本发明的照明装置的一个有利的已知应用，是其与荧光显微术结合使用可更好的观察标本。例如，荧光标记或光学查询标签，例如但不限于Texas红染料、荧光素、DAPI(或4’，6-二脒基(Diamidino)-2-苯吲哚(phenylindole))、有机荧光染料、刚果红、金属纳米粒子像例如金纳米粒子、或量子点，被施加到将被诱发荧光并观察的样本。一般地，使用这类标记的通常荧光显微术标记技术是本领域熟练人员所周知的。在暗视场显微术中，金属纳米粒子和量子点是优选地。可买到的金属纳米粒子通常具有大约几个纳米的尺寸，并且它们产生非常强的散射，这在暗视场显微术中是有效的。量子点是半导体纳米粒子，通常具有几个纳米的尺寸。它们是强荧光的，并能够用暗视场成像观察到。根据本发明，具有暗视场聚光器的照明装置可改进成现有的显微镜12，然后可以在这种显微镜下观察/研究/记录该样本。
而且，本发明的该系统和方法通过同时使用多个荧光标签(多个颜色)能够产生实时的图像记录(即，不需要多重曝光，并且不需要不同的带通滤光器)，这允许观察并记录多个细胞和细胞内交互作用.在图15B中可以更加清楚地看见一个例子.图15B的图像示出了与图15A(现有技术)相比更好的分辨率.特别的，向样本施加三种不同的标签.示出牛肺动脉内皮细胞的备有#1载片的
Figure G200580019890XD00191
被与Mito Trakcer Red CMXRos一起孵化以标记该线粒体。在固定和渗透后，该细胞被BODIPY FL phallacidin着色以标记该F-肌动蛋白纤丝并最后再被DAPI着色以标记该核子。在图15A中，通过使用单独的适合Texas红染料、荧光素和DAPI的带通滤光器获得多重曝光图像。在图15B中，示出较好分辨率的单个图像由本发明的照明装置产生而不使用任何滤光器。如这里更加详细论述的，与通常仅仅适用于对死的或非活细胞的现有技术相比，本发明的照明装置允许活细胞被诱发荧光并观察。
另外，分子探针(能够结合到特定蛋白质、细胞膜、核等的抗体或肽)可与光学查询标签(纳米粒子、量子点、染料)配对，并且这种复合体能够被引入到细胞。当该复合体结合目标分子时，该光学查询标签提供额外的对比度。可选的，穿透增强剂，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或二甲亚砜(DMSO)可与该光学查询标签结合使用。由本发明的照明系统产生的附加图像示于图16和17中。接下来将说明本方法的附加优点。
与本发明的照明装置结合的这种荧光技术在各种临床应用中是狠有用的，例如性传播的疾病的快速准确的检查，例如衣原体。例如，在根据本发明方法的实施例中，卫生保健专业技术人员收集来自病人的尿样。荧光素着色的抗体被加到该尿样，与该衣原体细菌结合，并在具有本发明的照明装置的显微镜光下发出荧光，提供衣原体存在或不存在的指示。本领域技术人员应当理解，本发明能够应用到许多其它应用中，包括涉及在生物样本中快速准确的检测传染物或病原体的存在的应用，也落在本发明的范围内。
本发明的照明装置与荧光显微术结合使用的一个显著的优点是，被观察的图像的空间分辨率和对比度通过最小化在样本上的斑点尺寸和减少杂光被提高。该斑点可通过向上和向下移动整个照明装置(不仅仅是暗视场聚光器)朝向或离开将被观察的标本，来进行定位，例如使用人工或电动定位调整机构。最小化斑点的尺寸增加了样本的辐照度(每单位面积的能量)并由于增加了的与样本最小粒子的交互作用而增加了对比度，否则这就不会产生足够的可见光。由于照明强度的增加，小的光散射粒子与其背景之间的光学差异增加了。在更高的照明下，更小的粒子散射足够的光以可视。即使粒子的尺寸小于50nm，该粒子也能被看见。小的蛋白质聚合体(类蛋白体)和嗅觉纤毛的移动能够利用本发明的系统和方法被看到并照相，该小的蛋白质聚合体(类蛋白体)和嗅觉纤毛的直径都小于100纳米，并由于太小而不能在明视场或DIC(微分干涉对比度)照明中被看到。该照明装置的高输出数值孔径允许利用该物镜的高数值孔径的全部优点，从而产生高亮度超分辨率图像。
与荧光显微术结合使用的本发明和方法的另一个显著的优点是，在本发明的照明装置的实施例形式中使用的优选金属卤化物灯产生一些强的光谱线，其能够与样本交互作用以产生特殊的光学效应，与通常具有连续的光谱的白炽灯或卤素灯相反.本发明的照明装置允许更有效的使用光.金属卤化物灯的强度主峰出现在313、334、365、406、435、546、和578纳米处.从该照明装置出射的光穿过该样本，与该分子交互作用，并诱发荧光.由于本发明的照明装置提供高效的照明，所以几乎来自光源的全部光被用于照射该样本，从而高效地保守住了光能.该照明装置的实施例形式的聚光器的几何结构和高孔径为产生衰减波提供了条件，大大提高了显微镜的分辨率，和全内反荧光(TIRF).当光以大于临界角(该临界角是折射角度为90度的入射角度)的角度被内反射离开界面时形成衰减波，从而产生全内反射.当次级微米尺寸的结构定位于非常靠近产生衰减波的该界面时，其与该结构交互作用，并产生散射和荧光.荧光的选择性地激发消除了焦点外的光并减少了光致褪色，这在常规的显微镜中典型地出现.
与共焦显微镜不同，本发明通过将其焦斑减少至近场大小，实现了其三维分段，以便能够实现宽视场实时探测而不需要扫描。通常公认的是，TIRF现象仅仅发生在非常靠近玻璃/样本的界面处，在那里光从具有高折射率的介质进入到具有低折射率的介质中。实际上，衰减波现象被延伸超过玻璃/水界面，，只要两个相邻表面的折射率存在梯度。与细胞内液之一相比，许多内细胞结构具有高折射率。细胞膜的折射率约为1.46，而细胞质相对于盐水的平均折射率为1.02，并且细胞质的折射率在横过细胞直径上变化，中心处的折射率是边缘处折射率的1.6倍。由此，以全内反射角度进入该细胞内界面的光也沿着这些表面产生衰减波，并在靠近这些界面的结构中产生荧光。衰减波荧光与本发明的高输出数值孔径一起，允许利用物镜的高数值孔径的全部优点，并利用例如21瓦特光源的低瓦特光产生高亮度超分辨率和荧光图像。当存在玻璃-金属界面时，该系统能够产生表面等离子。本发明的该系统还在每个每个角度经由光柱为驻波全内反射荧光创造条件。
与荧光技术结合使用的本发明的照明装置和方法还增加了结果图像的清晰度和强度。样本中任何深度处的焦点精细调焦和定位允许该照明装置将照明焦点刚好定位在非常靠近物镜的样本的上表面以下。这防止了发出的荧光不得不在到达物镜前穿过该样本的整个厚度。从而，与传统的显微镜典型的不够清晰的图像相比，获得了清晰和强烈的荧光图像。
本发明的该系统和方法还有利于消除了对激发滤光器和阻挡滤光器的需要，该激发滤光器和阻挡滤光器通常在传统的荧光显微镜中使用。由于本发明的照明装置从入射光和样本的交互作用(散射和荧光)产生的光中产生非常有效分离的入射光，因此消除了对激发滤光器和阻挡滤光器的需要。当不使用滤光器并且在样本中存在荧光时，由装配有本发明的照明装置的透射光显微镜产生的图像包括重叠的超分辨率图像，其将没有荧光物存在于荧光图像。与相位对比度显微术相反，本系统提供较好的分辨率并没有图像变形。利用本发明的照明装置产生的图像与Nomarski微分干涉对比度(DIC)显微术相似，但它们不需要预先必须的定向，而且它们具有较好的对比度和分辨率，使用者能够目视非常小的粒子，并且它们花费较少即可获得。因此，与利用该照明装置的超分辨率成像一起同时荧光观察的使用方法比将荧光观察与相位和DIC显微术结合更为有利。
因此，可以发现，与荧光显微术方法结合使用的本发明的照明装置，惊人的克服了传统的透射荧光显微术(完全荧光显微术)的许多问题。
另外，配备有本发明的照明装置的显微镜系统提供的透射光荧光显微术方法具有比明视场反射荧光显微术(上荧光显微术)显著的优点.本发明的照明装置典型的提供至少四(4)倍的更好的光节省，以便能够使用低瓦特功率电源，例如21瓦特电源；与典型的上荧光(epi-fluorescence)显微镜要求的大约75-100瓦特的较高瓦特相比.本发明的该照明装置不需要二向色镜，并还可任意排除激发和阻挡滤光器，从而提供更好的效率.由于传统的系统的二向色镜的透射效率大约为85％，以及该滤光器的透射效率大约为80％，因此，传统系统的这三个元件的整体效率被计算为大约54％(0.85×0.8×0.8＝0.544).由于本发明的照明装置的表面镜56的效率几乎为100％，因此本发明的透射效率典型地至少比传统的上荧光显微镜好46％.
本发明的照明装置的另一个优点特征是其固有的“冷”光。与典型的上荧光显微术中的固体锥形照明体积相比，本发明的照明装置的照明体积可由空的光锥限定。例如，对于具有大约1.2至1.4数值孔径范围和折射率1.51的空光锥，估计其照明体积要比固体锥形数值孔径1.33的小约2.5倍。因此，与标准的上荧光显微镜产生的图像相比，基于空的和固体的锥形几何体积比例，大约2.5倍小的样本体积可以被经受照明并光致褪色。
此外，本发明的该系统和方法能够以超分辨率图像同时荧光观察。因此，本发明能够更好的观察超小粒子例如量子点，其通常不能利用明视场上荧光显微镜观察到。本发明不需要改变用于多色荧光的滤光器，并且该图像可以按单次“拍摄”(记录)的方式被记录。这表现出比现有的系统大大的进步，在现有的系统中，单独的图像通过利用适用于某些斑点(颜色)的不同带通滤光器获得，并重叠以产生单独的图像。利用本系统和方法，由于不需要滤光器，能够实时获得单个图像。这样，本发明的该系统和方法能够利用多个荧光标签(多种颜色)产生实时图像记录，这允许观察和记录多个细胞和细胞内交互作用。
虽然已经参照优选实施例说明了本发明，但本领域技术人员应当理解，许多改进、添加和删除仍落在本发明由随后的权利要求所限定的范围内。

Claims (21)

1.一种用于显微镜的独立照明装置，包括：至少一个准直透镜，用于准直由光源产生的光；平面镜，用于反射被准直的光；以及暗视场聚光器，用于接收来自所述平面镜的被反射的光并将中空锥形光导向观察中的样本上，其中所述独立照明装置可拆装地附连到任何透射光显微镜以作为单个单元。
2.根据权利要求1所述的独立照明装置，进一步包括光束导向器，用于将来自光源的光导向所述暗视场聚光器。
3.根据权利要求1所述的独立照明装置，进一步包括基本上刚性的耦合装置，用于保持所述光源和所述暗视场聚光器之间的对准。
4.根据权利要求1所述的独立照明装置，其中所述光源是金属-卤化物光源。
5.根据权利要求1所述的独立照明装置，其中所述光源发出具有至少两个不同波长的光。
6.根据权利要求1所述的独立照明装置，其中所述至少一个准直透镜包括多个准直透镜，用于准直来自光源的光。
7.根据权利要求1所述的独立照明装置，进一步包括配件，用于将所述独立照明装置附连到透射光显微镜。
8.根据权利要求1所述的独立照明装置，其中所述暗视场聚光器是整体元件。
9.根据权利要求1所述的独立照明装置，进一步包括适配器，用于提高从所述光源到所述暗视场聚光器的光传输效率，所述适配器包括在中心设置的衬垫和多个环绕所述衬垫的光纤。
10.一种显微观察标本的方法，所述方法包括：
将独立且便携式的照明装置耦合到透射光显微镜，其中所述照明装置包括光源、准直透镜和暗视场聚光器；
使用所述照明装置的所述暗视场聚光器将中空锥形光聚焦到标本上；和
将来自所述照明装置的所述光源的光传输到所述暗视场聚光器，其中所述照明装置对来自所述照明装置的所述光源的所述光产生内反射。
11.根据权利要求10所述的方法，进一步包括将光传输通过适配器，所述适配器包括多个光纤，用于接收来自所述光源的光并将中空柱形光传递到所述暗视场聚光器。
12.根据权利要求10所述的方法，进一步包括向所述标本加荧光标记，并在显微镜下观察样本。
13.根据权利要求12所述的方法，其中观察进一步包括观察活的标本以实时观察细胞过程。
14.根据权利要求12所述的方法，其中将中空锥形光聚焦到标本上进一步包括调整所述锥形光的角度以提高分辨率。
15.根据权利要求14所述的方法，其中聚焦在标本上的中空锥形光的焦斑尺寸被减小至近场大小。
16.根据权利要求10所述的方法，其中基本上所有传输到照明装置的光都在照明装置内被内反射。
17.根据权利要求16所述的方法，其中基本上所有来自所述光源的传输光都对样本进行照射。
18.根据权利要求10所述的方法，其中所述照明装置产生衰减波。
19.根据权利要求10所述的方法，其中传输到所述照明装置中的光被以一角度内反射离开界面，所述角度比临界角大以便产生全内反射。
20.根据权利要求10所述的方法，其中所述暗视场聚光器具有大约1.2至大约1.4的数值孔径。
21.根据权利要求10所述的方法，其中所述光源包括金属-卤化物光源。
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