CN101052725A - T1r异寡聚味觉受体、表达所述受体的细胞系和味觉化合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特异性结合T1R1/T1R3或T1R2/T1R3受体或其片段或亚基的化合物。本发明还涉及包含T1R1/T1R3和T1R2/T1R3的异寡聚和嵌合的味觉受体在鉴定分别对鲜味刺激物和甜味刺激物产生应答的化合物的检测中的用途。此外，本发明还涉及在组成性或诱导性条件下稳定或瞬时共表达T1R1和T1R3，或T1R2和T1R3的组合的细胞系的构成。本发明还提供所述细胞系在基于细胞的测定中用以鉴定鲜味和甜味的调节化合物的用途，所述测定尤其是采用荧光测定成像法检测受体活性的高通量筛选测定。

Description

T1R异寡聚味觉受体、表达所述受体的细胞系和味觉化合物

相关申请的交叉引用

本申请要求在2003年8月6日提交的系列号为No.60/494,071的美国临时申请和在2004年3月9日提交的系列号为No.60/552,064的美国临时申请的优先权，以参考的方式将上述两个临时申请的全部内容引入到本文中。

技术领域

本发明部分涉及T1R受体组装形成功能性味觉受体这一发现。具体地，已发现T1R1和T1R3的共表达导致对包括谷氨酸单钠在内的鲜味刺激物产生应答的味觉受体的产生。此外，已发现T1R2和T1R3受体的共表达导致对包括天然存在和人造甜味剂在内的甜味刺激产生应答的味觉受体的产生。

同时，本发明涉及包含T1R1/T1R3和T1R2/T1R3的异寡聚味觉受体在鉴定分别对鲜味刺激物和甜味刺激物产生应答的化合物的测定中的用途。

本发明还涉及T1R1、T1R2和T1R3的嵌合体和截断形式，以及包含人类、大鼠或人类和大鼠亚基的T1R1/T1R3和T1R2/T1R3受体的嵌合体。

此外，本发明涉及细胞系的构建，所述细胞系在组成性或诱导性条件下稳定地或瞬时地共表达T1R1和T1R3的组合或T1R2和T1R3的组合，所述组合包括这些亚基的截断形式或嵌合形式，以及包含野生型或嵌合亚基的嵌合受体。

本发明还提供所述细胞系在鉴定鲜味调节化合物和甜味调节化合物的基于细胞的测定中的用途，所述测定尤其是通过使用荧光成像法检测受体活性的高通量筛选测定。

本发明还涉及与T1R1/T1R3和T1R2/T1R3受体以及与T1R1、T1R2和T1R3的嵌合或截断的亚基和嵌合受体结合的化合物。

背景技术

味觉系统提供有关外界化学组成的感觉信息。据信哺乳动物至少有5种基本的味觉：甜味、苦味、酸味、咸味和鲜味(见例如Kawamura等，Introduction to Umami：A Basic Taste(1987)；Kinnamon等，Ann.Rev.Physiol.，54：715-31(1992)；Lindemann，Physiol.Rev.，76：718-66(1996)；Stewart等，Am.J.Physiol.，272：1-26(1997))。据认为各味觉由在舌表面发现的味觉受体细胞中表达的一个或多个不同蛋白受体介导(Lindemann，Physol.Rev.，76：718-716(1996))。识别苦味、甜味和鲜味刺激物的味觉受体属于G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族(Hoon等，Cell 96：451(1999)；Adler等，Cell 100：693(2000))。(据信其它味觉由离子通道介导)。

G-蛋白偶联受体介导诸如内分泌功能、外分泌功能、心率、脂类分解和碳水化合物代谢等许多其它生理功能。许多对所述受体的生化分析和分子克隆已揭示有关这些受体的功能的很多基本原理。例如，美国专利No.5,691,188描述了当配体与GPCR结合时，该受体将如何发生构象变化，从而在Gα亚基的表面促使结合的GDP被GTP置换而导致异三聚体G蛋白的激活、并导致随后Gα亚基从Gβ和Gγ亚基上的解离。游离的Gα亚基和Gβγ复合物激活各种信号转导途径的下游元件。

早前假设T1R受体具有甜味受体的功能(Hoon等，Cell 96：541-51(1999)；Kitagawa等，Biochem Biophys Res.Commun.283：236-42(2001)；Max等，Nat.Genet.28：58-63(2001)；Montmayeur等，Nat.Neurosci.4：412-8(2001)；Sainz等，J.Neurochem.77：896-903(2001))，而Nelson等(2001)和Li等(2002)最近已证明分别为大鼠和人类的T1R2和T1R3以组合形式识别甜味刺激物。

但是，在本领域中，还需要新型或改进的调味剂。例如，五种已知的基本味觉之一是谷氨酸单钠(“MSG”)的“香味”或“鲜味”味道。已知MSG在一些人中产生不良的反应，但在MSG人造代替品的鉴定中的进展非常小。已知有一些天然存在的物质能够增加或增强MSG作为香味调味剂的效果，因此在给定的口味应用中将需要较少的MSG。例如，已知天然存在的核苷酸化合物肌苷一磷酸(IMP)或鸟苷一磷酸(GMP)对MSG的香味具有增效作用。但是由于从天然来源分离和纯化IMP和GMP或合成IMP和GMP非常困难和昂贵，因此对于在食物或药物组合物中的大多数商业需求来说，IMP和GMP的实际应用非常有限。目前提供MSG本身的香味或增进任何存在的MSG的效果的较便宜的化合物会具有非常高的价值。同样地，发现新的“高强度”的甜味剂(即它们比蔗糖甜数倍)的化合物也很有价值。

本领域需要的是鉴定和表征具有甜味和鲜味受体功能的受体，鉴定调节(增强或阻断)甜味和鲜味的化合物的测定方法和与这些受体特异性结合的化合物。

发明内容

本发明提供包含人类和大鼠的T1R的各种组合的嵌合受体，所述嵌合受体例如包含人类T1R2亚基和大鼠T1R3亚基的嵌合T1R2/T1R3受体；包含大鼠T1R2亚基和人类T1R3亚基的嵌合T1R2/T1R3受体；包含人类胞外域、大鼠跨膜结构域和大鼠胞内域的嵌合T1R2受体亚基；以及包含大鼠胞外域、人类跨膜结构域和人类胞内域的嵌合T1R3受体亚基。

本发明还提供与本文所公开的T1R1、T1R2、T1R3、T1R1/T1R3和T1R2/T1R3或其分离亚基、片段、嵌合体或截断形式特异性结合的化合物。

本发明涉及以下发现：当T1R的不同组合共表达时，产生对味觉刺激物发生应答的功能性味觉受体。具体地，本发明涉及以下发现：T1R2和T1R3的共表达导致对甜味刺激物产生应答的异寡聚味觉受体的产生。同时，本发明还涉及以下发现：T1R1和T1R3的共表达导致对鲜味刺激物(例如谷氨酸单钠)产生应答的异寡聚味觉受体的产生。

本发明还涉及共表达T1R1和T1R3(包括人类的或大鼠的)或T1R2和T1R3(包括人类的或大鼠的)的细胞系。在一个优选的实施方案中，这些细胞系组成性或诱导性地表达增加量的受体。这些细胞系包括瞬时地或稳定地表达T1R1和T1R3或T1R2和T1R3的细胞。

同时，本发明还提供测定方法，优选为高通量筛选测定方法，所述测定方法利用T1R2/T1R3味觉受体或T1R1/T1R3受体来鉴定调节甜味或鲜味的化合物，优选为高通量的基于细胞的测定方法。本发明还提供包括为确定这些化合物调节甜味或鲜味而进行味道检验在内的测定方法。

本发明还涉及例如与T1R2的N-末端胞外域结合的化合物、与T1R2的富含半胱氨酸结构域结合的化合物、与T1R2的跨膜结构域结合的化合物、与T1R3的跨膜结构域结合的化合物、与截断受体h2TM/h3TM的T1R2的跨膜结构域结合的化合物以及与截断受体h2TM/h3TM的T1R3的跨膜结构域结合的化合物。

附图说明

图1包含人类和大鼠T1R、人类钙敏感受体和大鼠代谢型谷氨酸受体的序列比对。

图2为RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应)扩增的实验结果，所述实验结果表明hT1R2和hT1R3在味觉组织中表达。

图3a～3b为功能性数据(胞内钙应答)，所述数据由稳定表达G_α15的HEK细胞中的不同甜味刺激物所获得，其中所述稳定表达G_α15的HEK细胞在不同浓度的甜味刺激物的存在下用人类T1R2、T1R3和T1R2/T1R3进行瞬时转染(图3a)；人类T1R2/T1R3对数种甜味刺激物产生应答的剂量反应性(图3b)；人类T1R2/T1R3在抗糖尿病植物因子(gurmarin)存在时对蔗糖产生应答，内源性β2-肾上腺素能受体在抗糖尿病植物因子存在时对异丙肾上腺素产生应答。图3c为对不同甜味剂产生的经标准化的应答。

图4为HEK细胞中响应350mM的蔗糖、25mM的色氨酸、15mM的天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和0.05％的应乐果甜蛋白而产生的胞内钙应答，所述HEK细胞稳定表达G_α15，并由hT1R2/hT1R3、rT1R2/rT1R3、hT1R2/rT1R3和rT1R2/hT1R3瞬时转染。

图5为基于荧光板反应器的测定的结果，其中稳定表达G_α15的HEK细胞由hT1R2和hT1R3或单独由hT1R3瞬时转染并与钙染料Fluo-4和甜味刺激物(12.5mM环己基氨基磺酸盐)接触。

图6为经标准化的剂量-应答曲线，该曲线显示，根据hT1R2和hT1R3与各种甜味刺激物(trp、环己基氨基磺酸盐、蔗糖、纽甜(neotame)、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精和Acek)的剂量特异性相互关系，hT1R2和hT1R3的组合具有作为人类甜味受体的功能。

图7为与mGluR1和T1R1有关的结构信息，该信息显示在这些分子中观察到关键的配体结合残基。

图8a～8c为功能性数据，所述数据显示HEK细胞在胞内钙的测定中响应谷氨酸所产生的应答，所述HEK细胞由T1R1/T1R3瞬时转染并稳定表达G_α15。图8a显示响应谷氨酸浓度的增加，胞内钙增加；图8b显示胞内钙对IMP(2mM)、谷氨酸(0.5mM)和0.2mM IMP产生的应答；以及图8c显示在存在或不存在0.2mM的IMP时，人类T1R1/T1R3对谷氨酸的应答。

图9a～9b分别为采用Myc标记的hT1R2的免疫荧光染色测定结果和FACS实验结果，结果表明PDZIP肽(SEQ ID No：1)的掺入促进了T1R(hT1R2)在质膜上的表达。

图10a到图10b为钙成像数据，该数据表明hT1R2/hT1R3对不同甜味刺激物的应答。

图11显示通过自动荧光成像获得的稳定表达hT1R1/hT1R3的细胞系对鲜味刺激物的应答。

图12显示通过自动荧光成像获得的稳定表达hT1R2/hT1R3的细胞系对甜味刺激物的应答。

图13显示存在或不存在0.2mM的IMP时，采用自动荧光成像确定的诱导性表达人类T1R1/T1R3味觉受体的细胞系对L-谷氨酸的剂量-应答曲线。

图14和图15显示诱导性表达人类T1R1/T1R3味觉受体的细胞系(I-17克隆)对一组L-氨基酸的应答。在图14中，在存在或不存在1mM的IMP时，对10mM不同的C-氨基酸进行检验。在图15中，在存在0.2mM的IMP时，确定活性氨基酸的剂量-应答。

图16显示lactisole抑制人类T1R2/T1R3和人类T1R1/T1R3的受体活性。

图17显示人类-大鼠T1R的嵌合体的示意图。如h2-r2、r2-h2、h3-r3和r3-h3所示，所述嵌合体为分别将人类或大鼠的胞外域与大鼠或人类的跨膜结构域融合而构建的嵌合体。

图18显示，新橙皮苷二氢查耳酮(NHDC)增强T1R1/T1R3鲜味受体的活性。[新橙皮苷二氢查耳酮]＝5μM。谷氨酸的剂量应答曲线向左迁移2.3倍(左图)，而谷氨酸/IMP的剂量应答向左迁移2.1倍。

图19显示，对照甜味剂并没有影响T1R1/T1R3鲜味受体的活性。[蛇菊苷]＝0.5mM。[糖精]＝1mM。谷氨酸剂量应答显示在左图中，而谷氨酸/IMP的剂量应答显示在右图中。

图20显示NHDC在人类T1R3的跨膜结构域上的定位。

图21显示化合物相对于人类T1R2的跨膜结构域的定位。

图22a～d显示定位于人类甜味受体的不同结构域/亚基的甜味剂。图22a显示人类和大鼠的甜味受体对蔗糖(200mM)、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(10mM)、纽甜(0.1mM)、环己基氨基磺酸盐(10mM)和存在lactisole(1mM)时的蔗糖(200mM)(Suc/Lac)所产生的应答。用人类或大鼠的T1R2、T1R3和G_α15的嵌合体G_α15/il瞬时转染HEK-293T细胞，并测定在对甜味剂产生应答时胞内钙的增加。图22b显示天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和纽甜定位于人类T1R2的N-末端胞外域。将T1R嵌合体的各个组合瞬时转染到含G_α15/il的HEK-293T细胞，并测定其对23a中列出的浓度的甜味剂所产生的应答。是否存在应答是重要的。图22c显示环己基氨基磺酸盐定位于人类T1R3的C-末端跨膜结构域。图22d显示lactisole定位于人类T1R3的跨膜结构域。将T1R嵌合体的不同组合瞬时转染到含G_α15/il的HEK-293T细胞中，并在lactisole(1mM)存在或不存在时测定所述组合对蔗糖(200mM)和Acek(10mM)所产生的应答。B、C和D中的活性代表约1000个汇合细胞的4个成像域中响应细胞数目的平均值±SE(标准误差)。

图23a～d显示T1R2或T1R3中的突变选择性地影响不同甜味剂的活性。图23a显示将人类和啮齿动物的T1R2与大鼠mGluR5的N-末端配体结合域的序列进行比对。用*标记mGluR5中涉及配体结合的8个关键氨基酸，这8个氨基酸酸中的3个在T1R2中是保守的并用下划线进行标记。图23b显示人类T1R2的N-末端胞外域中的两个点突变，这两个点突变导致对天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和纽甜不产生应答但对环己基氨基磺酸盐的应答却不受影响。如实施例所述，制备hT1R2/hT1R3(WT)、hT1R2 S144A/hT1R3(S144A)和hT1R2 E302A/hT1R3(E302A)的稳定细胞系。采用FLIPR测定这些稳定的细胞系对蔗糖、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、环己基氨基磺酸盐和纽甜的剂量-应答。该活性代表在4个记录孔中荧光强度的倍数增加的平均值±标准误差。图23c显示人类和啮齿动物的T1R3跨膜结构域的序列比对。用下划线标出3个胞外环并根据它们在蛋白序列中的顺序将其标为EL1、EL2或EL3。图23d显示hT1R3的胞外环中的突变，该突变导致细胞对环己基氨基磺酸盐不产生应答但不影响其对天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的应答。用大鼠的蛋白序列分别代替hT1R3的3个胞外环中的各环，将所得hT1R3突变体与G_α15/il一起瞬时转染到HEK-293T细胞中，并测定该细胞对蔗糖(200mM)、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(10mM)和环己基氨基磺酸盐(10mM)所产生的应答。活性代表约1000个汇合细胞的4个成像域中响应细胞数目的平均值±标准误差。

图24a～b显示人类T1R2对于G_α15偶联是必要的。图24a显示人类甜味受体、大鼠甜味受体和嵌合甜味受体对蔗糖(200mM)和Acek(10mM)产生的应答。用人类、大鼠或嵌合的T1R瞬时转染稳定的G_α15细胞，并测定胞内钙在对甜味剂的应答中的增加。图24b显示G_α15偶联由人类T1R2所介导。活性代表约1000个汇合细胞的4个成像域中响应细胞数目的平均值±标准误差。

图25a～f显示lactisole和环己基氨基磺酸盐对人类T1R1/T1R3鲜味受体的影响。图25a显示存在和不存在lactisole(5mM)时，人类T1R1/T1R3稳定细胞系对L-谷氨酸(5mM)和L-谷氨酸/IMP(1mM/0.2mM)产生的应答。图25b显示针对L-谷氨酸(Glu)和混有0.2mM IMP的L-谷氨酸(Glu/IMP)，测定lactisole的剂量-应答抑制曲线，所述Glu和Glu/IMP均采用两个不同浓度。对于8mM和80mM的L-谷氨酸，IC50分别为0.19±0.02mM和0.21±0.01mM。对于混有IMP的0.8mM和8mM的L-谷氨酸，IC50分别为0.35±0.03mM和0.82±0.06mM。图25c显示存在不同浓度的lactisole时，测定在有或没有0.2mM IMP时对L-谷氨酸的剂量应答。存在0μM、25μM或50μM的lactisole时，L-谷氨酸的EC50分别为9.9±1.5mM、7.9±0.5mM和7.0±0.3mM；存在0μM、100μM、或200μM的lactisole时，对混有IMP的L-谷氨酸的EC50分别为0.53±0.04mM、0.71±0.10mM和0.84±0.10mM。这些值代表4个独立应答的平均值±标准误差。图25d显示存在或不存在lactisole时，对甜味、鲜味和咸味刺激物的检测阈值所进行的测定。在检测阈值中，lactisole的抑制作用以倍数增加的形式显示。“检测阈值”被定义为能检测到的调味剂的下限。检测阈值的值由对3个对象、4次实验进行平均得到。图25e显示存在和不存在各种浓度的环己基氨基磺酸盐时，由FLIPR测定人类T1R1/T1R3稳定细胞系对L-谷氨酸(4mM)和内源M2受体激动剂氨甲酰胆碱的阈值水平的应答。图25f显示存在和不存在环己基氨基磺酸盐(8mM)时，针对有或没有0.2IMP的L-谷氨酸，由FLIPR测定人类T1R1/T1R3稳定细胞系的剂量-应答。B、C、E和F中的活性代表4个记录孔的荧光强度的倍数增加的平均值±标准误差。B、C、E和F中的剂量-应答至少独立重复6次。

图26显示甜味受体和鲜味受体的结构-功能关系的工作模型。实心箭头表示直接激活，空心箭头表示促进，而横线端头表示抑制。

图27a显示对甜味剂和lactisole的应答得以检测的T1R和嵌合体的所有16个组合。rT1R2/T1R3H-R、rT1R2/hT1R3和T1R2H-R/T1R3R-H显示对环己基氨基磺酸盐产生显著应答，并且它们可以受到lactisole的抑制。将T1R嵌合体瞬时转染到含G_α15/il的HEK-293T细胞中。活性代表约1000个汇合细胞的4个成像域中响应细胞数目的平均值±标准误差。在Y轴上的各个单位代表50个响应细胞。简写如下：Suc(蔗糖100mM)；Suc/Lac(蔗糖100mM，lactisole 1mM)；AceK(乙酰舒泛钾10mM)；AceK/Lac(乙酰舒泛钾10mM，lactisole 1mM)；ATM(天冬氨酰苯丙氨酸甲酯10mM)；NTM(纽甜10mM)；Cyc(环己基氨基磺酸盐10mM)。图27b显示针对蔗糖(Suc)、糖精(Sac)和D-色氨酸(D-Trp)(各采用2个不同的浓度)，测定人类甜味剂受体的lactisole剂量-依赖性抑制曲线。对50mM和120mM的蔗糖，IC50分别为19.6±0.1μM和64.6±0.3μM；对0.1mM和2mM的糖精，IC50分别为22.6±0.1μM和103±7μM；对D-色氨酸，IC50分别为19.9±0.2μM和168±9μM。图27c显示用不同浓度的lactisole测定人类甜味受体对蔗糖、D-Trp和糖精的剂量应答。存在0μM、10μM或20μM的lactisole时，蔗糖的EC50分别为19.4±0.9mM、24.7±1.0mM和31.3±0.3mM；D-Trp的EC50分别为0.37±0.02mM、0.60±0.03mM和0.94±0.08mM；糖精的EC50分别为42±3μM、67±6μM和118±2μM。这些值代表4个独立应答的平均值±标准误差。在B和C中的剂量-应答至少独立测定6次，并产生了如此处所显的类似结果。

具体实施方式

本发明提供特异地与本文公开的野生型和嵌合的甜味受体和鲜味受体结合的化合物。本发明还提供特异地与甜味受体和鲜味受体的野生型、嵌合的或截断的T1R2或T1R3亚基结合的化合物。

与T1R2/T1R3甜味受体的结合确定了一大类分子。该受体对包括碳水化合物糖、氨基酸和衍生物、甜蛋白和合成的甜味剂在内的所检验的每一个甜味剂均产生应答。同时，该受体显示出对某些甜味剂的立体选择性，例如，该受体对D-色氨酸产生应答但对L-色氨酸不产生应答，这与味觉生理学数据是一致的。

因而，本发明的化合物特异地结合嵌合受体。嵌合受体的例子包括但不限于，包含人类T1R2亚基和大鼠T1R3亚基的嵌合T1R2/T1R3受体，包含大鼠T1R2亚基和人类T1R3亚基的嵌合T1R2/T1R3受体，包含人类胞外域、大鼠跨膜结构域和大鼠胞内域的嵌合T1R2受体亚基，以及包含大鼠胞外域、人类跨膜结构域和人类胞内域的嵌合T1R3受体亚基。本发明提供功能性的味觉受体，优选为人类味觉受体，所述受体由不同的T1R组合(优选为T1R1/T1R3或T1R2/T1R3)的共表达产生；以及在共表达时产生功能性味觉受体(即甜味受体(T1R2/T1R3)或鲜味受体(T1R1/T1R3))的相应的分离核酸序列或其片段、嵌合体或变体。

T1R为C类G蛋白偶联受体(GPCR)家族，其在味觉组织中选择性表达(Hoon，M.A.等，Cell，1999.96(4)：541-551页；Bachmanov，A.A.等，Chem Senses，2001.26(7)：925-933页；Montmayeur，J.P.等，Nat Neurosci，2001.4(5)：492-498；Max，M.等，Nat Genet，2001.28(1)：58-63页；Kitagawa，M.等，Biochem Biophys Res Commun，2001.283(1)：236-242页和Nelson，G.等，Cell，2001.106(3)：381-390页)。T1R在HEK293细胞中的功能性表达揭示，T1R的不同组合对甜味刺激物和鲜味刺激物产生应答(Nelson，G.等，Cell，2001.106(3)：381-390页；Li，X.等，Proc NatlAcad Sci USA，2002.99(7)：4692-4696页)。当在293细胞中共表达时，T1R2和T1R3识别不同的天然或合成的甜味剂[由于以上提及的涉及“不同”的原因，请考虑我们是否需要这一实现部分。如果不需要，我将删除。我们可以讨论]，而T1R1和T1R3识别鲜味刺激物L-谷氨酸，而且鲜味标志物5’-核糖核苷酸促进该应答。敲除数据证实，T1R确实介导小鼠的甜味味觉和鲜味味觉(Damak，S.等，Science，2003 301(5634)：850-853页；Zhao，G.Q.等，Cell 2003年10月31日；115(3)：255-266)。

C类GPCR具有较大的N-末端胞外域，该胞外域常称为维纳斯捕蝇域(Venus flytrap domain，VFD)(Pin，J.P.，Pharmacol Ther，2003 98(3)：325-354页)，并已知在代谢型谷氨酸受体(mGluR)和钙敏感受体(CaR)的情况中以同二聚体的形式发挥作用，或在γ-氨基丁酸型B受体(GABA_BR)的情况中以异二聚体的形式发挥作用。功能性表达数据显示了T1R的异二聚体机制：T1R1和T1R2都需要与T1R3共表达才能发挥作用，在啮齿动物的舌中进行的T1R的重叠表达模式支持了这一点。

本文已明确，T1R家族成员与其它T1R家族成员以组合的形式发挥甜味和鲜味受体的作用。如下文实验例中所作的进一步详述，已证明共表达hT1R2和hT1R3的异源细胞被甜味刺激物选择性激活，这种激活以反映出人类的甜味味觉的方式进行。

例如，共表达hT1R2和hT1R3的HEK-293-G_α15细胞对环己基氨基磺酸盐、蔗糖、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和糖精产生特异性应答，而且对这些化合物的剂量应答与心理学味觉检测阈值相关。

同时，如得到实验例中的数据支持的那样，已表明共表达hT1R1和hT1R3的细胞被谷氨酸(谷氨酸单钠)和5’-核糖核苷酸选择性激活，这种激活以反映出人类的鲜味味觉的方式进行。例如，共表达hT1R1和hT1R3的HEK-293-G_α15细胞对谷氨酸产生特异性应答，并且对该鲜味化合物的剂量应答与其心理学味觉检测阈值相关。而且，诸如IMP等5’-核糖核苷酸增强T1R1/T1R3受体对谷氨酸的应答，这是鲜味的协同作用特性。

此外，如得到实验例中的实验数据显示，已表明稳定性和诱导性地共表达T1R1/T1R3的细胞对鲜味刺激物L-谷氨酸和L-天冬氨酸产生选择性应答，但对其它L-氨基酸只产生微弱的应答，而且是在浓度很高的情况下，这进一步为T1R1/T1R3受体能够用于鉴定调节(增强或阻断)鲜味刺激物的化合物的测定中提供了证据。

可以在表5中找到特异地结合到甜味受体并调节甜味的化合物的例子。

表1～4提供特异地结合到鲜味受体并调节鲜味的化合物的例子。

同时，如实施例中的实验数据所支持的那样，已表明共表达T1R1/T1R3或T1R2/T1R3的细胞系分别对鲜味刺激物或甜味刺激物产生应答，并且为定量剂量-应答模式，该模式进一步支持以下结论：与T1R1/T1R3和T1R2/T1R3受体特异性的结合可以用于确定受体的激动剂和拮抗剂(例如，MSG替代物、鲜味阻断剂、新的人造和天然的甜味剂和甜味阻断剂)。

同时，如实验例中的数据所支持的那样，已表明甜味阻断剂lactisole既抑制T1R2/T1R3甜味受体又抑制T1R1/T1R3鲜味受体。本文提供了增强、模拟、调节或阻断甜味或鲜味的化合物。lactisole既抑制T1R1/T1R3受体又抑制T1R2/T1R3受体的事实显示，这些受体可以具有与lactisole和其它潜在的味觉调节剂结合的相同亚基。因此，增强、模拟、调节或阻断甜味的化合物可能对鲜味具有类似的效果，反之亦然。

此外，如实验例中的数据所支持的那样，已证明当通过自动荧光成像法进行分析时，稳定地共表达T1R(即T1R1/T1R3和T1R2/T1R3)的细胞系对各种甜味刺激物和鲜味刺激物产生非常有效的应答，即其量要远远大于瞬时转染的细胞。因此，这些细胞系非常适合用于高通量筛选测定以鉴定调节、阻断、模拟或促进甜味或鲜味的化合物。但是，本发明还包括采用瞬时表达T1R或其组合的细胞所进行的测定。

而且，尽管本申请包括证明一些T1R以组合的形式(尤其是T1R1/T1R3和T1R2/T1R3)发挥作用以及证明这样的受体组合可用于各种测定(优选为高通量测定)的数据，但应该注意的是，本发明还包括单独采用T1R1、T1R2和T1R3或与其它蛋白(例如GPCR)的组合所进行的测定。

就配体特异性、G蛋白偶联效率以及对抑制剂的敏感性而言，人类和啮齿动物的甜味味觉是存在差异的。可以利用T1R配体特异性的物种差异来证明甜味受体确实以异聚体复合物的形式发挥作用，并且在所述受体上存在不止一个的配体结合位点。此外，已显示由T1R3介导的甜味受体和鲜味受体之间的功能性关联(实施例16)。

人类和大鼠的甜味受体均能够有效地偶联到带有来自G_αil(G_α15/il)的C-末端尾部序列的嵌合的G_α15。例如，人类的T1R2/T1R3对包括天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、纽甜和环己基氨基磺酸盐在内的一组甜味剂选择性产生应答，而大鼠的T1R2/T1R3却不产生所述的应答。这与味觉生理学数据是一致的。可以利用激动剂特异性上的这些差异来对它们在受体上的结合位点进行定位。可以在人类和大鼠基因之间产生嵌合的T1R，连接处位于紧邻跨膜结构域的前端。因此各个T1R嵌合体包括两个部分，来自不同物种的N-末端胞外域，与C-末端跨膜结构域和胞内域。例如，称为T1R2-R的嵌合T1R2具有来自人类T1R2 N-末端的序列，该序列融合到大鼠T1R2的C-末端序列。然后可以检验这些嵌合体的应答(图22)。

在化学领域的一系列的酰胺衍生物中，已发现新的化合物和新的调料、调味剂和甜味增强剂。酰胺化合物还包括某些酰胺衍生物的亚类或各类与酰胺有关的衍生物，例如脲、氨基甲酸酯、草酰胺和丙烯酰胺等。当与蔗糖一起使用或单独使用时，这些化合物促进体外应答并在人类的味觉中伴随增加甜味感觉。这些化合物对其它天然和合成的甜味调味剂具有增强作用。这些化合物的例子列在表5中。

在一个实施方案中，本发明提供新的化合物、食用调料、调味剂、口味增强剂、味道增强剂、口味调节化合物和/或包含它们的组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供新的甜味食用调料、甜味调味剂、甜味增强剂、甜味调节剂和包含它们的组合物。

更具体地，在另一个实施方案中，本发明涉及天然或合成的甜味调味剂(例如天然存在和合成的甜味剂)具有调节、诱导、增强或抑制作用的化合物。

在另一个实施方案中，本发明提供含有至少一种本发明化合物的组合物，优选适合于人类和动物食用的组合物。这些组合物包括食物、饮料和药物以及食物添加剂，当将所述食物添加剂添加到食物、饮料或药物中时调节其口味或味道，尤其是通过提高其甜味而调节其口味或味道。

本发明的另一个实施方案涉及本发明的化合物在调节所需食物、饮料或药物的甜味中的用途，所述组合物可以包含一种或多种引起甜味的其它化合物。当与天然存在和合成的甜味剂一起使用时，这些化合物不仅提高了体外应答而且还增强了人类味觉中的甜味和其它口味或味道感觉。当与诸如天然存在和合成的甜味剂等甜味调味剂一起使用时，这些特定化合物不仅增强了T1R2/T1R3的体外应答，而且还增强了人类味觉中的甜味和其它口味或味道感觉。

本文还公开了诸如酰胺、脲、氨基酰胺、酰氨基酰胺和β-内酰胺等新化合物和新的调料、调味剂和鲜味增强剂和调味剂。当与MSG一起使用或单独使用时，这些化合物提高了体外应答并增强了人类味觉中的鲜味感觉。这些化合物还增强了其它天然和合成的鲜味调味剂的作用。这些化合物的例子列在表1～4中。

在另外一个实施方案中，本发明提供新的化合物、食用调料、调味剂、口味增强剂、味道增强剂、口味调节剂化合物和/或包含它们的组合物。

在更具体的一个实施方案中，本发明提供新的鲜味食用调料、鲜味调味剂、鲜味增强剂和鲜味调节剂和包含它们的组合物。

更具体地，在另一个实施方案中，本发明涉及对天然或合成的鲜味调味剂(例如谷氨酸单钠(MSG))具有调节(诱导、增强或抑制)作用的化合物。

在另外一个实施方案中，本发明提供含有至少一种本发明化合物的的组合物，优选适合于人类和动物食用的组合物。这些组合物包括食物、饮料和药物、以及食物添加剂，当将所述食物添加剂添加到食物、饮料或药物中时调节其口味和味道，尤其是通过增强其鲜味而调节其口味和味道。

本发明的另外一个实施方案涉及本发明的化合物在调节所需食物、饮料或药物的鲜味中的用途，其中组合物可以包含一种或多种引起鲜味的其它化合物(例如MSG)。当与MSG一起使用时，这些化合物不仅提高体外应答而且还增强了人类味觉中的鲜味和其它口味或味道感觉。当与鲜味调味剂(例如MSG)一起使用时，这些特定化合物不仅增强了T1R1/T1R3的体外应答，而且还增强了人类味觉中的鲜味和其它口味或味道感觉。当单独品尝时，一些所述化合物引起人类的鲜味感觉。

通过本发明T1R测定所确定的与特定受体特异性结合的化合物可以用来调节食物和饮料的味道。下文中进一步详述的适宜测定方法，通过举例的方式包括全细胞测定法和生化测定法，这些测定法包括用不同T1R受体、或其嵌合体或片段(尤其是包含N-末端配体结合结构域的片段)的组合之一所进行的直接结合测定。适用于本发明的适宜测定方法的例子将在下文作进一步描述，并且其在GPCR领域是已知的。

可以将所述测定设计为对不同化合物或化合物的混合物与T1R味觉受体或T1R味觉受体的组合或与其它的异源(非T1R)蛋白(例如其它GPCR)一起组合表达的T1R受体的结合进行定量测定，或对表达T1R味觉受体的细胞的激活进行定量测定。该测定可能受到在诸如HEK-293、CHO和COS细胞等异源细胞中味觉受体的稳定或瞬时表达的影响。因而，用化合物的物理化学特征来定义共同具有这些特征的一类化合物。

所述测定优选使用还表达(优选稳定地表达)诸如G_α15或G_α16或其它混杂的G蛋白或G蛋白变体或内源性G蛋白等G蛋白的细胞。另外，其中还可以表达G_β和G_γ蛋白。

采用表达或含有以上鉴定的受体或受体组合的细胞或组合物，通过包括使用钙敏感染料、电压敏感染料、cAMP测定、用荧光标记配体或诸如³H谷氨酸等放射性配体的直接结合分析、或转录分析(用诸如荧光素酶或β-内酰胺酶等适宜的报道分子)等各种方法，可以确定化合物对甜味或鲜味的影响。

可以使用的采用本发明的一种或多种T1R的测定以举例的方式包括利用对活细胞进行遗传选择的测定、利用全细胞或膜片段或经纯化T1R蛋白的测定、利用诸如cAMP和IP3等第二信使的测定方法、检测将抑制蛋白转运到细胞表面的测定、通过检验配体来检测细胞表面上受体表达的缺失(内在化作用)的测定、直接配体结合测定、用抑制剂进行的竞争结合测定、用体外翻译蛋白进行的测定、检测配体结合后构象变化的测定(例如，如通过蛋白水解、荧光或NMR证明)、利用表达T1R或T1R组合的转基因非人类动物(例如蝇类、蠕虫或小鼠)的行为测定和利用由含有T1R基因的重组病毒感染的细胞的测定。

包括在本发明范围内的还有基于结构的分析，其中，确定了T1R或T1R片段(或T1R组合或T1R与另一个蛋白的组合)的X射线晶体结构，并通过分子模型技术将其用以预测可能与特定的T1R受体或受体组合结合的化合物和/或对特定的T1R受体或受体组合具有促进、模拟、阻断或调节作用的化合物。更具体地，本发明包括确定T1R1/T1R3(优选hT1R1/hT1R3)和/或T1R2/T1R3(优选hT1R2/hT1R3)的晶体结构，以及这些晶体结构在基于结构的设计方法中用以鉴定调节T1R受体活性的分子的用途。

本发明特别包括使用细胞进行的生化测定，所述细胞例如表达一种或多种全长T1R受体或片段(优选T1R1、T1R2和/或T1R3的N-末端结构域)的哺乳动物、酵母、昆虫或其它异源细胞。采用竞争结合测定(例如用放射性谷氨酸或IMP、荧光(例如荧光偏振，FRET)或GTPγ³⁵S结合测定)来测定化合物在这些测定方法中的作用。如所指出的那样，在一个优选实施方案中，所述测定将利用稳定地共表达T1R1/T1R3或T1R2/T1R3和适当的G蛋白(例如G_α15)的细胞系。其它适当的G蛋白包括在序列号为No.09/984,292和60/243,770的美国申请中公开的G蛋白的嵌合体和变体，通过参考的方式将它们的全部内容引入到本文中。

另外，可以构建并表达具有改进特性(例如增强了表面表达或G蛋白偶联)的受体。可以将这些T1R变体加入到基于细胞的测定和生化测定中。

可以预见，涉及人类T1R的本发现将延及其它物种，例如啮齿动物、猪、猴、狗和猫，甚至可能延及诸如鱼等非哺乳动物。在这方面，下文的实施例1已确认了几种鱼的T1R片段。因此，本发明可应用于筛选用于动物饲料制剂的化合物。

本发明还包括利用各种T1R的不同等位变体和它们的组合，据此能够鉴定在表达那些等位变体的个体中引起特定味觉感受的化合物或在所有个体中引起特定味觉感受的化合物。所述化合物可以使食物一般要更加美味。

编码T1R的核酸还可以提供用于鉴定味觉细胞的有用探针，这是因为该核酸在味觉细胞中特异地表达。例如，可以用T1R多肽和蛋白的探针来鉴定存在于叶状乳头、轮廓乳头和菌状乳头中的味觉细胞，以及存在于geschmackstreifen、口腔、胃肠上皮和会厌中的味觉细胞。特别地，检测T1R的方法可以用来鉴定对甜味和/或鲜味的刺激物或代表其它味觉形式的其它味觉刺激物敏感的味觉细胞。例如，根据本文的工作，可以推测稳定或瞬时表达T1R2和/或T1R3的细胞会对甜味刺激物产生应答。类似地，可以推测表达T1R1和/或T1R3的细胞会对鲜味刺激物产生应答。编码本发明的T1R蛋白和多肽的核酸可以从各种来源中分离，并可以对所述核酸进行遗传工程化、扩增、合成和/或者根据WO 00/035374公开的方法对该核酸进行重组表达，通过参考的方式将WO 00/035374的全部内容引入到本文中。在实施例中提供了可以根据本发明进行表达的T1R的列表。但是，应该强调的是，本发明包括基于所述T1R序列构建的其它特定的T1R或片段、变体或嵌合体的表达和用途，尤其是基于其它物种的T1R的表达和用途。

如公开的那样，本发明的一种重要方面是筛选这些味觉细胞特异性GPCR的调节剂(例如激活剂、抑制剂、刺激剂、增强剂、激动剂和拮抗剂)的多种方法。这些味觉转导的调节剂对调节味觉信号转导途径是有用的。可以采用这些筛选方法来鉴定味觉细胞活性的高亲和性激动剂和拮抗剂。在食物工业中，可以利用这些调节化合物来按照具体要求定制味道，例如调节食物的甜味和/或鲜味。

本发明弥补了以前对涉及甜味和鲜味的理解的缺乏，这是因为本发明鉴定了介导甜味和鲜味感觉的特异性T1R和T1R受体组合。因此，总的来说，本申请与本发明人的发现有关，所述发现涉及味觉特异性G蛋白偶联受体的T1R类和它们在味觉感受中的特定功能以及这些发现之间的关系，以更好地理解味觉的分子基础。

甜味和鲜味的分子基础—谷氨酸单钠的风味是个谜。最近鉴定了味觉特异性G蛋白偶联受体的三成员组，称为T1R。重叠T1R表达模式和结构相关的GABA_B受体是异二聚体的证明表明，T1R作为异二聚体的味觉受体发挥作用。在下文的实施例中，本发明人描述人类T1R1、T1R2和T1R3在异源细胞中的功能性共表达。共表达T1R1和T1R3的细胞受到鲜味刺激物的激活；而共表达T1R2和T1R3的细胞受到甜味刺激物的激活。T1R1/T1R3和T1R2/T1R3的活性与心理学检测阈值是有关联的。另外，已发现5’-核糖核苷酸IMP增强T1R1/T1R3对谷氨酸的应答，具有鲜味的协同特征。这些发现证明特异性T1R尤其是T1R的不同组合作为甜味和鲜味受体发挥功能。

据认为人类对苦味、甜味和鲜味的感受是由G蛋白偶联受体介导的(Lindemann，B.，Physiol.Res.76：718-766(1996))。最近，在对人类基因组的评价中发现了T2R类苦味受体(Adler等，Cell 100：613-702(2000)；Chandrasgekar等，Cell 100：703-711(2000)；Matsunami等，Nature 404：601-604(2000))，但没有鉴定出甜味和鲜味的受体。最近，鉴定了另外一类候选的味觉受体T1R。T1R是通过对来自大鼠味觉组织的扣除cDNA文库进行大规模测序而首次得以鉴定的，其被鉴定为T1R1，随后通过基于T1R1的简并PCR，导致鉴定出了T1R2(Hoon等，Cell 96：541-551(1999))。最近，本发明人和其它人在人类基因组数据库中鉴定了T1R家族的第三个也可能是最后一个成员T1R3(Kitagawa等，Biochem Biophys.Res Commun.283(1)：236-242(2001)；Max等，Nat.Genet.28(1)：58-63(2001)；Sainz等，J.Neurochem.77(3)：896-903(2001)；Montmayeur等，Nat.Neurosci.4，492-498.(2001))。据知，小鼠的T1R3定位于包含Sac(在小鼠中影响甜味感觉的基因座)的基因组间隔区中(Fuller等，J.Hered.65：33-36(1974)；Li等，Mamm.Genome 12：13-16(2001))。因此，推测T1R3作为甜味受体发挥功能。最近，高分辨的遗传作图研究增强了小鼠T1R3和Sac之间的联系(Fuller T.C.，J.Hered.65(1)：33-36(1974)；Li等，Mammal.Genome 12(1)：13-16(2001))。

有趣的是，已表明目前已进行功能性表达的所有C家族受体：代谢型谷氨酸受体、GABA_B受体、钙敏感受体(Conigrave，A.D.，Quinn，S.J.和Brown，E.M.，Proc Natl Acad Sci USA 97，4814-4819(2000))以及鱼嗅觉受体(Speca，D.J.等，Neuron 23，487-498.(1999))受到氨基酸的激活。这些共同特征提出这样的一种可能：T1R识别氨基酸，而且T1R还可能参与除了甜味氨基酸之外的谷氨酸的检测。或者，由于在大鼠的味觉组织中选择性表达mGluR4代谢型谷氨酸受体的转录变体并且受体激活阈值与谷氨酸的心理学检测阈值相似，推测mGluR4代谢型谷氨酸受体的转录变体为鲜味受体(Chaudhari等，Nat.Neurosci.3：113-119(2000))。这种假设难以与mGluR4变体在味觉组织中极低的表达量以及mGluR4敲除小鼠或多或少并未改变的谷氨酸味觉相吻合(Chaudhari和Roper，Ann.N.Y.Acad.Sci.855：398-406(1998))。而且，味觉变体在结构上是难以置信的，其不仅缺少形成野生型受体的谷氨酸结合袋的大部分残基，而且缺少大约一半的球状的N-末端谷氨酸结合结构域(Kunishima等，Nature407：971-977(2000))。

T1R在啮齿动物中的表达模式的比较分析证明，T1R2和T1R1(可能)各自与T1R3共表达(Hoon等，Cell 96：541-551(1999)；Kitagawa等，Biochem Biophy.Res.Commun.283：236-242(2001)；Max等，Nat.Genet.28：58-63(2001)；Montmayeur等，Nat.Neurosci 4：492-498(2001)；Sainz等，J.Neurochem 77：896-903(2001))。此外，二聚化正成为C家族受体的共同主题：代谢型谷氨酸和钙敏感受体是同二聚体(Romomano等，J.Biol.Chem.271：28612-28616(1996)；Okamoto等，J.Biol.Chem.273：13089-13096(1998)；Hah等，J.Biol.Chem.274：100008-100013(1999)；Bai等，J.Biol.Chem.273：23605-23610(1998))，而结构相关的GABA_B受体是异二聚体(Jones等，Nature 396：674-679(1998)；Kaupmann等，Nature396：683-687(1998)；White等，Nature 396：679-682(1998)；Kuner等，Science 283：74-77(1999))。本发明人通过在异源细胞中对T1R进行功能性共表达已证明，与人类T1R3结合的人类T1R2作为甜味受体发挥作用，而与人类T1R3结合的人类T1R1作为具有鲜味受体发挥作用。

以前由于缺少对甜味的测定方法，因而阻碍了人造甜味剂的改进进程，因此本文中讨论的发现特别重要。实际上，均能激活hT1R2/hT1R3的五种常用的商业人造甜味剂都是偶然发现的。类似地，除了感官检验这样繁杂的方法之外，还没有鉴定调节鲜味的化合物的测定方法。这些问题目前已经得到缓解，这是因为如在下文中讨论的实验结果所确定的，人类甜味和鲜味受体已经得到鉴定，并且也已经建立这些受体的测定方法，尤其是利用稳定表达功能性T1R味觉受体(即甜味受体或鲜味受体)的细胞所进行的测定。

基于此，本发明提供检测和表征味觉调节化合物的测定方法，其中T1R家族成员如它们在味蕾中所起的作用那样，起到味觉调节化合物对甜味和鲜味的所发挥效果的报道分子的作用。特别要提供并且在本发明范围之内的是用于鉴定对甜味和鲜味分别具有调节、模拟、增强和/或阻断作用的化合物的测定方法。测定GPCR活性尤其是测定影响GPCR活性的化合物的方法是已知的，并且适用于本发明的T1R家族成员及其功能性组合。前面已经确定了适宜的测定方法。

如在全文所公开的那样，本发明还提供与T1R1、T1R2、T1R3、T1R2/T1R3或T1R1/T1R3或者其片段、部分或亚基相结合的化合物。

特别地，可以将所述GPCR用于测定以下体外和体内变化：例如配体结合、离子浓度、膜电位、电流、离子流、转录、受体配体互相作用、第二信使浓度。在另外一个实施方案中，可以在细胞中重组表达T1R家族成员，可以通过测定Ca²⁺水平和诸如cAMP、cGMP和IP₃等其它胞内信息的变化来测定对借助GPCR活性的味觉传导的调节。

在某些测定中，将T1R多肽的结构域(例如胞外域、跨膜结构域或胞内域)融合到异源多肽上，据此形成嵌合多肽(例如具有GPCR活性的嵌合蛋白)。尤其考虑使用含有N-末端配体结合结构域的T1R1、T1R2和T1R3的片段。此类蛋白例如在鉴定T1R受体的配体、激动剂、拮抗剂或其它调节剂的测定中是有用的。例如，可以将T1R多肽与异源的通过分泌途径便于质膜运输、成熟和定位的伴侣序列作为嵌合受体在真核细胞中表达。选择性的异源序列可以是PDZ结构域互相作用肽(例如C-末端PDZIP片段(SEQ ID NO 1))。PDZIP是ER输出信号，根据本发明，已显示该输出信号促进诸如本文所述T1R受体等异源蛋白的表面表达。更特别地，在本发明的一个方面，可以用PDZIP来促进发生问题的膜蛋白(所述膜蛋白诸如嗅觉受体、T2R味觉受体和本文所述的T1R味觉受体等)的正确定位。

所述嵌合受体的例子包括跨物种的受体。可以一起利用来自各种物种的受体亚基的任何组合来形成嵌合受体，然后例如将该嵌合受体用于鉴定调味剂。因此，在此考虑的是含有人类T1R2亚基和大鼠T1R3亚基的嵌合的T1R2/T1R3。还考虑的是含有大鼠T1R2亚基和人类T1R3亚基的嵌合的T1R2/T1R3。还考虑的是含有人类胞外域、大鼠跨膜结构域和大鼠胞内域的嵌合T1R2受体亚基(例如SEQ ID NO：16和17)。还考虑的是含有大鼠胞外域、人类跨膜结构域和人类胞内域的嵌合T1R3受体亚基(例如SEQ ID NO：18和19)。

可以在诸如HEK-293细胞等任意的真核细胞中表达所述的嵌合T1R受体。优选地，所述细胞包含G蛋白，优选诸如G_α15和G_α16等混杂的G蛋白或者能够将大范围的GPCR连接到胞内信号转导途径或连接到信号转导蛋白(例如磷脂酶C)上的另一种类型的混杂G蛋白。可以采用任意标准方法来检测在所述细胞中所述嵌合受体的激活，所述标准方法例如通过检测细胞内的FURA-2依赖性荧光来检测胞内钙的变化。如果优选的宿主细胞没有表达适宜的G蛋白，可以用编码混杂的G蛋白的基因来对它们进行转染，例如在2001年10月29日提交的序列号为No.60/243,770的美国专利申请和序列号为No.09/984,297的美国专利申请以及2001年11月21日提交的序列号为No.09/989,497的美国专利申请所述，通过参考的方式将以上所述专利的全部内容引入到本文中。

味觉转导调节剂的另外测定方法包括使用以下进行的体外配体结合测定：T1R多肽、该多肽的部分(即胞外域、跨膜结构域或者其组合、或者包含T1R家族成员的一个或多个结构域的嵌合蛋白)；表达T1R多肽、片段或融合蛋白的卵母细胞或组织培养细胞；T1R家族成员的磷酸化和去磷酸化；结合GPCR的G蛋白；配体结合测定；电压、膜电位和传导力的变化；离子流测定；诸如cGMP、cAMP和三磷酸肌醇(IP₃)等胞内第二信使的变化；以及胞内钙水平的变化。

此外，本发明提供检测T1R核酸和蛋白表达的方法，使用该方法可以研究味觉转导调节和味觉受体细胞的特异性鉴定。T1R家族成员还可以提供对父亲血缘和法医研究有用的核酸探针。T1R基因还可以作为对鉴定诸如叶状、菌状、轮廓、geschmackstreifen和会厌味觉受体细胞等味觉受体细胞有用的核酸探针。T1R受体还可以用于产生对鉴定味觉受体细胞有用的单克隆抗体和多克隆抗体。

在功能上，T1R多肽包含有关的7次跨膜的G蛋白偶联受体家族，据信所述受体参与味觉转导，并可以与G蛋白相互相作用，从而介导味觉信号转导(见例如Fong，Cell Signal，8：217(1996)；Baldwin，Curr.Opin.Cell Biol.，6：180(1994))。在结构上，T1R家族成员的核苷酸序列编码包含胞外域、7次跨膜结构域和胞质域的相关多肽。来自其它物种的有关T1R家族基因在至少约50个核苷酸长度内，或者在100、200、500或500个以上的核苷酸长度的区域内与本文实施例中公开的T1R核酸序列或者其保守性修饰的变体具有至少约50％，或者60％、70％、80％或90％的核苷酸序列一致性，或者所编码的多肽在至少约25个氨基酸长度内，或者在50～100个氨基酸长度的氨基酸区域内与本文实施例中公开的T1R多肽序列或者其保守性修饰的变体具有至少约35～50％，或者60％、70％、80％或90％的氨基酸序列一致性。

已经鉴定了作为T1R家族成员特征的几个共有氨基酸序列或结构域。例如，T1R家族成员通常包含与T1R的共有序列1和序列2(分别为SEQ ID No 2和SEQ ID No 3)具有至少约50％，或者55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95～99％或更高的一致性的序列。因此可以用这些保守结构域通过一致性、特异性杂交或扩增、或由针对结构域所产生的抗体的特异性结合来鉴定T1R家族成员，通过举例的方式，T1R共有序列包括以下序列：

T1R家族的共有序列1：(SEQ ID NO：2)

(TR)C(FL)(RQP)R(RT)(SPV)(VERKT)FL(AE)(WL)(RHG)E

T1R家族的共有序列2：(SEQ ID NO：3)

(LQ)P(EGT)(NRC)YN(RE)A(RK)(CGF)(VLI)T(FL)(AS)(ML)

这些共有序列包含在本文所述T1R多肽中所发现的共有序列中，但预期其它有机体的T1R家族成员可能包含与本文具体描述的共有序列具有约75％或更高的一致性的共有序列。

可以用T1R的核苷酸和氨基酸序列的特定区域来鉴定T1R家族成员的多态性变体、物种间同源物和等位基因。这些鉴定可以在体外进行，例如在严格条件下进行杂交或利用PCR进行(例如，采用编码以上鉴定的T1R共有序列的引物)，或在计算机系统中用所述序列的信息与其它核苷酸序列进行比较。在单一物种群体内的T1R基因的不同等位基因还可以用于确定等位基因间的差异是否控制该群体成员间味觉感受的差异。可以用经典PCR型扩增和克隆技术来分离新的T1R，例如，简并引物在跨物种的情况中足以检测相关基因。

通常，可以通过比较约25个氨基酸或更多的氨基酸(例如50～100个氨基酸)的氨基酸序列来鉴定T1R家族成员的多态性变体和等位基因。氨基酸的一致性约为至少35％～50％，或者60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％-99％或更高的一致性通常证明蛋白是T1R家族成员的多态性变体、物种间同源物或等位基因。可以用以下讨论的任意序列比较算法来进行序列比较。也可以用与T1R多肽或其保守区域特异性结合的抗体来鉴定等位基因、物种间同源物和多态性变体。

可以通过测定假定的T1R基因或蛋白的味觉细胞特异性表达来证实T1R基因的多态性变体、物种间同源物和等位基因。通常，可以将具有本文所述的氨基酸序列的T1R多肽用作与假定的T1R多肽进行比较的阳性对照，以证明对T1R家族成员的多态性变体或等位基因的鉴定。预期T1R基因的多态性变体、等位基因和物种间类似物都保留了G蛋白偶联受体的7次跨膜结构。进一步的细节请见公开了有关的T1R家族成员GPCR-B3的WO 00/06592，以与本文公开一致的方式通过参考将其内容引入到本文中。GPCR-B3受体在本文中称为rT1R1和mT1R1。另外，见公开了有关的T1R家族成员GPCR-B4的WO 00/06593，以与本文公开一致的方式通过参考将其内容引入到本文中。GPCR-B4受体在本文中称为rT1R2和mT1R2。如前面讨论的那样，本发明还包括基于结构的测定，该测定利用T1R或T1R组合(例如hT1R2/hT1R3或hT1R1/hT1R3)的X射线晶体结构，以鉴定调节T1R受体活性并据此调节甜味和/或鲜味的分子。

本发明还提供用以鉴定增强、模拟、阻断和/或调节T1R受体的分子的测定，优选为高通量测定。在一些测定中，使用T1R家族成员的特定结构域与另一个T1R家族成员的特定结构域的组合，所述特定结构域例如胞外、跨膜或胞内结构域或区域。在其它实施方案中，可以将胞外域、跨膜区或它们的组合结合到固体基质上，用以例如分离能够结合T1R多肽和/或调节T1R多肽活性的配体、激动剂、拮抗剂或任意其它分子。

预想将各种保守性突变和置换均包含在本发明的范围内。例如，采用包括PCR、基因克隆、cDNA的定位诱变、宿主细胞转染和体外转录等重组基因技术的已知程序进行氨基酸置换在本领域技术水平之内。然后可以对变体进行筛选以检测活性。

                          定义

如本文使用的那样，除非另有描述，以下术语具有认为属于它们的含义。

“味觉细胞”包括组织成组以形成舌的味蕾的神经上皮细胞，例如叶状、菌状和轮廓细胞(见例如Roper等，Ann.Rev.Neurosci.12：329-353(1989))。还发现味觉细胞存在于颚和诸如食道和胃等其它组织中。

“T1R”是指在诸如叶状、菌状和轮廓细胞以及颚和食道的细胞等味觉细胞中表达的G蛋白偶联受体家族的一个或多个成员(见例如Hoon等，Cell，96：541-551(1999)，通过参考的方式将其全部内容引入到本文中)。该家族成员在WO 00/06592中还称为GPCR-B3和TR1，以及在WO00/06593中称为GPCR-B4和TR2。在本文中GPCR-B3还称为rT1R1，而GPCR-B4还称为rT1R2。还可以基于多态性(见例如Roper，上文)或通过在味觉细胞中特异性表达的蛋白的表达来鉴定味觉受体细胞。T1R家族成员可以具有作为甜味转导受体的能力或区分各种其它味觉形式的能力。在下文的实施例中鉴定包括hT1R1、hT1R2和hT1R3在内的代表性的T1R序列。

“T1R”核酸编码具有7个跨膜区的GPCR家族，该家族具有“G蛋白偶联受体活性”，例如，它们可以响应胞外刺激物而结合到G蛋白上，并通过刺激诸如磷脂酶C和腺苷酸环化酶等酶，促进诸如IP₃、cAMP、cGMP和Ca²⁺等第二信使的产生(对于GPCR的结构和功能的描述，见例如Fong，上文和Baldwin，上文)。单个味觉细胞可以含有许多不同的T1R多肽。

因此，术语“T1R”家族指多态性变体、等位基因、突变体和物种间同源物，其：(1)在约25个氨基酸或者50～100个氨基酸的范围内，与T1R多肽(优选与实施例1中所鉴定的多肽)具有至少约35％～50％的氨基酸一致性，或者具有约60％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸一致性；(2)特异地结合针对免疫原而产生的抗体，所述免疫原包含优选选自由实施例1所公开的T1R多肽序列及其保守性修饰的变体组成的组的氨基酸序列；(3)由核酸分子编码，所述核酸分子在严格杂交条件下与选自由包含在实施例1中的T1R核酸序列和其保守性修饰的变体组成的组的序列特异性杂交(杂交长度至少约为100个核苷酸，或者至少约500～1000个核苷酸)；或(4)包含至少与选自由实施例1中鉴定的T1R氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列具有至少约35％～50％的一致性的序列。

在拓扑学上，本文公开的T1R具有包含“维纳斯捕蝇域”和“富含半胱氨酸结构域”的“N-末端结构域”(也称为“胞外域”)；包含7个跨膜区和相应的胞质和胞外环的“跨膜结构域”；和“C-末端结构域”(见例如Hoon等，Cell，96：541-551(1999)；Buck和Axel，Cell，65：175-187(1991))。用本领域技术人员已知的方法(例如确定疏水和亲水结构域的序列分析程序)已从结构上确定了这些结构域(Stryer，Biochemistry，(第三版，1988))。所述结构域对构建嵌合蛋白和本发明的体外测定(例如配体结合测定)是有用的。化合物在这些结构确定的结构域上的特异结合为所述化合物提供了结构上的限定。

因此，“胞外域”是指从细胞膜突出并暴露在细胞的胞外表面的T1R多肽的结构域。此类结构域通常包括暴露在细胞的胞外表面的“N-末端结构域”，或者可以包括暴露在细胞的胞外表面的跨膜结构域的胞外环部分，即在跨膜区2和3之间的环，在跨膜区4和5之间的环和在跨膜区6和7之间的环。

“N-末端结构域”部分开始于N-末端并延伸到靠近第一跨膜结构域的起始部分的区域。更具体地，在本发明的一个实施方案中，该结构域起始于N-末端并大约结束于氨基酸563上下约20个氨基酸位置的保守性谷氨酸。这些胞外域对可溶相和固相的体外配体结合测定是有用的。另外，以下描述的跨膜区也可与胞外域一起结合到配体上，因此所述跨膜区对体外配体结合测定也是有用的。

“富含半胱氨酸结构域”是指多肽的结构域。该保守序列含有几个高度保守的形成二硫键的半胱氨酸残基，并定位于细胞膜外。该区域与T1R家族成员的结构域对应，并在所有的3个亚基(T1R1～T1R3)中都有发现。在T1R1的氨基酸510～566、T1R2的氨基酸508～565和T1R3的氨基酸512～568中发现富含半胱氨酸的序列。

“跨膜结构域”包含7个“跨膜区”，是指T1R多肽的定位于质膜中的的结构域，并且还可能包括相应的胞质(胞内)和胞外的环。在一个实施方案中，该区对应于T1R家族成员大约起始于氨基酸563上下20个氨基酸位置的保守性谷氨酸并大约结束于氨基酸812上下约10个氨基酸位置的保守性酪氨酸残基的区域。可以用如Kyte和Doolittle(J.Mol.Biol.，157：105-132(1982))或由Stryer(上文)记载的标准方法鉴定所述7个跨膜区与胞外环和胞质环。

“胞质结构域”是指面向细胞里面的T1R多肽的结构域，例如“C-末端区域”和跨膜结构域的胞内环，该胞内环例如在跨膜区1和2之间的胞内环，在跨膜区3和4之间的胞内环和在跨膜区5和6之间的胞内环。

“C-末端结构域”是指跨越最后跨膜结构域的末端和蛋白的C-末端的区域，并且该区域一般定位于胞质内。在一个实施方案中，该区域起始于氨基酸812上下约10个氨基酸位置的保守性酪氨酸残基并延续到多肽的C-末端。

术语“配体结合区”或“配体结合结构域”是指来自味觉受体尤其是基本至少合并有该受体的胞外域的味觉受体的序列。在一个实施方案中，配体结合区的胞外域可以包括N-末端结构域并选择性地包括跨膜结构域的部分(例如跨膜结构域的胞外环)。所述配体结合区可以能够结合配体，更具体地，结合用以增强、模拟、阻断和/或调节味觉(例如甜味或鲜味)的化合物。

在本发明的T1R受体或多肽的上下文中的短语“异聚体”或“异聚复合物”是指至少一个T1R受体与另一个受体(一般为另一个T1R受体多肽(或选择性地，另一个非T1R受体多肽))的功能性结合。为了清楚目的，在本申请中将T1R的功能性共依赖性描述为反映为它们作为异二聚体味觉受体复合物的可能功能。但是，如前面讨论的那样，功能性共依赖性也可以选择性地反映间接互相作用。例如，T1R3可以单独具有促进T1R1和T1R2的表面表达的功能，其可能独立地作为味觉受体发挥作用。选择性地，功能性的味觉受体可以由T1R3单独组成，在T1R1或T1R2的控制下被区别处理，这类似于钙相关受体的RAMP依赖性处理。

在用于检验调节T1R家族成员介导的味觉转导的化合物的测定的上下文中，短语“功能性作用”包括确定对间接或直接地受该受体的影响的参数，所述影响例如功能性的、物理的和化学的作用。它包括体外、体内和间接体内(ex vivo)的配体结合和以下变化：离子流、膜电位、电流、转录、G蛋白结合、GPCR磷酸化或去磷酸化、基于构象变化的测定、信号转导、受体-配体互相作用、第二信使(例如cAMP、cGMP、IP₃或胞内钙Ca²⁺)浓度，还包括诸如神经递质或激素释放的提高或降低等其它的生理作用。

在测定的上下文中“确定功能性作用”是指对化合物进行的测定，所述化合物提高或降低间接或直接地受T1R家族成员的影响的参数，所述影响例如功能性的、物理的和化学的作用。可以通过本领域技术人员已知的任意手段测定所述的功能性作用，所述手段例如光谱特征的变化(例如荧光、吸光度、折射率)、流体动力学(例如形状)、层析或溶解性质、膜片钳术、电压敏感染料、全细胞电流、放射性同位素流出、诱导性标记、卵母细胞T1R基因表达；组织培养细胞T1R表达；T1R基因的转录激活；配体结合测定；电压、膜电位和传导力的变化；离子流测定；诸如cAMP、cGMP和三磷酸肌醇(IP₃)等胞内第二信使的变化；胞内钙水平的变化；神经递质的释放，构象测定等。

本文“调料或调味剂”是指用于在受试对象中诱导包括甜味、酸味、咸味、苦味和鲜味以及其它等气味和/或味道的感觉的化合物或其生物上可接受的盐。所述受试对象可以是人类、动物和/或生物待分析物(例如在本申请中描述和引用的生物待分析物)。

本文“调料或味道调节剂”是指在受试对象中用于调节(包括增强或加强、抑制和诱导)天然或合成的调味剂的气味和/或味道的化合物或其生物上可接受的盐。

本文“调料或味道增强剂”是指用于增强天然或合成的调味剂的味道或气味的化合物或其生物上可接受的盐，所述调味剂例如用于调节鲜味的谷氨酸单钠(MSG)和用于调节甜味的果糖。

本文“鲜味调味剂”或“鲜味化合物”是指在受试对象中引起可检测的鲜味的化合物或其生物上可接受的盐，例如MSG。

本文“甜味调味剂”或“甜味化合物”是指在受试对象中引起可检测的甜味的化合物或其生物上可接受的盐，例如果糖。

本文“鲜味调节剂”是指用于在受试对象中调节(包括增强或加强、抑制和诱导)天然或合成的鲜味调味剂(例如谷氨酸单钠(MSG))的鲜味的化合物或其生物上可接受的盐。

本文“甜味调节剂”是指用于在受试对象中调节(包括增强或加强、抑制和诱导)天然或合成的甜味调味剂(例如果糖)的甜味的化合物或其生物上可接受的盐。

本文“味道增强量”是指足以增强天然或合成的调味剂的味道的化合物的量，所述调味剂例如用于调节鲜味的谷氨酸单钠(MSG)和用于调节甜味的果糖。

“湿汤类”意为湿/液体汤，包括冷冻的汤，而不管其浓度和容器。为此目的而定义的汤意为从肉、禽、鱼、蔬菜、谷物、水果和其它成分制备的食物，其在在包括可见的一些或全部的这些成分的片块的液体中烹调而成。所述的食物可能是清的(如清汤)或浓的(如杂脍)、滑的、浆状的或含有大块的、即用的、半压缩的或压缩的，并可能在供应时是热的或冷的，作为一顿饭中的第一道菜或作为主菜或作为餐间快餐(如饮料那样吸允)。可以将汤用作制备其它膳食组分的成分，并且其范围可以从清汤(清炖汤)到沙司(基于奶油或乳酪的汤)。

“脱水的烹调用食物类”意为：(i)烹饪佐料产品，例如：粉末、颗粒、糊状物、浓缩液体产品(包括压缩方块、片状或粉末或颗粒形式的浓缩肉汤、肉汤和肉汤类产品)，它们可以作为最终产品或作为产品中的成分、沙司和食谱混合物(与技术无关)而单独销售；(ii)膳食溶液产品例如：脱水和冻干的汤(包括脱水的汤的混合物)、脱水的速溶汤、脱水的即煮汤、现成菜、一顿饭和单份主食(包括面食、土豆和米饭等主菜)的脱水或常规环境食物制品；(iii)膳食调味产品例如：调味品、腌泡汁、色拉调料、色拉浇头、浸液、面包屑、奶油面糊混合物、耐贮存的涂抹物、烧烤沙司、液体食谱混合物、浓缩物、沙司或沙司混合物(包括用于色拉的食谱混合物)，不管是脱水的、液体的或冷冻的，它们可以作为最终产品或作为产品中的成分销售。

“饮料类”指饮料、饮料混合物和浓缩物，包括但不限于酒精和非酒精，即饮的和干粉的。其中加入本发明化合物的食物和饮料的其它例子通过举例的方式包括碳酸和非碳酸饮料，例如苏打水、果汁、酒精和非酒精饮料；甜食产品，例如蛋糕、饼干、馅饼、糖果、口香糖、果冻、冰淇淋、冰糕、布丁、果酱、果冻、色拉调料和其它调味品、谷类食物和其它早餐食物、罐头水果和水果沙司等。

另外，可以将主题化合物用在意欲加到食物和饮料中的调料制品中。在一个优选的例子中，组合物将包含诸如甜味调味剂等另外调料或味道调节剂。

在一些例子中，可以使用主题化合物的生物上可接受的盐。所述盐的例子包括碱金属盐和碱土金属盐、有机盐等。具体例子包括钾、钠、钙和镁的盐，盐酸盐或硫酸盐，乙醇胺盐等。所选择的盐对于摄食要具有生物安全性，并对所述化合物的甜味调节特性具有不良影响。

作为本文使用的术语“药用产品”包括固体和液体的可摄入的无毒物质，该物质具有药用价值，例如咳嗽糖浆、咳嗽滴剂、阿司匹林和可嚼的药用片剂。口服的卫生产品包括诸如牙膏和嗽口水等固体和液体。

“可食用或药学上可接受的载体或赋形剂”是用以制备本发明化合物的所需剂型的介质。可食用或药学上可接受的载体包括溶剂、稀释剂或其它液体载体；分散或悬浮助剂；表面活性剂；等渗剂；增稠或乳化剂；防腐剂；固体粘合剂和润滑剂等。

T1R基因或蛋白的“抑制剂”、“激活剂”、“增强剂”和“调节剂”是指使用味觉转导的体外和体内测定而鉴定的抑制、激活、增强或调节分子，例如配体、激动剂、拮抗剂和它们的同源物和模拟物。

抑制剂是例如结合、部分地或全部地阻断刺激，减弱、防止、延迟激活，钝化、脱敏或下调味觉转导的化合物，例如拮抗剂。激活剂和增强剂是结合、增强、刺激、提高、开启、激活、促进、增强激活、敏化或上调味觉转导的化合物，例如激动剂。调节剂包括例如改变受体与以下物质的相互相作用的化合物，所述物质为结合激活剂或抑制剂的胞外蛋白(ebnerin和疏水载体家族的其它成员)；G蛋白；激酶(例如视紫红质激酶和参与受体的脱激活和脱敏化的β肾上腺素能受体激酶的同源物)；以及也能使受体脱激活和脱敏化的抑制蛋白。调节剂可以包括T1R家族成员的遗传修饰形式(例如改变活性)，以及天然存在和合成的配体、拮抗剂、激动剂、化学小分子等。所述针对抑制剂和激活剂的测定包括例如在细胞或细胞膜中表达T1R家族成员，存在或不存在诸如甜味调味剂等调味剂时施用假定的调节剂化合物，然后如上所述测定对味觉转导的功能性作用。将包含用潜在增强剂、激活剂、抑制剂或调节剂处理的T1R家族成员的样品或待分析物与不用抑制剂、激活剂或调节剂处理的对照样品进行比较，以测定调节程度。设定阳性对照样品(例如没有添加调节剂的甜味调味剂)的相对T1R活性值为100％。

“EC₅₀”被定义为不管是作为激活剂、增强剂还是调节剂，引起化合物能够引起的最大应答的50％的该化合物的量。在一个实施例中，测定化合物的剂量依赖性应答曲线，并由该曲线得到与最大应答的50％相对应的化合物浓度。

“IC₅₀”被定义为作为抑制剂，引起化合物能够引起的最大效果的50％的该化合物的量。

对于甜味调味剂和增强剂，在化合物被鉴定后，它们的活性的得分以最大果糖强度的百分比(％)给出。在化合物剂量应答中，可以计算EC₅₀以反映该化合物作为甜味激动剂的潜能。在本发明中，低于约100mM的EC₅₀指示化合物作为甜味激动剂诱导T1R2/T1R3的活性。优选地，对于甜味激动剂，阳性样品(hit)具有低于约1mM的EC₅₀，更优选低于约10μM的EC₅₀。

在甜味增强的测定试验中，测定果糖剂量应答，用同时在每一个果糖浓度的一定量的候选化合物来测定第二果糖剂量应答。然后，根据以下定义计算EC₅₀比率：

EC₅₀比率＝EC₅₀(果糖)/EC₅₀(果糖+[化合物])

其中“[化合物]”是指用以引起(或增强或加强)果糖剂量应答的化合物的浓度。这些浓度可以从pM至mM，更优选地，从低nM至μM来进行变化。有效的甜味增强剂在所使用的化合物的低浓度时具有高的EC₅₀比率。

在本发明中，高于1的EC₅₀比率指示化合物调节(加强)T1R2/T1R3的活性，并且该化合物是甜味增强剂。优选地，阳性样品具有的EC₅₀比率值至少为1.20，优选范围为至少1.50～100，或者甚至更高。

相反地，竞争性激动剂(那些相互排斥性结合的甜味调味剂)或抑制剂总是产生低于1(例如0～1)的EC₅₀比率。

对于鲜味调味剂和增强剂，它们的活性的得分以最大MSG强度的百分比(％)给出。在化合物剂量应答中，可以计算EC₅₀以反映化合物作为鲜味激动剂的潜能。在本发明中，低于约10mM的EC₅₀指示化合物诱导T1R1/T1R3的活性，并且是鲜味激动剂。优选地，对于鲜味激动剂，阳性样品具有低于约1mM的EC₅₀值，更优选范围为约pM到约低μM。

在增强测定试验中，测定MSG剂量应答，同时用同时在每一个MSG浓度的一定量的候选化合物来测定第二MSG剂量应答。然后，根据以下定义计算EC₅₀比率：

EC₅₀比率＝EC₅₀(MSG)/EC₅₀(MSG+[化合物])

其中“[化合物]”是指用以引起(或增强或加强)MSG剂量应答的化合物的浓度。这些浓度可以从pM至mM，更优选地，从低nM到μM来进行变化。有效的鲜味增强剂在所使用的化合物的低浓度时具有高的EC₅₀比率。

在本发明中，大于1的EC₅₀比率指示化合物调节(加强)T1R1/T1R3的活性，并且该化合物是鲜味增强剂。优选地，阳性样品的EC₅₀比率值至少为1.20，优选范围为至少1.50～100，或者甚至更高。

设定阴性对照样品(例如没有加入味觉刺激物的缓冲液)的相对T1R活性值为0％。当阳性对照样品和调节剂的混合物导致T1R活性相对于阳性对照为约80％，或者为50％或25％～0％时，取得对T1R的抑制。当T1R活性值比阳性对照样品高出10％、25％、50％、75％、或者100％、或者150％、或者200％～500％或者1000％～3000％时，单独的调节剂取得对T1R的激活。

在本文中使用的术语“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”是指不含有其它不同的化合物的状态，所述不同的化合物为本发明的化合物通常在天然状态与之伴随的化合物，因此“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”的对象包含给定样品的量的至少0.5重量％、1重量％、5重量％、10重量％或20重量％，并且最优选为至少50重量％或75重量％。在一个优选的实施方案中，这些术语是指至少包含给定样品的量的至少95重量％的本发明化合物。如本文所使用的那样，当所指的是核酸或蛋白时，术语“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”还指不同于其在哺乳动物尤其是人类体内天然存在状态的纯化或浓缩状态。高于在哺乳动物尤其是人类体内天然存在状态的任意纯化或浓缩程度均在“分离的”的意思之内，所述纯化或浓缩程度包括(1)从其它有关结构或化合物中进行的纯化(2)与结构或化合物所具有的关联，所述关联不是在哺乳动物尤其是人体中的正常关联。在本文中描述的核酸或蛋白或各种类别的核酸或蛋白可以根据本领域技术人员已知的各种方法和过程进行分离，或者与它们的天然不是正常关联的结构或化合物进行联合。

术语“核酸”或“核酸序列”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡聚核苷酸。该术语包括含有已知的天然核苷酸的同源物的核酸(即寡聚核苷酸)。该术语还包括具有合成主链的类似核酸的结构(见例如Oligonucleotides and Analogues，a Practical Approach，F.Eckstein编辑，Oxford Univ.Press(1991)；Antisense Strategies，Annals of theN.Y.Academy of Sciences，第600卷，Baserga等编辑(NYAS 1992)；Milligan J.Med.Chem.36：1923-1937(1993)；Antisense Research andApplications(1993，CRC Press)，WO 97/03211；WO 96/39154；Mata，Toxicol.Appl.Pharmacol.144：189-197(1997)；Strauss-Soukup，Biochemistry36：8692-8698(1997)；Samstag，Antisense Nucleic Acid Drug Dev，6：153-156(1996))。

除非另有说明，特定的核酸序列还隐含地包括其经保守性修饰的变体(例如简并密码子置换)和互补序列，以及明确说明的序列。具体地，可以通过产生例如其中一个或多个所选择的密码子的第三位被混合的碱基和/或三磷酸脱氧肌苷残基置换的序列而获得的简并密码子置换(Batzer等，Nucleic Acid Res.，19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.，260：2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes，8：91-98(1994))。术语核酸可以与基因、cDNA、mRNA、寡聚核苷酸和多核苷酸互换使用。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中是互换使用的，其是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“质膜移位结构域”或仅仅为“移位结构域”意为这样的多肽结构域，当将其加入到多肽编码序列中时，与没有所述多肽结构域相比，能够更高效地将杂合(“融合”)蛋白“伴随”或“移位”到细胞的质膜。例如，“移位结构域”可以来自牛的视紫红质受体多肽，该多肽为具有7次跨膜的受体。然而，如同其它移位促进序列一样，也可以使用来自其它哺乳动物的视紫红质。因此，移位结构域在将7次跨膜融合蛋白移位到质膜是特别有效的，并且包含氨基末端的移位结构域的蛋白(例如味觉受体多肽)比没有所述移位结构域的蛋白能够更有效地转移到质膜上。但是，如果该多肽的N-末端区域例如与本发明的T1R受体具有结合活性，则优选使用其它移位结构域。例如，可以使用如本文描述的PDZ结构域互相作用肽。

本文描述的“移位结构域”、“配体结合结构域”以及嵌合受体组合物还可以包括结构和活性基本上与作为例证的序列相对应的“类似物”、“保守性变体”和“模拟物”(“肽模拟物”)。因此，术语“保守性变体”、“类似物”或“模拟物”是指具有修饰的氨基酸序列的多肽，由此如本文所定义的，所述变化没有使该多肽的(保守性变体的)结构和/或活性产生根本性改变。这些包括氨基酸序列的保守性修饰变体，即对于蛋白活性来说并不关键的那些残基的置换、添加或缺失，或者用具有类似特性(例如酸性、碱性、带正电的或带负电的，极性的或非极性等)的残基所进行的氨基酸置换，使得甚至是关键的氨基酸的置换也并不根本改变结构和/或活性。

更具体地，“保守性修饰变体”适用于氨基酸和核酸的序列。对于特定的核酸序列，保守性修饰变体是指编码相同或实质上相同的氨基酸序列的核酸序列，或者当核酸不编码氨基酸序列时，指实质上相同的序列。由于遗传密码子的简并性，大量功能性相同的核酸编码任意给定的蛋白。

例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因此，在由密码子确定丙氨酸时的每一个位置，可以将该密码子改变为任何一个所述的相应密码子而不改变所编码的多肽。

所述核酸变体是“沉默变异”，这是一类保守性修饰的变异。本文编码多肽的每一条核酸序列也描述了该核酸的每一个可能的沉默变异。本领域技术人员应该认识到，可以对核酸中的各密码子(除了一般是甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和一般是色氨酸的唯一密码子的TGG之外)进行修饰，以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各沉默变异隐含在各所述的序列中。

提供功能类似的氨基酸的保守性置换表在本领域中是已知的。例如，一个选择保守性置换的示例性准则包括(在原始的残基之后为示例性置换)：ala/gly或ser；arg/lys；asn/gln或his；asp/glu；cys/ser；gln/asn；gly/asp；gly/ala或pro；his/asn或gln；ile/leu或val；leu/ile或val；lys/arg或gln或glu；met/leu或tyr或ile；phe/met或leu或tyr；ser/thr；thr/ser；trp/tyr；tyr/trp或phe；val/ile或leu。选择性的示例性准则使用以下6组，各组包含相互间保守性置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(I)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(还见例如Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Company(1984)；Schultz和Schimer，Principles of ProteinStructure，Springer-Vrlag(1979))。本领域技术人员应该理解，上述确定的置换并不是唯一可能的保守性置换。例如，为某些目的，不管氨基酸是带正电的还是带负电的，可以认为所有带电的氨基酸均是相互间的保守性置换。另外，在编码序列中改变、增加或缺失单个氨基酸或低百分比的氨基酸的置换、缺失或添加也可以被认为是“保守性修饰变异”。

术语“模拟物”和“肽模拟物”是指具有基本相同的多肽(例如本发明的移位结构域、配体结合结构域或嵌合受体)结构和/或功能特征的合成化学化合物。所述模拟物可以全部由氨基酸的合成的非天然类似物组成，或可以是部分天然肽氨基酸和氨基酸的部分非天然类似物的嵌合分子。该模拟物还可以混有任意量的天然氨基酸保守性置换，条件是所述置换没有实质性改变该模拟物的结构和/或功能。

对于本发明中作为保守变体的多肽，可以用常规实验来确定模拟物是否处于本发明的范围之内，即其结构和/或功能没有发生实质性改变。多肽模拟物组合物可以包含非天然结构组分的任意组合，所述多肽组合物通常来自3个结构基团：a)除了天然酰胺键(“肽键”)连接之外的残基连接基团；b)代替天然存在的氨基酸残基的非天然残基；或c)引起二级结构模拟的残基，即诱导二级结构或使二级结构稳定，所述二级结构例如β转角、γ转角、β片层和α螺旋构象等。当通过化学手段而不是天然肽键来连接多肽的全部或某些残基时，可以将该多肽表征为模拟物。单个肽模拟物的残基可以由肽键、其它化学键或偶联手段连接，例如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能的马来酰亚胺、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)。可以代替传统酰胺键(“肽键”)连接的连接基团包括例如酮基亚甲基(例如用于-C(＝O)-NH-的-C(＝O)-CH₂-)、氨基亚甲基(CH₂-NH)、乙烯、烯烃(CH＝CH)、醚(CH₂-O)、硫醚(CH₂-S)、四氮唑(CN₄)、噻唑、retroamide或酯(见例如Spatola，Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，第7卷，267-357页，“Peptide Backbone Modifications，”Marcell Dekker，NY(1983))。多肽还可以由于其含有代替天然存在的氨基酸残基的全部或一些非天然残基的而被表征为模拟物；在科学或专利文献中详细描述了非天然的残基。

“标记”或“可检测部分”是通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测的组合物。例如，有用的标记包括³²P、荧光染料、电子密度试剂、酶(例如在ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛、制成可检测形式的(例如通过将放射性标记混入肽)半抗原和蛋白、或用来检测与肽特异性反应的抗体的半抗原和蛋白。

“标记的核酸探针或寡聚核苷酸”是通过接头或化学键共价结合或通过离子键、范德华力、静电或氢键非共价结合到标记上的核酸探针或寡聚核苷酸，由此可以通过检测结合到探针上的标记的存在来检测探针的存在。

本文使用的术语“核酸探针或寡聚核苷酸”被定义为通过一种或多种类型的化学键(通常通过一般由氢键形成的互补碱基配对)能够与互补序列的目标核酸相结合的核酸。如本文使用的那样，探针可以包括天然碱基(即A、G、C或T)或修饰的碱基(7-脱氮鸟嘌呤核苷、肌苷等)。另外，只要不影响杂交，探针中的碱基可以由磷酸二酯键之外的键来连接。因此，例如，探针可以是组成性碱基由磷酸二酯键之外的肽键来连接的肽核酸。本领域技术人员应该理解，探针可以与缺乏与该探针的完整互补性的目标序列相结合，这取决于杂交条件的严格性。选择性地，例如用同位素、生色团、发光团、色原等直接标记探针，或者选择性地，用诸如生物素等间接地标记探针，所述生物素可以后来与链霉抗生物素蛋白结合。通过测定探针的存在或者不存在，可以检测所选择的序列或亚序列的存在或不存在。

当指核酸的一部分时使用的术语“异源”指示所述核酸包含两个或两个以上相互关系与天然的相互关系不相同的亚序列。例如，核酸通常是通过重组产生，具有来自不相关的基因的序列，该序列经过排列以形成新的功能性核酸，例如一种来源的启动子和另外一种来源的编码区。类似地，异源蛋白指示该蛋白包含两个或两个以上相互关系不与天然的相互关系相同的亚序列(例如融合蛋白)。

“启动子”被定义为指导核酸转录的一排核酸序列。如本文所使用的那样，启动子包括位于转录起始位点附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II类型的启动子情况中的TATA元件。选择性地，启动子还包括远端的增强子或抑制子元件，该元件可以位于离转录起始位点多达几千个碱基对的位置。“组成型”启动子是在绝大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。

“诱导型”启动子是在环境或发育调节下具有活性的启动子。术语“可操作连接”是指在核酸表达控制序列(例如启动子、转录因子结合位点的序列)和另一个序列之间的功能性连接，其中，所述表达控制序列指导与所述另一个序列相对应的核酸序列的转录。

如本文所用的那样，“重组”指合成的或体外操作的多核苷酸(例如“重组的多核苷酸”)，指用重组多核苷酸在细胞中或其它生物系统中产生基因产物的方法，或指由重组的多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白”)。“重组手段”还包括将具有各种不同来源的编码区或结构域或启动子序列的核酸连入到表达盒或载体中以表达(例如诱导型或组成型表达)包含本发明的移位结构域和用本发明的引物扩增的核酸序列的融合蛋白。

如本文所用的那样，“稳定细胞系”是指稳定地(即在很长的时间内)表达异源核酸序列(即T1R或G蛋白)的细胞系。在一个优选的实施方案中，所述稳定细胞系由下述方法产生，所述方法为用含有T1R表达构建体(即T1R1、T1R2和/或T1R3)的线性化载体对适宜的细胞进行转染，所述适宜的细胞一般为哺乳动物细胞，例如HEK-293细胞。最优选地，通过共转染表达hT1R1和hT1R3或hT1R2和hT1R3的两个线性化质粒和适当的选择程序以产生其中稳定整合有这些基因的细胞系而获得所述的稳定细胞系。最优选地，该细胞系还稳定表达诸如G_α15等G蛋白。

短语“选择性(特异性)杂交”是指当复合混合物(例如全细胞DNA或文库DNA或RNA)中存在特定核酸序列时，在严格杂交条件下，分子只与所述特定核酸序列结合、双联或杂交。

短语“严格杂交条件”是指在该条件下探针与其目标亚序列杂交，但不与其它序列杂交，所述杂交通常在核酸的复合混合物中进行。严格条件取决于序列并因环境的不同而不同。较长的序列在较高的温度特异性杂交。在Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid assays”(1993)中可以找到核酸杂交的详尽指南。通常，对于在一定的离子强度、pH下的特定序列，选择的严格条件比热解链点(Tm)约低5℃～10℃。Tm是平衡时(因为存在的目标序列过量，在Tm，平衡时50％的探针被占据)50％的与目标序列互补的探针与目标序列杂交的温度(一定的离子强度、pH和核酸浓度)。严格条件是以下条件：其中在pH7.0～8.3，盐浓度为低于约1.0M的钠离子，通常钠离子(或其它盐)浓度约为0.01M～1.0M，并且对于短探针(例如10～50个核苷酸)，所述温度至少为约30℃，而对于长探针(例如多于50个核苷酸)，所述温度至少为约60℃。严格条件还可以通过添加诸如甲酰胺等去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少为背景的2倍，选择性地，为背景杂交的10倍。示例性的严格的杂交条件可如下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS、并在42℃温浴，或者，5×SSC、1％的SDS，并在65℃温浴，在65℃于0.2×SSC和0.1％的SDS中洗涤。所述杂交和洗涤步骤例如可进行1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟或更长的时间。

如果核酸编码的多肽是实质上相关的，那么在严格条件下不相互杂交的核酸还是实质上相关的。例如，当采用遗传密码子所允许具有的最大密码子简并性来生成核酸拷贝时，上述情况就会发生。在这种情况中，所述核酸通常在中等严格杂交条件下进行杂交。示例性的“中等严格杂交条件”包括在37℃于40％的甲酰胺、1M的NaCl、1％的SDS的缓冲液中进行的杂交，并在45℃于1×SSC中进行洗涤。所述杂交和洗涤步骤可进行例如1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟或更长的时间。阳性杂交至少为背景的2倍。本领域技术人员应该很容易认识到，可以利用选择性的杂交和洗涤条件来提供严格程度类似的条件。

“抗体”是指特异结合和识别抗原的包含来源于免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽。普遍认为免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ的恒定区基因以及无数免疫球蛋白的可变区基因。轻链被归类为κ或被归类为λ。重链被归类为γ、μ、α、δ或ε，因此依次将免疫球蛋白分别定义为以下类型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体，每个四聚体包含两对相同的多肽链，每对多肽链具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50kDa～70kDa)。每条链的N-末端确定主要负责抗原识别的约100～110或更多个氨基酸的可变区。所述“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别是指这些轻链和重链。

“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)恒定区或其部分经过改变、替换或交换，使得抗原结合位点(可变区)连接到不同的或经改变的类型、效应子功能和/或物种的恒定区，或者连接到赋予所述嵌合抗体新的特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等)；或(b)用具有不同的或改变的抗原特异性的可变区来改变、替换或交换可变区或其部分。

“抗T1R”抗体是特异结合由T1R基因、cDNA或其亚序列编码的多肽的抗体或抗体片段。

术语“免疫测定”是使用抗体来特异性结合抗原的测定。所述免疫测定的特征是，利用特定抗体的特异结合性质来分离、定位和/或定量抗原。

当指分子或组合物时，短语“特异性(选择性)结合”或“特异性(选择性)反应”，是指决定该分子在异源群体的其它生物物质中的存在的结合反应。因此，在指定的条件下，特异分子结合到特定受体(至少是背景的两倍)，并且实质上并没有大量地结合到样品中存在的其它分子上。在所述条件下与受体的特异结合可能需要根据对特定分子的特异性所选择的受体。

对于抗体，可以采用各种免疫测定形式来选择与特定蛋白具有特异免疫反应性的抗体。例如，常规上采用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白具有特异免疫反应性的抗体(见例如Harlow和Lane，Antibodies，ALaboratory Manual，(1988)，描述能够用来测定特异免疫反应性的免疫测定形式和条件)。典型地，特异性或选择性反应至少是背景信号或噪音的2倍，更典型地，超过背景的10倍～100倍。

短语“选择性结合”是指核酸与以上所确定的另一个核酸“选择性杂交”的能力，或者抗体与以上所确定的另一个蛋白选择性(或特异性)结合的能力。

术语“表达载体”是指在包括原核细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞等在内的任意细胞中，为体外或体内表达(组成型表达或诱导型表达)本发明的核酸序列目的而采用的任意重组表达系统。该术语包括线性或环状表达系统。该术语包括保持附加型的表达系统或整合到宿主细胞基因组中的表达系统。该表达系统具有自我复制的能力或不具有自我复制的能力，所述不具有自我复制的能力指的是即只在细胞中驱动瞬时表达。该术语包括只包含重组核酸的转录所需要的最少元件的重组表达“盒”。

“宿主细胞”是指包含表达载体并支持该表达载体复制或表达的细胞。宿主细胞可以是诸如大肠杆菌(E.coli)等原核细胞，或者是诸如酵母、昆虫、两栖动物、蠕虫或哺乳动物细胞(例如CHO、海拉细胞、HEK-293等)等真核细胞等，例如培养细胞、外植体和体内细胞。

                       化合物

如上所述，T1R受体上具有不同的结构域。T1R1、T1R2和T1R3各包含N-末端胞外域(也称为维纳斯捕蝇结构域)，包含7个跨膜区和相应的胞质和胞外环的跨膜结构域；富含半胱氨酸结构域和C-末端结构域。各区域确定了特异结合到该区域的一组特异化合物。

在人类中，N-末端胞外域包含hT1R2的氨基酸1～560和hT1R3的氨基酸1～563。在大鼠中，N-末端胞外域包含rT1R2的氨基酸1～564和rT1R3的氨基酸1～568。

在人类中，C-末端跨膜结构域和胞内域包含hT1R2的氨基酸561～839和hT1R3的氨基酸564～852。在大鼠中，C-末端跨膜结构域和胞内域包含rT1R2的氨基酸565～842和rT1R3的氨基酸569～858。

代谢型谷氨酸受体(mGluR)是对谷氨酸产生应答的另一类型的C类G蛋白偶联受体。这些受体主要发现于脑和神经元组织，它们在脑和神经元组织的神经元信号转导中发挥作用。mGluR的N-末端胞外域可以与T1R共价结合以形成嵌合受体。mGluR受体可以例如是mGluR1～mGluR8中的任意一种。不同的配体结合到鲜味受体和甜味受体的不同亚基上的不同结构域。例如，天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和纽甜结合到T1R2的N-末端胞外域，而环己基氨基磺酸盐、新橙皮苷二氢查耳酮(NHDC)和lactisole则结合到T1R3的跨膜结构域。由于T1R3是T1R1/T1R3鲜味受体中的两个亚基之一，环己基氨基磺酸盐、NHDC和lactisole也可以与T1R1/T1R3鲜味受体中的T1R3相互作用。环己基氨基磺酸盐和NHDC促进鲜味受体的活性，而lactisole则抑制鲜味受体。

当涉及到鲜味调味剂时，本发明的特异性结合化合物包括酰胺。酰胺化合物还包括某些亚类的酰胺衍生物或各类与酰胺有关的衍生物，例如脲、氨基甲酸酯、草酰胺、丙烯酰胺等。

与T1R2的跨膜结构域相互作用的分子例如可以是甜味的调节剂，而与T1R3的跨膜结构域相互作用的分子可以是甜味和/或鲜味的调节剂。

人类T1R2/T1R3识别不被大鼠T1R2/T1R3识别的一组甜味剂，但是人类的T1R2/T1R3受到lactisole的抑制，而大鼠的T1R2/T1R3不受lactisole的抑制。当人类T1R2的胞外域被其大鼠的对应物所代替时，人类受体失去识别天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的能力，表明人类T1R2的这一部分对于结合天冬氨酰苯丙氨酸甲酯是必要的。相反地，当大鼠T1R2的胞外域被其人类的对应物所代替时，大鼠受体获得了识别天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的能力，表明人类T1R2的这一部分足以结合天冬氨酰苯丙氨酸甲酯。采用相同的原理，人类T1R3的跨膜结构域是必要和充分的。

表6显示用以代表各种大鼠/人类嵌合受体和受体亚基的缩写。

表6

hT1R2-人类T1R2
	hT1R3-人类T1R3
rT1R2-大鼠T1R2
	rT1R3-大鼠T1R3
hT1R2/rT1R3-由人类T1R2和大鼠T1R3组成的受体
	rT1R2/hT1R3-由大鼠T1R2和人类T1R3组成的受体
hT1R2/h3-r3-由人类T1R2与嵌合T1R3组成的受体，所述嵌合T1R3具有人类的N-末端胞外域和大鼠的跨膜结构域以及C-末端结构域
	rT1R2/r3-h3-由大鼠T1R2与嵌合T1R3组成的受体，所述嵌合T1R3具有大鼠的N-末端胞外域和人类的跨膜结构域和C-末端结构域
h2-r2/rT1R3-由嵌合T1R2和大鼠T1R3组成的受体，所述嵌合T1R2具有人类的N-末端胞外域和大鼠的跨膜结构域和C-末端结构域
	r2-h2/rT1R3-由嵌合T1R2和大鼠T1R3组成的受体，所述嵌合T1R2具有大鼠的N-末端胞外域和人类的跨膜结构域和C-末端结构

h2-h1/hT1R3-由嵌合T1R和人类T1R3组成的受体，所述嵌合T1R具有人类的T1R2的N-末端胞外域和人类的T1R1跨膜结构域和C-末端结构域
	h1-h2/hT1R3-由嵌合T1R和人类T1R3组成的受体，所述嵌合T1R具有人类T1R1的N-末端胞外域和人类的T1R2跨膜结构域和C-末端结构域
h2-mGluR1/h3-mGluR1-由来自hT1R2的N-末端胞外域(共价结合到mGluR1的跨膜结构域和C-末端结构域)和来自hT1R3的N-末端胞外域(共价结合到mGluR1的跨膜结构域和C-末端结构域)组成的受体
	h1-mGluR1/h3-mGluR1-由来自hT1R1的N-末端胞外域(共价结合到mGluR1的跨膜结构域和C-末端结构域)与来自hT1R3的N-末端胞外域(共价结合到mGluR1的跨膜结构域和C-末端结构域)组成的受体
mGluR1-h2/mGluR1-h3-由来自mGluR1的N-末端胞外域(共价结合到hT1R2的跨膜结构域和C-末端结构域)与来自mGluR1的N-末端胞外域(共价结合到hT1R3的跨膜结构域和C-末端结构域)组成的受体
	mGluR1-h1/mGluR1-h3-由来自mGluR1的N-末端胞外域(共价结合到hT1R1的跨膜结构域和C-末端结构域)与来自mGluR1的N-末端胞外域(共价结合到hT1R3的跨膜结构域和C-末端结构域)组成的受体

本文公开了特异性结合到包含hT1R2/hT1R3(而不是rT1R2/rT1R3)的T1R2/T1R3受体上的非天然存在的化合物。所述化合物的例子包括但不限于纽甜、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、环己基氨基磺酸盐、lactisole、化合物883360、化合物6542888、化合物403249、化合物6364395、二羟基苯甲酸(DHB)、化合物6542888和新橙皮苷二氢查耳酮(NHDC)。可以在表1～4中找到其它例子。非肽的有机化合物的大小可约为维度为15×8×8埃³的长方形结构，更优选地，维度应该为12×5×5埃³。

本文还公开了特异性结合到包含hT1R2/rT1R3(但不是rT1R2/hT1R3)的T1R2/T1R3受体上的化合物。所述化合物的例子包括但不限于天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和纽甜。可以在表5中找到其它的例子。

本文还公开了特异性结合到hT1R2/hT1R3受体的T1R2的N-末端胞外域上的化合物。所述化合物的例子包括但不限于纽甜、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、碳水化合物糖(例如蔗糖、果糖、葡萄糖、塔格糖、赤藓糖醇、山梨糖醇、麦芽糖、木糖醇、乳糖和半乳糖，以及所有其它碳水化合物糖)。可以在表5中找到其它的例子。

本文还公开了特异性结合到hT1R2/hT1R3和hT1R2/rT1R3受体的T1R2的维纳斯捕蝇域(VFD)上的化合物。

本文还公开了特异性结合到T1R2/T1R3受体的T1R2亚基的N-末端维纳斯捕蝇域(VFD)上的化合物。更具体地，本文还公开了特异性结合到人类T1R2/T1R3受体的T1R2亚基的N-末端维纳斯捕蝇域的氨基酸残基114和氨基酸残基302上的化合物。所述化合物的例子包括但不限于天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、纽甜、碳水化合物，以及诸如D-Trp、Ala和Gly等甜味氨基酸。

本文还公开了特异性结合到hT1R2/hT1R3受体的T1R2的富含半胱氨酸区上的化合物。本文还公开了特异性结合到hT1R2/hT1R3受体的T1R2的跨膜结构域(TM)上的化合物。

本文还公开了特异性结合到包含rT1R2/hT1R3(但不是hT1R2/rT1R3)的T1R2/T1R3受体上的化合物。所述化合物的例子包括但不限于环己基氨基磺酸盐、NHDC、lactisole、化合物883360、化合物403249和化合物6364395。可以在表5中找到其它的例子。

本文还公开了特异性结合hT1R2/hT1R3和rT1R2/r3-h3但不结合rT1R2/rT1R3或hT1R2/h3-r3的化合物。所述化合物的例子包括但不限于环己基氨基磺酸盐、NHDC、lactisole、化合物883360、化合物403249和化合物6364395。

本文还公开了特异性结合到人类T1R2/T1R3受体的T1R3亚基的C-末端结构域的胞外环2和胞外环3上的化合物。本文还公开了特异性结合到hT1R2/hT1R3和r2-h2/rT1R3但不结合到rT1R2/rT1R3或h2-r2/hT1R3上的化合物。

本文还公开了特异性结合到人类T1R2/T1R3受体的T1R3亚基的N-末端胞外域上的化合物。本文还公开了特异性结合到hT1R2/hT1R3受体的T1R3的维纳斯捕蝇域(VFD)上的化合物。所述化合物的例子包括但不限于天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、纽甜、碳水化合物，以及诸如D-Trp、Ala和Gly等甜味氨基酸。

本文还公开了特异性结合到hT1R2/hT1R3受体的T1R3的跨膜结构域的化合物。本文还公开了特异性结合到人类T1R2/T1R3的T1R3亚基的跨膜结构域的胞外环2和胞外环3上的化合物。所述化合物的例子包括但不限于环己基氨基磺酸盐。

本发明的化合物不包括蔗糖、果糖、葡萄糖、赤藓糖醇、异麦芽酮糖醇(isomalt)、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇，某些已知的天然萜类化合物、黄酮类化合物或蛋白甜味剂、二肽、三肽、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、三氯蔗糖、卤代糖、乙酰舒泛钾、环己基氨基磺酸盐、三氯蔗糖和天胺甜素。纽甜、紫苏葶、SC-45647、SC-40014、应乐果甜蛋白、NC-002740-01、奇异果甜蛋白、CC-00100、NC-00420、天胺甜素、SC-44102、对乙氧基苯脲、NC-00576、甘草酸(slycyrrhizic Acid)、蛇菊苷、糖精钠、D-色氨酸、环己基氨基磺酸盐、DHB、乙醇酸、甘氨酸、D(-)果糖、高呋喃(homofuronol)、D(-)塔格糖、麦芽糖、D(+)葡萄糖、D-山梨糖醇、D(+)半乳糖、α-乳糖、L()果糖、L(+)化合物403249和葡萄糖。

选择性地，本发明的化合物也不是化合物6364395。

本文还公开了结合T1R域的截断区的化合物。例如，公开了特异性结合包含h2TM/h3TM的截断的甜味受体的T1R2的TM域的化合物，特异性结合包含h2TM/h3TM的截断的甜味受体的T1R3的TM域的化合物，特异性结合包含mGluR-h2/mGluR-h3的嵌合受体的T1R2的TM域的化合物，特异性结合包含mGluR-h2/mGluR-h3的嵌合受体的T1R3的TM域的化合物，结合包含h1TM/h3TM的截断的风味受体的T1R1的TM域的化合物，结合包含h1TM/h3TM的截断的甜味受体的T1R3的TM域的化合物，结合包含mGluR-h1/mGluR-h3的嵌合受体的T1R1的TM域的化合物，以及结合包含mGluR-h1/mGluR-h3的嵌合受体的T1R3的TM域的化合物。SEQ ID NO：29～33代表所述截断的受体。

本发明的化合物不包括谷氨酸单钠(“MSG”)、肌苷一磷酸(IMP)或鸟苷一磷酸(GMP)、蔗糖、果糖、葡萄糖、赤藓糖醇、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇，某些已知的天然萜类化合物、黄酮类化合物或蛋白甜味剂、二肽、三肽、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、三氯蔗糖、卤代糖、乙酰舒泛钾、环己基氨基磺酸盐、三氯蔗糖、天胺甜素、谷氨酸单钠(“MSG”)、肌苷一磷酸(IMP)或鸟苷一磷酸(GMP)或腺苷一磷酸。

化合物403249是(5-(4H-苯并[d][1，3]氧硫杂环己二烯-2-基)-2-甲氧基苯酚，而化合物6364395是3-(3-羟基-4-甲氧基苯乙基)苯并[d]异氧氮杂茂-4，6-二醇。

在用FLIPR仪器(荧光测定强度平板读取器(Fluorometric IntensityPlate Reader，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)进行基于荧光的测定中，相对于果糖最大活性，上述化合物可以显示出化合物依赖性荧光活性至少增加25％。例如，所述程序的例子见实施例12和实施例18。所述化合物显出(demonstrate)：在用FLIPR仪器(Molecular Devices)进行的基于荧光的测定中，甜味剂的EC₅₀(EC₅₀ for a sweetener)以化合物依赖性方式降低至少2倍。而且，在基于细胞的测定中，所述化合物可导致用野生型或嵌合受体转染的100个细胞中的至少10个显示出化合物依赖性的荧光增强。在实施例24中可以找到基于细胞的测定的例子。所述化合物还显示：对亚最大水平(sub-maximal level)的甜味剂产生应答的荧光细胞数目以化合物依赖性方式增加至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2倍或者更高倍数，或者倍数为其间的任意数。可以通过荧光、钙水平、IP₃水平、cAMP水平、GTPγS结合或报道基因活性(例如荧光素酶、β-半乳糖苷酶)来对应答进行测定。

此外，本文公开的化合物可以在细胞中具有一个或多个以下特征：相对于对照，EC₅₀至少约下降50％；胞内钙水平至少约上升25％；胞内cAMP至少约上升25％；胞内cGMP至少约上升25％；胞内IP₃至少约上升25％或GTPγS与G蛋白的结合至少约上升25％。

使用化合物的方法

本发明还公开了调节食用或药用产品的风味的方法，该方法包括：提供至少一种食用或药用产品或者其前体，并将食用或药用产品或者其前体与至少风味调节量的本文公开的至少一种非天然存在的化合物或其食用上可接受的盐进行组合，以形成经改进的食用产品或药用产品；据此调节食用产品或药用产品的风味。

本发明还公开了抑制食用或药用产品的风味的方法，该方法包括：提供至少一种食用或药用产品或者其前体，并将食用或药用产品或者其前体与至少风味抑制量的本文公开的至少一种非天然存在的化合物或其食用上可接受的盐进行组合，以形成经改进的食用或药用产品；据此抑制食用或药用产品的风味。

本发明还公开了增强食用或药用产品的风味的方法，该方法包括：提供至少一种食用或药用产品或者其前体，并将食用或药用产品或者其前体与至少风味增强量的本文公开的至少一种非天然存在的化合物或其食用上可接受的盐进行组合，以形成经改进的食用或药用产品；据此提高食用或药用产品的风味。

本发明还公开了调节食用或药用产品的甜味的方法，该方法包括：提供至少一种食用或药用产品或者其前体，并将食用或药用产品或者其前体与至少甜味调节量的本文公开的至少一种非天然存在的化合物或其食用上可接受的盐进行组合，以形成经改进的食用或药用产品；据此调节食用或药用产品的甜味。

本发明还公开了抑制食用或药用产品的甜味的方法，该方法包括：提供至少一种食用或药用产品或者其前体，并将食用或药用产品或者其前体与至少甜味抑制量的本文公开的至少一种非天然存在的化合物或其食用上可接受的盐进行组合，以形成经改进的食用或药用产品；据此抑制食用或药用产品的甜味。

本发明还公开了增强食用或药用产品的甜味的方法，该方法包括：提供至少一种食用或药用产品或者其前体，并将食用或药用产品或者其前体与至少甜味增强量的本文公开的至少一种非天然存在的化合物或其食用上可接受的盐进行组合，以形成经改进的食用产品或药用产品；据此增强食用或药用产品的甜味。

本发明还公开了增强鲜味感觉的方法，该方法包括用环己基氨基磺酸盐和NHDC以及它们的衍生物接触鲜味受体；以及公开了增强鲜味感觉的方法，该方法包括用lactisole衍生物接触鲜味受体。本发明还公开了增强甜味感觉的方法，该方法包括用环己基氨基磺酸盐和NHDC以及它们的衍生物接触甜味受体；以及公开了增强甜味感觉的方法，该方法包括用lactisole衍生物接触甜味受体。

T1R多肽的分离和表达

可以如下所述对本发明的T1R或其片段或变体进行分离和表达。可以利用PCR引物来扩增编码味觉受体配体结合区的核酸，并可选择性地建立这些核酸的文库。然后可以用个体表达载体或表达载体的文库感染或转染宿主细胞以用于这些核酸或文库的功能性表达。可以在体外或体内制备并表达这些基因或载体。本领域技术人员应该认识到，可以通过调节本发明载体内的所述基因和核酸(例如启动子、增强子等)的表达或活性，获得用于改变和控制核酸表达的所需表型。可以使用用于提高或降低表达或活性的任意已知的所述方法。本发明可以结合在科学和专利文献中进行充分描述的本领域已知的任意方法或程序来实施。

可以从各种来源(基因工程的、扩增的和/或重组表达的)分离本发明的核酸序列和用于实施本发明的其它核酸，所述核酸不论是RNA、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或者它们的杂合体。除了哺乳动物细胞以外，还可以使用诸如细菌系统、酵母系统、昆虫系统或植物系统等任意的重组表达系统。

选择性地，可以通过已知的体外化学合成技术来合成所述核酸，所述技术例如在Carruthers，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-418(1982)；Adams，Am.Chem.Soc.105：661(1983)；Belousov，Nucleic Acids Res.25：3440-3444(1997)；Frenkel，Free Radic.Biol.Med.19：373-380(1995)；Blommers，Biochemistry 33：7886-7896(1994)；Narang，Meth.Enzymol.68：90(1979)；Brown，Meth.Enzymol.68：109(1979)；Beaucage，Tetra.Lett.22：1859(1981)；美国专利No.4,458,066中描述的技术。然后可以通过合成互补链并在适宜的条件下使所述链一起退火或者通过采用DNA聚合酶和适宜的引物序列来添加互补链而获得双链DNA片段。

在科学和专利文献中详细描述了对核酸进行操作的技术，所述技术例如在序列中引入突变、亚克隆、探针标记、测序和杂交等技术，见例如Sambrook编，Molecular Cloning：a Laboratory manual(第二版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)；Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel编，John Wiley & Sons，Inc.，New York(1997)；LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology：Hybridization WithNucleic Acid Probes，第I部分，Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen编，Elsevier，N.Y.(1993)。

可以通过本领域技术人员已知的任意的大量普通方法对核酸、载体、衣壳和多肽等进行分析和定量。所述方法包括诸如NMR、分光光度法、放射照相法、电泳法、毛细管电泳法、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)和超扩散色谱法等分析生物化学方法，诸如流体或凝胶沉淀素反应法、免疫扩散法、免疫电泳法、放射性免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫-荧光测定法等各种免疫学方法，Southern分析，Northern分析，点印迹分析，凝胶电泳法(例如SDS-PAGE)，RT-PCR，定量PCR，其它核酸或目标或信号扩增方法，放射性标记法，闪烁计数法和亲和色谱法。

可以利用寡核苷酸引物来扩增编码味觉受体配体结合区的核酸片段。还可以用扩增技术对本文所述的核酸进行克隆或定量测定。扩增方法也是本领域已知的技术，包括例如聚合酶链式反应(PCR)(PCRProtocols，a Guide to Methods and Applications，Innis编.Academic Press，N.Y.(1990)和PCR Strategies，Innis编，Academic Press，Inc.，N.Y.(1995))；连接酶链式反应(LCR)(见例如Wu，Genomics 4：560(1989)；Landegren，Science 241：1077，(1988)；Barringer，Gene 89：117(1990))；转录扩增(见例如，Kwoh，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173(1989))；以及自动维持序列复制(见例如Guatelli，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874(1990))；Q-β复制酶扩增(见例如Smith，J.Clin.Microbiol.35：1477-1491(1997))；自动Q-β复制酶扩增测定(见例如Burg，Mol.Cell.Probes 10：257-271(1996))和其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)；还见Berger，Methods Enzymol.152：307-316(1987)；Sambrook；Ausubel；美国专利No.4,683,195和No.4,683,202；Sooknanan，Biotechnology 13：563-564(1995))。可以将引物设计为保留“供体”7-膜受体的原始序列。选择性地，引物可以编码保守性置换(例如疏水残基的疏水性，见以上讨论)的氨基酸残基或功能上的良性置换(例如不阻止质膜插入，不引起肽酶的剪切，不引起受体的异常折叠等)。一旦扩增，可以根据本领域已知方法克隆单独的核酸或作为文库的核酸，如果需要，可以采用常规的分子生物学方法将所述核酸克隆到任意的各种载体中；在例如美国专利No.5,426,039中描述了用于体外克隆经扩增的核酸的方法。

可以设计引物对以选择性地扩增T1R家族成员的配体结合区。对于不同的配体或调味剂，所述区域可以不同。因此，对于一种调味剂来说可能是最小结合区的区域对于另外一种调味剂来说可能太有限。因此，可以扩增包含不同胞外域结构的的不同大小的配体结合区。

在本领域中，设计简并引物对的范例是已知的。例如，可以从http://blocks.fhcrc.org/codehop.html获得共有-简并杂交寡核苷酸引物(COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer，CODEHOP)策略计算机程序，该程序与BlockMaker多序列比对站点直接链接，所述站点用于以一组相关蛋白序列(如已知味觉受体的配体结合区)为起始来进行杂合引物预测(见例如Rose，Nucleic Acids Res.26：1628-1635(1998)；Singh，Biotechniques 24：318-319(1998))。

在本领域中，合成寡核苷酸引物对的手段是已知的。“天然”的碱基对或合成的碱基对都可以采用。例如，人造核苷酸碱基的应用提供了操纵引物序列的通用方法并产生更复杂的扩增产物混合物。各种家族的人造核苷酸碱基能够通过内键旋转来呈现多氢成键取向而提供用于简并分子识别的方法。在PCR引物的单位点中引入这些类似物可以允许产生扩增产物的复合文库，见例如Hoops，Nucleic Acids Res.25：4866-4871(1997)。非极性分子也可以用来模拟天然DNA碱基的形状。腺嘌呤的非氢键合形式模拟物可以针对胸腺嘧啶的非极性形式模拟物进行有效和选择性复制(见例如Morales，Nat.Struct.Biol.5：950-954(1998))。例如，两个简并碱基可以是嘧啶碱基6H，8H-3，4-二氢嘧啶并[4，5-c][1，2]噁嗪-7-酮或嘌呤碱基N6-甲氧基-2，6-二氨基嘌呤(见例如Hill，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：4258-4263(1998))。本发明的示例性简并引物中加入了核苷酸碱基类似物5’-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲酰-2’-脱氧-胞嘧啶核苷、3’-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(序列中的术语“P”见上文)。所述嘧啶类似物通过氢键与包括A和G残基在内的嘌呤配对。

可以采用上述的核酸探针分离与本文公开的味觉受体基本相同的多态性变体、等位基因和物种间同源物。选择性地，可以通过检测与抗血清或纯化抗体产生免疫的经表达的同源物，采用表达文库来克隆T1R多肽及其多态性变体、等位基因和物种间同源物，所述抗血清或纯化抗体通过抗T1R多肽而制得，其还可以识别并选择性地结合T1R同源物。

可以采用简并引物对，通过扩增(例如PCR)适宜的核酸序列，产生编码味觉受体的配体结合区的核酸。经扩增的核酸可以是来自任意细胞或组织的基因组DNA或者来自味觉受体表达细胞的mRNA或cDNA。

在一个实施方案中，可以构建杂合蛋白编码序列，该杂合蛋白编码序列包含编码融合到移位序列的T1R的核酸。还提供了包含其它家族的化学感觉受体尤其是味觉受体的移位基序和调味剂结合结构域的杂合T1R。可以将所述核酸序列操作性地连接到转录或翻译控制元件，所述元件例如转录和翻译起始序列、启动子和增强子、转录和翻译终止子、多腺苷酸化序列和对将DNA转录为RNA有用的其它序列。在构建重组表达盒、载体和转基因物中，可以采用启动子片段指导所需核酸在所有所需细胞或组织中的表达。

在另外一个实施方案中，融合蛋白可以包括C-末端或N-末端的移位序列。此外，融合蛋白可以包含附加的元件(例如为了蛋白的检测、纯化或其它应用)。有利于检测和纯化的结构域包括例如金属螯合肽(例如聚组氨酸序列、组氨酸-色氨酸模块或者其它允许在固定的金属上纯化的区域)；麦芽糖结合蛋白；允许在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域；或在FLAGS展开/亲和纯化系统(Immunex Corp.，Seattle，WA)中应用的结构域。

在移位结构域(为有效地进行质膜表达)和其它新翻译的多肽之间包括诸如因子Xa(见例如Ottavi，Biochimie 80：289-293(1998))、枯草杆菌蛋白酶识别基序(见例如Polyak，Protein Eng.10：615-619(1997))等可剪切的接头序列，以及肠激酶(Invitrogen，San Diego，CA)等，这对于促进纯化可以是有用的。例如，一个构建体可以包括连接到6个组氨酸残基的编码多肽的核酸序列，在所述6个组氨酸残基之后为硫氧还蛋白、肠激酶可剪切位点(见例如Williams，Biochemistry 34：1787-1797(1995))和C-末端移位结构域。组氨酸残基促进检测和纯化，而肠激酶可剪切位点提供用于从融合蛋白的剩余物中纯化所需蛋白的手段。在科学和专利文献(见例如Kroll，DNA Cell.Biol.12：441-453(1993))中充分描述了有关编码融合蛋白的载体的技术和融合蛋白的应用。

可以通过各种常规技术，将包含配体结合结构域编码序列的表达载体(不管是单独的表达载体还是表达载体文库)导入到基因组或细胞的细胞质或细胞核中并进行表达，在科学和专利文献(见例如Roberts，Nature 328：731(1987)；Berger(上文)；Schneider，Protein Expr.Purif.6435：10(1995)；Sambrook；Tijssen；Ausubel)中详细描述了所述的常规技术。来自生物试剂和实验装备制造商的产品信息也提供了有关已知生物学方法的信息。载体可以从天然来源中分离，从诸如ATCC或GenBank文库等来源中获得，或通过合成或重组方法制备。

可以采用在细胞中稳定表达或瞬时表达的表达盒、载体或病毒(例如附加型表达系统)来表达核酸。可以在表达盒和载体中引入选择标记而使转化细胞和序列具有可选择的表型。例如，选择标记可以编码为附加维持型和复制型，因此不需要整合到宿主的基因组中。例如，所述标记可以编码抗生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、杀稻瘟素、潮霉素)或除草剂抗性(例如氯磺隆或Basta)，以允许对转化有所需DNA序列的那些细胞进行选择(见例如Blondelet-Rouault，Gene 190：315-317(1997)；Aubrecht，J.Pharmacol.Exp.Ther.281：992-997(1997))。由于赋予抗诸如新霉素或潮霉素等底物的抗性的选择性标记基因仅可用在组织培养中，因此在体外和体内还可以将化学抗性基因用作选择性标记。

嵌合的核酸序列可以编码在任意的7次跨膜多肽中的T1R配体结合结构域。由于7次跨膜受体多肽具有相似的一级序列和二级和三级结构，所以通过序列分析可以容易地鉴定出结构域(例如胞外域、TM域、胞质域等)。例如，同源性模型化、傅立叶分析和螺旋周期检测能够鉴定和表征带有7次跨膜受体序列的7个结构域。快速傅立叶转换(Fast FourierTransform，FFT)算法可以用来估定表征所分析序列的疏水性和变化性的概况的主要周期。周期性检测增强和α螺旋周期性指数可以根据例如Donnelly(Protein Sci.2：55-70(1993))的方法进行。其它的比对和模型化算法在本领域内是已知的，见例如Peitsch，Receptors Channels 4：161-164(1996)；Kyte和Doolittle，J.Med.Bio.，157：105-132(1982)；Cronet，ProteinEng.6：59-64(1993)。

本发明还不仅包括具有指定核酸序列和氨基酸序列的DNA和蛋白，而且还包括DNA片段尤其是例如40、60、80、100、150、200或250个或者更多个核苷酸的片段以及例如10、20、30、50、70、100或150个或者更多个氨基酸的蛋白片段。选择性地，核酸片段可以编码抗原性多肽，该抗原性多肽能够结合抗T1R家族成员而制得的抗体。此外，本发明的蛋白片段可以选择性地为抗原性多肽，该抗原多肽能够结合抗T1R家族成员而制得的抗体。

本发明还考虑包含嵌合蛋白，该嵌合蛋白包含至少一条本文所述的T1R多肽之一的至少10、20、30、50、70、100或150或者更多个氨基酸，该氨基酸与代表所有的或部分的另一种GPCR的附加氨基酸相偶联，所述GPCR优选为7次跨膜超家族的成员。这些嵌合体可以从本发明的受体或另外的GPCR制备，或者它们可以通过结合2个或2个以上本发明T1R受体而制得。在一个实施方案中，嵌合受体的一部分对应于或来自于本发明的T1R多肽的胞外域。在另外一个实施方案中，嵌合体的一部分对应于或来自于本文所述的T1R多肽的胞外域和一个或多个跨膜结构域，而剩余的一个部分或多个部分可以来自于另外的GPCR。在本领域中，嵌合受体是已知的，并且嵌合受体的产生技术以及用于整合到其中的G蛋白偶联受体的结构域或片段的选择和其边界(boundaries)也是已知的。因此，采用本领域技术人员的这些知识可以容易地产生所述的嵌合受体。使用所述的嵌合受体可以提供例如本文具体公开的受体之一的味觉选择性特征，该特征与另外受体(例如在现有技术测定系统中所使用的熟知受体)的信号转导特征偶联。

如以上所述，类似于天然的T1R受体的所述嵌合体或与天然的T1R受体组合或联合的所述嵌合体将与通常影响甜味或鲜味的分子相结合和/或被这些分子激活。功能性的嵌合T1R受体或受体组合是当单独表达或与其它T1R或其它GPCR(它们本身也可能是嵌合的)结合表达时结合到味觉刺激物尤其是甜味刺激物(T1R2/3)或鲜味刺激物(T1R1/3)上或被所述刺激物激活的分子。引起甜味的分子包括诸如蔗糖、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、木糖醇、环己基氨基磺酸盐等天然和人造甜味剂，引起鲜味的分子包括谷氨酸和谷氨酸类似物和诸如5’-核苷酸等结合到天然的T1R1和/或T1R3的其它化合物。

例如，诸如配体结合结构域、胞外域、跨膜区、跨膜结构域、胞质域、N-末端结构域、C-末端结构域等结构域或它们的任意组合可以共价连接到异源蛋白上。例如，T1R胞外域可以连接到异源GPCR跨膜结构域，或异源GPCR胞外域可以连接到T1R跨膜结构域。可以使用其它所选择的异源蛋白，例如绿色荧光蛋白。

处于本发明的范围之内的还有用于表达本发明的T1R、片段、嵌合体或变体的宿主细胞。为了获得克隆的基因或核酸(例如编码本发明的T1R、片段或变体的cDNA)的高水平表达，本领域技术人员通常将所述感兴趣的核酸序列亚克隆到表达载体中，所述表达载体包含指导转录的强启动子、转录/翻译终止子，如果所述核酸是编码蛋白的核酸，所述表达载体包含用于翻译起始的核糖体结合位点。适当的细菌启动子是本领域已知的(例如Sambrook等描述)。但是，也可以使用细菌或真核表达系统。

用于将外源核苷酸序列导入宿主细胞中的任意熟知程序都可以使用。所述程序包括使用磷酸钙转染、多聚季铵盐、原生质体融合、电穿孔、脂质体、微注射、原生质载体、病毒载体和其它任意的用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遗传物质导入宿主细胞中熟知方法(见例如Sambrook等)。只要所使用的特定遗传工程程序能够成功地将至少一个核酸分子导入到能够表达感兴趣的T1R、片段或变体的宿主细胞中即可。

将表达载体导入到细胞中以后，在有利于感兴趣的受体、片段或变体表达的条件下培养经转染的细胞，然后采用标准技术从培养物中回收所述的受体、片段或变体。在本领域中，所述技术的例子是熟知的，见例如WO 00/06593，与该公开内容一致的方式以参考方式引入。

T1R多肽的检测

除了采用核酸杂交技术检测T1R基因和基因表达之外，还可以采用免疫测定来检测T1R，例如鉴定味觉受体细胞和T1R家族成员的变体。免疫测定可以用来对T1R进行定性或定量分析。可以在Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(1988)中找到可应用的技术的概述。

1.T1R家族成员的抗体

产生与T1R家族成员发生特异性反应的多克隆和单克隆抗体的方法对于本领域技术人员来说是已知的(见例如Coligan，Current Protocols inImmunology(1991)；Harlow和Lane(上文)；Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(第二版，1986)；和Kohler和Milstein，Nature，256：495-497(1975))。所述技术包括通过从噬菌体或类似载体中的重组抗体文库中选择抗体而进行抗体制备，以及通过免疫兔或小鼠而制备多克隆和单克隆抗体(见例如Huse等，Science，246：1275-1281(1989)；Ward等，Nature，341：544-546(1989))。

很多包含T1R的免疫原可以用来产生与T1R家族成员发生特异性反应的抗体。例如，可以根据本文所述来分离重组的T1R多肽或其抗原性片段。适当的抗原区包括例如用以鉴定T1R家族成员的共有序列。如上所述，可以在真核细胞或原核细胞中表达重组蛋白，并一般按如上所述纯化重组蛋白。重组蛋白是优选用于产生单克隆或多克隆抗体的免疫原。选择性地，可以将来自本文公开的序列并与载体蛋白结合的合成肽用作免疫原。也可以使用纯化或非纯化形式的天然存在的蛋白。然后将产物注射到能够产生抗体的动物中。可以制备单克隆抗体或多克隆抗体，以备后续用于测定蛋白而进行的免疫测定中。

对于本领域技术人员来说，多克隆抗体的制备方法是已知的。例如，通过标准的佐剂(例如弗氏佐剂)和标准的免疫程序，采用所述蛋白对近交系小鼠(例如BALB/C小鼠)或兔进行免疫。通过验血并测定对T1R的反应滴度来监测动物对免疫原制备物的免疫应答。当获得抗所述免疫原的抗体的适当高滴度时，从动物中收集血液并制备抗血清。如果需要，可以进一步分离所述抗血清组分，以富集与所述蛋白反应的抗体(见Harlow和Lane，上文)。

可以通过本领域技术人员熟悉的各种技术获得单克隆抗体。简而言之，可以使来自经所需抗原免疫的动物的脾细胞无限增殖(一般通过与骨髓瘤细胞融合)(见Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.，6：511-519(1976))。可选择的无限增殖的方法包括采用EB病毒、致癌基因或逆转录病毒进行转化，或本领域熟知的其它方法。筛选来自无限增殖的单细胞的克隆，以制备对抗原具有所需特异性和亲和性的抗体，并通过各种技术提高由所述细胞制备的单克隆抗体的产率，所述技术包括注射到脊椎动物宿主的腹膜腔中。选择性地，根据由Huse等(Science，246：1275-1281(1989))概述的常规程序，通过筛选来自人类B细胞的DNA文库，可以分离编码单克隆抗体或其结合性片段的DNA序列。

在免疫测定中，收集单克隆抗体和多克隆血清并用免疫原蛋白进行滴定，所述免疫测定例如用固定在固体支持物上的免疫原进行的固相免疫测定。通常，采用竞争性结合免疫测定，选择具有104或更高滴度的多克隆抗血清，并检验它们抗非T1R多肽或甚至是其它的T1R家族成员或来自其它生物体的其它相关蛋白的交叉反应性。特异性多克隆抗血清和单克隆抗体通常结合的Kd至少约为0.1mM，更普遍至少约为1pM，选择性地至少约为0.1pM或更佳，选择性地为0.01pM或更佳。

一旦获得T1R家族成员特异性抗体，可以采用各种免疫测定方法检测单个的T1R蛋白和蛋白片段。对于免疫学程序和免疫测定程序的综述，见Basic and Clinical Immunology(Stites和Terr编，第7版，1991)。而且，可以在任意的数种组合中进行本发明的免疫测定，在EnzymeImmunoassay(Maggio编，1980)和Harlow和Lane的文献(见上文)中有所述组合的全面综述。

2.免疫结合测定

可以采用大量公知的免疫结合测定中的任意测定对T1R蛋白、片段和变体进行检测和/或定量(见例如美国专利4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168)。对于常规免疫测定的综述，也可见Methods in CellBiology：Antibodies in Cell Biology，第37卷(Asai编，1993)；Basic andClinical Immunology(Stites和Terr编，第7版，1991)。免疫学结合测定(或免疫测定)通常采用特异性结合所选择的蛋白或抗原(在这种情况下，T1R家族成员或其抗原性亚序列)的抗体。可以通过大量本领域技术人员公知手段和任意上述手段制备所述抗体(例如抗T1R)。

免疫测定还经常采用标记剂来特异性结合并标记由抗体和抗原形成的复合物。所述标记剂本身可以是含有抗体/抗原复合物的组分之一。因此，所述标记剂可以是经标记的T1R多肽或经标记的抗T1R抗体。选择性地，所述标记剂可以是第三组分，例如特异性结合到抗体/T1R复合物的第二抗体(第二抗体一般对获得第一抗体的物种的抗体具有特异性)。也可以采用诸如蛋白A或蛋白G等能够特异性结合免疫球蛋白恒定区的其它蛋白作为标记剂。这些蛋白表现出与来自各种物种的免疫球蛋白恒定区具有强的非免疫原反应性(见例如Kronval等，J.Immunol.，111：1401-1406(1973)；Akerstrom等，J.Immunol.，135：2589-2542(1985))。可以用能够与另外的分子(例如链霉抗生物素蛋白)特异性结合的可检测组分(诸如生物素)修饰标记剂。对于本领域技术人员来说，各种可检测组分是公知的。

在整个测定过程中，各种试剂组合后，可能需要进行温育和/或洗涤步骤。温育步骤的时间可以为约5秒钟至几小时，选择性地在约5分钟至约24小时的范围内变化。但是，温育时间将取决于测定形式、抗原、溶液体积和浓度等。尽管所述测定可以在一个温度范围内(例如10℃～40℃)进行，但是一般在环境温度进行所述测定。

A.非竞争性测定形式

用于在样品中检测T1R多肽的免疫测定可以是竞争性也可以是非竞争性。非竞争性免疫测定是在测定中直接检测抗原的量的测定。在一个优选的“夹心式”测定中，例如，可以将抗T1R抗体直接结合到固体基质上，在其上该抗体被固定。然后所述经固定的抗体捕获存在于待测样品中的T1R多肽。然后，如此固定的T1R多肽与标记剂(例如带有标记的第二T1R抗体)结合。或者，第二抗体可以没有标记，但它接下来可以被经标记的第三抗体结合，所述经标记的第三抗体对获得第二抗体的物种的抗体具有特异性。第二或第三抗体一般用能够与另外的分子(例如链霉抗生物素蛋白)特异性结合的可检测组分(例如生物素)进行修饰，以提供可检测组分。

B.竞争性测定形式

在竞争性测定中，通过测定已知添加的(外源的)被样品中存在的未知T1R多肽从抗T1R抗体上置换(竞争走)的T1R多肽的量来间接检测样品中存在的T1R多肽的量。在一个竞争性测定中，将已知量的T1R多肽添加到样品中，然后使该样品与特异性结合所述T1R的抗体接触。结合到所述抗体的外源T1R多肽的量与样品中存在的T1R多肽的浓度成反比。在一个特别优选的实施方案中，所述抗体被固定到固体基质上。可以通过测定存在于T1R/抗体复合物中的T1R多肽的量或者通过测定剩下的未形成复合物的蛋白的量，测定结合到抗体上的T1R多肽的量。T1R多肽的量可以通过提供经标记的T1R分子来进行检测。

半抗原抑制测定是另外一种优选的竞争性测定。在该测定中，已知的T1R多肽被固定到固体基质上。将已知量的抗T1R抗体添加到样品中，然后使该样品与固定的T1R接触。结合到已知的固定的T1R多肽的抗T1R抗体的量与样品中存在的T1R多肽的量成反比。同样地，可以通过测定被固定的抗体部分或余留在溶液中的抗体部分来测定被固定的抗体的量。如上所述，当抗体被标记时，检测可以是直接检测；通过随后添加特异性结合抗体的经标记的组分时，检测是间接检测。

C.交叉反应性测定

竞争性结合形式中的免疫测定可以用于交叉反应性测定。例如，可以将至少部分由本文公开的核酸序列编码的蛋白固定到固体支持物上。向与所述经固定的抗原竞争结合抗血清的待分析物中添加蛋白(例如T1R多肽和同源物)。比较所添加的蛋白与所述经固定的蛋白竞争结合抗血清的能力和由本文公开的核酸序列编码的T1R多肽与其本身竞争的能力。用标准的计算方法，计算上述蛋白的交叉反应性的百分比。选择与上述列出的各添加蛋白的交叉反应性低于10％的那些抗血清并将其合并。用所添加的经考虑(considered)的蛋白(例如相关性较低的同源物)通过免疫吸附从经合并的抗血清中选择性地除去交叉反应抗体。另外，可以将包含代表保守性基序的氨基酸序列的肽用于交叉反应性测定，所述保守性基序用于鉴定T1R家族的成员。

然后将经免疫吸附并合并的抗血清用于上述的竞争性结合免疫测定，以对第二蛋白(认为可能是T1R家族成员的等位基因或多态性变体)和免疫原蛋白(即由本文公开的核酸序列编码的T1R多肽)进行比较。为了进行这种比较，在很宽的浓度范围内各对这两种蛋白进行测定，并确定抑制抗血清与经固定的蛋白的结合的50％所需的各蛋白的量。如果抑制结合的50％所需的第二蛋白的量比抑制结合的50％所需的由本文公开的核酸序列编码的蛋白的量低10倍，那么就认为第二蛋白特异性结合由T1R免疫原制得的多克隆抗体。

可以用所产生的抗T1R保守性基序的抗体来制备只特异性结合到T1R家族的GPCR但不结合到其它家族的GPCR的抗体。

可以通过采用其它T1R家族成员扣除交叉反应抗体，来制备特异性结合到T1R家族的特定成员的多克隆抗体。物种特异性的多克隆抗体可以采用类似的方法制备。例如，可以通过扣除与直向同源序列(例如大鼠T1R1或小鼠T1R1)具有交叉反应性的抗体来制备对人类T1R1特异的抗体。

D.其它测定形式

用Western印迹(免疫印迹)分析对样品中存在的T1R多肽进行检测和定量。该技术通常包括：通过基于分子量的凝胶电泳分离样品蛋白，将分离的蛋白转移到适宜的固体支持物(例如硝酸纤维素滤膜、尼龙滤膜或衍生的尼龙滤膜)上，将所述样品与特异性结合T1R多肽的抗体温育。抗T1R多肽抗体特异性结合到固体支持物上的T1R多肽。可以直接标记所述抗体，或者随后用特异性结合到抗T1R抗体的标记抗体(例如标记的羊抗小鼠抗体)进行检测。

其它测定形式包括脂质体免疫测定(LIA)，该测定方法使用经设计而结合特异性分子(例如抗体)的脂质体并释放经包封的试剂或标记。然后根据标准方法(见Monroe等，Amer.Clin.Prod.Rev，5：34-41(1986))测定释放后的化学物质。

E.非特异性结合的降低

本领域技术人员应该理解，在免疫测定中经常需要使非特异性结合最小化。特别地，当测定涉及到固定到固体基质上的抗原或抗体时，使与所述基质的非特异性结合量最小化是可取的。对于本领域技术人员来说，降低所述非特异性结合的手段是熟知的。一般地，该技术涉及用蛋白质组合物包被所述基质。特别地，广泛使用诸如牛血清清蛋白(BSA)、脱脂奶粉和明胶等蛋白组合物，其中最优选的是奶粉。

F.标记

在所述测定中使用的特定标记或可检测基团不是本发明的关键方面，只要所述标记或可检测基团没有显著干扰在所述测定中使用的抗体的特异性结合即可。可检测基团可以是具有可检测的物理或化学特性的任意物质。在免疫测定领域，所述可检测标记已经发展得非常完善，并且通常大部分在所述免疫测定方法中有用的任意标记都可应用于本发明。因此，标记是通过分光光度法、光化学法、生物化学法、免疫化学法、电学法、光学法或化学法可以检测的任意组合物。在本发明中有用的标记包括磁珠(例如DYNABEADSTM)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记(例如³H、¹²⁵I、¹⁴C、³⁵S)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和在ELISA中常用的其它酶)，以及诸如胶体金、着色玻璃或塑料珠(例如聚苯乙烯、聚苯丙烯、胶乳等)等比色标记。

根据本领域熟知方法，所述标记可以直接或间接地与待分析物的所需成分相偶联。如以上所述，可以使用大量标记，标记的选择取决于所需要的灵敏度、与化合物结合的容易程度、稳定性要求、可获得的仪器和处置规定。

非放射性标记经常通过间接方法进行连接。通常，配体分子(例如生物素)共价结合到所述分子上。然后配体结合到另外一个分子(例如链霉抗生物素蛋白分子)上，所述另外一个分子本身是可检测的或者共价结合到诸如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物等信号系统上。配体和它们的靶可以与识别T1R多肽的抗体或识别抗T1R的第二抗体适当组合使用。

也可以将所述分子例如通过与酶或荧光团结合而直接结合到产生信号的化合物上。作为标记的感兴趣的酶主要是水解酶，尤其是磷酸酶、酯酶、糖苷酶，或氧化酶(oxidotase)，尤其是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光化合物包括萤光素和2，3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。可以使用的各种标记系统或信号产生系统的综述见美国专利No.4,391,904。

对于本领域技术人员来说，检测标记的手段是熟知的。因此，例如，当标记为放射性标记时，检测手段包括闪烁计数器或如放射自显影中的照相胶片。当标记为荧光标记时，可以通过用适当波长的光激发荧光染料并检测所获得的荧光而对荧光标记进行检测。可以通过照相胶片手段，通过使用诸如电荷耦合装置(CCDs)或光电倍增管等电子检测仪而通过目视检测荧光。类似地，可以通过为酶提供适当的底物并检测所获得的反应产物来对酶促标记进行检测。最后，可以通过观察与比色标记有关的颜色而简单地检测简单的比色标记。因此，在各种浸染试条测定法中，结合的金通常呈现粉色，而各种结合的珠子呈现所述珠子的颜色。

有些测定方式不需要使用标记成分。例如，凝集测定可以用来检测目标抗体的存在。在这种情况中，含有目标抗体的样品凝集包被有抗原的粒子。在这种形式中，不需要标记任何成分，并且通过简单的目视检查来检测目标抗体的存在。

调节剂的检测

以下描述了用于在体外和体内测定待测化合物是否特异性结合本发明的T1R受体的组合物和方法。可以对细胞生理学的许多方面进行监测，以评价配体结合到本发明的T1R多肽的效果。可以在表达化学感应受体的完整细胞中、在经透化处理的细胞中或在通过标准方法制备的膜组分上或体外从头合成的合成蛋白中进行这些测定。

在体内，味觉受体与调味剂结合并启动由化学刺激到电信号的转换。受到激活或抑制的G蛋白接着改变目标酶、通道和其它效应蛋白的特性。其中的一些例子是：视觉系统的转导蛋白对cGMP磷酸二酯酶的激活、刺激性G蛋白对腺苷酸环化酶的激活、Gq和其它同源G蛋白对磷酸酯酶C的激活以及Gi和其它G蛋白对多种通道的调节。也可以测定下游的结果，例如磷酸酯酶C引起甘油二酯和IP₃的产生，以及接着由IP₃引起的钙动员。

测定的T1R蛋白或多肽优选为选自实施例1中公开的序列中选择的具有T1R多肽序列的多肽，或该多肽的片段或保守性修饰的变体。或者，所述片段和变体可以是结合到抗T1R抗体的抗原性片段和变体。或者，所述片段和变体可以结合甜味剂或鲜味调味剂或者由甜味剂或鲜味调味剂激活。

选择性地，测定的T1R蛋白或多肽可以来自真核宿主细胞并可以包括与实施例1公开的T1R多肽或该多肽的片段或保守性修饰的变体具有氨基酸序列同一性的氨基酸亚序列。通常，所述氨基酸同一性为至少35～50％，或者选择性地为75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或者99％。选择性地，测定的T1R蛋白或多肽可以包含T1R蛋白的诸如胞外域、跨膜区、跨膜结构域、胞质域、配体结合结构域等结构域。此外，如上所述，T1R蛋白或其结构域可以共价连接到异源蛋白而形成用于本文所述的测定中的嵌合蛋白。

用上述重组的或天然存在的T1R蛋白或多肽检验T1R受体活性的调节剂。可以将重组的或天然存在的T1R蛋白或多肽进行分离，在细胞中进行共表达，在来自细胞的膜中进行共表达，在组织或动物中进行共表达。例如，可以使用舌切片、来自舌的解离细胞、经转化的细胞或膜。可以用本文描述的体外或体内测定之一检验调节。

例如，如在下文的实验例中所公开的那样，已发现某些5’-核苷酸(例如5’IMP或5’GMP)增强L-谷氨酸激活鲜味受体的活性或阻断鲜味刺激物(例如L-谷氨酸和L-天冬氨酸)对鲜味受体的激活。

1.体外结合测定

也可以采用本发明的T1R多肽，采用可溶状态或固态的反应对味觉转导进行体外测定。在一个特定实施方案中，可以在可溶状态或固态的反应中用T1R配体结合结构域体外测定配体的结合。

例如，推测T1R的N-末端结构域参与配体的结合。更具体地，T1R属于GPCR亚家族，该家族的特征是胞外N-末端片段大(约600个氨基酸)。据认为所述N-末端片段形成配体结合结构域，因此在鉴定T1R激动剂和拮抗剂的生化测定中是有用的。配体结合结构域有可能由诸如跨膜结构域的胞外环等胞外域的附加部分形成。

曾用与T1R有关的诸如代谢型谷氨酸受体等其它GPCR进行体外结合测定(见例如Han和Hampson，J.Biol.Chem.274：10008-10013(1999))。所述测定可能通过置换放射性标记或荧光标记的配体来进行，测定内在荧光的变化或蛋白水解敏感性的变化等。

配体与本发明的T1R多肽的异聚体复合物的结合可以在溶液中、在双层膜上、任选附着到固相上、在脂单层中或囊泡中进行检验。调节剂的结合可以采用例如光谱特征(例如荧光、吸光度、折射率)、流体动力学(例如形状)、色谱层析或溶解特性的变化进行检验。

在本发明的另一个实施方案中，可以采用GTPγ³⁵S测定。如上所述，一旦激活GPCR，就刺激G蛋白复合物的Gα亚基将结合的GDP换成GTP。在存在假定配体的情况下，可以通过测定添加的放射性标记的GTPγ³⁵S与G蛋白的结合来测定生化待分析物中G蛋白交换活性的配体介导的刺激。通常，将包含感兴趣的化学感应受体的膜和G蛋白复合物混合。向待分析物中添加可能的抑制剂和/或激活剂以及GTPγ³⁵S，测定GTPγ³⁵S与G蛋白的结合。可以通过液体闪烁计数或包括闪烁亲近测定(SPA)在内的本领域已知的其它任意方法来对结合进行测定。在其它的测定形式中，可以采用荧光标记的GTPγ³⁵S。

2.荧光偏振测定

在另一个实施方案中，可以采用基于荧光偏振(“FP”)的测定来检测和监测配体结合。荧光偏振是用于测定平衡结合、核酸杂交和酶活性的多用途的实验室技术。各种荧光偏振测定的类似之处在于它们都不需要诸如离心、过滤、色谱层析、沉淀或电泳等分离步骤。这些测定可以直接在溶液中实时进行，并且不需要固定相。由于偏振测定的速度快并且对样品不造成破坏，因此偏振值的测定可以重复进行和在添加各种试剂之后进行。通常，该技术可以用来测定低皮摩尔～微摩尔水平的荧光团的偏振值。这一部分描述可如何采用荧光偏振来以简单和定量方式测定配体与本发明的T1R多肽的结合。

当荧光标记分子被平面偏振光激发时，它发出偏振程度与它的分子旋转成反比的光。荧光标记的大分子在激发态(在荧光素的情况中为4纳秒)期间保持相对稳定，并且所述光的偏振在激发和发射之间保持相对恒定。荧光标记的小分子在激发态期间快速转动，并且偏振在激发和发射之间变化显著。因此，小分子具有低的偏振值而大分子具有高的偏振值。例如，单链的荧光素标记的寡核苷酸具有相对低的偏振值，但是当它与互补链杂交时，它就具有较高的偏振值。当用FP检测和监测可能激活和/或抑制本发明的化学感应受体的调味剂结合时，可以使用荧光标记的调味剂或自动荧光调味剂。

荧光偏振(P)定义为：

其中，

为与激发光平面平行的发射光的强度，而Int_⊥为与激发光平面垂直的发射光的强度。P是光强度比率，是无量纲的数。例如，Beacon和Beacon 2000^TM系统可以与这些测定联用。所述系统通常以毫偏振单位来表示偏振(1个偏振单位＝1000mP单位)

分子的旋光度和大小的关系由Perrin方程表示，而读取器由Jolley，M.E.(1991)在Journal of Analytical Toxicology第236-240页中描述，其中给出了上述方程的详细解释。类似地，Perrin方程认为偏振与旋转弛豫时间成正比例，所述时间是分子旋转约68.5°的角度所需要的时间。旋转弛豫时间与粘度(η)、绝对温度(T)、分子体积(V)和气体常数(R)的相关性由以下方程表示：

对于小分子(例如荧光素)，旋转弛豫时间短(≈1纳秒)，而对于大分子(例如免疫球蛋白)，旋转弛豫时间长(≈100纳秒)。如果粘度和温度保持恒定，旋转弛豫时间与分子体积直接相关，因而偏振与分子体积直接相关。分子体积的变化可以是由于荧光标记分子与其它分子的相互作用、解离、聚合、降解、杂交或发生构象变化。例如，曾利用荧光偏振来测定由蛋白酶、DNA酶和RNA酶对较大的荧光素标记的聚合物进行的酶切。也曾利用荧光偏振来测定蛋白/蛋白相互作用、抗体/抗原结合和蛋白/DNA结合的平衡结合。

A.固态和可溶的高通量测定

在另一个实施方案中，本发明提供采用异寡聚T1R多肽复合物或共表达T1R多肽的细胞或组织进行的可溶测定。优选地，所述细胞包括稳定共表达功能性T1R1/T1R3(鲜味)味觉受体或T1R2/T1R3(甜味)味觉受体的细胞系。在另一个实施方案中，本发明提供高通量形式的基于固相的体外测定，其中所述的T1R多肽或表达T1R多肽的细胞或组织被附着到固相基质或味觉刺激化合物上并与T1R受体接触，并采用适当的标记或所产生的抗T1R受体的抗体对结合进行检测。

在本发明的高通量测定中，仅在一天之内就可以筛选高达数千个不同的调节剂或配体。特别地，微量滴定板的各个孔可以用来分别测定所选择的可能调节剂，或者，如果要观测浓度或温育时间的效果，可以每5～10个孔检测一个调节剂。因此，单个标准微量滴定板可以测定约100(例如96)个调节剂。如果采用1536孔微量滴定板，那么采用单个板就可以很容易地测定约1000～约1500个不同的化合物。在各板孔中测定多个化合物也是可能的。每天测定几个不同的板是可能的；用本发明的集成系统，可以进行筛选最高达约6000～20000个不同化合物的测定。新近，也研制出针对试剂进行操作的微观流体途径。

可通过共价键或非共价键(例如通过标记)直接或间接地将感兴趣的分子结合到固态组分上。所述标记可以是多种化合物中的任意化合物。一般地，将结合标记的分子(标记结合物)固定到固体支持物上，并通过所述标记和标记结合物的相互作用将感兴趣的标记分子(例如感兴趣的味觉转导分子)附着到固体支持物上。

根据文献中充分描述的已知分子的互相作用，可以采用许多标记和标记结合物。例如，当标记为诸如生物素、蛋白A或蛋白G等天然结合物时，可以将该标记与适当的标记结合物(抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性链亲和素、免疫球蛋白的Fc区等)组合使用。抗带有诸如生物素等天然结合物的分子的抗体也是可以大量获得的，并且所述抗体是适当的标记结合物(见SIGMA Immunochemicals 1998 SIGMA目录，St.Louis MO)。

类似地，任意的半抗原或抗原化合物均可以与适当的抗体组合使用，以形成标记/标记结合物对。可以通过商购获得数千种特异性抗体，在文献中也描述了很多其它抗体。例如，在一个普通的组合中，标记为第一抗体，而标记结合物是识别所述第一抗体的第二抗体。除了抗原-抗体的相互作用之外，受体-配体的相互作用也适合于作为标记和标记结合物对。例如细胞膜受体的激动剂和拮抗剂(例如，细胞受体-配体的相互作用，例如铁传递蛋白、c-盒(c-kit)、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘着蛋白家族、整合蛋白家族、选择蛋白家族等，见例如Pigott和Power，The Adhesion MoleculeFacts Book I(1993))。类似地，毒素和毒液、病毒抗原决定簇、激素(例如阿片剂、类固醇等)、胞内受体(例如介导包括类固醇、甲状腺激素、类维生素A和维生素D等各种小配体和肽等的作用的胞内受体)、药物、凝集素、糖类、核酸(线性和环状聚合物构型)、寡聚糖、蛋白、磷脂和抗体可以与各种细胞受体发生相互作用。

诸如聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚芳撑硫化物、聚硅氧烷、聚酰亚胺和聚乙酸酯等合成的聚合物也可以形成适宜的标记或标记结合物。本领域技术人员根据本文所公开的评述将会显而易见，很多其它的标记/标记结合物在本文所述的测定系统中也是有用的。

诸如肽、聚醚等常规接头也可以用作标记，并包括诸如约5～200个氨基酸之间的聚甘氨酸等多肽序列。对于本领域技术人员来说，该类柔性接头是已知的。例如，可以从Shearwater Polymers，Inc.Huntsville，Alabama获得聚乙二醇接头。所述接头选择性地具有酰胺键、硫氢键或者杂官能团键。

可以采用目前可利用的任意各种方法将标记结合物固定到固体基质上。可以通过将全部或部分基质与化学试剂接触而对固体基质进行常规衍生化或功能化，所述化学试剂将与标记结合物的一部分具有反应性的化学基团固定到表面上。例如，适合于与较长的链部分附着的基团包括胺、羟基、巯基和羧基。可以采用氨基烷基硅烷和羟基烷基硅烷对诸如玻璃表面等各种表面进行功能化。在文献中有所述固相生物聚合物阵列的组成的详细描述，见例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154(1963)(描述例如肽的固相合成)；Geysen等，J.Immun.Meth.，102：259-274(1987)(描述固相组分在针(pin)上的合成)；Frank和Doring，Tetrahedron，44：60316040(1988)(描述各种肽序列在纤维素盘上的合成)；Fodor等，Science，251：767-777(1991)；Sheldon等，Clinical Chemistry，39(4)：718-719(1993)；以及Kozal等，Nature Medicine，2(7)：753759(1996)(都描述固定到固体基质上的生物聚合物阵列)。用于将标记结合物固定到基质上的非化学手段包括诸如加热、通过紫外线照射进行交联等其它常规方法。

3.基于细胞的测定

在一个优选的处理方案中，在真核细胞中瞬时或稳定地共表达T1R蛋白或多肽的组合，所述T1R蛋白或多肽为未经修饰的形式或为嵌合体、变体或截断的受体，带有或优选地不带有有利于其成熟和通过分泌途径进行定位的异源伴侣序列。所述的T1R多肽可以在诸如HEK-293细胞等任意真核细胞中表达。优选地，所述细胞包含功能性G蛋白，例如G_α15或先前鉴定的嵌合G蛋白，或者另一种G蛋白，该另一种G蛋白能够将该嵌合受体偶联到胞内信号转导途径中或者诸如磷脂酶C等信号转导蛋白上。此外，优选地，产生稳定地共表达T1R1/T1R3或T1R2/T1R3的细胞，原因在于，已发现(如实验例中所显示的)此类细胞表现出对味觉刺激物的应答增强(与瞬时表达相同的T1R组合的细胞相比)。可以采用任意标准方法来检测此类细胞中T1R受体的激活，所述标准方法例如通过检测细胞中Fluo-4依赖性荧光来检测胞内钙的变化。所述测定是本申请中提供的实验发现的基础。

激活的GPCR受体经常是使受体的C-末端尾部(并且可能还有其它位点)磷酸化的激酶的底物。因此，激活剂促进³²P从放射性标记的ATP转移到受体，而这可以由闪烁计数器进行测定。C-末端尾部的磷酸化将促进抑制蛋白样蛋白的结合并会干扰G蛋白的结合。对于GPCR信号转导和测定信号转导的方法的总述，见例如Methods in Enzymology，第237和238卷(1994)以及第96卷(1983)；Bourne等，Nature，10：349：117-127(1991)；Bourne等，Nature，348：125-132(1990)；Pitcher等，Annu.Rev.Biochem.，67：653-692(1998)。

可以通过对用假定的T1R调节剂处理的T1R多肽的应答和未处理对照样品或含有已知的“阳性”对照的样品的应答进行比较，测定T1R调节。所述假定的T1R调节剂可以包括抑制或激活T1R多肽活性的分子。在一个实施方案中，将对照样品(未用激活剂或抑制剂处理)的相对T1R活性值指定为100。相对于对照，当T1R活性值为约90％，选择性地为50％，选择性地为25％～0％时，实现对T1R多肽的抑制。相对于对照，当T1R活性值为110％，选择性地为150％，选择性地为200％～500％或者1000％～2000％时，实现对T1R多肽的激活。

可以通过测定表达T1R多肽的细胞或膜的离子极化(即电势)的变化来评价离子流的变化。测定细胞极化变化的一个手段是采用电压夹和膜片钳技术测定电流的变化(据此测定极化的变化)(见例如the“cell-attached”mode，the“inside-out”mode，and the“whole cell”mode，例如Ackerman等，New Engl.J Med.，336：1575-1595(1997))。采用标准方法可以方便地测定全细胞的电流。其它已知的测定包括：放射性标记的离子流测定和采用电压敏感染料的荧光测定(见例如Vestergarrd-Bogind等，J.Membrane Biol.，88：67-75(1988)；Gonzales和Tsien，Chem.Biol.，4：269277(1997)；Daniel等，J.Pharmacol.Meth.，25：185-193(1991)；Holevinsky等，J.Membrane Biology，137：59-70(1994))。

可以通过检测上述任意参数来测定待测化合物对所述多肽的功能的影响。影响GPCR活性的任何适宜的生理学变化都可以用来评价待测化合物对本发明的多肽的影响。当采用完整细胞或动物对功能性结果进行测定时，还可以测定对已知的和未表征的遗传标记的诸如递质释放、激素释放、转录变化(例如Northern印迹)等各种效果，诸如细胞生长或pH变化等细胞代谢变化，以及诸如Ca²⁺、IP₃、cGMP或cAMP等胞内第二信使的变化。

优选的GPCR测定包括装载有离子或电压敏感染料以报道受体活性的细胞。检测所述受体活性的测定方法也可以采用已知的其它G蛋白偶联受体的激动剂和拮抗剂作为对照以评价待测化合物的活性。在鉴定调节化合物(例如激动剂、拮抗剂)的测定中，可以分别采用离子敏感指示剂或膜电压荧光指示剂监测细胞质中离子水平或膜电压的变化。可以利用的离子敏感指示剂和电压探针可以是Molecular Probes的1997年的目录中公开的指示剂和探针。对于G蛋白偶联受体，诸如G_α15和G_α16等混杂G蛋白可以在所选择的测定中使用(Wilkie等，Proc.Nat’l Acad.Sci.，88：10049-10053(1991))。

受体的激活启动后续胞内事件，例如第二信使的增加。一些G蛋白偶联受体的激活通过磷脂酶C介导的磷脂酰肌醇的水解而刺激肌醇三磷酸(IP₃)的形成(Berridge和Irvine，Nature，312：315-321(1984))。IP₃接着刺激胞内钙离子库的释放。因此，细胞质中钙离子水平的变化或者诸如IP₃等第二信使水平的变化可以用来评价G蛋白偶联受体的功能。作为从胞内库的钙释放和胞外钙借助质膜离子通道的进入的结果，表达所述G蛋白偶联受体的细胞可以显示出细胞质钙水平的上升。

在一个优选的实施方案中，可以在带有混合的G蛋白的异源细胞中稳定地或瞬时地共表达T1R基因(优选稳定地共表达T1R基因)而测定T1R多肽活性，所述混合的G蛋白将受体连接到磷脂酶C信号转导途径中(见Offermanns和Simon，J.Biol.Chem.，270：15175-15180(1995))。在另一个优选的实施方案中，细胞系为HEK-293(其一般不表达T1R基因)，而混合的G蛋白为G_α15(Offermanns和Simon，上文)。通过测定胞内Ca²⁺水平的变化而对味觉转导的调节进行测定，所述胞内Ca²⁺水平在通过施用与T1R多肽结合的分子而对T1R信号转导途径的调节产生应答而发生变化。选择性地，采用荧光Ca²⁺指示剂染料和荧光测定成像来测定Ca²⁺水平的变化。

在另一个实施方案中，可以根据美国专利5,436,128来分析磷脂酰肌醇(PI)的水解，以参考的方式将该专利内容引入到本文中。简而言之，该测定涉及用³H-肌醇对细胞进行48小时或48小时以上的标记。用待测化合物处理经标记的细胞1小时。裂解所处理的细胞并在氯仿-甲醇-水中进行提取，此后通过离子交换层析分离肌醇磷酸并通过闪烁计数进行定量。通过计算存在激动剂时的cpm与存在缓冲液对照时的cpm的比率，从而测定刺激倍数。类似地，通过计算存在拮抗剂时的cpm与存在缓冲液对照(可以含或不含激动剂)时的cpm的比率，从而测定抑制倍数。

其它受体测定可以包括测定胞内环状核苷酸(例如cAMP或cGMP)的水平。在受体的激活导致环状核苷酸水平下降的情况中，优选在将受体激活化合物添加到测定所用的细胞中之前，使所述细胞与提高胞内环状核苷酸水平的试剂(例如毛喉素)接触。在一个实施方案中，可以采用免疫测定来检测胞内cAMP或cGMP的变化。在Offermanns和Simon，J.Bio.Chem.，270：15175-15180(1995)中描述的方法可以用来测定cAMP的水平。另外，在Felley-Bosco等，Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.，11：159-164(1994)中描述的方法可以用于测定cGMP水平。此外，在美国专利4,115,538描述了用于测定cAMP和/或cGMP的测定试剂盒，以参考的方式将该专利的内容引入到本文中。

在另一个实施方案中，可以对转录水平进行测定，以评价待测化合物对信号转导的作用。使含有感兴趣的T1R多肽的宿主细胞与待测化合物接触足够长的时间，以实现任何的互相作用，然后测定基因的表达水平。实现所述互相作用的时间的长短可以根据经验进行确定，例如通过持续一段时间并测定转录水平(将该转录水平作为时间的函数)来确定。转录的量可以采用本领域技术人员任意已知地适宜方法来测定。例如，采用northern印迹检测感兴趣的蛋白的mRNA的表达，或者可以采用免疫测定来鉴定它们的多肽产物。选择性地，如美国专利5,436,128所述，可以采用利用报道基因的基于转录的测定方法，以参考的方式将该专利的内容引入到本文中。所述报道基因可以是例如氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶和碱性磷酸酶。此外，可以通过将感兴趣的蛋白附着到第二报道分子(例如绿色荧光蛋白)而将该蛋白用作间接的报道分子(见例如Mistili和Spector，Nature Biotechnology，15：961-964(1997))。

然后将转录的量与不存在待测化合物的相同细胞中的转录的量进行比较，或者将转录的量与缺乏感兴趣的T1R多肽的基本相同的细胞中的转录的量进行比较。基本相同的细胞可以来自用以制备重组细胞但没有通过引入异源DNA而进行修饰的相同细胞。转录的量中的任何差异指示待测化合物以某种方式改变了感兴趣的T1R多肽的活性。

4.表达化学感应受体的转基因的非人类动物

表达本发明的T1R味觉受体序列组合的非人类动物也可以用于受体测定。通过将非人类动物(该非人类动物用编码化学感应受体或其配体结合区的核酸进行稳定或瞬时转染)与待测化合物接触，并确定该动物是否通过与受体多肽复合物的特异性结合来与待测化合物进行反应，从而可以将所述表达用于确定待测化合物是否在体内与哺乳动物味觉跨膜受体复合物特异性结合。

用本发明的载体转染或感染的动物对鉴定和表征能够结合到特异的或一组受体上的味觉刺激物的测定尤其有用。可以将表达人类味觉受体序列的所述载体感染的动物用于体内筛选味觉刺激物及其对例如细胞生理学(例如对味觉神经元)、对CNS或行为的影响。选择性地，可以将表达T1R或其组合的稳定细胞系用作核酸转移供体，以产生稳定表达特定T1R或组合的克隆的转基因动物。用核酸转移产生稳定表达所需的异源DNA的克隆动物的方法是授予麻萨诸塞州大学(University ofMassachusettes(许可给Advanced Cell Technology，Inc.)和Roslin Institute(许可给Geron Corp.)的已授权的数个美国专利的主题。

本领域熟知感染/表达单独的或文库形式的核酸和载体的方法。可以通过各种手段测定各种单独的细胞、器官和整个动物的参数。例如，可以采用诸如腺病毒表达载体等感染剂通过递送而例如使本发明的T1R序列在动物味觉组织中共表达。

内源味觉受体基因可以保持具有功能性而野生型(天然)的活性仍可以存在。在其它情况中，当需要使所有味觉受体的活性都是来自引入的外源杂合受体的活性时，优选使用敲除系。本领域熟知用于构建非人类动物尤其是转基因小鼠的方法，以及选择和制备重组构建体以产生转化细胞的方法。

“敲除”细胞或动物的构建是基于这样的前提：通过将用以破坏所要抑制的基因的DNA序列的某些部分的新DNA序列引入基因组中，可以降低或完全消除该特定基因在哺乳动物细胞中的表达水平。此外，可以采用“基因陷阱插入”来破坏宿主基因，并且可以采用小鼠胚胎干(ES)细胞来产生敲除的转基因动物(见例如Holzschu，Transgenic Res 6：97-106(1997))。通常通过在互补核酸序列之间进行同源重组来插入外源序列。外源序列是所要修饰的目标基因的某些部分，例如外显子、内含子、转录调节序列或任何能够影响目标基因的表达水平的基因组序列；或者它们的组合。借助在多潜能胚胎干细胞中进行同源重组的基因靶向可以准确修饰感兴趣的基因组序列。可以使用任意技术产生、筛选、繁殖敲除动物，例如见Bijvoet，Hum.Mol.Genet.7：53-62(1998)；Moreadith，J.Mol.Med.75：208-216(1997)；Tojo，Cytotechnology 19：161-165(1995)；Mudgett，Methods Mol.Biol.48：167-184(1995)；Longo，Transgenic Res.6：321-328(1997)；美国专利No 5,616,491；5,464,764；5,631,153；5,487,992；5,627,059；5,272,071；WO 91/09955；WO 93/09222；WO 96/29411；WO 95/31560；WO 91/12650。

本发明的核酸也可以用作产生“敲除”人类细胞或其子代的反应物。同样地，本发明的核酸也可以用作在小鼠中产生“敲进”的反应物。人类或大鼠的T1R基因序列可以置换小鼠基因组中的直向同源T1R。采用这种方式，得以产生表达人类或大鼠的T1R的小鼠。然后采用所述小鼠分析人类或大鼠的T1R的功能和鉴定所述T1R的配体。

a.调节剂

检验为T1R家族成员的调节剂的化合物可以是任意的小化学化合物或生物学物质(例如蛋白、核酸或脂类)。所述化学化合物或生物学物质的例子包括5¹IMP和5¹GMP。实质上，任何化学化合物都可以用作本发明的测定中的潜在的调节剂或配体，但是大多时候所检测的化合物是在水溶液中可溶的化合物。可以通过使测定步骤自动化并从方便的任意来源提供化合物而将所述测定设计为用以筛选大的化学物质文库；通常这些测定是平行进行的(例如在自动仪器测定中，采用微量滴定板进行的微量滴定形式)。应该理解，可以通过诸多化学反应之一合成化学物质文库(例如Senomyx proprietary chemistries)。另外，还有很多化学化合物的供应商，其中包括Sigma(St.Louis，MO)、Aldrich(St.Louis，MO)、Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs，瑞士)等。

在一个优选实施方案中，高通量筛选方法包括提供包含大量的潜在的味觉影响化合物(潜在的调节剂或配体化合物)的组合性化学物质文库或肽文库。然后如本文所述，在一个或多个测定中筛选所述“组合性化学物质文库”或“配体文库”，以鉴定显示出所需的特征活性的那些文库成员(尤其是化学物质种类或亚类)。如此鉴定出的化合物可以作为常规“引导化合物”或者可以将它们本身用作潜在的或实际的味觉调节剂。

优选地，所述文库的筛选是针对稳定表达T1R或T1R组合(即T1R1/T1R3或T1R2/T1R3)和优选适宜的G蛋白(例如G_α15)的细胞或细胞系进行的。如下文实施例中那样，所述稳定表达的细胞系对味觉刺激物(例如鲜味或甜味刺激物)表现出极为显著的应答。但是，也可以在所述的测定中使用瞬时表达一个或多个T1R的细胞和细胞系。

组合性化学物质文库是由化学合成或生物合成或者组合大量的化学“构件”(例如反应物)而产生的多种化学化合物的集合。例如，通过按给定的化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸数目)以每一种可能的方式将一套化学构件(氨基酸)组合而形成线性的组合性化学物质文库，例如多肽文库。通过化学构件的组合混合，可以合成成千上万的化学化合物。

对于本领域技术人员来说，组合性化学物质文库的制备和筛选是熟知的。所述组合性化学物质文库包括但不限于肽文库(见例如美国专利5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.，37：487-493(1991)和Houghton等，Nature，354：84-88(1991))。也可以使用其它用于产生化学上不同文库的化学物质。所述化学物质包括但不限于拟肽(例如PCT公布No.WO91/19735)，编码的肽(例如PCT公布WO 93/20242)，随机的生物寡聚物(例如PCT公布No.WO 92/00091)，苯并二氮卓(例如美国专利No.5,288,514)，诸如乙内酰脲、苯并二氮卓和二肽等多种物质(diversomers)(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.，90：6909-6913(1993))，乙烯多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.，114：6568(1992))，带有葡萄糖骨架的非肽的肽模拟物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.，114：9217-9218(1992))，类似的有机合成的小分子化合物文库(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.，116：2661(1994))，低聚氨基甲酸酯(Cho等，Science，261：1303(1993))，肽酰磷酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.，59：658(1994))，核酸文库(Ausubel，Berger和Sambrook，全部见上文)，肽核酸文库(美国专利5,539,083)，抗体文库(Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)：309-314(1996)和PCT/US96/10287)，碳水化合物文库(Liang等，Science，274：1520-1522(1996)和美国专利5,593,853)，有机小分子文库(苯并二氮杂卓，Baum，C&EN，1月18日，第33页(1993)；噻唑烷酮和metathiazanones，美国专利5,549,974；pynrolidines，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮卓，5,288,514等)。

制备组合性文库的设备可以通过商购获得(见例如357MPS，390MPS(Advanced Chem Tech，Louisville KY)，Symphony(Rainin，Woburn，MA)，433A(Applied Biosystems，Foster City，CA)，9050 Plus(Millipore，Bedford，MA))。另外，许多组合性文库本身可以通过商购获得(见例如ComGenex，Princeton，NJ；Tripos，Inc.，St.Louis，MO；3D Pharmaceuticals，Exton，PA；Martek Biosciences；Columbia，MD等)。

在本发明的一个方面，T1R调节剂可以用于任何的食品、糖果、药物组合物或它们的成分中，据此以所需的方式调节所述产品、组合物或成分的味道。例如，可以添加增强甜味感觉的T1R调节剂，以使产品或组合物变甜；可以将增强鲜味感觉的T1R调节剂添加到食物中，以增加香味。选择性地，可以用T1R拮抗剂阻断甜味和/或鲜味。

b.试剂盒

T1R基因和它们的同源物是用于鉴定化学感应受体细胞、法医和父亲血源确认以及检查味道转导的有用工具。诸如T1R探针和引物等与T1R核酸特异性杂交的T1R家族成员特异性试剂以及诸如T1R抗体等与T1R多肽特异性结合的T1R特异性试剂可以用来检查味觉细胞表达和味觉转导调节。

用于测定样品中T1R家族成员的DNA和RNA的存在的核酸测定方法包括本领域技术人员已知的众多技术，例如Southern分析、northern分析、点印迹、RNA酶保护、S1分析，扩增技术(例如PCR)，以及原位杂交。例如，在原位杂交中，目标核酸分子从其细胞环境中被释放出来从而可用以在细胞内进行杂交，同时保持了细胞的形态以备随后的解释和分析。以下文章提供了原位杂交技术的综述：Singer等，Biotechniques(4：230250(1986))；Haase等，Methods in Virology(第VII卷第189-226页(1984))；和Names等编的Nucleic Acid Hybridization：A PracticalApproach(1987)。另外，可以采用上述的各种免疫测定技术检测T1R多肽。一般将待测样品与阳性对照(例如表达重组的T1R多肽的样品)和阴性对照进行比较。

本发明还提供用于筛选T1R家族成员的调节剂的试剂盒。所述试剂盒可以由容易获得的物质和试剂制备。例如，所述试剂盒可以包含任意的一种或多种以下物质：T1R核酸或蛋白、反应管和用于检测T1R活性的说明书。选择性地，试剂盒包括具有生物活性的T1R受体或稳定表达或瞬时表达具有生物活性的包含味觉受体在内的T1R。可以根据本发明制备多种试剂盒和成分，这取决于试剂盒的预期的使用者和使用者的特定需要。

                       实施例

尽管已在上文中详细描述了本发明，但是还是提供以下实施例以阐明优选的实施方案。这些实施例的目的是为了对本发明进行描述，而不是对本发明范围进行限定。

在本文提供的蛋白序列中，一个字母代码X或Xaa是指二十种常规氨基酸残基中的任意一种。在本文提供的DNA序列中，一个字母代码N或n是指4个常规核苷酸碱基A、T、C或G中的任意一个。

                       实施例1

无内含子的hT1R表达构建体的产生

通过基于cDNA和基因组DNA的方法的组合，克隆无内含子的hT1R表达构建体。为了产生全长的hT1R1表达构建体，通过重叠PCR，将在克隆的hT1R间隔序列(登录号AL159177)中确认的两个5’编码外显子合并，然后将其连接到5’截断的睾丸cDNA克隆。hT1R2的表达构建体是由经部分测序的hT1R2的基因组的间隔序列产生。采用来自大鼠的相应编码序列的探针，通过筛选克隆的基因组的间隔序列的鸟枪(shotgun)文库，鉴定出hT1R2的2个丢失的5’外显子。然后通过重叠PCR合并编码外显子而产生全长的表达构建体。由经过测序的hT1R3基因组的间隔序列(登录号AL139287)通过重叠PCR产生hT1R3的表达构建体。采用通过基于hT1R3的简并PCR产生的rT1R3外显子片段，从来自大鼠味觉组织的cDNA文库中分离到大鼠T1R3。从Charles Zuker博士(Universityof California，San Diego)获得部分的hT1R1 cDNA、rT1R2 cDNA和部分的hT1R2的基因组序列。

序列表提供了以上鉴定的T1R的克隆序列以及其它全长的或部分的T1R序列的核酸和氨基酸序列。

同时，以下与两对直向同源的鱼T1R的C-末端相对应的概念性翻译来自未公开的基因组序列片段，并在此提供所述概念性翻译。Fugu T1RA来自登录号′scaffold 164′；Fugu T1RB来自登录号LPC61711；河豚T1RA来自登录号AL226735；河豚T1RB来自登录号AL222381。在概念性翻译中的不明确之处(′X′)来源于数据库序列中的不明确之处。这些序列可以在序列表中找到。

另外，在公共领域中涉及小鼠和大鼠的T1R及其等位基因变体的登录号和引用的参考文献提供如下：

rT1R1(登录号AAD18069)(Hoon等，Cell 96(4)：541-551(1999))；

rT1R2(登录号AAD18070)(Hoon等，Cell 96(4)：541-559(1999))；

mT1R1(登录号AAK39437)；mT1R2(登录号AAK39438)；

mT1R3(登录号AAK55537)(Max等，Nat.Genet.28(1)：58-63(2001))；

rT1R1(登录号AAK7092)(Li等，Mamm.Genome(12(1)：13-16(2001))；

mT1R1(登录号NP 114073)；mT1R1(登录号AAK07091)(Li等，Mamm.Genome(121)：13-16(2001))；rT1R2(登录号AAD18070)(Hoon等，Cell 9664)：541-551(1999))；mT1R2(登录号NP114079)；mT1R3(登录号AAK39436)；mT1R3(登录号BAB47181)；(Kitagawa等，Biochem.Biophys.Res.Comm.283(1)：236-242(2001))；mT1R3(登录号NP114078)；mT1R3(登录号AAK55536)(Max等，Nat.Genet.28(1)：58-63(2001))；和mT1R3(登录号No.AAK01937)。

                         实施例2

人类T1R和大鼠T1R的序列比对

将选自以上鉴定的那些序列的克隆T1R序列与相应的大鼠的T1R进行比对。如图1所示，将人类T1R1、人类T1R2、人类T1R3和大鼠T1R3与以前描述的T1R(rT1R1，其登录号为AAD18069；rT1R2，其登录号为AAD18070)、大鼠mGluR1代谢型谷氨酸受体(登录号P23385)；以及人类的钙敏感受体(登录号为P41180)进行比对。为了使上述比较清楚，截断了mGluR1和钙敏感受体的C-末端。将7个可能的跨膜片段框成蓝色。将在mGluR1的晶体结构中与谷氨酸侧链正丁酸基(carbutylate)接触的残基框成红色，而将与谷氨酸α-氨基酸部分接触的残基框成绿色。将mGluR1和钙敏感受体中涉及在亚基之间形成二硫键的半胱氨酸残基圈成紫色。这些半胱氨酸在T1R1和T1R2中并不保守但位于比对的退化区(degraded region)，该退化区包含可能类似的T1R3的半胱氨酸残基，该半胱氨酸也被圈起来。

                        实施例3

通过RT-PCR证实hT1R2和hT1R3在味觉组织中表达

如图2所示，将hT1R2和hT1R3在味觉组织中进行表达：由切除的人类轮廓乳头进行RT-PCR可以检测到所述两个基因的表达。

                        实施例4

在异源细胞中进行T1R的异源表达的方法

在37℃，将稳定地表达G_α15的HEK-293衍生细胞(Chandrashekar等Cell 100(6)：703-711(2000))培养并保持在Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM培养基，Gibco BRL)中，所述培养基添加有10％的FBS、MEM非必需氨基酸(Gibco BRL)和3μg/ml杀稻瘟素。对于钙成像实验，首先将细胞接种在24孔的组织培养板(约10万细胞/孔)上，并用MirusTransIt-293(PanVera)通过脂质转染法进行转染。为了使谷氨酸诱导的和葡萄糖诱导的脱敏最小化，在转染后约24小时，用低葡萄糖的DMEM/GlutaMAX(Gibco BRL)代替所添加的DMEM。24小时后，给细胞装载钙染料Fluo-4(Molecular Probes)(在Dulbecco’s PBS缓冲液(DPBS，GibcoBRL)中的浓度为3μm)，在室温装载1.5小时。用250μl的DPBS替换后，在室温下通过添加200μl的DPBS进行刺激，所述DPBS添加有味觉刺激物。用Imaging Workbench 4.0软件(Axon)在Axiovert S100TV显微镜(Zeiss)上监测钙动员。T1R1/T1R3和T1R2/T1R3的应答非常短暂—钙上升很少超过15秒，并且是不同步的。因此一个时段内响应细胞的数目是相对稳定的；因此，在固定的时间点(通常在添加刺激物后30秒时)通过对响应细胞的数目进行手动计数而对细胞应答进行定量。

                        实施例5

人类T1R2/T1R3发挥作为甜味受体的功能

用人类T1R2、T1R3和T1R2/T1R3瞬时转染稳定表达G_α15的HEK细胞，并测定因对提高蔗糖浓度产生应答而增加的胞内钙(图3(a))。另外，针对数种甜味刺激物，测定T1R2/T1R3的剂量应答(图3(b))。对于不同的甜味剂，响应细胞的最大百分比也不同，该百分比在10％～30％的范围内。为清楚目的，将剂量应答标准化为响应细胞的最大百分比。图3中的值代表4次独立应答的平均值±标准误差。X轴圆圈标志着通过味觉检验而测定的心理学检测阈值。Gurmarin(经过滤的10g/l的武靴藤(Gymnema sylvestre)水性提取物的50倍稀释物)抑制T1R2/T1R3对250mM蔗糖的应答，但不抑制内源β2-肾上腺素能受体对20μM异丙基肾上腺素的应答(图3(b))。图3(c)包含T1R2/T1R3共表达细胞系对不同甜味剂(蔗糖、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、D-色氨酸和糖精)的经标准化的应答。

                       实施例6

大鼠T1R2/T1R3也发挥作为甜味受体的功能

用hT1R2/hT1R3、rT1R2/rT1R3、hT1R2/rT1R3和rT1R2/hT1R3瞬时转染稳定表达G_α15的HEK细胞，然后测定这些细胞因对350mM蔗糖、25mM色氨酸、15mM天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和0.05％应乐果甜蛋白产生应答而引起的胞内钙的升高。蔗糖和天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的结果包含在图4中，指示rT1R2/rT1R3也具有作为甜味受体的功能。另外，这些结果表明T1R2可以控制T1R2/T1R3的配体特异性。

                      实施例7

用基于自动荧光的测定获得的T1R2/T1R3的应答

用hT1R2、hT1R3瞬时转染稳定表达G_α15的HEK细胞。将钙染料Fluo-4装载到这些细胞中，并用荧光读板仪测定它们对甜味剂的应答。图5包含表达hT1R2/hT1R3的细胞和只表达hT1R3(J19-22)的细胞对环己基氨基磺酸盐(12.5mM)的应答。所获得的荧光结果表明，对这些味觉刺激物的应答只发生在表达hT1R2/hT1R3的细胞中。图6包含经过标准化的剂量-应答曲线，其结果表明，根据hT1R2和hT1R3与各种甜味刺激物的剂量特异性相互作用，hT1R2和hT1R3一起发挥作为人类味觉受体的功能。特别地，图6包含对蔗糖、色氨酸和其它各种可商购获得的甜味剂的剂量-应答。这些结果表明，由于在测定中获得的等级次序和阈值忠实地反映了对人类甜味的值，因此T1R2/T1R3是人类的甜味受体。

                     实施例8

mGluR1的配体结合残基在T1R1中是保守的

如图6所示，mGluR1的关键的配体结合残基在T1R1中是保守的。显示了谷氨酸与mGluR1的相互作用，其中根据与图1相同的颜色方案，突出显示几个关键残基。

                     实施例9

人类的T1R1/T1R3发挥作为鲜味受体的功能

用人类的T1R1、T1R3和T1R1/T1R3瞬时转染稳定表达G_α15的HEK细胞，然后测定因对谷氨酸的浓度上升(图8(a))以及0.5mM的谷氨酸、0.2mM IMP和0.5mM谷氨酸加上0.2mM IMP(图8(b))产生应答而引起的胞内钙的上升。存在和不存在0.2mM IMP时，测定人类T1R1/T1R3对谷氨酸的剂量应答(图8(c))。对于谷氨酸，响应细胞的最大百分比约为5％；而对谷氨酸加上IMP，响应细胞的最大百分比约为10％。为清楚目的，将剂量应答标准化为响应细胞的最大百分比。其值代表4次独立应答的平均值±标准误差，X轴圆圈标志着通过味觉检验而测定的味觉检测阈值。

                    实施例10

将PDZIP作为输出序列

将6残基PDZIP序列(SVSTW(SEQ ID NO：1))融合到hT1R2的C-末端，并将该嵌合受体(即hT1R2-PDZIP)转染到HEK-293宿主细胞中，然后采用免疫荧光和FACS扫描数据，检测hT1R2的表面表达。如图9A和图9B所示，相对于hT1R2，包含的PDZIP序列增加了hT1R2-PDZIP的表面表达。更具体地，图9A显示myc标记的hT1R2的免疫荧光染色，证明PDZIP显著提高hT1R2蛋白在质膜上的量。图9B显示FACS分析数据，证明了相同的结果：表达myc标记的hT1R2的细胞用虚线表示，而表达myc标记的hT1R2-PDZIP的细胞用实线表示。特别地，图10A显示在HBS缓冲液中的未转染的G_α15稳定宿主细胞；图10B显示在5号甜味剂集合体(糖精、环己基氨基磺酸钠、乙酰舒泛钾和天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，在HBS缓冲液中浓度各为20mM)中，hT1R2-PDZIP转染的Gα15稳定宿主细胞；图10C显示在5号甜味剂集合体中T1R3-PDZIP转染的G_α15稳定宿主细胞；和图10D显示在5号甜味剂集合体中，hT1R2-PDZIP/hT1R3-PDZIP共转染的Gα15稳定宿主细胞。此外，图10E～10H显示hT1R2/hT1R3共转染的Gα15稳定宿主细胞对蔗糖(E：0mM(在HBS缓冲液中)；F：30mM；G：60mM和H：250mM)的剂量依赖性应答。图10I-10L显示hT1R2/hT1R3共转染的Gα15稳定宿主细胞对单独的甜味剂(I：天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(1.5mM)；J：乙酰舒泛钾(1mM)；K：纽甜(20mM)；L：环己基氨基磺酸钠(20mM))的应答。如由图10的钙图像所示，hT1R2和hT1R3对由甜味刺激物引发的活性是必要的。

                     实施例11

稳定地共表达T1R1/T1R3或T1R2/T1R3的细胞系的产生

通过将分别包含hT1R1或hT1R2表达构建体(质粒SAV2485用于T1R1，质粒SAV2486用于T1R2)和hT1R3(质粒SXV550用于T1R3)的线性化的由PEAK10衍生而来(Edge Biosystems)的载体和由pCDNA3.1/ZEO衍生而来(Invitrogen)的载体转染到G_α15表达细胞系中，产生稳定地共表达人类T1R2/T1R3或人类T1R1/T1R3的人类细胞系。具体地，通过将线性化的SAV2486和SXV550共转染到稳定表达G_α15的AuroraBioscience的HEK-293细胞系中，产生T1R2/T1R3稳定细胞系。通过将线性化的SAV2485和SXV550共转染到稳定表达G_α15的相同的HEK-293细胞系中，产生T1R1/T1R3稳定细胞系。在SAV2485/SXV550和SAV2486/SXV550转染之后，选择抗嘌呤霉素和抗零霉素的克隆进行扩大培养，并通过钙成像检验对甜味或鲜味刺激物所产生的应答。细胞是于37℃在添加有GlutaMAX、10％经过透析的FBS和0.003mg/ml的杀稻瘟素的低葡萄糖DMEM中在0.0005mg/ml嘌呤霉素(CALBIOCHEM)和0.1mg/ml零霉素(Invitrogen)中进行选择的。扩大培养抗性克隆，并通过荧光显微镜评估所述抗性克隆对甜味刺激物的应答。对于在VIPR-II仪器(Aurora Biosciences)上进行的自动荧光测定成像，首先将T1R2/T1R3稳定细胞接种到96孔板上(约100,000细胞/孔)。24小时后，将钙染料fluo-3-AM(Molecular Probes)(在PBS中为0.005mM)在室温装载到细胞中1小时。用70μl PBS替换后，在室温通过添加其中加有味觉刺激物的70μl PBS进行刺激。在添加化合物后计算20秒～30秒内的荧光(480nm激发和535nm发射)应答的平均值，用在化合物添加前测定的背景荧光进行修正，并标准化为对0.001mM离子霉素(CALBIOCHEM)的应答，所述离子霉素为一种钙离子载体。

然后观测到当这些细胞系与甜味或鲜味刺激物接触时，对于活性克隆，通常有80％～100％的细胞对味觉刺激物产生应答。没有想到的是，单细胞应答的强度显著大于瞬时转染的细胞应答的强度。

根据这些观测，本发明人利用上述的Aurora Bioscience的VIPR仪器通过自动荧光成像检验了T1R稳定细胞系的活性。在图11和图12中分别显示了2个T1R1/T1R3细胞系和1个T1R2/T1R3细胞系的应答。

显著地，相对于瞬时转染细胞，增加的响应细胞数目和增强的应答强度导致活性上升10倍(通过比较的方式，在最适宜的条件下，用T1R2/T1R3瞬时转染的细胞对离子霉素的应答百分比约为5％)。而且，对稳定表达的人类T1R2/T1R3和T1R1/T1R3，所获得的剂量应答与人类味觉检测阈值有关联。这些稳定细胞系的很强的T1R活性表明，它们非常适合高通量筛选化学物质文库以鉴定化合物，该化合物例如小分子，该小分子调节甜味或鲜味受体并因此调节、增强、阻断或模拟甜味或鲜味。

                     实施例12

选择性响应鲜味刺激物的诱导性共表达T1R1/T1R3的细胞系的产生

相对于瞬时转染的细胞系，稳定表达鲜味受体的T1R1/T1R3 HEK293细胞系表现出显著提高的活性。但是，一个缺点是它们在细胞增殖过程中可以很快地失去活性。

另外，这些发现表明(i)T1R1/T1R3是鲜味受体，即(ii)显著表达T1R1/T1R3的细胞系(优选为稳定和/或可诱导型T1R1/T1R3细胞系)可以用在测定中，优选地，用在高通量筛选化学物质文库中以鉴定新的鲜味调节剂。可以使用增强鲜味的调节剂。

为了克服T1R1/T1R3稳定细胞系的不稳定性，用GeneSwitch系统(Invitrogen)对HEK-G_α15进行改造，以诱导表达T1R1/T1R3。对用于人类T1R1和T1R3的PGene衍生而来抗零霉素的表达载体(质粒SXV603用于T1R1而质粒SXV611用于T1R3)和抗嘌呤霉素的携带有GeneSwitch蛋白的pSwitch衍生而来的载体(质粒SXV628)进行线性化，并将它们共转染到HEK-G_α15细胞系中。选择抗零霉素和嘌呤霉素的克隆进行扩大培养，用各种量的米非司酮诱导，并采用钙成像来检测对鲜味刺激物产生的应答。

T1R1/T1R3的诱导表达导致很强的活性。例如，约80％的诱导细胞对L-谷氨酸产生应答，而只有约10％的瞬时转染细胞对L-谷氨酸产生应答。更具体地，对表达人类T1R1和人类T1R3的pGene衍生而来的抗零霉素的表达载体和抗嘌呤霉素的pSwitch衍生而来的携带有GeneSwitch蛋白的载体进行线性化，并共转染到G_α15细胞中。在0.5μg/ml嘌呤霉素(CAL BIOCHEM)和100μg/ml零霉素(Invitrogen)中，于37℃在添加有GlutaMAX、10％经过透析的FBS和3μg/ml杀稻瘟素的Dulbecco改进的Eagle培养基中对细胞进行选择。扩大培养抗性克隆，在用10^-10M米非司酮进行诱导后，按照Li等(PNAS 99(7)：4692-4696(2002))的方法，通过荧光显微镜检测它们对鲜味刺激物的应答。

对于在FLIPR仪器(Molecular Device)上进行的自动荧光测定成像，在存在10^-10M米非司酮时，将来自一个克隆(指定为克隆I-17)的细胞接种到96孔板上(约80,000个细胞/孔)并温育48小时。然后用钙染料fluo-4-AM(Molecular Probes)(在PBS中为3μM)将细胞在室温装载1.5小时。

用50μl PBS替换后，在室温通过添加其中加有不同刺激物的50μlPBS进行刺激。不同于先前需要通过对响应细胞进行单个计数以对T1R1/T1R3受体活性进行定量的瞬时T1R1/T1R3鲜味受体表达系统(Li等，PNAS 99(7)：4692-4696(2002))，(因为其中的受体的活性低)，本发明的诱导型表达系统导致克隆I-17具有实质性提高的活性，其可通过对成像细胞视野内的最大荧光增加进行求和(480nm激发和535nm发射)来对受体活性进行定量。对来自4次独立测定的最大荧光进行平均，用在化合物添加之前测定的背景荧光进行修正，并标准化为对0.002mM的离子霉素(CALBIOCHEM)的应答。

这些结果包含在图13中。特别地，图13包含存在或不存在0.2mMIMP时，所测定的对L-谷氨酸的剂量应答曲线。在该图中，每一个数值表示对4次独立测定的最大荧光(经过采用背景荧光进行修正)进行求和后的平均数。这些剂量-应答曲线与用T1R1/T1R3瞬时转染的细胞所测定的曲线相对应。

还通过采用不同的L-氨基酸进行筛选来评估鲜味T1R1/T1R3味觉受体的选择性。所获得的结果表明，T1R1/T1R3被具有鲜味的L-氨基酸(L-谷氨酸和L-天冬氨酸)选择性激活。

在图14和图15中显示了当存在不同的L-氨基酸时I-17克隆应答实验的测定结果。图14显示存在或不存在1mM的IMP时，使I-17细胞系与浓度为10mM的不同L-氨基酸接触的实验结果。

图15包含存在0.2mM的IMP时所测定的对活性氨基酸的剂量-应答曲线。每一个数值表示4次独立测定的平均值。

在这些实验中所获得的结果支持鲜味受体对鲜味刺激物的特异性和选择性。虽然鲜味刺激物L-谷氨酸和L天冬氨酸在不同的浓度中都显著激活T1R1/T1R3受体(见图14和图15)，但激活人类T1R1/T1R3受体的其它L-氨基酸只稍微激活该受体且是在高得多的浓度条件下。

因此，这些结果支持T1R1/T1R3受体对鲜味刺激物的选择性以及所述诱导型稳定表达系统在高通量筛选测定中使用时的适用性，所述高通量筛选测定采用自动荧光测定成像仪器来鉴定激活鲜味受体的化合物(例如L-谷氨酸或L-天冬氨酸)或增强L-谷氨酸激活鲜味受体的活性的化合物(例如5’-IMP或5’-GMP)或阻断鲜味受体刺激物(例如L-谷氨酸和L-天冬氨酸)对鲜味受体的激活的化合物。

采用所述测定而鉴定的化合物具有作为在食物和饮料组合物中用于模拟或阻断鲜味刺激物的食用调料的潜在实用性。

                    实施例13

lactisole抑制人类T1R2/T1R3和T1R1/T1R3的受体活性以及甜味和鲜味

Lactisole是芳烷基羧酸，曾被认为是选择性的甜味抑制剂(见例如Lindley(1986)的美国专利4,567,053；和Schiffrnan等，Chem Senses24：439-447(1999))。测定存在各种浓度的lactisole时用T1R2/T1R3瞬时转染的HEK-G_α15细胞对150mM蔗糖的应答。Lactisole抑制人类T1R2/T1R3的活性，其IC₅₀为24μM。

T1R1/T1R3鲜味受体和T1R2/T1R3甜味受体可以具有共同的亚基。因此理论上曾认为，抑制T1R2/T1R3甜味受体的lactisole对T1R1/T1R3鲜味受体可能也具有类似的作用。本发明人检验了lactisole影响人类T1R1/T1R3对10mM的L-谷氨酸的应答的效果。如同lactisole对T1R2/T1R3甜味受体的作用一样，lactisole抑制T1R1/T1R3，其IC₅₀为165μM。由于毒蕈碱乙酰胆碱受体并没有被lactisole所抑制，所以lactisole的抑制作用可能反映了其对T1R受体的拮抗作用，而不是例如对G_α15介导的信号转导的非特异抑制。

然后，本发明人评估了lactisole对人类鲜味味觉的作用。根据Schiffman等(Chem.Senses 24：439-447(1989))的方法，在存在1mM的lactisole和2mM的lactisole时，测定鲜味刺激物L-谷氨酸(存在或不存在0.2mM的IMP)、甜味刺激物蔗糖和D-色氨酸以及咸味刺激物氯化钠的味觉阈值。毫摩尔浓度的lactisole显著提高甜味刺激物和鲜味刺激物的检测阈值，但并没有提高咸味刺激物的检测阈值。这些结果包含在图16中。

总而言之，(i)这些发现进一步支持本发明人的以下假设：T1R1/T1R3是唯一的鲜味受体，和(ii)T1R1/T1R3受体和T1R2/T1R3受体可能具有结构上相关的lactisole结合结构域。

尽管上文的详细描述已经记述了本发明的多个实施方案，但是应该理解，以上描述的目的只是为了对本发明进行阐述，而不是对所公开的发明进行限定。本发明只由后附权利要求来限定。

                   实施例14

在甜味受体上对配体互相作用位点进行定位

通过共表达T1R2R-H和人类T1R3，人类甜味受体的一部分(T1R2的N-末端结构域)被大鼠蛋白序列置换。对天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和纽甜的应答的消除显示人类T1R2的N-末端结构域对于识别天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和纽甜是必要的。类似地，通过共表达T1R2H-R和大鼠T1R3，大鼠T1R2的N-末端结构域也被人类蛋白序列置换。该嵌合受体获得对天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和纽甜产生应答的能力，表明人类T1R2的相同结构域足以(在甜味受体的情况中)识别那两种甜味剂(图22B)。这些体外功能性表达数据表明，重要的相互作用的决定簇位于N-末端胞外域。

相反地，用大鼠蛋白序列置换人类T1R2的任一半，并不影响对环己基氨基磺酸盐的应答。实际上，当与T1R2共表达时，人类T1R3的C-末端结构域对于识别环己基氨基磺酸盐是必要和充分的(图22C)。已知家族C GPCR的跨膜结构域包含变构调节剂的结合位点(Gasparini，F.，R.Kuhn和J.P.Pin，Curr Opin Pharmacol，2002年2月；2(1)：43-49)。这在家族C GPCR中是第一次出现的，其中激动剂直接结合到跨膜结构域并在缺乏其它配体的情况下激活受体。

芳烷基羧酸lactisole是特异的人类甜味抑制剂，其对啮齿动物的味觉具有生理作用。与味觉效果一致的是，在本发明人的测定系统中，lactisole抑制人类的T1R2/T1R3对蔗糖产生的应答，但不抑制大鼠的T1R2/T1R3对蔗糖产生的应答(图22A)。采用T1R嵌合体对lactisole互相作用位点进行相同类型的定位实验。和环己基氨基磺酸盐一样，lactisole需要人类T1R3的C-末端结构域来抑制受体对蔗糖和乙酰舒泛钾产生应答(图22D)。这一结果进一步证明T1R3的C-末端结构域在甜味受体功能中的重要性。检验了所有16种可能组合形式的嵌合体，而所有功能性组合所得到的结果与本发明人模型是一致的。

对T1R2和T1R3进行诱变研究，以限定在天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、纽甜和环己基氨基磺酸盐的识别中的必要氨基酸。如果T1R2和T1R3负责识别不同的甜味剂，则T1R2的N-末端结构域中的突变将影响对天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和纽甜的应答，但不影响对环己基氨基磺酸盐的应答。而且，T1R3的C-末端结构域的突变将具有相反的效果。为了选择T1R2的N-末端结构域中的关键氨基酸残基，对T1R2序列与mGluR1进行比对(图23A)。在对mGluR1的配体结合中起关键作用的8个残基中(Kunishima，N.，等，Nature，2000.407(6807)：971-977)，3个残基在人类T1R2是保守的(S144、Y218和E302)。分别对这3个残基进行突变，并检验所获得的受体对不同甜味剂的应答。将Y218置换为A消除了所有所检验的甜味剂的应答，表明Y218对该受体的总体构象是重要的。包含S144A和E302A的两个其它hT1R2变体选择性地影响对天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和纽甜的应答，但是不影响对环己基氨基磺酸盐的应答。表达S144A和E302A hT1R2变体(与野生型hT1R3和G_α15共表达)的稳定细胞系在生理浓度下并不对天冬氨酰苯丙氨酸甲酯或纽甜产生应答，但是对环己基氨基磺酸盐产生应答(图23B)。

为了进一步对环己基氨基磺酸盐-结合位点进行定位，将T1R3的C-末端结构域的3个胞外环融合。对人类和啮齿动物的T1R3的比对揭示，在这3个胞外环中存在多个氨基酸差异(图23C)。用大鼠的序列置换胞外环2或胞外环3，消除了环己基氨基磺酸盐应答，但不影响蔗糖或天冬氨酰苯丙氨酸甲酯应答。相反地，置换胞外环1对环己基氨基磺酸盐的应答并不产生明显的影响，表明EC环(胞外环)2和EC环3在识别环己基氨基磺酸盐中起重要的作用(图23D)。任何所述环的置换均没有影响lactisole的抑制作用，表明不同的结合机制。总而言之，T1R2或T1R3中的氨基酸置换选择性地干扰了由不同甜味剂诱导的活性，这与嵌合受体的结果是一致的。

以上结果表明人类甜味受体作为T1R2和T1R3的异聚复合物发挥功能。两个亚基对于不同甜味剂的识别是必要的，这些数据表明，在受体上存在用于不同种类的激动剂的多个结合袋。多配体结合位点的存在为本发明的特异性结合的化合物提供了结构上的指导和界定。

                      实施例15

受体-G蛋白相互作用的定位

人类和大鼠甜味剂受体在它们的G蛋白偶联效力上也存在差异。尽管人类和大鼠的受体都能够有效地偶联到G_α15/il，但是只有人类受体能够有效地偶联到G_α15上(图24A)。这种物种上的差异允许采用上述相同的嵌合受体对受体G蛋白的相互相作用进行定位。T1R2似乎对于G_α15偶联是关键的，但是T1R3则不然，这是因为用大鼠相应的序列置换人类T1R2的C-末端消除了偶联，而用人类序列置换大鼠的T1R2的C-末端这半部分使该受体能够偶联G_α15并对蔗糖和乙酰舒泛钾产生应答(图24)；交换T1R3的C-末端序列对G_α15偶联并没有产生影响(图24B)。这些观测结果表明，T1R2在功能性表达系统的G蛋白偶联中发挥重要作用。曾推测味导素(Wong，G.T.，K.S.Gannon和R.F.Margolskee，Nature，1996.381(6585)：796-800页)是对于甜味受体的内源G蛋白，而T1R2可能是味觉细胞中负责体内偶联的亚基。GABA_BR是异聚的家族C GPCR的其它例子，同时一个亚基(GABA_BR1)负责配体结合，而另一个亚基(GABA_BR2)负责G蛋白偶联(Margeta-Mitrovic，M.，Paroc Natl Acad SciUSA，2001.98(25)：14643-14648；Margeta-Mitrovic，M.，Proc Natl AcadSci USA，2001.98(25)：14649-14654)。甜味受体与GABA_BR是不同的，因为T1R2对于配体识别和G蛋白偶联都是必要的。

                    实施例16

lactisole对人类T1R1/T1R3具有拮抗作用并抑制人类的鲜味味觉

曾假设，由于T1R1/T1R3作为异聚受体以及甜味受体发挥功能，因此lactisole应该对T1R1/T1R3活性具有类似的作用，这是因为T1R3是甜味受体和鲜味受体的共同亚基。实际上，lactisole对人类T1R1/T1R3具有拮抗作用(图25A)。Lactisole起着T1R1/T1R3的非竞争性抑制剂的作用，这是因为IC₅₀值显然不依赖于谷氨酸的浓度(图25B)，并且lactisole降低了受体的最大活性而没有显著改变激动剂的EC₅₀(图25C)。这些结果表明，lactisole结合在L-谷氨酸的不同位点，并与以下假设是一致的，即谷氨酸结合袋位于T1R1中。Lactisole似乎是甜味受体的竞争性抑制剂，这是因为它的IC₅₀依赖于甜味剂的浓度，并且提高了甜味剂的EC₅₀而没有显著影响最大活性。

由于Lactisole对HEK细胞中的内源毒蕈碱乙酰胆碱受体没有影响，或者对在HEK细胞中瞬时表达的小鼠苦味受体mT2R5没有影响，因此Lactisole的抑制效果由T1R受体介导。如同T1R2/T1R3受体的情况一样，在洗掉并重新刺激后，lactisole对T1R1/T1R3对鲜味刺激物产生的应答所产生的抑制作用是可逆的。

为了将受体活性与行为联系起来，检验lactisole对人类鲜味味觉的作用。如所预期的那样，毫摩尔浓度的lactisole显著地提高了甜味刺激物和鲜味刺激物的检测阈值，但没有提高成味刺激物的检测阈值(图25D)。以前不知道Lactisole是鲜味抑制剂。受体活性和味觉结果之间的关联表明T1R在人类的鲜味味觉中具有关键的作用。

                       实施例17

环己基氨基磺酸盐增强人类T1R1/T1R3受体的活性

基于相同的T1R异聚模型(图26)，曾推测环己基氨基磺酸盐也将通过作用于T1R3而调节人类T1R1/T1R3鲜味受体的活性。尽管单独的环己基氨基磺酸盐对T1R1/T1R3没有影响，但是在存在L-谷氨酸时它增强了受体的活性(图27E)。这种作用是对人类T1R1/T1R3具有特异性的，这是因为存在碳酰胆碱时环己基氨基磺酸盐对内源的毒蕈碱乙酰胆碱受体的活性没有影响(图27E)。值得一提的是，环己基氨基磺酸盐对甜味受体(图23B)和鲜味受体具有类似的EC₅₀。在存在或不存在IMP时，环己基氨基磺酸盐可再现地将对L-谷氨酸的剂量-应答曲线向左迁移约两倍(图25F)。IMP具有更为显著的增强受体的作用，并且在存在IMP时，可以观察到环己基氨基磺酸盐的作用(图25F)，表明其与IMP具有增强受体的不同机制。由于IMP对甜味受体没有影响，因此它可能结合到T1R1。包括蔗糖、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精和D-色氨酸等其它甜味剂对人类T1R1/T1R3的活性没有影响。

总之，已证明，T1R2和T1R3均对功能性的甜味受体是必要的，天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和纽甜需要T1R2的N-末端胞外域，G蛋白偶联需要T1R2的C-末端这半部分，以及环己基氨基磺酸盐和lactisole需要T1R3的跨膜结构域。这些发现表明，T1R亚基在异聚复合物中具有不同的功能性作用并且在甜味受体上存在多个甜味剂相互作用位点。由于T1R3是甜味受体和鲜味受体的共同亚基，因而推测环己基氨基磺酸盐和lactisole对鲜味受体具有作用，并证实了这种作用。而且，可以建立lactisole对受体活性的作用和味觉的关联。基于这些发现，建立了T1R家族味觉受体的结构-功能关系的模型(图26)。类似于天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和纽甜，天然碳水化合物甜味剂结合到T1R2的N-末端区域，并且在甜味受体上还有其它配体结合位点，例如T1R2的跨膜结构域。类似地，鲜味受体作为异聚复合物发挥功能，并且MSG和IMP可能均结合到T1R1亚基上，这是因为MSG和IMP对甜味受体均不具有任何影响，而T1R1的跨膜结构域负责G蛋白的偶联。

                        实施例18

用于甜味调味剂的HTS程序

将稳定表达Gα15和hT1R2/hT1R3(Li，X.，Staszewski，L.，Xu，H.，Durick，K.，Zoller，M.，Adler，E.Proc Natl Acad Sci USA 2002，99，4692-4696，国际专利申请号WO 03/001876 A2，以参考的方式将其全部内容引入到本文中)的HEK293细胞系衍生物(Chandrashekar，J.，Mueller，K.L.，Hoon，M.A.，Adler，E.，Feng，L.，Guo，W，Zuker，C.S.，Ryba，NJ.，.Cel，12000，100，703-711)用来鉴定具有甜味增强特性的化合物。

首先基于化合物对hT1R2/hT1R3-HEK293-Gα15细胞系(Li等，请见上文)的活性对化合物进行选择。在FLIPR仪器(荧光测定强度读板仪(Fluorometric Intensity Plate Reader)，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上用自动荧光成像测定方法对活性进行测定(称为FLIPR测定)。将来自一个克隆的细胞(指定为S-9细胞)接种到384孔板(约50,000个细胞/孔)的培养基中，该培养基含有DMEM低葡萄糖(Invitrogen，Carlsbad，CA)、10％经透析的胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)、100单位/毫升的青霉素G和100μg/ml链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)(Li等，请见上文)，还见国际专利申请WO 03/001876 A2)。使S-9细胞在37℃生长24小时。然后在室温用钙染料Fluo-3AM(Molecular Probes，Eugene，OR)(在磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中为4μM)将S-9细胞装载1小时。用25μl D-PBS替换后，在室温下通过添加25μl D-PBS在FLIPR仪器中进行刺激，所述D-PBS添加有相应浓度为所需最终水平两倍的不同刺激物。通过测定最大荧光上升(使用480nm激发和535nm发射)，在用刺激前测定的基础荧光强度标准化后，对受体活性进行定量。

对于剂量应答分析，提供在60nM～30μM范围内的10个不同浓度的刺激物(每个浓度具有2个重复)。将活性标准化为用400mM的D-果糖(引起最大受体应答的浓度)获得的应答。用非线性回归算法测定EC₅₀(用Senomyx，Inc.软件)，其中希尔斜率、底部渐近线和顶部渐近线是允许改变的。当采用可商购用于非线性回归分析的软件(例如GraphPad PRISM(San Diego，CA))来分析剂量-应答数据时也获得了相同的结果。

为了测定细胞对不同刺激物的应答对hT1R2/hT1R3的依赖性，对所选择的化合物针对HEK293-Gα15细胞(不表达人类甜味受体)进行同样的分析。在FLIPR测定中，HEK293-Gα15细胞对D-果糖或者任何其它已知的甜味剂都没有显示出任何功能性应答。类似地，在FLIPR测定中，当采用HEK293-Gα15细胞时，本文中所描述的化合物也没有诱导任何功能性应答。

                       实施例19

通过人类志愿者进行甜味调味剂的口味增强测定

感官味觉检验者的基本筛查：检验潜在的调查对象排列和评定代表5种基本味道的溶液的强度的能力。调查对象排列和评定以下5种化合物各5种不同浓度的强度：蔗糖(甜味)、氯化钠(咸味)、柠檬酸(酸味)、咖啡因(苦味)和谷氨酸单钠(鲜味)。每一次调查期间，调查对象品尝总共25个样品(5个样品，每个样品5种溶液类型)。在第一次调查期间，调查对象针对所讨论的特征的强度排列出5种浓度。这种排列要用其它样品另外重复4次。在第二次调查期间中，调查对象用称为“标记的量值等级(LMS)”的线性等级评定每个样品的5种浓度的强度。用强度(例如难以检测、弱、中等、强、非常强和可想象到的最强)设置LMS，以帮助调查对象对样品进行评定。在室温下品尝10ml体积的样品并用3位数的盲法编码进行标记。在每种样品溶液(例如蔗糖、柠檬酸等)样品中，以随机平衡次序的方式提供样品。

为了能够被选中以参加检验，调查对象需要在合理出错次数的情况下准确地排列和评定样品的强度，大约有25个人成功地完成了这一程序。

在上述程序中被选中的调查对象被认为有资格进行初步检验程序。采用初步味觉检验来评估新的化合物的基本味道和异味(off-taste)的强度。一小组的调查对象(n＝5)品尝大约5种浓度的化合物(一般在1μM～100μM范围内，按半对数周期，例如1μM、3μM、10μM、30μM和100μM)，所述化合物在水溶液中或缓冲液中，或者为评估增强作用而在4％(重量/体积，117mM)的蔗糖溶液中。为了有助于化合物分散在基于水的溶液中，样品通常还包含0.1％的乙醇。调查对象在LMS上评定所述5种基本味道(甜味、咸味、酸味、苦味和鲜味)以及异味(例如化学物质、金属、硫磺)。样品是在室温下提供，每份提供的体积为10ml。检验的目的是为了确定没有令人不快的异味的最高浓度，以及确定在所检验的任何浓度下甜味是否存在明显的增强。

如果化合物是有效的并且不产生令人不快的异味，那么该化合物将在更大规模的研究中由经过专门训练的人员(专家小组)进行检验。

例如，5位调查对象评估了在水中和在4％的蔗糖溶液中的1μM、3μM、10μM、30μM和100μM的XVI-3。含有化合物的所有样品都由0.1％的乙醇进行平衡(有助于化合物的分散)。要求调查对象采用LMS评定所品尝的每个样品的基本味道和异味。当调查对象记录任何样品中的甜味时，他们被要求品尝蔗糖的参考样品(2％、4％、6％、8％的蔗糖)以估计相等值的甜味。

采用经过专门训练的人员(专家)小组进一步评估经过初步味道检验进行检验的化合物。

从具有资格品尝的调查对象组成的较大的组中选择经过专门训练的人员小组的调查对象。采用蔗糖溶液通过排列和评定实验进一步对调查对象进行与甜味有关的训练。调查对象用甜味溶液完成一系列排列、评定并区分标准检验。在排列和评定实验中，调查对象对蔗糖浓度为2％、4％、6％、8％(重量/体积)的蔗糖进行评估。

对由经过专门训练的人员检验的化合物与参考实验的差异进行评估。给调查对象提供各种浓度(2％、4％、6％、8％(重量/体积)的蔗糖)的参考样品并要求根据甜味与参考样品的差异对样品在-5至+5的范围内进行评定(分数：-5＝甜味远低于参考样品；0＝甜味与参考样品相同；+5＝甜味远高于参考样品)。待测样品是含有各种含量的蔗糖和化合物的溶液。通常，各检验期间比较参考样品(标为REF)和大量的待测样品(标有3位数的盲法编码)。各检验一般包括各种含有不同含量的蔗糖的样品，以及一份参考样品本身的盲样以评估专家小组的准确度。在加有4％或6％蔗糖的样品中对化合物与参考样品进行比较检验。所有样品都是在室温下提供，体积为10ml。而且，为了确定单独的化合物的甜味，以指定的浓度制备参考溶液并与蔗糖(2％)的阈值甜度进行比较。

                        实施例20

用于鲜味调味剂的HTS程序

采用GeneSwitch系统(Invitrogen)改造HEK-G_α15细胞，以诱导表达T1R1/T1R3。将用于人类T1R1和T1R3的由pGene衍生而来的抗零霉素的表达载体(质粒SXV603用于T1R1和质粒SXV611用于T1R3)和携带有GeneSwitch蛋白的抗嘌呤霉素的由pSwitch衍生而来的载体(质粒SXV628)线性化并共转染到HEK-G_α15细胞系中。选择抗零霉素和抗嘌呤霉素的克隆，并进行扩大培养，用各种量的米非司酮进行诱导，并采用钙成像检验对鲜味刺激物的应答。在0.5μg/ml嘌呤霉素(CAL BIOCHEM)和100μg/ml零霉素(Invitrogen)中，于37℃在添加有GlutaMAX、10％经过透析的FBS和3μg/ml杀稻瘟素的Dulbecco改进的Eagle培养基中对细胞进行选择。将抗性克隆扩大培养，在用10^-10M米非司酮进行诱导后，采用荧光显微镜按照Li等(PNAS(2002)99(7)：4692-4696)的方法检测所述细胞对鲜味刺激物的应答。对于在FLIPR仪器(Molecular Devise)上进行的自动荧光测定成像，在存在10^-10M米非司酮时，将来自一个克隆(指定为克隆I-17)的细胞接种到96孔板或384孔板(约80,000个细胞/孔)中，并温育48小时。然后在室温用钙染料fluo-4-AM(MolecularProbes)(在PBS中为3μM)对细胞装载，装载1.5小时。用50μl PBS替换后，在室温通过添加加有不同刺激物的50μl PBS进行刺激。对来自4个独立测定的最大荧光进行平均计算，用在化合物添加之前测定的背景荧光进行修正，并将其标准化为0.002mM的离子霉素(CALBIOCHEM)的应答。

                      实施例21

用于鲜味调味剂的味觉检验

感官味觉检验者的基本检查：采用在文献中记载的三角检验对品尝者进行训练，以评估以下标准味道化合物的水溶液(各为5mL，“假的(swash)和真的(spit)”)的味道：用于甜味品尝的蔗糖(50mM)；用于酸味品尝的柠檬酸(5mM)或乳酸(20mM)；用于咸味品尝的NaCl(12mM)；用于苦味品尝的奎宁(10μM)或咖啡因(1mM)和用于鲜味或“美味”品尝的谷氨酸单钠(8mM)。

针对鲜味品尝进行的训练：为品尝者提供1～3组6份MSG和/或MSG-IMP样品，其中MSG的范围为3mM～60mM，而IMP的范围为0μM～200μM，各按照浓度逐步上升的顺序放在盘子中。这种训练让品尝者进行剂量应答评估。另外一组由相同的6份样品组成，但是以随机的顺序放置。然后要求品尝者按强度逐步上升的顺序排列所述样品，并对鲜味的强度进行评定。

选择合格的味觉调查对象：用5对味觉样品，让品尝者进行标准的二选一(2AFC)检验。要求他们对从两份样品(一对)中选择最有鲜味的样品。该检验包括两组容易的样品对、两组中等难度的样品对和一组具有难度的样品对。选择能够区分中等难度的样品对的品尝者作为调查对象。

通过一小组的调查对象进行鲜味增强剂候选物(UEC)的尝试性/定性味道检验：在水中(如果不溶，使用最小量的乙醇)制备适当浓度(一般为1μM～50μM)的味觉样品；单独品尝30μM和/或50μM的UEC的鲜味和其它属性。对筛查名单上的适宜的标记量值等级(LMS)的那些味觉属性进行评定；如果UEC不具有/具有较低的鲜味和其它味道，然后再进行区别检验；比较一定浓度的MSG，例如12mM的MSG和12mM的MSG+30μM UEC，以确定是否存在任何的增强；评定筛查名单上在适宜LMS上所品尝出的鲜味强度；改变UEC和/或MSG的浓度，以发现最理想的组合；决定在专家小组筛选中使用的溶液；记录包括研究的描述、样品的制备、样品的排列、名单和调查对象的签字页、数据录入项和评估等所有的程序和数据。

UEC的2AFC专家小组筛查：采用由尝试性品尝产生的程序通过合格的调查对象进行专家小组筛选；记录所有程序和数据；准备统计学上具有显著性结论的总结报告(如果有)。

                   实施例22

化合物2725761和化合物3756807的定量品尝检验

按照以上提供的程序进行化合物2725761和化合物3756807的定量品尝检验。发现这两个化合物除了它们的鲜味强度的相加效应之外，它们均对MSG也具有一定的增强效果。

                   实施例23

化合物2725761和化合物3756807的合成

由化合物2725761和化合物3756807相应的酸和胺，根据实施例22所示制备化合物2725761和化合物3756807。采用常规的方法(例如碱性和酸性水洗或者制备型HPLC)对产物进行纯化。根据常用的分析方法(例如NMR和LCMS)确认这些化合物的结构。该方法也可以用于合成在表1～表5中显示的化合物。

                   实施例24

基于细胞的测定

于37℃，使细胞生长并保持在Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中，所述培养基添加有10％FBS和MEM非必需氨基酸(GibcoBRL)；用于G_α15细胞的培养基还包含3μg/ml的杀稻瘟素(Gibco BRL)。对于钙成像实验，首先将细胞接种在48孔的组织培养板(约3万个细胞/孔)上，并用Mirus TransIt-293(Pan Vera)进行转染。通过与RFP表达载体共转染而估算的转染效率通常约为60％。为了使谷氨酸诱导的和葡萄糖诱导的脱敏最小化，在转染后约24小时，用添加有GlutaMAX和10％经过透析的FBS(Gibco BRL)的低葡萄糖DMEM代替所添加的DMEM。再经过24小时后，在室温用钙染料Fluo-4-AM(Molecular Probes)(在Dulbecco氏PBS缓冲液(DPBS，GibcoBRL)中为3μM)对细胞进行装载1.5小时。用100μl的DPBS替换后，在室温通过添加100μl添加有味觉刺激物的DPBS进行刺激。在配备有反相10X/0.5LWD平场荧光物镜(Zeiss)和冷却式CCD照相机(Princeton Instruments)的Axiovert S100显微镜上监测钙动员。在480nm激发和535nm发射的条件下获得荧光图像，并用Imaging Workbench 4.0软件(Axon Instruments)进行分析。通过计算添加刺激物后30秒的响应细胞数目而对T1R1受体的活性进行定量。

                       序列表

<110>西诺米克斯公司

<120>T1R异寡聚味觉受体、表达所述受体的细胞系以及味觉化合物

<130>FCI05US3117

<140>PCT/US2004/025459

<141>2004-08-06

<150>60/494,071

<151>2003-08-06

<150>60/552,064

<151>2004-03-09

<160>33

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>1

Ser Val Ser Thr Trp

 1               5

<210>2

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<221>变体

<222>1、3、4、6、7、8、11、12、13

<223>在位置1，Xaa可以为Thr或Arg

     在位置3，Xaa可以为Phe或Leu

     在位置4，Xaa可以为Arg、Gln或Pro

     在位置6，Xaa可以为Arg或Thr

     在位置7，Xaa可以为Ser、Pro或Val

     在位置8，Xaa可以为Val、Glu、Arg、

     Lys或Thr

     在位置11，Xaa可以为Ala或Glu

     在位置12，Xaa可以为Trp或Leu

     在位置13，Xaa可以为Arg、His或Gly

<400>2

Xaa Cys Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Phe Leu Xaa Xaa Xaa Glu

 1               5                  10

<210>3

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<221>变体

<222>1、3、4、7、9、10、11、13、14、15

<223>在位置1，Xaa可以为Leu或Gln

     在位置3，Xaa可以为Glu、Gly或Thr

     在位置4，Xaa可以为Asn、Arg或Cys

     在位置7，Xaa可以为Arg或Glu

     在位置9，Xaa可以为Arg或Lys

     在位置10，Xaa可以为Cys、Gly或Phe

     在位置11，Xaa可以为Val、Leu或Ile

     在位置13，Xaa可以为Phe或Leu

     在位置14，Xaa可以为Ala或Ser

     在位置15，Xaa可以为Met或Leu

<400>3

Xaa Pro Xaa Xaa Tyr Asn Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa

 1               5                  10                  15

<210>4

<211>858

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>4

Met Pro Gly Leu Ala Ile Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Phe Leu Glu

 1               5                  10                  15

Leu Gly Met Gly Ser Ser Leu Cys Leu Ser Gln Gln Phe Lys Ala Gln

            20                  25                  30

Gly Asp Tyr Ile Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Thr Thr Glu Glu

        35                  40                  45

Ala Thr Leu Asn Gln Arg Thr Gln Pro Asn Gly Ile Leu Cys Thr Arg

    50                  55                  60

Phe Ser Pro Leu Gly Leu Phe Leu Ala Met Ala Met Lys Met Ala Val

65                  70                  75                  80

Glu Glu Ile Asn Asn Gly Ser Ala Leu Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly

                85                  90                  95

Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Cys Ser Glu Pro Val Val Thr Met Lys Pro

            100                 105                 110

Ser Leu Met Phe Met Ala Lys Val Gly Ser Gln Ser Ile Ala Ala Tyr

        115                 120                 125

Cys Asn Tyr Thr Gln Tyr Gln Pro Arg Val Leu Ala Val Ile Gly Pro

    130                 135                 140

His Ser Ser Glu Leu Ala Leu Ile Thr Gly Lys Phe Phe Ser Phe Phe

145                 150                 155                 160

Leu Met Pro Gln Val Ser Tyr Ser Ala Ser Met Asp Arg Leu Ser Asp

                165                 170                 175

Arg Glu Thr Phe Pro Ser Phe Phe Arg Thr Val Pro Ser Asp Arg Val

            180                 185                 190

Gln Leu Gln Ala Val Val Thr Leu Leu Gln Asn Phe Ser Trp Asn Trp

        195                 200                 205

Val Ala Ala Leu Gly Ser Asp Asp Asp Tyr Gly Arg Glu Gly Leu Ser

    210                 215                 220

Ile Phe Ser Gly Leu Ala Asn Ser Arg Gly Ile Cys Ile Ala His Glu

225                 230                 235                 240

Gly Leu Val Pro Gln His Asp Thr Ser Gly Gln Gln Leu Gly Lys Val

                245                 250                 255

Val Asp Val Leu Arg Gln Val Asn Gln Ser Lys Val Gln Val Val Val

            260                 265                 270

Leu Phe Ala Ser Ala Arg Ala Val Tyr Ser Leu Phe Ser Tyr Ser Ile

        275                 280                 285

Leu His Asp Leu Ser Pro Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ser Trp Leu

    290                 295                 300

Thr Ser Asp Leu Val Met Thr Leu Pro Asn Ile Ala Arg Val Gly Thr

305                 310                 315                 320

Val Leu Gly Phe Leu Gln Arg Gly Ala Leu Leu Pro Glu Phe Ser His

                325                 330                 335

Tyr Val Glu Thr Arg Leu Ala Leu Ala Ala Asp Pro Thr Phe Cys Ala

            340                 345                 350

Ser Leu Lys Ala Glu Leu Asp Leu Glu Glu Arg Val Met Gly Pro Arg

        355                 360                 365

Cys Ser Gln Cys Asp Tyr Ile Met Leu Gln Asn Leu Ser Ser Gly Leu

    370                 375                 380

Met Gln Asn Leu Ser Ala Gly Gln Leu His His Gln Ile Phe Ala Thr

385                 390                 395                 400

Tyr Ala Ala Val Tyr Ser Val Ala Gln Ala Leu His Asn Thr Leu Gln

                405                 410                 415

Cys Asn Val Ser His Cys His Thr Ser Glu Pro Val Gln Pro Trp Gln

            420                 425                 430

Leu Leu Glu Asn Met Tyr Asn Met Ser Phe Arg Ala Arg Asp Leu Thr

        435                 440                 445

Leu Gln Phe Asp Ala Lys Gly Ser Val Asp Met Glu Tyr Asp Leu Lys

    450                 455                 460

Met Trp Val Trp Gln Ser Pro Thr Pro Val Leu His Thr Val Gly Thr

465                 470                 475                 480

Phe Asn Gly Thr Leu Gln Leu Gln His Ser Lys Met Tyr Trp Pro Gly

                485                 490                 495

Asn Gln Val Pro Val Ser Gln Cys Ser Arg Gln Cys Lys Asp Gly Gln

            500                 505                 510

Val Arg Arg Val Lys Gly Phe His Ser Cys Cys Tyr Asp Cys Val Asp

        515                 520                 525

Cys Lys Ala Gly Ser Tyr Arg Lys His Pro Asp Asp Phe Thr Cys Thr

    530                 535                 540

Pro Cys Gly Lys Asp Gln Trp Ser Pro Glu Lys Ser Thr Thr Cys Leu

545                 550                 555                 560

Pro Arg Arg Pro Lys Phe Leu Ala Trp Gly Glu Pro Ala Val Leu Ser

                565                 570                 575

Leu Leu Leu Leu Leu Cys Leu Val Leu Gly Leu Thr Leu Ala Ala Leu

            580                 585                 590

Gly Leu Phe Val His Tyr Trp Asp Ser Pro Leu Val Gln Ala Ser Gly

        595                 600                 605

Gly Ser Leu Phe Cys Phe Gly Leu Ile Cys Leu Gly Leu Phe Cys Leu

    610                 615                 620

Ser Val Leu Leu Phe Pro Gly Arg Pro Arg Ser Ala Ser Cys Leu Ala

625                 630                 635                 640

Gln Gln Pro Met Ala His Leu Pro Leu Thr Gly Cys Leu Ser Thr Leu

                645                 650                 655

Phe Leu Gln Ala Ala Glu Ile Phe Val Glu Ser Glu Leu Pro Leu Ser

            660                 665                 670

Trp Ala Asn Trp Leu Cys Ser Tyr Leu Arg Gly Pro Trp Ala Trp Leu

        675                 680                 685

Val Val Leu Leu Ala Thr Leu Val Glu Ala Ala Leu Cys Ala Trp Tyr

    690                 695                 700

Leu Met Ala Phe Pro Pro Glu Val Val Thr Asp Trp Gln Val Leu Pro

705                 710                 715                 720

Thr Glu Val Leu Glu His Cys Arg Met Arg Ser Trp Val Ser Leu Gly

                725                 730                 735

Leu Val His Ile Thr Asn Ala Val Leu Ala Phe Leu Cys Phe Leu Gly

            740                 745                 750

Thr Phe Leu Val Gln Ser Gln Pro Gly Arg Tyr Asn Arg Ala Arg Gly

        755                 760                 765

Leu Thr Phe Ala Met Leu Ala Tyr Phe Ile Ile Trp Val Ser Phe Val

    770                 775                 780

Pro Leu Leu Ala Asn Val Gln Val Ala Tyr Gln Pro Ala Val Gln Met

785                 790                 795                 800

Gly Ala Ile Leu Phe Cys Ala Leu Gly Ile Leu Ala Thr Phe His Leu

                805                 810                 815

Pro Lys Cys Tyr Val Leu Leu Trp Leu Pro Glu Leu Asn Thr Gln Glu

            820                 825                 830

Phe Phe Leu Gly Arg Ser Pro Lys Glu Ala Ser Asp Gly Asn Ser Gly

        835                 840                 845

Ser Ser Glu Ala Thr Arg Gly His Ser Glu

    850                 855

<210>5

<211>841

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>5

Met Leu Leu Cys Thr Ala Arg Leu Val Gly Leu Gln Leu Leu Ile Ser

 1               5                  10                  15

Cys Cys Trp Ala Phe Ala Cys His Ser Thr Glu Ser Ser Pro Asp Phe

            20                  25                  30

Thr Leu Pro Gly Asp Tyr Leu Leu Ala Gly Leu Phe Pro Leu His Ser

        35                  40                  45

Gly Cys Leu Gln Val Arg His Arg Pro Glu Val Thr Leu Cys Asp Arg

    50                  55                  60

Ser Cys Ser Phe Asn Glu His Gly Tyr His Leu Phe Gln Ala Met Arg

65                  70                  75                  80

Leu Gly Val Glu Glu Ile Asn Asn Ser Thr Ala Leu Leu Pro Asn Ile

                85                  90                  95

Thr Leu Gly Tyr Gln Leu Tyr Asp Val Cys Ser Asp Ser Ala Asn Val

            100                 105                 110

Tyr Ala Thr Leu Arg Val Leu Ser Leu Pro Gly Gln His His Ile Glu

        115                 120                 125

Leu Gln Gly Asp Leu Leu His Tyr Ser Pro Thr Val Leu Ala Val Ile

    130                 135                 140

Gly Pro Asp Ser Thr Asn Arg Ala Ala Thr Thr Ala Ala Leu Leu Ser

145                 150                 155                 160

Pro Phe Leu Val Pro Met Ile Ser Tyr Ala Ala Ser Ser Glu Thr Leu

                165                 170                 175

Ser Val Lys Arg Gln Tyr Pro Ser Phe Leu Arg Thr Ile Pro Asn Asp

            180                 185                 190

Lys Tyr Gln Val Glu Thr Met Val Leu Leu Leu Gln Lys Phe Gly Trp

        195                 200                 205

Thr Trp Ile Ser Leu Val Gly Ser Ser Asp Asp Tyr Gly Gln Leu Gly

    210                 215                 220

Val Gln Ala Leu Glu Asn Gln Ala Thr Gly Gln Gly Ile Cys Ile Ala

225                 230                 235                 240

Phe Lys Asp Ile Met Pro Phe Ser Ala Gln Val Gly Asp Glu Arg Met

                245                 250                 255

Gln Cys Leu Met Arg His Leu Ala Gln Ala Gly Ala Thr Val Val Val

            260                 265                 270

Val Phe Ser Ser Arg Gln Leu Ala Arg Val Phe phe Glu Ser Val Val

        275                 280                 285

Leu Thr Asn Leu Thr Gly Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ala Trp Ala

    290                 295                 300

Leu Ser Arg His Ile Thr Gly Val Pro Gly Ile Gln Arg Ile Gly Met

305                 310                 315                 320

Val Leu Gly Val Ala Ile Gln Lys Arg Ala Val Pro Gly Leu Lys Ala

                325                 330                 335

Phe Glu Glu Ala Tyr Ala Arg Ala Asp Lys Lys Ala Pro Arg pro Cys

            340                 345                 350

His Lys Gly Ser Trp Cys Ser Ser Asn Gln Leu Cys Arg Glu Cys Gln

        355                 360                 365

Ala Phe Met Ala His Thr Met Pro Lys Leu Lys Ala Phe Ser Met Ser

    370                 375                 380

Ser Ala Tyr Asn Ala Tyr Arg Ala Val Tyr Ala Val Ala His Gly Leu

385                 390                 395                 400

His Gln Leu Leu Gly Cys Ala Ser Gly Ala Cys Ser Arg Gly Arg Val

                405                 410                 415

Tyr Pro Trp Gln Leu Leu Glu Gln Ile His Lys Val His Phe Leu Leu

            420                 425                 430

His Lys Asp Thr Val Ala Phe Asn Asp Asn Arg Asp Pro Leu Ser Ser

        435                 440                 445

Tyr Asn Ile Ile Ala Trp Asp Trp Asn Gly Pro Lys Trp Thr Phe Thr

    450                 455                 460

Val Leu Gly Ser Ser Thr Trp Ser Pro Val Gln Leu Asn Ile Asn Glu

465                 470                 475                 480

Thr Lys Ile Gln Trp His Gly Lys Asp Asn Gln Val Pro Lys Ser Val

                485                 490                 495

Cys Ser Ser Asp Cys Leu Glu Gly His Gln Arg Val Val Thr Gly Phe

            500                 505                 510

His His Cys Cys Phe Glu Cys Val Pro Cys Gly Ala Gly Thr Phe Leu

        515                 520                 525

Asn Lys Ser Asp Leu Tyr Arg Cys Gln Pro Cys Gly Lys Glu Glu Trp

    530                 535                 540

Ala Pro Glu Gly Ser Gln Thr Cys Phe Pro Arg Thr Val Val Phe Leu

545                 550                 555                 560

Ala Leu Arg Glu His Thr Ser Trp Val Leu Leu Ala Ala Asn Thr Leu

                565                 570                 575

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Thr Ala Gly Leu Phe Ala Trp His Leu

            580                 585                 590

Asp Thr Pro Val Val Arg Ser Ala Gly Gly Arg Leu Cys Phe Leu Met

        595                 600                 605

Leu Gly Ser Leu Ala Ala Gly Ser Gly Ser Leu Tyr Gly Phe Phe Gly

    610                 615                 620

Glu Pro Thr Arg Pro Ala Cys Leu Leu Arg Gln Ala Leu Phe Ala Leu

625                 630                 635                 640

Gly Phe Thr Ile Phe Leu Ser Cys Leu Thr Val Arg Ser Phe Gln Leu

                645                 650                 655

Ile Ile Ile Phe Lys Phe Ser Thr Lys Val Pro Thr Phe Tyr His Ala

            660                 665                 670

Trp Val Gln Asn His Gly Ala Gly Leu Phe Val Met Ile Ser Ser Ala

        675                 680                 685

Ala Gln Leu Leu Ile Cys Leu Thr Trp Leu Val Val Trp Thr Pro Leu

    690                 695                 700

Pro Ala Arg Glu Tyr Gln Arg Phe Pro His Leu Val Met Leu Glu Cys

705                 710                 715                 720

Thr Glu Thr Asn Ser Leu Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu Tyr Asn Gly

                725                 730                 735

Leu Leu Ser Ile Ser Ala Phe Ala Cys Ser Tyr Leu Gly Lys Asp Leu

            740                 745                 750

Pro Glu Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Cys Val Thr Phe Ser Leu Leu Phe

        755                 760                 765

Asn Phe Val Ser Trp Ile Ala Phe Phe Thr Thr Ala Ser Val Tyr Asp

    770                 775                 780

Gly Lys Tyr Leu Pro Ala Ala Asn Met Met Ala Gly Leu Ser Ser Leu

785                 790                 795                 800

Ser Ser Gly Phe Gly Gly Tyr Phe Leu Pro Lys Cys Tyr Val Ile Leu

                805                 810                 815

Cys Arg Pro Asp Leu Asn Ser Thr Glu His Phe Gln Ala Ser Ile Gln

            820                 825                 830

Asp Tyr Thr Arg Arg Cys Gly Ser Thr

        835                 840

<210>6

<211>839

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>6

Met Gly Pro Arg Ala Lys Thr Ile Cys Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp

 1               5                  10                  15

Val Leu Ala Glu Pro Ala Glu Asn Ser Asp Phe Tyr Leu Pro Gly Asp

            20                  25                  30

Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Leu His Ala Asn Met Lys Gly Ile

        35                  40                  45

Val His Leu Asn Phe Leu Gln Val Pro Met Cys Lys Glu Tyr Glu Val

    50                  55                  60

Lys Val Ile Gly Tyr Asn Leu Met Gln Ala Met Arg Phe Ala Val Glu

65                  70                  75                  80

Glu Ile Asn Asn Asp Ser Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu Leu Gly Tyr

                85                  90                  95

Glu Ile Val Asp Val Cys Tyr Ile Ser Asn Asn Val Gln Pro Val Leu

            100                 105                 110

Tyr Phe Leu Ala His Glu Asp Asn Leu Leu Pro Ile Gln Glu Asp Tyr

        115                 120                 125

Ser Asn Tyr Ile Ser Arg Val Val Ala Val Ile Gly Pro Asp Asn Ser

    130                 135                 140

Glu Ser Val Met Thr Val Ala Asn Phe Leu Ser Leu Phe Leu Leu Pro

145                 150                 155                 160

Gln Ile Thr Tyr Ser Ala Ile Ser Asp Glu Leu Arg Asp Lys Val Arg

                165                 170                 175

Phe Pro Ala Leu Leu Arg Thr Thr Pro Ser Ala Asp His His Val Glu

            180                 185                 190

Ala Met Val Gln Leu Met Leu His Phe Arg Trp Asn Trp Ile Ile Val

        195                 200                 205

Leu Val Ser Ser Asp Thr Tyr Gly Arg Asp Asn Gly Gln Leu Leu Gly

    210                 215                 220

Glu Arg Val Ala Arg Arg Asp Ile Cys Ile Ala Phe Gln Glu Thr Leu

225                 230                 235                 240

Pro Thr Leu Gln Pro Asn Gln Asn Met Thr Ser Glu Glu Arg Gln Arg

                245                 250                 255

Leu Val Thr Ile Val Asp Lys Leu Gln Gln Ser Thr Ala Arg Val Val

            260                 265                 270

Val Val Phe Ser Pro Asp Leu Thr Leu Tyr His Phe Phe Asn Glu Val

        275                 280                 285

Leu Arg Gln Asn Phe Thr Gly Ala Val Trp Ile Ala Ser Glu Ser Trp

    290                 295                 300

Ala Ile Asp Pro Val Leu His Asn Leu Thr Glu Leu Gly His Leu Gly

305                 310                 315                 320

Thr Phe Leu Gly Ile Thr Ile Gln Ser Val Pro Ile Pro Gly Phe Ser

                325                 330                 335

Glu Phe Arg Glu Trp Gly Pro Gln Ala Gly Pro Pro Pro Leu Ser Arg

            340                 345                 350

Thr Ser Gln Ser Tyr Thr Cys Asn Gln Glu Cys Asp Asn Cys Leu Asn

        355                 360                 365

Ala Thr Leu Ser Phe Asn Thr Ile Leu Arg Leu Ser Gly Glu Arg Val

    370                 375                 380

Val Tyr Ser Val Tyr Ser Ala Val Tyr Ala Val Ala His Ala Leu His

385                 390                 395                 400

Ser Leu Leu Gly Cys Asp Lys Ser Thr Cys Thr Lys Arg Val Val Tyr

                405                 410                 415

Pro Trp Gln Leu Leu Glu Glu Ile Trp Lys Val Asn Phe Thr Leu Leu

            420                 425                 430

Asp His Gln Ile Phe Phe Asp Pro Gln Gly Asp Val Ala Leu His Leu

        435                 440                 445

Glu Ile Val Gln Trp Gln Trp Asp Arg Ser Gln Asn Pro Phe Gln Ser

    450                 455                 460

Val Ala Ser Tyr Tyr Pro Leu Gln Arg Gln Leu Lys Asn Ile Gln Asp

465                 470                 475                 480

Ile Ser Trp His Thr Val Asn Asn Thr Ile Pro Met Ser Met Cys Ser

                485                 490                 495

Lys Arg Cys Gln Ser Gly Gln Lys Lys Lys Pro Val Gly Ile His Val

            500                 505                 510

Cys Cys Phe Glu Cys Ile Asp Cys Leu Pro Gly Thr Phe Leu Asn His

        515                 520                 525

Thr Glu Asp Glu Tyr Glu Cys Gln Ala Cys Pro Asn Asn Glu Trp Ser

    530                 535                 540

Tyr Gln Ser Glu Thr Ser Cys Phe Lys Arg Gln Leu Val Phe Leu Glu

545                 550                 555                 560

Trp His Glu Ala Pro Thr Ile Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gly

                565                 570                 575

Phe Leu Ser Thr Leu Ala Ile Leu Val Ile Phe Trp Arg His Phe Gln

            580                 585                 590

Thr Pro Ile Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met Leu

        595                 600                 605

Thr Leu Leu Leu Val Ala Tyr Met Val Val Pro Val Tyr Val Gly Pro

    610                 615                 620

Pro Lys Val Ser Thr Cys Leu Cys Arg Gln Ala Leu Phe Pro Leu Cys

625                 630                 635                 640

Phe Thr Ile Cys Ile Ser Cys Ile Ala Val Arg Ser Phe Gln Ile Val

                645                 650                 655

Cys Ala Phe Lys Met Ala Ser Arg Phe Pro Arg Ala Tyr Ser Tyr Trp

            660                 665                 670

Val Arg Tyr Gln Gly Pro Tyr Val Ser Met Ala Phe Ile Thr Val Leu

        675                 680                 685

Lys Met Val Ile Val Val Ile Gly Met Leu Ala Thr Gly Leu Ser Pro

    690                 695                 700

Thr Thr Arg Thr Asp Pro Asp Asp Pro Lys Ile Thr Ile Val Ser Cys

705                 710                 715                 720

Asn Pro Asn Tyr Arg Asn Ser Leu Leu Phe Asn Thr Ser Leu Asp Leu

                725                 730                 735

Leu Leu Ser Val Val Gly Phe Ser Phe Ala Tyr Met Gly Lys Glu Leu

            740                 745                 750

Pro Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr Leu Ser Met Thr Phe

        755                 760                 765

Tyr Phe Thr Ser Ser Val Ser Leu Cys Thr Phe Met Ser Ala Tyr Ser

    770                 775                 780

Gly Val Leu Val Thr Ile Val Asp Leu Leu Val Thr Val Leu Asn Leu

785                 790                 795                 800

Leu Ala Ile Ser Leu Gly Tyr Phe Gly Pro Lys Cys Tyr Met Ile Leu

                805                 810                 815

Phe Tyr Pro Glu Arg Asn Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Ser Met Ile Gln

            820                 825                 830

Gly Tyr Thr Met Arg Arg Asp

        835

<210>7

<211>852

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>7

Met Leu Gly Pro Ala Val Leu Gly Leu Ser Leu Trp Ala Leu Leu His

 1               5                  10                  15

Pro Gly Thr Gly Ala Pro Leu Cys Leu Ser Gln Gln Leu Arg Met Lys

            20                  25                  30

Gly Asp Tyr Val Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Glu Ala Glu Glu

        35                  40                  45

Ala Gly Leu Arg Ser Arg Thr Arg Pro Ser Ser Pro Val Cys Thr Arg

    50                  55                  60

Phe Ser Ser Asn Gly Leu Leu Trp Ala Leu Ala Met Lys Met Ala Val

65                  70                  75                  80

Glu Glu Ile Asn Asn Lys Ser Asp Leu Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly

                85                  90                  95

Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Cys Ser Glu Pro Val Val Ala Met Lys Pro

            100                 105                 110

Ser Leu Met Phe Leu Ala Lys Ala Gly Ser Arg Asp Ile Ala Ala Tyr

        115                 120                 125

Cys Asn Tyr Thr Gln Tyr Gln Pro Arg Val Leu Ala Val Ile Gly Pro

    130                 135                 140

His Ser Ser Glu Leu Ala Met Val Thr Gly Lys Phe Phe Ser Phe Phe

145                 150                 155                 160

Leu Met Pro Gln Val Ser Tyr Gly Ala Ser Met Glu Leu Leu Ser Ala

                165                 170                 175

Arg Glu Thr Phe Pro Ser Phe Phe Arg Thr Val Pro Ser Asp Arg Val

            180                 185                 190

Gln Leu Thr Ala Ala Ala Glu Leu Leu Gln Glu Phe Gly Trp Asn Trp

        195                 200                 205

Val Ala Ala Leu Gly Ser Asp Asp Glu Tyr Gly Arg Gln Gly Leu Ser

    210                 215                 220

Ile Phe Ser Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Ile Cys Ile Ala His Glu

225                 230                 235                 240

Gly Leu Val Pro Leu Pro Arg Ala Asp Asp Ser Arg Leu Gly Lys Val

                245                 250                 255

Gln Asp Val Leu His Gln Val Asn Gln Ser Ser Val Gln Val Val Leu

            260                 265                 270

Leu Phe Ala Ser Val His Ala Ala His Ala Leu Phe Asn Tyr Ser Ile

        275                 280                 285

Ser Ser Arg Leu Ser Pro Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ala Trp Leu

    290                 295                 300

Thr Ser Asp Leu Val Met Gly Leu Pro Gly Met Ala Gln Met Gly Thr

305                 310                 315                 320

Val Leu Gly Phe Leu Gln Arg Gly Ala Gln Leu His Glu Phe Pro Gln

                325                 330                 335

Tyr Val Lys Thr His Leu Ala Leu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Cys Ser

            340                 345                 350

Ala Leu Gly Glu Arg Glu Gln Gly Leu Glu Glu Asp Val Val Gly Gln

        355                 360                 365

Arg Cys Pro Gln Cys Asp Cys Ile Thr Leu Gln Asn Val Ser Ala Gly

    370                 375                 380

Leu Asn His His Gln Thr Phe Ser Val Tyr Ala Ala Val Tyr Ser Val

385                 390                 395                 400

Ala Gln Ala Leu His Asn Thr Leu Gln Cys Asn Ala Ser Gly Cys Pro

                405                 410                 415

Ala Gln Asp Pro Val Lys Pro Trp Gln Leu Leu Glu Asn Met Tyr Asn

            420                 425                 430

Leu Thr Phe His Val Gly Gly Leu Pro Leu Arg Phe Asp Ser Ser Gly

        435                 440                 445

Asn Val Asp Met Glu Tyr Asp Leu Lys Leu Trp Val Trp Gln Gly Ser

    450                 455                 460

Val Pro Arg Leu His Asp Val Gly Arg Phe Asn Gly Ser Leu Arg Thr

465                 470                 475                 480

Glu Arg Leu Lys Ile Arg Trp His Thr Ser Asp Asn Gln Lys Pro Val

                485                 490                 495

Ser Arg Cys Ser Arg Gln Cys Gln Glu Gly Gln Val Arg Arg Val Lys

            500                 505                 510

Gly Phe His Ser Cys Cys Tyr Asp Cys Val Asp Cys Glu Ala Gly Ser

        515                 520                 525

Tyr Arg Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ala Cys Thr Phe Cys Gly Gln Asp

    530                 535                 540

Glu Trp Ser Pro Glu Arg Ser Thr Arg Cys Phe Arg Arg Arg Ser Arg

545                 550                 555                 560

Phe Leu Ala Trp Gly Glu Pro Ala Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

                565                 570                 575

Ser Leu Ala Leu Gly Leu Val Leu Ala Ala Leu Gly Leu Phe Val His

            580                 585                 590

His Arg Asp Ser Pro Leu Val Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys

        595                 600                 605

Phe Gly Leu Val Cys Leu Gly Leu Val Cys Leu Ser Val Leu Leu Phe

    610                 615                 620

Pro Gly Gln Pro Ser Pro Ala Arg Cys Leu Ala Gln Gln Pro Leu Ser

625                 630                 635                 640

His Leu Pro Leu Thr Gly Cys Leu Ser Thr Leu Phe Leu Gln Ala Ala

                645                 650                 655

Glu Ile Phe Val Glu Ser Glu Leu Pro Leu Ser Trp Ala Asp Arg Leu

            660                 665                 670

Ser Gly Cys Leu Arg Gly Pro Trp Ala Trp Leu Val Val Leu Leu Ala

        675                 680                 685

Met Leu Val Glu Val Ala Leu Cys Thr Trp Tyr Leu Val Ala Phe Pro

    690                 695                 700

Pro Glu Val Val Thr Asp Trp His Met Leu Pro Thr Glu Ala Leu Val

705                 710                 715                 720

His Cys Arg Thr Arg Ser Trp Val Ser Phe Gly Leu Ala His Ala Thr

                725                 730                 735

Asn Ala Thr Leu Ala Phe Leu Cys Phe Leu Gly Thr Phe Leu Val Arg

            740                 745                 750

Ser Gln Pro Gly Arg Tyr Asn Arg Ala Arg Gly Leu Thr Phe Ala Met

        755                 760                 765

Leu Ala Tyr Phe Ile Thr Trp Val Ser Phe Val Pro Leu Leu Ala Asn

    770                 775                 780

Val Gln Val Val Leu Arg Pro Ala Val Gln Met Gly Ala Leu Leu Leu

785                 790                 795                 800

Cys Val Leu Gly Ile Leu Ala Ala Phe His Leu Pro Arg Cys Tyr Leu

                805                 810                 815

Leu Met Arg Gln Pro Gly Leu Asn Thr Pro Glu Phe Phe Leu Gly Gly

            820                 825                 830

Gly Pro Gly Asp Ala Gln Gly Gln Asn Asp Gly Asn Thr Gly Asn Gln

        835                 840                 845

Gly Lys His Glu

    850

<210>8

<211>2526

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>8

atgctgctct gcacggctcg cctggtcggc ctgcagcttc tcatttcctg ctgctgggcc    60

tttgcctgcc atagcacgga gtcttctcct gacttcaccc tccccggaga ttacctcctg    120

gcaggcctgt tccctctcca ttctggctgt ctgcaggtga ggcacagacc cgaggtgacc    180

ctgtgtgaca ggtcttgtag cttcaatgag catggctacc acctcttcca ggctatgcgg    240

cttggggttg aggagataaa caactccacg gccctgctgc ccaacatcac cctggggtac    300

cagctgtatg atgtgtgttc tgactctgcc aatgtgtatg ccacgctgag agtgctctcc    360

ctgccagggc aacaccacat agagctccaa ggagaccttc tccactattc ccctacggtg    420

ctggcagtga ttgggcctga cagcaccaac cgtgctgcca ccacagccgc cctgctgagc    480

cctttcctgg tgcccatgat tagctatgcg gccagcagcg agacgctcag cgtgaagcgg    540

cagtatccct ctttcctgcg caccatcccc aatgacaagt accaggtgga gaccatggtg    600

ctgctgctgc agaagttcgg gtggacctgg atctctctgg ttggcagcag tgacgactat    660

gggcagctag gggtgcaggc actggagaac caggccactg gtcaggggat ctgcattgct    720

ttcaaggaca tcatgccctt ctctgcccag gtgggcgatg agaggatgca gtgcctcatg    780

cgccacctgg cccaggccgg ggccaccgtc gtggttgttt tttccagccg gcagttggcc    840

agggtgtttt tcgagtccgt ggtgctgacc aacctgactg gcaaggtgtg ggtcgcctca    900

gaagcctggg ccctctccag gcacatcact ggggtgcccg ggatccagcg cattgggatg    960

gtgctgggcg tggccatcca gaagagggct gtccctggcc tgaaggcgtt tgaagaagcc    1020

tatgcccggg cagacaagaa ggcccctagg ccttgccaca agggctcctg gtgcagcagc    1080

aatcagctct gcagagaatg ccaagctttc atggcacaca cgatgcccaa gctcaaagcc    1140

ttctccatga gttctgccta caacgcatac cgggctgtgt atgcggtggc ccatggcctc    1200

caccagctcc tgggctgtgc ctctggagct tgttccaggg gccgagtcta cccctggcag    1260

cttttggagc agatccacaa ggtgcatttc cttctacaca aggacactgt ggcgtttaat    1320

gacaacagag atcccctcag tagctataac ataattgcct gggactggaa tggacccaag    1380

tggaccttca cggtcctcgg ttcctccaca tggtctccag ttcagctaaa cataaatgag    1440

accaaaatcc agtggcacgg aaaggacaac caggtgccta agtctgtgtg ttccagcgac    1500

tgtcttgaag ggcaccagcg agtggttacg ggtttccatc actgctgctt tgagtgtgtg    1560

ccctgtgggg ctgggacctt cctcaacaag agtgacctct acagatgcca gccttgtggg    1620

aaagaagagt gggcacctga gggaagccag acctgcttcc cgcgcactgt ggtgtttttg    1680

gctttgcgtg agcacacctc ttgggtgctg ctggcagcta acacgctgct gctgctgctg    1740

ctgcttggga ctgctggcct gtttgcctgg cacctagaca cccctgtggt gaggtcagca    1800

gggggccgcc tgtgctttct tatgctgggc tccctggcag caggtagtgg cagcctctat    1860

ggcttctttg gggaacccac aaggcctgcg tgcttgctac gccaggccct ctttgccctt    1920

ggtttcacca tcttcctgtc ctgcctgaca gttcgctcat tccaactaat catcatcttc    1980

aagttttcca ccaaggtacc tacattctac cacgcctggg tccaaaacca cggtgctggc    2040

ctgtttgtga tgatcagctc agcggcccag ctgcttatct gtctaacttg gctggtggtg    2100

tggaccccac tgcctgctag ggaataccag cgcttccccc atctggtgat gcttgagtgc    2160

acagagacca actccctggg cttcatactg gccttcctct acaatggcct cctctccatc    2220

agtgcctttg cctgcagcta cctgggtaag gacttgccag agaactacaa cgaggccaaa    2280

tgtgtcacct tcagcctgct cttcaacttc gtgtcctgga tcgccttctt caccacggcc    2340

agcgtctacg acggcaagta cctgcctgcg gccaacatga tggctgggct gagcagcctg    2400

agcagcggct tcggtgggta ttttctgcct aagtgctacg tgatcctctg ccgcccagac    2460

ctcaacagca cagagcactt ccaggcctcc attcaggact acacgaggcg ctgcggctcc    2520

acctga                                                               2526

<210>9

<211>2559

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>9

atgctgggcc ctgctgtcct gggcctcagc ctctgggctc tcctgcaccc tgggacgggg    60

gccccattgt gcctgtcaca gcaacttagg atgaaggggg actacgtgct gggggggctg    120

ttccccctgg gcgaggccga ggaggctggc ctccgcagcc ggacacggcc cagcagccct    180

gtgtgcacca ggttctcctc aaacggcctg ctctgggcac tggccatgaa aatggccgtg    240

gaggagatca acaacaagtc ggatctgctg cccgggctgc gcctgggcta cgacctcttt    300

gatacgtgct cggagcctgt ggtggccatg aagcccagcc tcatgttcct ggccaaggca    360

ggcagccgcg acatcgccgc ctactgcaac tacacgcagt accagccccg tgtgctggct    420

gtcatcgggc cccactcgtc agagctcgcc atggtcaccg gcaagttctt cagcttcttc    480

ctcatgcccc aggtcagcta cggtgctagc atggagctgc tgagcgcccg ggagaccttc    540

ccctccttct tccgcaccgt gcccagcgac cgtgtgcagc tgacggccgc cgcggagctg    600

ctgcaggagt tcggctggaa ctgggtggcc gccctgggca gcgacgacga gtacggccgg    660

cagggcctga gcatcttctc ggccctggcc gcggcacgcg gcatctgcat cgcgcacgag    720

ggcctggtgc cgctgccccg tgccgatgac tcgcggctgg ggaaggtgca ggacgtcctg    780

caccaggtga accagagcag cgtgcaggtg gtgctgctgt tcgcctccgt gcacgccgcc    840

cacgccctct tcaactacag catcagcagc aggctctcgc ccaaggtgtg ggtggccagc    900

gaggcctggc tgacctctga cctggtcatg gggctgcccg gcatggccca gatgggcacg    960

gtgcttggct tcctccagag gggtgcccag ctgcacgagt tcccccagta cgtgaagacg    1020

cacctggccc tggccaccga cccggccttc tgctctgccc tgggcgagag ggagcagggt    1080

ctggaggagg acgtggtggg ccagcgctgc ccgcagtgtg actgcatcac gctgcagaac    1140

gtgagcgcag ggctaaatca ccaccagacg ttctctgtct acgcagctgt gtatagcgtg    1200

gcccaggccc tgcacaacac tcttcagtgc aacgcctcag gctgccccgc gcaggacccc    1260

gtgaagccct ggcagctcct ggagaacatg tacaacctga ccttccacgt gggcgggctg    1320

ccgctgcggt tcgacagcag cggaaacgtg gacatggagt acgacctgaa gctgtgggtg    1380

tggcagggct cagtgcccag gctccacgac gtgggcaggt tcaacggcag cctcaggaca    1440

gagcgcctga agatccgctg gcacacgtct gacaaccaga agcccgtgtc ccggtgctcg    1500

cggcagtgcc aggagggcca ggtgcgccgg gtcaaggggt tccactcctg ctgctacgac    1560

tgtgtggact gcgaggcggg cagctaccgg caaaacccag acgacatcgc ctgcaccttt    1620

tgtggccagg atgagtggtc cccggagcga agcacacgct gcttccgccg caggtctcgg    1680

ttcctggcat ggggcgagcc ggctgtgctg ctgctgctcc tgctgctgag cctggcgctg    1740

ggccttgtgc tggctgcttt ggggctgttc gttcaccatc gggacagccc actggttcag    1800

gcctcggggg ggcccctggc ctgctttggc ctggtgtgcc tgggcctggt ctgcctcagc    1860

gtcctcctgt tccctggcca gcccagccct gcccgatgcc tggcccagca gcccttgtcc    1920

cacctcccgc tcacgggctg cctgagcaca ctcttcctgc aggcggccga gatcttcgtg    1980

gagtcagaac tgcctctgag ctgggcagac cggctgagtg gctgcctgcg ggggccctgg    2040

gcctggctgg tggtgctgct ggccatgctg gtggaggtcg cactgtgcac ctggtacctg    2100

gtggccttcc cgccggaggt ggtgacggac tggcacatgc tgcccacgga ggcgctggtg    2160

cactgccgca cacgctcctg ggtcagcttc ggcctagcgc acgccaccaa tgccacgctg    2220

gcctttctct gcttcctggg cactttcctg gtgcggagcc agccgggctg ctacaaccgt    2280

gcccgtggcc tcacctttgc catgctggcc tacttcatca cctgggtctc ctttgtgccc    2340

ctcctggcca atgtgcaggt ggtcctcagg cccgccgtgc agatgggcgc cctcctgctc    2400

tgtgtcctgg gcatcctggc tgccttccac ctgcccaggt gttacctgct catgcggcag    2460

ccagggctca acacccccga gttcttcctg ggagggggcc ctggggatgc ccaaggccag    2520

aatgacggga acacaggaaa tcaggggaaa catgagtga                           2559

<210>10

<211>2518

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>10

atggggccca gggcaaagac catctgctcc ctgttcttcc tcctatgggt cctggctgag    60

ccggctgaga actcggactt ctacctgcct ggggattacc tcctgggtgg cctcttctcc    120

ctccatgcca acatgaaggg cattgttcac cttaacttcc tgcaggtgcc catgtgcaag    180

gagtatgaag tgaaggtgat aggctacaac ctcatgcagg ccatgcgctt cgcggtggag    240

gagatcaaca atgacagcag cctgctgcct ggtgtgctgc tgggctatga gatcgtggat    300

gtgtgctaca tctccaacaa tgtccagccg gtgctctact tcctggcaca cgaggacaac    360

ctccttccca tccaagagga ctacagtaac tacatttccc gtgtggtggc tgtcattggc    420

cctgacaact ccgagtctgt catgactgtg gccaattcct ctccctattt ctccttccac    480

agatcaccta cagcgccatc agcgatgagc tgcgagacaa ggtgcgcttc ccggctttgc    540

tgcgtaccac acccagcgcc gaccaccacg tcgaggccat ggtgcagctg atgctgcact    600

tccgctggaa ctggatcatt gtgctggtga gcagcgacac ctatggccgc gacaatggca    660

gctgcttggc gagcgcgtgg cccggcgcga catctgcatc gccttccagg agacgctgcc    720

cacactgcag cccaaccaga acatgacgtc agaggagcgc cagcgcctgg tgaccattgt    780

ggacaagctg cagcagagca cagcgcgcgt cgtggtcgtg ttctcgcccg acctgaccct    840

gtaccacttc ttcaatgagg tgctgcgcca gaacttcacg ggcgccgtgt ggatcgcctc    900

cgagtcctgg gccatcgacc cggtcctgca caacctcacg gagctgggcc acttgggcac    960

cttcctgggc atcaccatcc agagcgtgcc catcccgggc ttcagtgagt tccgcgagtg    1020

gggcccacag gctgggccgc cacccctcag caggaccagc cagagctata cctgcaacca    1080

ggagtgcgac aactgcctga acgccacctt gtccttcaac accattctca ggctctctgg    1140

ggagcgtgtc gtctacagcg tgtactctgc ggtctatgct gtggcccatg ccctgcacag    1200

cctcctcggc tgtgacaaaa gcacctgcac caagagggtg gtctacccct ggcagctgct    1260

tgaggagatc tggaaggtca acttcactct cctggaccac caaatcttct tcgacccgca    1320

aggggacgtg gctctgcact tggagattgt ccagtggcaa tgggaccgga gccagaatcc    1380

cttccagagc gtcgcctcct actaccccct gcagcgacag ctgaagaaca tccaagacat    1440

ctcctggcac accgtcaaca acacgatccc tatgtccatg tgttccaaga ggtgccagtc    1500

agggcaaaag aagaagcctg tgggcatcca cgtctgctgc ttcgagtgca tcgactgcct    1560

tcccggcacc ttcctcaacc acactgaaga tgaatatgaa tgccaggcct gcccgaataa    1620

cgagtggtcc taccagagtg agacctcctg cttcaagcgg cagctggtct tcctggaatg    1680

gcatgaggca cccaccatcg ctgtggccct gctggccgcc ctgggcttcc tcagcaccct    1740

ggccatcctg gtgatattct ggaggcactt ccagacaccc atagttcgct cggctggggg    1800

ccccatgtgc ttcctgatgc tgacactgct gctggtggca tacatggtgg tcccggtgta    1860

cgtggggccg cccaaggtct ccacctgcct ctgccgccag gccctctttc ccctctgctt    1920

cacaatttgc atctcctgta tcgccgtgcg ttctttccag atcgtctgcg ccttcaagat    1980

ggccagccgc ttcccacgcg cctacagcta ctgggtccgc taccaggggc cctacgtctc    2040

tatggcattt atcacggtac tcaaaatggt cattgtggta attggcatgc tggccacggg    2100

cctcagtccc accacccgta ctgaccccga tgaccccaag atcacaattg tctcctgtaa    2160

ccccaactac cgcaacagcc tgctgttcaa caccagcctg gacctgctgc tctcagtggt    2220

gggtttcagc ttcgcctaca tgggcaaaga gctgcccacc aactacaacg aggccaagtt    2280

catcaccctc agcatgacct tctatttcac ctcatccgtc tccctctgca ccttcatgtc    2340

tgcctacagc ggggtgctgg tcaccatcgt ggacctcttg gtcactgtgc tcaacctcct    2400

ggccatcagc ctgggctact tcggccccaa gtgctacatg atcctcttct acccggagcg    2460

caacacgccc gcctacttca acagcatgat ccagggctac accatgagga gggactag      2518

<210>11

<211>2577

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>11

atgccgggtt tggctatctt gggcctcagt ctggctgctt tcctggagct tgggatgggg    60

tcctctttgt gtctgtcaca gcaattcaag gcacaagggg actatatatt gggtggacta    120

tttcccctgg gcacaactga ggaggccact ctcaaccaga gaacacagcc caacggcatc    180

ctatgtacca ggttctcgcc ccttggtttg ttcctggcca tggctatgaa gatggctgta    240

gaggagatca acaatggatc tgccttgctc cctgggctgc gactgggcta tgacctgttt    300

gacacatgct cagagccagt ggtcaccatg aagcccagcc tcatgttcat ggccaaggtg    360

ggaagtcaaa gcattgctgc ctactgcaac tacacacagt accaaccccg tgtgctggct    420

gtcattggtc cccactcatc agagcttgcc ctcattacag gcaagttctt cagcttcttc    480

ctcatgccac aggtcagcta tagtgccagc atggatcggc taagtgaccg ggaaacattt    540

ccatccttct tccgcacagt gcccagtgac cgggtgcagc tgcaggccgt tgtgacactg    600

ttgcagaatt tcagctggaa ctgggtggct gccttaggta gtgatgatga ctatggccgg    660

gaaggtctga gcatcttttc tggtctggcc aactcacgag gtatctgcat tgcacacgag    720

ggcctggtgc cacaacatga cactagtggc caacaattgg gcaaggtggt ggatgtgcta    780

cgccaagtga accaaagcaa agtacaggtg gtggtgctgt ttgcatctgc ccgtgctgtc    840

tactcccttt ttagctacag catccttcat gacctctcac ccaaggtatg ggtggccagt    900

gagtcctggc tgacctctga cctggtcatg acacttccca atattgcccg tgtgggcact    960

gttcttgggt ttctgcagcg cggtgcccta ctgcctgaat tttcccatta tgtggagact    1020

cgccttgccc tagctgctga cccaacattc tgtgcctccc tgaaagctga gttggatctg    1080

gaggagcgcg tgatggggcc acgctgttca caatgtgact acatcatgct acagaacctg    1140

tcatctgggc tgatgcagaa cctatcagct gggcagttgc accaccaaat atttgcaacc    1200

tatgcagctg tgtacagtgt ggctcaggcc cttcacaaca ccctgcagtg caatgtctca    1260

cattgccaca catcagagcc tgttcaaccc tggcagctcc tggagaacat gtacaatatg    1320

agtttccgtg ctcgagactt gacactgcag tttgatgcca aagggagtgt agacatggaa    1380

tatgacctga agatgtgggt gtggcagagc cctacacctg tactacatac tgtaggcacc    1440

ttcaacggca cccttcagct gcagcactcg aaaatgtatt ggccaggcaa ccaggtgcca    1500

gtctcccagt gctcccggca gtgcaaagat ggccaggtgc gcagagtaaa gggctttcat    1560

tcctgctgct atgactgtgt ggactgcaag gcagggagct accggaagca tccagatgac    1620

ttcacctgta ctccatgtgg caaggatcag tggtccccag aaaaaagcac aacctgctta    1680

cctcgcaggc ccaagtttct ggcttggggg gagccagctg tgctgtcact tctcctgctg    1740

ctttgcctgg tgctgggcct gacactggct gccctggggc tctttgtcca ctactgggac    1800

agccctcttg ttcaggcctc aggtgggtca ctgttctgct ttggcctgat ctgcctaggc    1860

ctcttctgcc tcagtgtcct tctgttccca ggacgaccac gctctgccag ctgccttgcc    1920

caacaaccaa tggctcacct ccctctcaca ggctgcctga gcacactctt cctgcaagca    1980

gccgagatct ttgtggagtc tgagctgcca ctgagttggg caaactggct ctgcagctac    2040

cttcggggcc cctgggcttg gctggtggta ctgctggcca ctcttgtgga ggctgcacta    2100

tgtgcctggt acttgatggc tttccctcca gaggtggtga cagattggca ggtgctgccc    2160

acggaggtac tggaacactg ccgcatgcgt tcctgggtca gcctgggctt ggtgcacatc    2220

accaatgcag tgttagcttt cctctgcttt ctgggcactt tcctggtaca gagccagcct    2280

ggtcgctata accgtgcccg tggcctcacc ttcgccatgc tagcttattt catcatctgg    2340

gtctcttttg tgcccctcct ggctaatgtg caggtggcct accagccagc tgtgcagatg    2400

ggtgctatct tattctgtgc cctgggcatc ctggccacct tccacctgcc caaatgctat    2460

gtacttctgt ggctgccaga gctcaacacc caggagttct tcctgggaag gagccccaag    2520

gaagcatcag atgggaatag tggtagtagt gaggcaactc ggggacacag tgaatga       2577

<210>12

<211>137

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>12

Pro Ser Pro Phe Arg Asp Ile Val Ser Tyr Pro Asp Lys Ile Ile Leu

 1               5                  10                  15

Gly Cys Phe Met Asn Leu Lys Thr Ser Ser Val Ser Phe Val Leu Leu

            20                  25                  30

Leu Leu Leu Cys Leu Leu Cys Phe Ile Phe Ser Tyr Met Gly Lys Asp

        35                  40                  45

Leu Pro Lys Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Ala Ile Thr Phe Cys Leu Leu

    50                  55                  60

Leu Leu Ile Leu Thr Trp Ile Ile Phe Thr Thr Ala Ser Leu Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Gln Gly Lys Tyr Ile His Ser Leu Asn Ala Leu Ala Val Leu Ser Ser

                85                  90                  95

Ile Tyr Ser Phe Leu Leu Trp Tyr Phe Leu Pro Lys Cys Tyr Ile Ile

            100                 105                 110

Ile Phe Gln Pro Gln Lys Asn Thr Gln Lys Tyr Phe Gln Gly Leu Ile

        115                 120                 125

Gln Asp Tyr Thr Lys Thr Ile Ser Gln

    130                 135

<210>13

<211>242

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>13

Phe Ala Val Asn Tyr Asn Thr Pro Val Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro

 1               5                  10                  15

Met Cys Phe Leu Ile Leu Gly Cys Leu Ser Leu Cys Ser Ile Ser Val

            20                  25                  30

Phe Phe Tyr Phe Glu Arg Pro Thr Glu Ala Phe Cys Ile Leu Arg Phe

        35                  40                  45

Met Pro Phe Leu Leu Phe Tyr Ala Val Cys Leu Ala Cys Phe Ala Val

    50                  55                  60

Arg Ser Phe Gln Ile Val Ile Ile Phe Lys Ile Ala Ala Lys Phe Pro

65                  70                  75                  80

Arg Val His Ser Trp Trp Met Lys Tyr His Gly Gln Trp Leu Val Ile

                85                  90                  95

Ser Met Thr Phe Val Leu Gln Ala Val Val Ile Val Ile Gly Phe Ser

            100                 105                 110

Ser Asn Pro Pro Leu Pro Tyr Xaa Xaa Phe Val Ser Tyr Pro Asp Lys

        115                 120                 125

Ile Ile Leu Gly Cys Asp Val Asn Leu Asn Met Ala Ser Thr Ser Phe

    130                 135                 140

Phe Leu Leu Leu Leu Leu Cys Ile Leu Cys Phe Thr Phe Ser Tyr Met

145                 150                 155                 160

Gly Lys Asp Leu Pro Lys Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Ala Ile Thr Phe

                165                 170                 175

Cys Leu Leu Leu Leu Ile Leu Thr Trp Ile Ile Phe Ala Thr Ala Phe

            180                 185                 190

Met Leu Tyr His Gly Lys Tyr Ile His Thr Leu Asn Ala Leu Ala Val

        195                 200                 205

Leu Ser Ser Ala Tyr Cys Phe Leu Leu Trp Tyr Phe Leu Pro Lys Cys

    210                 215                 220

Tyr Ile Ile Ile Phe Gln Pro His Lys Asn Thr Gln Lys Tyr Phe Gln

225                 230                 235                 240

Leu Ser

<210>14

<211>165

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>14

Lys Lys Gln Gly Pro Glu Val Asp Ile Phe Ile Val Ser Val Thr Ile

 1               5                  10                  15

Leu Cys Ile Ser Val Leu Gly Val Ala Val Gly Pro Pro Glu Pro Ser

            20                  25                  30

Gln Asp Leu Asp Phe Tyr Met Asp Ser Ile Val Leu Glu Cys Ser Asn

        35                  40                  45

Thr Leu Ser Pro Gly Ser Phe Ile Glu Leu Cys Tyr Val Cys Val Leu

    50                  55                  60

Ser Val Leu Cys Phe Phe Phe Ser Tyr Met Gly Lys Asp Leu Pro Ala

65                  70                  75                  80

Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Cys Val Thr Phe Ser Leu Met Val Tyr Met

                85                  90                  95

Ile Ser Trp Ile Ser Phe Phe Thr Val Tyr Leu Ile Ser Arg Gly Pro

            100                 105                 110

Phe Thr Val Ala Ala Tyr Val Cys Ala Thr Leu Val Ser Val Leu Ala

        115                 120                 125

Phe Phe Gly Gly Tyr Phe Leu Pro Lys Ile Tyr Ile Ile Val Leu Lys

    130                 135                 140

Pro Gln Met Asn Thr Thr Ala His Phe Gln Asn Cys Ile Gln Met Tyr

145                 150                 155                 160

Thr Met Ser Lys Gln

                165

<210>15

<211>236

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>15

Ala Pro Lys Ser Ser Gln Arg Xaa Leu Arg Arg Thr Arg Leu Xaa Leu

 1               5                  10                  15

Glu Trp Asp His Pro Met Ser Val Ala Leu Leu Phe Phe Leu Val Cys

            20                  25                  30

Cys Leu Leu Met Thr Ser Ser Ser Ala Val Ile Leu Leu Leu Asn Ile

        35                  40                  45

Asn Thr Pro Val Ala Lys Ser Ala Gly Gly Xaa Thr Cys Xaa Leu Lys

    50                  55                  60

Leu Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ala Met Ser Ser Xaa Cys His Phe Gly

65                  70                  75                  80

Gln Pro Ser Pro Leu Ala Ser Lys Leu Lys Gln Pro Gln Phe Thr Phe

                85                  90                  95

Ser Phe Thr Val Cys Leu Ala Cys Asn Arg Cys Ala Leu Ala Thr Gly

            100                 105                 110

His Leu His Phe Xaa Ile Arg Val Ala Leu Pro Pro Ala Tyr Asn Xaa

        115                 120                 125

Trp Ala Lys Asn His Gly Pro Xaa Ala Thr Ile Phe Ile Ala Ser Ala

    130                 135                 140

Ala Ile Leu Cys Val Leu Cys Leu Arg Val Ala Val Gly Pro Pro Gln

145                 150                 155                 160

Pro Ser Gln Asx Leu Asx Phe Xaa Thr Asn Ser Ile Xaa Leu Xaa Xaa

                165                 170                 175

Ser Asn Thr Leu Ser Pro Gly Ser Phe Val Glu Leu Cys Asn Val Ser

            180                 185                 190

Leu Leu Ser Ala Val Cys Phe Val Phe Ser Xaa Met Gly Lys Asx Leu

        195                 200                 205

Pro Ala Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Cys Val Thr Phe Ser Leu Met Val

    210                 215                 220

Asn Xaa Ile Ser Trp Ile Ser Phe Phe Thr Val Tyr

225                 230                 235

<210>16

<211>838

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>16

Met Gly Pro Arg Ala Lys Thr Ile Cys Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp

 1               5                  10                  15

Val Leu Ala Glu Pro Ala Glu Asn Ser Asp Phe Tyr Leu Pro Gly Asp

            20                  25                  30

Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Leu His Ala Asn Met Lys Gly Ile

        35                  40                  45

Val His Leu Asn Phe Leu Gln Val Pro Met Cys Lys Glu Tyr Glu Val

    50                  55                  60

Lys Val Ile Gly Tyr Asn Leu Met Gln Ala Met Arg Phe Ala Val Glu

65                  70                  75                  80

Glu Ile Asn Asn Asp Ser Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu Leu Gly Tyr

                85                  90                  95

Glu Ile Val Asp Val Cys Tyr Ile Ser Asn Asn Val Gln Pro Val Leu

            100                 105                 110

Tyr Phe Leu Ala His Glu Asp Asn Leu Leu Pro Ile Gln Glu Asp Tyr

        115                 120                 125

Ser Asn Tyr Ile Ser Arg Val Val Ala Val Ile Gly Pro Asp Asn Ser

    130                 135                 140

Glu Ser Val Met Thr Val Ala Asn Phe Leu Ser Leu Phe Leu Leu Pro

145                 150                 155                 160

Gln Ile Thr Tyr Ser Ala Ile Ser Asp Glu Leu Arg Asp Lys Val Arg

                165                 170                 175

Phe Pro Ala Leu Leu Arg Thr Thr Pro Ser Ala Asp His His Val Glu

            180                 185                 190

Ala Met Val Gln Leu Met Leu His Phe Arg Trp Asn Trp Ile Ile Val

        195                 200                 205

Leu Val Ser Ser Asp Thr Tyr Gly Arg Asp Asn Gly Gln Leu Leu Gly

    210                 215                 220

Glu Arg Val Ala Arg Arg Asp Ile Cys Ile Ala Phe Gln Glu Thr Leu

225                 230                 235                 240

Pro Thr Leu Gln Pro Asn Gln Asn Met Thr Ser Glu Glu Arg Gln Arg

                245                 250                 255

Leu Val Thr Ile Val Asp Lys Leu Gln Gln Ser Thr Ala Arg Val Val

            260                 265                 270

Val Val Phe Ser Pro Asp Leu Thr Leu Tyr His Phe Phe Asn Glu Val

        275                 280                 285

Leu Arg Gln Asn Phe Thr Gly Ala Val Trp Ile Ala Ser Glu Ser Trp

    290                 295                 300

Ala Ile Asp Pro Val Leu His Asn Leu Thr Glu Leu Gly His Leu Gly

305                 310                 315                 320

Thr Phe Leu Gly Ile Thr Ile Gln Ser Val Pro Ile Pro Gly Phe Ser

                325                 330                 335

Glu Phe Arg Glu Trp Gly Pro Gln Ala Gly Pro Pro Pro Leu Ser Arg

            340                 345                 350

Thr Ser Gln Ser Tyr Thr Cys Asn Gln Glu Cys Asp Asn Cys Leu Asn

        355                 360                 365

Ala Thr Leu Ser Phe Asn Thr Ile Leu Arg Leu Ser Gly Glu Arg Val

    370                 375                 380

Val Tyr Ser Val Tyr Ser Ala Val Tyr Ala Val Ala His Ala Leu His

385                 390                 395                 400

Ser Leu Leu Gly Cys Asp Lys Ser Thr Cys Thr Lys Arg Val Val Tyr

                405                 410                 415

Pro Trp Gln Leu Leu Glu Glu Ile Trp Lys Val Asn Phe Thr Leu Leu

            420                 425                 430

Asp His Gln Ile Phe Phe Asp Pro Gln Gly Asp Val Ala Leu His Leu

        435                 440                 445

Glu Ile Val Gln Trp Gln Trp Asp Arg Ser Gln Asn Pro Phe Gln Ser

    450                 455                 460

Val Ala Ser Tyr Tyr Pro Leu Gln Arg Gln Leu Lys Asn Ile Gln Asp

465                 470                 475                 480

Ile Ser Trp His Thr Val Asn Asn Thr Ile Pro Met Ser Met Cys Ser

                485                 490                 495

Lys Arg Cys Gln Ser Gly Gln Lys Lys Lys Pro Val Gly Ile His Val

            500                 505                 510

Cys Cys Phe Glu Cys Ile Asp Cys Leu Pro Gly Thr Phe Leu Asn His

        515                 520                 525

Thr Glu Asp Glu Tyr Glu Cys Gln Ala Cys Pro Asn Asn Glu Trp Ser

    530                 535                 540

Tyr Gln Ser Glu Thr Ser Cys Phe Lys Arg Gln Leu Val Phe Leu Glu

545                 550                 555                 560

His Glu Val Pro Thr Ile Val Val Ala Ile Leu Ala Ala Leu Gly Phe

                565                 570                 575

Phe Ser Thr Leu Ala Ile Leu Phe Ile Phe Trp Arg His Phe Gln Thr

            580                 585                 590

Pro Met Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met Leu Val

        595                 600                 605

Pro Leu Leu Leu Ala Phe Gly Met Val Pro Val Tyr Val Gly Pro Pro

    610                 615                 620

Thr Val Phe Ser Cys Phe Cys Arg Gln Ala Phe Phe Thr Val Cys Phe

625                 630                 635                 640

Ser Ile Cys Leu Ser Cys Ile Thr Val Arg Ser Phe Gln Ile Val Cys

                645                 650                 655

Val Phe Lys Met Ala Arg Arg Leu Pro Ser Ala Tyr Ser Phe Trp Met

            660                 665                 670

Arg Tyr His Gly Pro Tyr Val Phe Val Ala Phe Ile Thr Ala Ile Lys

        675                 680                 685

Val Ala Leu Val Val Gly Asn Met Leu Ala Thr Thr Ile Asn Pro Ile

    690                 695                 700

Gly Arg Thr Asp Pro Asp Asp Pro Asn Ile Met Ile Leu Ser Cys His

705                 710                 715                 720

Pro Asn Tyr Arg Asn Gly Leu Leu Phe Asn Thr Ser Met Asp Leu Leu

                725                 730                 735

Leu Ser Val Leu Gly Phe Ser Phe Ala Tyr Met Gly Lys Glu Leu Pro

            740                 745                 750

Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr Leu Ser Met Thr Phe Ser

        755                 760                 765

Phe Thr Ser Ser Ile Ser Leu Cys Thr Phe Met Ser Val His Asp Gly

    770                 775                 780

Val Leu Val Thr Ile Met Asp Leu Leu Val Thr Val Leu Asn Phe Leu

785                 790                 795                 800

Ala Ile Gly Leu Gly Tyr Phe Gly Pro Lys Cys Tyr Met Ile Leu Phe

                805                 810                 815

Tyr Pro Glu Arg Asn Thr Ser Ala Tyr Phe Asn Ser Met Ile Gln Gly

            820                 825                 830

Tyr Thr Met Arg Lys Ser

        835

<210>17

<211>844

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>17

Met Gly Pro Gln Ala Arg Thr Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Leu His

 1               5                  10                  15

Val Leu Pro Lys Pro Gly Lys Leu Val Glu Asn Ser Asp Phe His Leu

            20                  25                  30

Ala Gly Asp Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Thr Leu His Ala Asn Val

        35                  40                  45

Lys Ser Ile Ser His Leu Ser Tyr Leu Gln Val Pro Lys Cys Asn Glu

    50                  55                  60

Phe Thr Met Lys Val Leu Gly Tyr Asn Leu Met Gln Ala Met Arg Phe

65                  70                  75                  80

Ala Val Glu Glu Ile Asn Asn Cys Ser Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu

                85                  90                  95

Leu Gly Tyr Glu Met Val Asp Val Cys Tyr Leu Ser Asn Asn Ile His

            100                 105                 110

Pro Gly Leu Tyr Phe Leu Ala Gln Asp Asp Asp Leu Leu Pro Ile Leu

        115                 120                 125

Lys Asp Tyr Ser Gln Tyr Met Pro His Val Val Ala Val Ile Gly Pro

    130                 135                 140

Asp Asn Ser Glu Ser Ala Ile Thr Val Ser Asn Ile Leu Ser His Phe

145                 150                 155                 160

Leu Ile Pro Gln Ile Thr Tyr Ser Ala Ile Ser Asp Lys Leu Arg Asp

                165                 170                 175

Lys Arg His Phe Pro Ser Met Leu Arg Thr Val Pro Ser Ala Thr His

            180                 185                 190

His Ile Glu Ala Met Val Gln Leu Met Val His Phe Gln Trp Asn Trp

        195                 200                 205

Ile Val Val Leu Val Ser Asp Asp Asp Tyr Gly Arg Glu Asn Ser His

    210                 215                 220

Leu Leu Ser Gln Arg Leu Thr Lys Thr Ser Asp Ile Cys Ile Ala Phe

225                 230                 235                 240

Gln Glu Val Leu Pro Ile Pro Glu Ser Ser Gln Val Met Arg Ser Glu

                245                 250                 255

Glu Gln Arg Gln Leu Asp Asn Ile Leu Asp Lys Leu Arg Arg Thr Ser

            260                 265                 270

Ala Arg Val Val Val Val Phe Ser Pro Glu Leu Ser Leu Tyr Ser Phe

        275                 280                 285

Phe His Glu Val Leu Arg Trp Asn Phe Thr Gly Phe Val Trp Ile Ala

    290                 295                 300

Ser Glu Ser Trp Ala Ile Asp Pro Val Leu His Asn Leu Thr Glu Leu

305                 310                 315                 320

Arg His Thr Gly Thr Phe Leu Gly Val Thr Ile Gln Arg Val Ser Ile

                325                 330                 335

Pro Gly Phe Ser Gln Phe Arg Val Arg Arg Asp Lys Pro Gly Tyr Pro

            340                 345                 350

Val Pro Asn Thr Thr Asn Leu Arg Thr Thr Cys Asn Gln Asp Cys Asp

        355                 360                 365

Ala Cys Leu Asn Thr Thr Lys Ser Phe Asn Asn Ile Leu Ile Leu Ser

    370                 375                 380

Gly Glu Arg Val Val Tyr Ser Val Tyr Ser Ala Val Tyr Ala Val Ala

385                 390                 395                 400

His Ala Leu His Arg Leu Leu Gly Cys Asn Arg Val Arg Cys Thr Lys

                405                 410                 415

Gln Lys Val Tyr Pro Trp Gln Leu Leu Arg Glu Ile Trp His Val Asn

            420                 425                 430

Phe Thr Leu Leu Gly Asn Arg Leu Phe Phe Asp Gln Gln Gly Asp Met

        435                 440                 445

Pro Met Leu Leu Asp Ile Ile Gln Trp Gln Trp Asp Leu Ser Gln Asn

    450                 455                 460

Pro Phe Gln Ser Ile Ala Ser Tyr Ser Pro Thr Ser Lys Arg Leu Thr

465                 470                 475                 480

Tyr Ile Asn Asn Val Ser Trp Tyr Thr Pro Asn Asn Thr Val Pro Val

                485                 490                 495

Ser Met Cys Ser Lys Ser Cys Gln Pro Gly Gln Met Lys Lys Ser Val

            500                 505                 510

Gly Leu His Pro Cys Cys Phe Glu Cys Leu Asp Cys Met Pro Gly Thr

        515                 520                 525

Tyr Leu Asn Arg Ser Ala Asp Glu Phe Asn Cys Leu Ser Cys Pro Gly

    530                 535                 540

Ser Met Trp Ser Tyr Lys Asn Asp Ile Thr Cys Phe Gln Arg Arg Pro

545                 550                 555                 560

Thr Phe Leu Glu Trp Trp His Glu Ala Pro Thr Ile Ala Val Ala Leu

                565                 570                 575

Leu Ala Ala Leu Gly Phe Leu Ser Thr Leu Ala Ile Leu Val Ile Phe

            580                 585                 590

Trp Arg His Phe Gln Thr Pro Ile Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met

        595                 600                 605

Cys Phe Leu Met Leu Thr Leu Leu Leu Val Ala Tyr Met Val Val Pro

    610                 615                 620

Val Tyr Val Gly Pro Pro Lys Val Ser Thr Cys Leu Cys Arg Gln Ala

625                 630                 635                 640

Leu Phe Pro Leu Cys Phe Thr Ile Cys Ile Ser Cys Ile Ala Val Arg

                645                 650                 655

Ser Phe Gln Ile Val Cys Ala Phe Lys Met Ala Ser Arg Phe Pro Arg

            660                 665                 670

Ala Tyr Ser Tyr Trp Val Arg Tyr Gln Gly Pro Tyr Val Ser Met Ala

        675                 680                 685

Phe Ile Thr Val Leu Lys Met Val Ile Val Val Ile Gly Met Leu Ala

    690                 695                 700

Thr Gly Leu Ser Pro Thr Thr Arg Thr Asp Pro Asp Asp Pro Lys Ile

705                 710                 715                 720

Thr Ile Val Ser Cys Asn Pro Asn Tyr Arg Asn Ser Leu Leu Phe Asn

                725                 730                 735

Thr Ser Leu Asp Leu Leu Leu Ser Val Val Gly Phe Ser Phe Ala Tyr

            740                 745                 750

Met Gly Lys Glu Leu Pro Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr

        755                 760                 765

Leu Ser Met Thr Phe Tyr Phe Thr Ser Ser Val Ser Leu Cys Thr Phe

    770                 775                 780

Met Ser Ala Tyr Ser Gly Val Leu Val Thr Ile Val Asp Leu Leu Val

785                 790                 795                 800

Thr Val Leu Asn Leu Leu Ala Ile Ser Leu Gly Tyr Phe Gly Pro Lys

                805                 810                 815

Cys Tyr Met Ile Leu Phe Tyr Pro Glu Arg Asn Thr Pro Ala Tyr Phe

            820                 825                 830

Asn Ser Met Ile Gln Gly Tyr Thr Met Arg Arg Asp

        835                 840

<210>18

<211>855

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>18

Met Leu Gly Pro Ala Val Leu Gly Leu Ser Leu Trp Ala Leu Leu His

 1               5                  10                  15

Pro Gly Thr Gly Ala Pro Leu Cys Leu Ser Gln Gln Leu Arg Met Lys

            20                  25                  30

Gly Asp Tyr Val Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Glu Ala Glu Glu

        35                  40                  45

Ala Gly Leu Arg Ser Arg Thr Arg Pro Ser Ser Pro Val Cys Thr Arg

    50                  55                  60

Phe Ser Ser Asn Gly Leu Leu Trp Ala Leu Ala Met Lys Met Ala Val

65                  70                  75                  80

Glu Glu Ile Asn Asn Lys Ser Asp Leu Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly

                85                  90                  95

Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Cys Ser Glu Pro Val Val Ala Met Lys Pro

            100                 105                 110

Ser Leu Met Phe Leu Ala Lys Ala Gly Ser Arg Asp Ile Ala Ala Tyr

        115                 120                 125

Cys Asn Tyr Thr Gln Tyr Gln Pro Arg Val Leu Ala Val Ile Gly Pro

    130                 135                 140

His Ser Ser Glu Leu Ala Met Val Thr Gly Lys Phe Phe Ser Phe Phe

145                 150                 155                 160

Leu Met Pro Gln Val Ser Tyr Gly Ala Ser Met Glu Leu Leu Ser Ala

                165                 170                 175

Arg Glu Thr Phe Pro Ser Phe Phe Arg Thr Val Pro Ser Asp Arg Val

            180                 185                 190

Gln Lau Thr Ala Ala Ala Glu Leu Leu Gln Glu Phe Gly Trp Asn Trp

        195                 200                 205

Val Ala Ala Leu Gly Ser Asp Asp Glu Tyr Gly Arg Gln Gly Leu Ser

    210                 215                 220

Ile Phe Ser Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Ile Cys Ile Ala His Glu

225                 230                 235                 240

Gly Leu Val Pro Leu Pro Arg Ala Asp Asp Ser Arg Leu Gly Lys Val

                245                 250                 255

Gln Asp Val Leu His Gln Val Asn Gln Ser Ser Val Gln Val Val Leu

            260                 265                 270

Leu Phe Ala Ser Val His Ala Ala His Ala Leu Phe Asn Tyr Ser Ile

        275                 280                 285

Ser Ser Arg Leu Ser Pro Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ala Trp Leu

    290                 295                 300

Thr Ser Asp Leu Val Met Gly Leu Pro Gly Met Ala Gln Met Gly Thr

305                 310                 315                 320

Val Leu Gly Phe Leu Gln Arg Gly Ala Gln Leu His Glu Phe Pro Gln

                325                 330                 335

Tyr Val Lys Thr His Leu Ala Leu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Cys Ser

            340                 345                 350

Ala Leu Gly Glu Arg Glu Gln Gly Leu Glu Glu Asp Val Val Gly Gln

        355                 360                 365

Arg Cys Pro Gln Cys Asp Cys Ile Thr Leu Gln Asn Val Ser Ala Gly

    370                 375                 380

Leu Asn His His Gln Thr Phe Ser Val Tyr Ala Ala Val Tyr Ser Val

385                 390                 395                 400

Ala Gln Ala Leu His Asn Thr Leu Gln Cys Asn Ala Ser Gly Cys Pro

                405                 410                 415

Ala Gln Asp Pro Val Lys Pro Trp Gln Leu Leu Glu Asn Met Tyr Asn

            420                 425                 430

Leu Thr Phe His Val Gly Gly Leu Pro Leu Arg Phe Asp Ser Ser Gly

        435                 440                 445

Asn Val Asp Met Glu Tyr Asp Leu Lys Leu Trp Val Trp Gln Gly Ser

    450                 455                 460

Val Pro Arg Leu His Asp Val Gly Arg Phe Asn Gly Ser Leu Arg Thr

465                 470                 475                 480

Glu Arg Leu Lys Ile Arg Trp His Thr Ser Asp Asn Gln Lys Pro Val

                485                 490                 495

Ser Arg Cys Ser Arg Gln Cys Gln Glu Gly Gln Val Arg Arg Val Lys

            500                 505                 510

Gly Phe His Ser Cys Cys Tyr Asp Cys Val Asp Cys Glu Ala Gly Ser

        515                 520                 525

Tyr Arg Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ala Cys Thr Phe Cys Gly Gln Asp

    530                 535                 540

Glu Trp Ser Pro Glu Arg Ser Thr Arg Cys Phe Arg Arg Arg Ser Arg

545                 550                 555                 560

Phe Leu Glu Leu Ala Trp Gly Glu Pro Ala Val Leu Ser Leu Leu Leu

                565                 570                 575

Leu Leu Cys Leu Val Leu Gly Leu Thr Leu Ala Ala Leu Gly Leu Phe

            580                 585                 590

Val His Tyr Trp Asp Ser Pro Leu Val Gln Ala Ser Gly Gly Ser Leu

        595                 600                 605

Phe Cys Phe Gly Leu Ile Cys Leu Gly Leu Phe Cys Leu Ser Val Leu

    610                 615                 620

Leu Phe Pro Gly Arg Pro Arg Ser Ala Ser Cys Leu Ala Gln Gln Pro

625                 630                 635                 640

Met Ala His Leu Pro Leu Thr Gly Cys Leu Ser Thr Leu Phe Leu Gln

                645                 650                 655

Ala Ala Glu Ile Phe Val Glu Ser Glu Leu Pro Leu Ser Trp Ala Asn

            660                 665                 670

Trp Leu Cys Ser Tyr Leu Arg Gly Pro Trp Ala Trp Leu Val Val Leu

        675                 680                 685

Leu Ala Thr Leu Val Glu Ala Ala Leu Cys Ala Trp Tyr Leu Met Ala

    690                 695                 700

Phe Pro Pro Glu Val Val Thr Asp Trp Gln Val Leu Pro Thr Glu Val

705                 710                 715                 720

Leu Glu His Cys Arg Met Arg Ser Trp Val Ser Leu Gly Leu Val His

                725                 730                 735

Ile Thr Asn Ala Val Leu Ala Phe Leu Cys Phe Leu Gly Thr Phe Leu

            740                 745                 750

Val Gln Ser Gln Pro Gly Arg Tyr Asn Arg Ala Arg Gly Leu Thr Phe

        755                 760                 765

Ala Met Leu Ala Tyr Phe Ile Ile Trp Val Ser Phe Val Pro Leu Leu

    770                 775                 780

Ala Asn Val Gln Val Ala Tyr Gln Pro Ala Val Gln Met Gly Ala Ile

785                 790                 795                 800

Leu Phe Cys Ala Leu Gly Ile Leu Ala Thr Phe His Leu Pro Lys Cys

                805                 810                 815

Tyr Val Leu Leu Trp Leu Pro Glu Leu Asn Thr Gln Glu Phe Phe Leu

            820                 825                 830

Gly Arg Ser Pro Lys Glu Ala Ser Asp Gly Asn Ser Gly Ser Ser Glu

        835                 840                 845

Ala Thr Arg Gly His Ser Glu

    850                 855

<210>19

<211>859

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>19

Met Pro Glv Leu Ala Ile Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Phe Leu Glu

 1               5                  10                  15

Leu Gly Met Gly Ser Ser Leu Cys Leu Ser Gln Gln Phe Lys Ala Gln

            20                  25                  30

Gly Asp Tyr Ile Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Thr Thr Glu Glu

        35                  40                  45

Ala Thr Leu Asn Gln Arg Thr Gln Pro Asn Gly Ile Leu Cys Thr Arg

    50                  55                  60

Phe Ser Pro Leu Gly Leu Phe Leu Ala Met Ala Met Lys Met Ala Val

65                  70                  75                  80

Glu Glu Ile Asn Asn Gly Ser Ala Leu Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly

                85                  90                  95

Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Cys Ser Glu Pro Val Val Thr Met Lys Pro

            100                 105                 l10

Ser Leu Met Phe Met Ala Lys Val Gly Ser Gln Ser Ile Ala Ala Tyr

        115                 120                 125

Cys Asn Tyr Thr Gln Tyr Gln Pro Arg Val Leu Ala Val Ile Gly Pro

    130                 135                 140

His Ser Ser Glu Leu Ala Leu Ile Thr Gly Lys Phe Phe Ser Phe Phe

145                 150                 155                 160

Leu Met Pro Gln Val Ser Tyr Ser Ala Ser Met Asp Arg Leu Ser Asp

                165                 170                 175

Arg Glu Thr Phe Pro Ser Phe Phe Arg Thr Val Pro Ser Asp Arg Val

            180                 185                 190

Gln Leu Gln Ala Val Val Thr Leu Leu Gln Asn Phe Ser Trp Asn Trp

        195                 200                 205

Val Ala Ala Leu Gly Ser Asp Asp Asp Tyr Gly Arg Glu Gly Leu Ser

    210                 215                 220

Ile Phe Ser Gly Leu Ala Asn Ser Arg Gly Ile Cys Ile Ala His Glu

225                 230                 235                 240

Gly Leu Val Pro Gln His Asp Thr Ser Gly Gln Gln Leu Gly Lys Val

                245                 250                 255

Val Asp Val Leu Arg Gln Val Asn Gln Ser Lys Val Gln Val Val Val

            260                 265                 270

Leu Phe Ala Ser Ala Arg Ala Val Tyr Ser Leu Phe Ser Tyr Ser Ile

        275                 280                 285

Leu His Asp Leu Ser Pro Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ser Trp Leu

    290                 295                 300

Thr Ser Asp Leu Val Met Thr Leu Pro Asn Ile Ala Arg Val Gly Thr

305                 310                 315                 320

Val Leu Gly Phe Leu Gln Arg Gly Ala Leu Leu Pro Glu Phe Ser His

                325                 330                 335

Tyr Val Glu Thr Arg Leu Ala Leu Ala Ala Asp Pro Thr Phe Cys Ala

            340                 345                 350

Ser Leu Lys Ala Glu Leu Asp Leu Glu Glu Arg Val Met Gly Pro Arg

        355                 360                 365

Cys Ser Gln Cys Asp Tyr Ile Met Leu Gln Asn Leu Ser Ser Gly Leu

    370                 375                 380

Met Gln Asn Leu Ser Ala Gly Gln Leu His His Gln Ile Phe Ala Thr

385                 390                 395                 400

Tyr Ala Ala Val Tyr Ser Val Ala Gln Ala Leu His Asn Thr Leu Gln

                405                 410                 415

Cys Asn Val Ser His Cys His Thr Ser Glu Pro Val Gln Pro Trp Gln

            420                 425                 430

Leu Leu Glu Asn Met Tyr Asn Met Ser Phe Arg Ala Arg Asp Leu Thr

        435                 440                 445

Leu Gln Phe Asp Ala Lys Gly Ser Val Asp Met Glu Tyr Asp Leu Lys

    450                 455                 460

Met Trp Val Trp Gln Ser Pro Thr Pro Val Leu His Thr Val Gly Thr

465                 470                 475                 480

Phe Asn Gly Thr Leu Gln Leu Gln His Ser Lys Met Tyr Trp Pro Gly

                485                 490                 495

Asn Gln Val Pro Val Ser Gln Cys Ser Arg Gln Cys Lys Asp Gly Gln

            500                 505                 510

Val Arg Arg Val Lys Gly Phe His Ser Cys Cys Tyr Asp Cys Val Asp

        515                 520                 525

Cys Lys Ala Gly Ser Tyr Arg Lys His Pro Asp Asp Phe Thr Cys Thr

    530                 535                 540

Pro Cys Gly Lys Asp Gln Trp Ser Pro Glu Lys Ser Thr Thr Cys Leu

545                 550                 555                 560

Pro Arg Arg Pro Lys Phe Leu Glu Leu Ala Trp Gly Glu Pro Ala Val

                565                 570                 575

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Leu Val Leu Ala

            580                 585                 590

Ala Leu Gly Leu Phe Val His His Arg Asp Ser Pro Leu Val Gln Ala

        595                 600                 605

Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Phe Gly Leu Val Cys Leu Gly Leu Val

    610                 615                 620

Cys Leu Ser Val Leu Leu Phe Pro Gly Gln Pro Ser Pro Ala Arg Cys

625                 630                 635                 640

Leu Ala Gln Gln Pro Leu Ser His Leu Pro Leu Thr Gly Cys Leu Ser

                645                 650                 655

Thr Leu Phe Leu Gln Ala Ala Glu Ile Phe Val Glu Ser Glu Leu Pro

            660                 665                 670

Leu Ser Trp Ala Asp Arg Leu Ser Gly Cys Leu Arg Gly Pro Trp Ala

        675                 680                 685

Trp Leu Val Val Leu Leu Ala Met Leu Val Glu Val Ala Leu Cys Thr

    690                 695                 700

Trp Tyr Leu Val Ala Phe Pro Pro Glu Val Val Thr Asp Trp His Met

705                 710                 715                 720

Leu Pro Thr Glu Ala Leu Val His Cys Arg Thr Arg Ser Trp Val Ser

                725                 730                 735

Phe Gly Leu Ala His Ala Thr Asn Ala Thr Leu Ala Phe Leu Cys Phe

            740                 745                 750

Leu Gly Thr Phe Leu Val Arg Ser Gln Pro Gly Arg Tyr Asn Arg Ala

        755                 760                 765

Arg Gly Leu Thr Phe Ala Met Leu Ala Tyr Phe Ile Thr Trp Val Ser

    770                 775                 780

Phe Val Pro Leu Leu Ala Asn Val Gln Val Val Leu Arg Pro Ala Val

785                 790                 795                 800

Gln Met Gly Ala Leu Leu Leu Cys Val Leu Gly Ile Leu Ala Ala Phe

                805                 810                 815

His Leu Pro Arg Cys Tyr Leu Leu Met Arg Gln Pro Gly Leu Asn Thr

            820                 825                 830

Pro Glu Phe Phe Leu Gly Gly Gly Pro Gly Asp Ala Gln Gly Gln Asn

        835                 840                 845

Asp Gly Asn Thr Gly Asn Gln Gly Lys His Glu

    850                 855

<210>20

<211>841

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>20

Met Leu Leu Cys Thr Ala Arg Leu Val Gly Leu Gln Leu Leu Ile Ser

 1               5                  10                  15

Cys Cys Trp Ala Phe Ala Cys His Ser Thr Glu Ser Ser Pro Asp Phe

            20                  25                  30

Thr Leu Pro Gly Asp Tyr Leu Leu Ala Gly Leu Phe Pro Leu His Ser

        35                  40                  45

Gly Cys Leu Gln Val Arg His Arg Pro Glu Val Thr Leu Cys Asp Arg

    50                  55                  60

Ser Cys Ser Phe Asn Glu His Gly Tyr His Leu Phe Gln Ala Met Arg

65                  70                  75                  80

Leu Gly Val Glu Glu Ile Asn Asn Ser Thr Ala Leu Leu Pro Asn Ile

                85                  90                  95

Thr Leu Gly Tyr Gln Leu Tyr Asp Val Cys Ser Asp Ser Ala Asn Val

            100                 105                 110

Tyr Ala Thr Leu Arg Val Leu Ser Leu Pro Gly Gln His His Ile Glu

        115                 120                 125

Leu Gln Gly Asp Leu Leu His Tyr Ser Pro Thr Val Leu Ala Val Ile

    130                 135                 140

Gly Pro Asp Ser Thr Asn Arg Ala Ala Thr Thr Ala Ala Leu Leu Ser

145                 150                 155                 160

Pro Phe Leu Val Pro Met Ile Ser Tyr Ala Ala Ser Ser Glu Thr Leu

                165                 170                 175

Ser Val Lys Arg Gln Tyr Pro Ser Phe Leu Arg Thr Ile Pro Asn Asp

            180                 185                 190

Lys Tyr Gln Val Glu Thr Met Val Leu Leu Leu Gln Lys Phe Gly Trp

        195                 200                 205

Thr Trp Ile Ser Leu Val Gly Ser Ser Asp Asp Tyr Gly Gln Leu Gly

    210                 215                 220

Val Gln Ala Leu Glu Asn Gln Ala Thr Gly Gln Gly Ile Cys Ile Ala

225                 230                 235                 240

Phe Lys Asp Ile Met Pro Phe Ser Ala Gln Val Gly Asp Glu Arg Met

                245                 250                 255

Gln Cys Leu Met Arg His Leu Ala Gln Ala Gly Ala Thr Val Val Val

            260                 265                 270

Val Phe Ser Ser Arg Gln Leu Ala Arg Val Phe Phe Glu Ser Val Val

        275                 280                 285

Leu Thr Asn Leu Thr Gly Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ala Trp Ala

    290                 295                 300

Leu Ser Arg His Ile Thr Gly Val Pro Gly Ile Gln Arg Ile Gly Met

305                 310                 315                 320

Val Leu Gly Val Ala Ile Gln Lys Arg Ala Val Pro Gly Leu Lys Ala

                325                 330                 335

Phe Glu Glu Ala Tyr Ala Arg Ala Asp Lys Lys Ala Pro Arg Pro Cys

            340                 345                 350

His Lys Gly Ser Trp Cys Ser Ser Asn Gln Leu Cys Arg Glu Cys Gln

        355                 360                 365

Ala Phe Met Ala His Thr Met Pro Lys Leu Lys Ala Phe Ser Met Ser

    370                 375                 380

Ser Ala Tyr Asn Ala Tyr Arg Ala Val Tyr Ala Val Ala His Gly Leu

385                 390                 395                 400

His Gln Leu Leu Gly Cys Ala Ser Gly Ala Cys Ser Arg Gly Arg Val

                405                 410                 415

Tyr Pro Trp Gln Leu Leu Glu Gln Ile His Lys Val His Phe Leu Leu

            420                 425                 430

His Lys Asp Thr Val Ala Phe Asn Asp Asn Arg Asp Pro Leu Ser Ser

        435                 440                 445

Tyr Asn Ile Ile Ala Trp Asp Trp Asn Gly Pro Lys Trp Thr Phe Thr

    450                 455                 460

Val Leu Gly Ser Ser Thr Trp Ser Pro Val Gln Leu Asn Ile Asn Glu

465                 470                 475                 480

Thr Lys Ile Gln Trp His Gly Lys Asp Asn Gln Val Pro Lys Ser Val

                485                 490                 495

Cys Ser Ser Asp Cys Leu Glu Gly His Gln Arg Val Val Thr Gly Phe

            500                 505                 510

His His Cys Cys Phe Glu Cys Val Pro Cys Gly Ala Gly Thr Phe Leu

        515                 520                 525

Asn Lys Ser Asp Leu Tyr Arg Cys Gln Pro Cys Gly Lys Glu Glu Trp

    530                 535                 540

Ala Pro Glu Gly Ser Gln Thr Cys Phe Pro Arg Thr Val Val Phe Leu

545                 550                 555                 560

Glu Trp His Glu Pro Ile Ser Leu Val Leu Ile Ala Ala Asn Thr Leu

                565                 570                 575

Leu Leu Leu Leu Leu Val Gly Thr Ala Gly Leu Phe Ala Trp His Phe

            580                 585                 590

His Thr Pro Val Val Arg Ser Ala Gly Gly Arg Leu Cys Phe Leu Met

        595                 600                 605

Leu Gly Ser Leu Val Ala Gly Ser Cys Ser Phe Tyr Ser Phe Phe Gly

    610                 615                 620

Glu Pro Thr Val Pro Ala Cys Leu Leu Arg Gln Pro Leu Phe Ser Leu

625                 630                 635                 640

Gly Phe Ala Ile Phe Leu Ser Cys Leu Thr Ile Arg Ser Phe Gln Leu

                645                 650                 655

Val Ile Ile Phe Lys Phe Ser Thr Lys Val Pro Thr Phe Tyr Arg Thr

            660                 665                 670

Trp Ala Gln Asn His Gly Ala Gly Leu Phe Val Ile Val Ser Ser Thr

        675                 680                 685

Val His Leu Leu Ile Cys Leu Thr Trp Leu Val Met Trp Thr Pro Arg

    690                 695                 700

Pro Thr Arg Glu Tyr Gln Arg Phe Pro His Leu Val Ile Leu Glu Cys

705                 710                 715                 720

Thr Glu Val Asn Ser Val Gly Phe Leu Leu Ala Phe Thr His Asn Ile

                725                 730                 735

Leu Leu Ser Ile Ser Thr Phe Val Cys Ser Tyr Leu Gly Lys Glu Leu

            740                 745                 750

Pro Glu Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Cys Val Thr Phe Ser Leu Leu Leu

        755                 760                 765

Asn Phe Val Ser Trp Ile Ala Phe Phe Thr Met Ala Ser Ile Tyr Gln

    770                 775                 780

Gly Ser Tyr Leu Pro Ala Val Asn Val Leu Ala Gly Leu Thr Thr Leu

785                 790                 795                 800

Ser Gly Gly Phe Ser Gly Tyr Phe Leu Pro Lys Cys Tyr Val Ile Leu

                805                 8l0                 815

Cys Arg Pro Glu Leu Asn Asn Thr Glu His Phe Gln Ala Ser Ile Gln

            820                 825                 830

Asp Tyr Thr Arg Arg Cys Gly Thr Thr

        835                 840

<210>21

<211>840

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>21

Met Leu Phe Trp Ala Ala His Leu Leu Leu Ser Leu Gln Leu Val Tyr

 1               5                  10                  15

Cys Trp Ala Phe Ser Cys Gln Arg Thr Glu Ser Ser Pro Gly Phe Ser

            20                  25                  30

Leu Pro Gly Asp Phe Leu Leu Ala Gly Leu Phe Ser Leu His Gly Asp

        35                  40                  45

Cys Leu Gln Val Arg His Arg Pro Leu Val Thr Ser Cys Asp Arg Pro

    50                  55                  60

Asp Ser Phe Asn Gly His Gly Tyr His Leu Phe Gln Ala Met Arg Phe

65                  70                  75                  80

Thr Val Glu Glu Ile Asn Asn Ser Ser Ala Leu Leu Pro Asn Ile Thr

                85                  90                  95

Leu Gly Tyr Glu Leu Tyr Asp Val Cys Ser Glu Ser Ala Asn Val Tyr

            100                 105                 110

Ala Thr Leu Arg Val Leu Ala Leu Gln Gly Pro Arg His Ile Glu Ile

        115                 120                 125

Gln Lys Asp Leu Arg Asn His Ser Ser Lys Val Val Ala Phe Ile Gly

    130                 135                 140

Pro Asp Asn Thr Asp His Ala Val Thr Thr Ala Ala Leu Leu Gly Pro

145                 150                 155                 160

Phe Leu Met Pro Leu Val Ser Tyr Glu Ala Ser Ser Val Val Leu Ser

                165                 170                 175

Ala Lys Arg Lys Phe Pro Ser Phe Leu Arg Thr Val Pro Ser Asp Arg

            180                 185                 190

His Gln Val Glu Val Met Val Gln Leu Leu Gln Ser Phe Gly Trp Val

        195                 200                 205

Trp Ile Ser Leu Ile Gly Ser Tyr Gly Asp Tyr Gly Gln Leu Gly Val

    210                 215                 220

Gln Ala Leu Glu Glu Leu Ala Val Pro Arg Gly Ile Cys Val Ala Phe

225                 230                 235                 240

Lys Asp Ile Val Pro Phe Ser Ala Arg Val Gly Asp Pro Arg Met Gln

                245                 250                 255

Ser Met Met Gln His Leu Ala Gln Ala Arg Thr Thr Val Val Val Val

            260                 265                 270

Phe Ser Asn Arg His Leu Ala Arg Val Phe Phe Arg Ser Val Val Leu

        275                 280                 285

Ala Asn Leu Thr Gly Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Asp Trp Ala Ile

    290                 295                 300

Ser Thr Tyr Ile Thr Ser Val Thr Gly Ile Gln Gly Ile Gly Thr Val

305                 310                 315                 320

Leu Gly Val Ala Val Gln Gln Arg Gln Val Pro Gly Leu Lys Glu Phe

                325                 330                 335

Glu Glu Ser Tyr Val Arg Ala Val Thr Ala Ala Pro Ser Ala Cys Pro

            340                 345                 350

Glu Gly Ser Trp Cys Ser Thr Asn Gln Leu Cys Arg Glu Cys His Thr

        355                 360                 365

Phe Thr Thr Arg Asn Met Pro Thr Leu Gly Ala Phe Ser Met Ser Ala

    370                 375                 380

Ala Tyr Arg Val Tyr Clu Ala Val Tyr Ala Val Ala His Gly Leu His

385                 390                 395                 400

Gln Leu Leu Gly Cys Thr Ser Glu Ile Cys Ser Arg Gly Pro Val Tyr

                405                 410                 415

Pro Trp Gln Leu Leu Gln Gln Ile Tyr Lys Val Asn Phe Leu Leu His

            420                 425                 430

Glu Asn Thr Val Ala Phe Asp Asp Asn Gly Asp Thr Leu Gly Tyr Tyr

        435                 440                 445

Asp Ile Ile Ala Trp Asp Trp Asn Gly Pro Glu Trp Thr Phe Glu Ile

    450                 455                 460

Ile Gly Ser Ala Ser Leu Ser Pro Val His Leu Asp Ile Asn Lys Thr

465                 470                 475                 480

Lys Ile Gln Trp His Gly Lys Asn Asn Gln Val Pro Val Ser Val Cys

                485                 490                 495

Thr Thr Asp Cys Leu Ala Gly His His Arg Val Val Val Gly Ser His

            500                 505                 510

His Cys Cys Phe Glu Cys Val Pro Cys Glu Ala Gly Thr Phe Leu Asn

        515                 520                 525

Met Ser Glu Leu His Ile Cys Gln Pro Cys Gly Thr Glu Glu Trp Ala

    530                 535                 540

Pro Lys Glu Ser Thr Thr Cys Phe Pro Arg Thr Val Glu Phe Leu Glu

545                 550                 555                 560

Leu Arg Glu His Thr Ser Trp Val Leu Leu Ala Ala Asn Thr Leu Leu

                565                 570                 575

Leu Leu Leu Leu Leu Gly Thr Ala Gly Leu Phe Ala Trp His Leu Asp

            580                 585                 590

Thr Pro Val Val Arg Ser Ala Gly Gly Arg Leu Cys Phe Leu Met Leu

        595                 600                 605

Gly Ser Leu Ala Ala Gly Ser Gly Ser Leu Tyr Gly Phe Phe Gly Glu

    610                 615                 620

Pro Thr Arg Pro Ala Cys Leu Leu Arg Gln Ala Leu Phe Ala Leu Gly

625                 630                 635                 640

Phe Thr Ile Phe Leu Ser Cys Leu Thr Val Arg Ser Phe Gln Leu Ile

                645                 650                 655

Ile Ile Phe Lys Phe Ser Thr Lys Val Pro Thr Phe Tyr His Ala Trp

            660                 665                 670

Val Gln Asn His Gly Ala Gly Leu Phe Val Met Ile Ser Ser Ala Ala

        675                 680                 685

Gln Leu Leu Ile Cys Leu Thr Trp Leu Val Val Trp Thr Pro Leu Pro

    690                 695                 700

Ala Arg Glu Tyr Gln Arg Phe Pro His Leu Val Met Leu Glu Cys Thr

705                 710                 7l5                 720

Glu Thr Asn Ser Leu Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu Tyr Asn Gly Leu

                725                 730                 735

Leu Ser Ile Ser Ala Phe Ala Cys Ser Tyr Leu Gly Lys Asp Leu Pro

            740                 745                 750

Glu Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Cys Val Thr Phe Ser Leu Leu Phe Asn

        755                 760                 765

Phe Val Ser Trp Ile Ala Phe Phe Thr Thr Ala Ser Val Tyr Asp Gly

    770                 775                 780

Lys Tyr Leu Pro Ala Ala Asn Met Met Ala Gly Leu Ser Ser Leu Ser

785                 790                 795                 800

Ser Gly Phe Gly Gly Tyr Phe Leu Pro Lys Cys Tyr Val Ile Leu Cys

                805                 810                 815

Arg Pro Asp Leu Asn Ser Thr Glu His Phe Gln Ala Ser Ile Gln Asp

            820                 825                 830

Tyr Thr Arg Arg Cys Gly Ser Thr

        835                 840

<210>22

<211>838

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>22

Met Gly Pro Arg Ala Lys Thr Ile Cys Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp

 1               5                  10                  15

Val Leu Ala Glu Pro Ala Glu Asn Ser Asp Phe Tyr Leu Pro Gly Asp

            20                  25                  30

Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Leu His Ala Asn Met Lys Gly Ile

        35                  40                  45

Val His Leu Asn Phe Leu Gln Val Pro Met Cys Lys Glu Tyr Glu Val

    50                  55                  60

Lys Val Ile Gly Tyr Asn Leu Met Gln Ala Met Arg Phe Ala Val Glu

65                  70                  75                  80

Glu Ile Asn Asn Asp Ser Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu Leu Gly Tyr

                85                  90                  95

Glu Ile Val Asp Val Cys Tyr Ile Ser Asn Asn Val Gln Pro Val Leu

            100                 105                 110

Tyr Phe Leu Ala His Glu Asp Asn Leu Leu Pro Ile Gln Glu Asp Tyr

        115                 120                 125

Ser Asn Tyr Ile Ser Arg Val Val Ala Val Ile Gly Pro Asp Asn Ser

    130                 135                 140

Glu Ser Val Met Thr Val Ala Asn Phe Leu Ser Leu Phe Leu Leu Pro

145                 150                 155                 160

Gln Ile Thr Tyr Ser Ala Ile Ser Asp Glu Leu Arg Asp Lys Val Arg

                165                 170                 175

Phe Pro Ala Leu Leu Arg Thr Thr Pro Ser Ala Asp His His Val Glu

            180                 185                 190

Ala Met Val Gln Leu Met Leu His Phe Arg Trp Asn Trp Ile Ile Val

        195                 200                 205

Leu Val Ser Ser Asp Thr Tyr Gly Arg Asp Asn Gly Gln Leu Leu Gly

    210                 215                 220

Glu Arg Val Ala Arg Arg Asp Ile Cys Ile Ala Phe Gln Glu Thr Leu

225                 230                 235                 240

Pro Thr Leu Gln Pro Asn Gln Asn Met Thr Ser Glu Glu Arg Gln Arg

                245                 250                 255

Leu Val Thr Ile Val Asp Lys Leu Gln Gln Ser Thr Ala Arg Val Val

            260                 265                 270

Val Val Phe Ser Pro Asp Leu Thr Leu Tyr His Phe Phe Asn Glu Val

        275                 280                 285

Leu Arg Gln Asn Phe Thr Gly Ala Val Trp Ile Ala Ser Glu Ser Trp

    290                 295                 300

Ala Ile Asp Pro Val Leu His Asn Leu Thr Glu Leu Gly His Leu Gly

305                 310                 315                 320

Thr Phe Leu Gly Ile Thr Ile Gln Ser Val Pro Ile Pro Gly Phe Ser

                325                 330                 335

Glu Phe Arg Glu Trp Gly Pro Gln Ala Gly Pro Pro Pro Leu Ser Arg

            340                 345                 350

Thr Ser Gln Ser Tyr Thr Cys Asn Gln Glu Cys Asp Asn Cys Leu Asn

        355                 360                 365

Ala Thr Leu Ser Phe Asn Thr Ile Leu Arg Leu Ser Gly Glu Arg Val

    370                 375                 380

Val Tyr Ser Val Tyr Ser Ala Val Tyr Ala Val Ala His Ala Leu His

385                 390                 395                 400

Ser Leu Leu Gly Cys Asp Lys Ser Thr Cys Thr Lys Arg Val Val Tyr

                405                 410                 415

Pro Trp Gln Leu Leu Glu Glu Ile Trp Lys Val Asn Phe Thr Leu Leu

            420                 425                 430

Asp His Gln Ile Phe Phe Asp Pro Gln Gly Asp Val Ala Leu His Leu

        435                 440                 445

Glu Ile Val Gln Trp Gln Trp Asp Arg Ser Gln Asn Pro Phe Gln Ser

    450                 455                 460

Val Ala Ser Tyr Tyr Pro Leu Gln Arg Gln Leu Lys Asn Ile Gln Asp

465                 470                 475                 480

Ile Ser Trp His Thr Val Asn Asn Thr Ile Pro Met Ser Met Cys Ser

                485                 490                 495

Lys Arg Cys Gln Ser Gly Gln Lys Lys Lys Pro Val Gly Ile His Val

            500                 505                 510

Cys Cys Phe Glu Cys Ile Asp Cys Leu Pro Gly Thr Phe Leu Asn His

        515                 520                 525

Thr Glu Asp Glu Tyr Glu Cys Gln Ala Cys Pro Asn Asn Glu Trp Ser

    530                 535                 540

Tyr Gln Ser Glu Thr Ser Cys Phe Lys Arg Gln Leu Val Phe Leu Glu

545                 550                 555                 560

His Glu Val Pro Thr Ile Val Val Ala Ile Leu Ala Ala Leu Gly Phe

                565                 570                 575

Phe Ser Thr Leu Ala Ile Leu Phe Ile Phe Trp Arg His Phe Gln Thr

            580                 585                 590

Pro Met Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met Leu Val

        595                 600                 605

Pro Leu Leu Leu Ala Phe Gly Met Val Pro Val Tyr Val Gly Pro Pro

    610                 615                 620

Thr Val Phe Ser Cys Phe Cys Arg Gln Ala Phe Phe Thr Val Cys Phe

625                 630                 635                 640

Ser Ile Cys Leu Ser Cys Ile Thr Val Arg Ser Phe Gln Ile Val Cys

                645                 650                 655

Val Phe Lys Met Ala Arg Arg Leu Pro Ser Ala Tyr Ser Phe Trp Met

            660                 665                 670

Arg Tyr His Gly Pro Tyr Val Phe Val Ala Phe Ile Thr Ala Ile Lys

        675                 680                 685

Val Ala Leu Val Val Gly Asn Met Leu Ala Thr Thr Ile Asn Pro Ile

    690                 695                 700

Gly Arg Thr Asp Pro Asp Asp Pro Asn Ile Met Ile Leu Ser Cys His

705                 710                 715                 720

Pro Asn Tyr Arg Asn Gly Leu Leu Phe Asn Thr Ser Met Asp Leu Leu

                725                 730                 735

Leu Ser Val Leu Gly Phe Ser Phe Ala Tyr Met Gly Lys Glu Leu Pro

            740                 745                 750

Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr Leu Ser Met Thr Phe Ser

        755                 760                 765

Phe Thr Ser Ser Ile Ser Leu Cys Thr Phe Met Ser Val His Asp Gly

    770                 775                 780

Val Leu Val Thr Ile Met Asp Leu Leu Val Thr Val Leu Asn Phe Leu

785                 790                 795                 800

Ala Ile Gly Leu Gly Tyr Phe Gly Pro Lys Cys Tyr Met Ile Leu Phe

                805                 810                 815

Tyr Pro Glu Arg Asn Thr Ser Ala Tyr Phe Asn Ser Met Ile Gln Gly

            820                 825                 830

Tyr Thr Met Arg Lys Ser

        835

<210>23

<211>843

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>23

Met Gly Pro Gln Ala Arg Thr Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Leu His

 1               5                  10                  15

Val Leu Pro Lys Pro Gly Lys Leu Val Glu Asn Ser Asp Phe His Leu

            20                  25                  30

Ala Gly Asp Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Thr Leu His Ala Asn Val

        35                  40                  45

Lys Ser Ile Ser His Leu Ser Tyr Leu Gln Val Pro Lys Cys Asn Glu

    50                  55                  60

Phe Thr Met Lys Val Leu Gly Tyr Asn Leu Met Gln Ala Met Arg Phe

65                  70                  75                  80

Ala Val Glu Glu Ile Asn Asn Cys Ser Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu

                85                  90                  95

Leu Gly Tyr Glu Met Val Asp Val Cys Tyr Leu Ser Asn Asn Ile His

            100                 105                 110

Pro Gly Leu Tyr Phe Leu Ala Gln Asp Asp Asp Leu Leu Pro Ile Leu

        115                 120                 125

Lys Asp Tyr Ser Gln Tyr Met Pro His Val Val Ala Val Ile Gly Pro

    130                 135                 140

Asp Asn Ser Glu Ser Ala Ile Thr Val Ser Asn Ile Leu Ser His Phe

145                 150                 155                 160

Leu Ile Pro Gln Ile Thr Tyr Ser Ala Ile Ser Asp Lys Leu Arg Asp

                165                 170                 175

Lys Arg His Phe Pro Ser Met Leu Arg Thr Val Pro Ser Ala Thr His

            180                 185                 190

His Ile Glu Ala Met Val Gln Leu Met Val His Phe Gln Trp Asn Trp

        195                 200                 205

Ile Val Val Leu Val Ser Asp Asp Asp Tyr Gly Arg Glu Asn Ser His

    210                 215                 220

Leu Leu Ser Gln Arg Leu Thr Lys Thr Ser Asp Ile Cys Ile Ala Phe

225                 230                 235                 240

Gln Glu Val Leu Pro Ile pro Glu Ser Ser Gln Val Met Arg Ser Glu

                245                 250                 255

Glu Gln Arg Gln Leu Asp Asn Ile Leu Asp Lys Leu Arg Arg Thr Ser

            260                 265                 270

Ala Arg Val Val Val Val phe Ser pro Glu Leu Ser Leu Tyr Ser Phe

        275                 280                 285

phe His Glu Val Leu Arg Trp Asn Phe Thr Gly Phe Val Trp Ile Ala

    290                 295                 300

Ser Glu Ser Trp Ala Ile Asp Pro Val Leu His Asn Leu Thr Glu Leu

305                 310                 315                 320

Arg His Thr Gly Thr Phe Leu Gly Val Thr Ile Gln Arg Val Ser Ile

                325                 330                 335

Pro Gly Phe Ser Gln Phe Arg Val Arg Arg Asp Lys Pro Gly Tyr Pro

            340                 345                 350

Val Pro Asn Thr Thr Asn Leu Arg Thr Thr Cys Asn Gln Asp Cys Asp

        355                 360                 365

Ala Cys Leu Asn Thr Thr Lys Ser Phe Asn Asn Ile Leu Ile Leu Ser

    370                 375                 380

Gly Glu Arg Val Val Tyr Ser Val Tyr Ser Ala Val Tyr Ala Val Ala

385                 390                 395                 400

His Ala Leu His Arg Leu Leu Gly Cys Asn Arg Val Arg Cys Thr Lys

                405                 410                 415

Gln Lys Val Tyr Pro Trp Gln Leu Leu Arg Glu Ile Trp His Val Asn

            420                 425                 430

Phe Thr Leu Leu Gly Asn Arg Leu Phe Phe Asp Gln Gln Gly Asp Met

        435                 440                 445

Pro Met Leu Leu Asp Ile Ile Gln Trp Gln Trp Asp Leu Ser Gln Asn

    450                 455                 460

Pro Phe Gln Ser Ile Ala Ser Tyr Ser Pro Thr Ser Lys Arg Leu Thr

465                 470                 475                 480

Tyr Ile Asn Asn Val Ser Trp Tyr Thr Pro Asn Asn Thr Val Pro Val

                485                 490                 495

Ser Met Cys Ser Lys Ser Cys Gln Pro Gly Gln Met Lys Lys Ser Val

            500                 505                 510

Gly Leu His Pro Cys Cys Phe Glu Cys Leu Asp Cys Met Pro Gly Thr

        515                 520                 525

Tyr Leu Asn Arg Ser Ala Asp Glu Phe Asn Cys Leu Ser Cys Pro Gly

    530                 535                 540

Ser Met Trp Ser Tyr Lys Asn Asp Ile Thr Cys Phe Gln Arg Arg Pro

545                 550                 555                 560

Thr Phe Leu Glu Trp His Glu Ala Pro Thr Ile Ala Val Ala Leu Leu

                565                 570                 575

Ala Ala Leu Gly Phe Leu Ser Thr Leu Ala Ile Leu Val Ile Phe Trp

            580                 585                 590

Arg His Phe Gln Thr Pro Ile Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys

        595                 600                 605

Phe Leu Met Leu Thr Leu Leu Leu Val Ala Tyr Met Val Val Pro Val

    610                 615                 620

Tyr Val Gly Pro Pro Lys Val Ser Thr Cys Leu Cys Arg Gln Ala Leu

625                 630                 635                 640

Phe Pro Leu Cys Phe Thr Ile Cys Ile Ser Cys Ile Ala Val Arg Ser

                645                 650                 655

Phe Gln Ile Val Cys Ala Phe Lys Met Ala Ser Arg Phe Pro Arg Ala

            660                 665                 670

Tyr Ser Tyr Trp Val Arg Tyr Gln Gly Pro Tyr Val Ser Met Ala Phe

        675                 680                 685

Ile Thr Val Leu Lys Met Val Ile Val Val Ile Gly Met Leu Ala Thr

    690                 695                 700

Gly Leu Ser Pro Thr Thr Arg Thr Asp Pro Asp Asp Pro Lys Ile Thr

705                 710                 715                 720

Ile Val Ser Cys Asn Pro Asn Tyr Arg Asn Ser Leu Leu Phe Asn Thr

                725                 730                 735

Ser Leu Asp Leu Leu Leu Ser Val Val Gly Phe Ser Phe Ala Tyr Met

            740                 745                 750

Gly Lys Glu Leu Pro Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr Leu

        755                 760                 765

Ser Met Thr Phe Tyr Phe Thr Ser Ser Val Ser Leu Cys Thr Phe Met

    770                 775                 780

Ser Ala Tyr Ser Gly Val Leu Val Thr Ile Val Asp Leu Leu Val Thr

785                 790                 795                 800

Val Leu Asn Leu Leu Ala Ile Ser Leu Gly Tyr Phe Gly Pro Lys Cys

                805                 810                 815

Tyr Met Ile Leu Phe Tyr Pro Glu Arg Asn Thr Pro Ala Tyr Phe Asn

            820                 825                 830

Ser Met Ile Gln Gly Tyr Thr Met Arg Arg Asp

        835                 840

<210>24

<211>853

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>24

Met Leu Gly Pro Ala Val Leu Gly Leu Ser Leu Trp Ala Leu Leu His

 1               5                  10                  15

Pro Gly Thr Gly Ala Pro Leu Cys Leu Ser Gln Gln Leu Arg Met Lys

            20                  25                  30

Gly Asp Tyr Val Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Glu Ala Glu Glu

        35                  40                  45

Ala Gly Leu Arg Ser Arg Thr Arg Pro Ser Ser Pro Val Cys Thr Arg

    50                  55                  60

Phe Ser Ser Asn Gly Leu Leu Trp Ala Leu Ala Met Lys Met Ala Val

65                  70                  75                  80

Glu Glu Ile Asn Asn Lys Ser Asp Leu Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly

                85                  90                  95

Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Cys Ser Glu Pro Val Val Ala Met Lys Pro

            100                 105                 110

Ser Leu Met Phe Leu Ala Lys Ala Gly Ser Arg Asp Ile Ala Ala Tyr

        115                 120                 125

Cys Asn Tyr Thr Gln Tyr Gln Pro Arg Val Leu Ala Val Ile Gly Pro

    130                 135                 140

His Ser Ser Glu Leu Ala Met Val Thr Gly Lys Phe Phe Ser Phe Phe

145                 150                 155                 160

Leu Met Pro Gln Val Ser Tyr Gly Ala Ser Met Glu Leu Leu Ser Ala

                165                 170                 175

Arg Glu Thr Phe Pro Ser Phe Phe Arg Thr Val Pro Ser Asp Arg Val

            180                 185                 190

Gln Leu Thr Ala Ala Ala Glu Leu Leu Gln Glu Phe Gly Trp Asn Trp

        195                 200                 205

Val Ala Ala Leu Gly Ser Asp Asp Glu Tyr Gly Arg Gln Gly Leu Ser

    210                 215                 220

Ile Phe Ser Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Ile Cys Ile Ala His Glu

225                 230                 235                 240

Gly Leu Val Pro Leu Pro Arg Ala Asp Asp Ser Arg Leu Gly Lys Val

                245                 250                 255

Gln Asp Val Leu His Gln Val Asn Gln Ser Ser Val Gln Val Val Leu

            260                 265                 270

Leu Phe Ala Ser Val His Ala Ala His Ala Leu Phe Asn Tyr Ser Ile

        275                 280                 285

Ser Ser Arg Leu Ser Pro Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ala Trp Leu

    290                 295                 300

Thr Ser Asp Leu Val Met Gly Leu Pro Gly Met Ala Gln Met Gly Thr

305                 310                 315                 320

Val Leu Gly Phe Leu Gln Arg Gly Ala Gln Leu His Glu Phe Pro Gln

                325                 330                 335

Tyr Val Lys Thr His Leu Ala Leu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Cys Ser

            340                 345                 350

Ala Leu Gly Glu Arg Glu Gln Gly Leu Glu Glu Asp Val Val Gly Gln

        355                 360                 365

Arg Cys Pro Gln Cys Asp Cys Ile Thr Leu Gln Asn Val Ser Ala Gly

    370                 375                 380

Leu Asn His His Gln Thr Phe Ser Val Tyr Ala Ala Val Tyr Ser Val

385                 390                 395                 400

Ala Gln Ala Leu His Asn Thr Leu Gln Cys Asn Ala Ser Gly Cys Pro

                405                 410                 415

Ala Gln Asp Pro Val Lys Pro Trp Gln Leu Leu Glu Asn Met Tyr Asn

            420                 425                 430

Leu Thr Phe His Val Gly Gly Leu Pro Leu Arg Phe Asp Ser Ser Gly

        435                 440                 445

Asn Val Asp Met Glu Tyr Asp Leu Lys Leu Trp Val Trp Gln Gly Ser

    450                 455                 460

Val Pro Arg Leu His Asp Val Gly Arg Phe Asn Gly Ser Leu Arg Thr

465                 470                 475                 480

Glu Arg Leu Lys Ile Arg Trp His Thr Ser Asp Asn Gln Lys Pro Val

                485                 490                 495

Ser Arg Cys Ser Arg Gln Cys Gln Glu Gly Gln Val Arg Arg Val Lys

            500                 505                 510

Gly Phe His Ser Cys Cys Tyr Asp Cys Val Asp Cys Glu Ala Gly Ser

        515                 520                 525

Tyr Arg Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ala Cys Thr Phe Cys Gly Gln Asp

    530                 535                 540

Glu Trp Ser Pro Glu Arg Ser Thr Arg Cys Phe Arg Arg Arg Ser Arg

545                 550                 555                 560

Phe Leu Glu Trp Gly Glu Pro Ala Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu

                565                 570                 575

Cys Leu Val Leu Gly Leu Thr Leu Ala Ala Leu Gly Leu Phe Val His

            580                 585                 590

Tyr Trp Asp Ser Pro Leu Val Gln Ala Ser Gly Gly Ser Leu Phe Cys

        595                 600                 605

Phe Gly Leu Ile Cys Leu Gly Leu Phe Cys Leu Ser Val Leu Leu Phe

    610                 615                 620

Pro Gly Arg Pro Arg Ser Ala Ser Cys Leu Ala Gln Gln Pro Met Ala

625                 630                 635                 640

His Leu Pro Leu Thr Gly Cys Leu Ser Thr Leu Phe Leu Gln Ala Ala

                645                 650                 655

Glu Ile Phe Val Glu Ser Glu Leu Pro Leu Ser Trp Ala Asn Trp Leu

            660                 665                 670

Cys Ser Tyr Leu Arg Gly Pro Trp Ala Trp Leu Val Val Leu Leu Ala

        675                 680                 685

Thr Leu Val Glu Ala Ala Leu Cys Ala Trp Tyr Leu Met Ala Phe Pro

    690                 695                 700

Pro Glu Val Val Thr Asp Trp Gln Val Leu Pro Thr Glu Val Leu Glu

705                 710                 715                 720

His Cys Arg Met Arg Ser Trp Val Ser Leu Gly Leu Val His Ile Thr

                725                 730                 735

Asn Ala Val Leu Ala Phe Leu Cys Phe Leu Gly Thr Phe Leu Val Gln

            740                 745                 750

Ser Gln Pro Gly Arg Tyr Asn Arg Ala Arg Gly Leu Thr Phe Ala Met

        755                 760                 765

Leu Ala Tyr Phe Ile Ile Trp Val Ser Phe Val Pro Leu Leu Ala Asn

    770                 775                 780

Val Gln Val Ala Tyr Gln Pro Ala Val Gln Met Gly Ala Ile Leu Phe

785                 790                 795                 800

Cys Ala Leu Gly Ile Leu Ala Thr Phe His Leu Pro Lys Cys Tyr Val

                805                 810                 815

Leu Leu Trp Leu Pro Glu Leu Asn Thr Gln Glu Phe Phe Leu Gly Arg

            820                 825                 830

Ser Pro Lys Glu Ala Ser Asp Gly Asn Ser Gly Ser Ser Glu Ala Thr

        835                 840                 845

Arg Gly His Ser Glu

    850

<210>25

<211>857

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>25

Met Pro Gly Leu Ala Ile Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Phe Leu Glu

 1               5                  10                  15

Leu Gly Met Gly Ser Ser Leu Cys Leu Ser Gln Gln Phe Lys Ala Gln

            20                  25                  30

Gly Asp Tyr Ile Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Thr Thr Glu Glu

        35                  40                  45

Ala Thr Lau Asn Gln Arg Thr Gln Pro Asn Gly Ile Leu Cys Thr Arg

    50                  55                  60

Phe Ser Pro Leu Gly Leu Phe Leu Ala Met Ala Met Lys Met Ala Val

65                  70                  75                  80

Glu Glu Ile Asn Asn Gly Ser Ala Leu Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly

                85                  90                  95

Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Cys Ser Glu Pro Val Val Thr Met Lys Pro

            100                 105                 110

Ser Leu Met Phe Met Ala Lys Val Gly Ser Gln Ser Ile Ala Ala Tyr

        115                 120                 125

Cys Asn Tyr Thr Gln Tyr Gln Pro Arg Val Leu Ala Val Ile Gly Pro

    130                 135                 140

His Ser Ser Glu Leu Ala Leu Ile Thr Gly Lys Phe Phe Ser Phe Phe

145                 150                 155                 160

Leu Met Pro Gln Val Ser Tyr Ser Ala Ser Met Asp Arg Leu Ser Asp

                165                 170                 175

Arg Glu Thr Phe Pro Ser Phe Phe Arg Thr Val Pro Ser Asp Arg Val

            180                 185                 190

Gln Leu Gln Ala Val Val Thr Leu Leu Gln Asn Phe Ser Trp Asn Trp

        195                 200                 205

Val Ala Ala Leu Gly Ser Asp Asp Asp Tyr Gly Arg Glu Gly Leu Ser

    210                 215                 220

Ile Phe Ser Gly Leu Ala Asn Ser Arg Gly Ile Cys Ile Ala His Glu

225                 230                 235                 240

Gly Leu Val Pro Gln His Asp Thr Ser Gly Gln Gln Leu Gly Lys Val

                245                 250                 255

Val Asp Val Leu Arg Gln Val Asn Gln Ser Lys Val Gln Val Val Val

            260                 265                 270

Leu Phe Ala Ser Ala Arg Ala Val Tyr Ser Leu Phe Ser Tyr Ser Ile

        275                 280                 285

Leu His Asp Leu Ser Pro Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ser Trp Leu

    290                 295                 300

Thr Ser Asp Leu Val Met Thr Leu Pro Asn Ile Ala Arg Val Gly Thr

305                 310                 315                 320

Val Leu Gly Phe Leu Gln Arg Gly Ala Leu Leu Pro Glu Phe Ser His

                325                 330                 335

Tyr Val Glu Thr Arg Leu Ala Leu Ala Ala Asp Pro Thr Phe Cys Ala

            340                 345                 350

Ser Leu Lys Ala Glu Leu Asp Leu Glu Glu Arg Val Met Gly Pro Arg

        355                 360                 365

Cys Ser Gln Cys Asp Tyr Ile Met Leu Gln Asn Leu Ser Ser Gly Leu

    370                 375                 380

Met Gln Asn Leu Ser Ala Gly Gln Leu His His Gln Ile Phe Ala Thr

385                 390                 395                 400

Tyr Ala Ala Val Tyr Ser Val Ala Gln Ala Leu His Asn Thr Leu Gln

                405                 410                 415

Cys Asn Val Ser His Cys His Thr Ser Glu Pro Val Gln Pro Trp Gln

            420                 425                 430

Leu Leu Glu Asn Met Tyr Asn Met Ser Phe Arg Ala Arg Asp Leu Thr

        435                 440                 445

Leu Gln Phe Asp Ala Lys Gly Ser Val Asp Met Glu Tyr Asp Leu Lys

    450                 455                 460

Met Trp Val Trp Gln Ser Pro Thr Pro Val Leu His Thr Val Gly Thr

465                 470                 475                 480

Phe Asn Gly Thr Leu Gln Leu Gln His Ser Lys Met Tyr Trp Pro Gly

                485                 490                 495

Asn Gln Val Pro Val Ser Gln Cys Ser Arg Gln Cys Lys Asp Gly Gln

            500                 505                 510

Val Arg Arg Val Lys Gly Phe His Ser Cys Cys Tyr Asp Cys Val Asp

        515                 520                 525

Cys Lys Ala Gly Ser Tyr Arg Lys His Pro Asp Asp Phe Thr Cys Thr

    530                 535                 540

Pro Cys Gly Lys Asp Gln Trp Ser Pro Glu Lys Ser Thr Thr Cys Leu

545                 550                 555                 560

Pro Arg Arg Pro Lys Phe Leu Glu Trp Gly Glu Pro Ala Val Leu Leu

                565                 570                 575

Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Leu Val Leu Ala Ala Leu

            580                 585                 590

Gly Leu Phe Val His His Arg Asp Ser Pro Leu Val Gln Ala Ser Gly

        595                 600                 605

Gly Pro Leu Ala Cys Phe Gly Leu Val Cys Leu Gly Leu Val Cys Leu

    610                 615                 620

Ser Val Leu Leu Phe Pro Gly Gln Pro Ser Pro Ala Arg Cys Leu Ala

625                 630                 635                 640

Gln Gln Pro Leu Ser His Leu Pro Leu Thr Gly Cys Leu Ser Thr Leu

                645                 650                 655

Phe Leu Gln Ala Ala Glu Ile Phe Val Glu Ser Glu Leu Pro Leu Ser

            660                 665                 670

Trp Ala Asp Arg Leu Ser Gly Cys Leu Arg Gly Pro Trp Ala Trp Leu

        675                 680                 685

Val Val Leu Leu Ala Met Leu Val Glu Val Ala Leu Cys Thr Trp Tyr

    690                 695                 700

Leu Val Ala Phe Pro Pro Glu Val Val Thr Asp Trp His Met Leu Pro

705                 710                 715                 720

Thr Glu Ala Leu Val His Cys Arg Thr Arg Ser Trp Val Ser Phe Gly

                725                 730                 735

Leu Ala His Ala Thr Asn Ala Thr Leu Ala Phe Leu Cys Phe Leu Gly

            740                 745                 750

Thr Phe Leu Val Arg Ser Gln Pro Gly Arg Tyr Asn Arg Ala Arg Gly

        755                 760                 765

Leu Thr Phe Ala Met Leu Ala Tyr Phe Ile Thr Trp Val Ser Phe Val

    770                 775                 780

Pro Leu Leu Ala Asn Val Gln Val Val Leu Arg Pro Ala Val Gln Met

785                 790                 795                 800

Gly Ala Leu Leu Leu Cys Val Leu Gly Ile Leu Ala Ala Phe His Leu

                805                 810                 815

Pro Arg Cys Tyr Leu Leu Met Arg Gln Pro Gly Leu Asn Thr Pro Glu

            820                 825                 830

Phe Phe Leu Gly Gly Gly Pro Gly Asp Ala Gln Gly Gln Asn Asp Gly

        835                 840                 845

Asn Thr Gly Asn Gln Gly Lys His Glu

    850                 855

<210>26

<211>840

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>26

Met Gly Pro Arg Ala Lys Thr Ile Cys Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp

 1               5                  10                  15

Val Leu Ala Glu Pro Ala Glu Asn Ser Asp Phe Tyr Leu Pro Gly Asp

            20                  25                  30

Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Leu His Ala Asn Met Lys Gly Ile

        35                  40                  45

Val His Leu Asn Phe Leu Gln Val Pro Met Cys Lys Glu Tyr Glu Val

    50                  55                  60

Lys Val Ile Gly Tyr Asn Leu Met Gln Ala Met Arg Phe Ala Val Glu

65                  70                  75                  80

Glu Ile Asn Asn Asp Ser Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu Leu Gly Tyr

                85                  90                  95

Glu Ile Val Asp Val Cys Tyr Ile Ser Asn Asn Val Gln Pro Val Leu

            100                 105                 110

Tyr Phe Leu Ala His Glu Asp Asn Leu Leu Pro Ile Gln Glu Asp Tyr

        115                 120                 125

Ser Asn Tyr Ile Ser Arg Val Val Ala Val Ile Gly Pro Asp Asn Ser

    130                 135                 140

Glu Ser Val Met Thr Val Ala Asn Phe Leu Ser Leu Phe Leu Leu Pro

145                 150                 155                 160

Gln Ile Thr Tyr Ser Ala Ile Ser Asp Glu Leu Arg Asp Lys Val Arg

                165                 170                 175

Phe Pro Ala Leu Leu Arg Thr Thr Pro Ser Ala Asp His His Val Glu

            180                 185                 190

Ala Met Val Gln Leu Met Leu His Phe Arg Trp Asn Trp Ile Ile Val

        195                 200                 205

Leu Val Ser Ser Asp Thr Tyr Gly Arg Asp Asn Gly Gln Leu Leu Gly

    210                 215                 220

Glu Arg Val Ala Arg Arg Asp Ile Cys Ile Ala Phe Gln Glu Thr Leu

225                 230                 235                 240

Pro Thr Leu Gln Pro Asn Gln Asn Met Thr Ser Glu Glu Arg Gln Arg

                245                 250                 255

Leu Val Thr Ile Val Asp Lys Leu Gln Gln Ser Thr Ala Arg Val Val

            260                 265                 270

Val Val Phe Ser Pro Asp Leu Thr Leu Tyr His Phe Phe Asn Glu Val

        275                 280                 285

Leu Arg Gln Asn Phe Thr Gly Ala Val Trp Ile Ala Ser Glu Ser Trp

    290                 295                 300

Ala Ile Asp Pro Val Leu His Asn Leu Thr Glu Leu Gly His Leu Gly

305                 3l0                 315                 320

Thr Phe Leu Gly Ile Thr Ile Gln Ser Val Pro Ile Pro Gly Phe Ser

                325                 330                 335

Glu Phe Arg Glu Trp Gly Pro Gln Ala Gly Pro Pro Pro Leu Ser Arg

            340                 345                 350

Thr Ser Gln Ser Tyr Thr Cys Asn Gln Glu Cys Asp Asn Cys Leu Asn

        355                 360                 365

Ala Thr Leu Ser Phe Asn Thr Ile Leu Arg Leu Ser Gly Glu Arg Val

    370                 375                 380

Val Tyr Ser Val Tyr Ser Ala Val Tyr Ala Val Ala His Ala Leu His

385                 390                 395                 400

Ser Leu Leu Gly Cys Asp Lys Ser Thr Cys Thr Lys Arg Val Val Tyr

                405                 410                 415

Pro Trp Gln Leu Leu Glu Glu Ile Trp Lys Val Asn Phe Thr Leu Leu

            420                 425                 430

Asp His Gln Ile Phe Phe Asp Pro Gln Gly Asp Val Ala Leu His Leu

        435                 440                 445

Glu Ile Val Gln Trp Gln Trp Asp Arg Ser Gln Asn Pro Phe Gln Ser

    450                 455                 460

Val Ala Ser Tyr Tyr Pro Leu Gln Arg Gln Leu Lys Asn Ile Gln Asp

465                 470                 475                 480

Ile Ser Trp His Thr Val Asn Asn Thr Ile Pro Met Ser Met Cys Ser

                485                 490                 495

Lys Arg Cys Gln Ser Gly Gln Lys Lys Lys Pro Val Gly Ile His Val

            500                 505                 510

Cys Cys Phe Glu Cys Ile Asp Cys Leu Pro Gly Thr Phe Leu Asn His

        515                 520                 525

Thr Glu Asp Glu Tyr Glu Cys Gln Ala Cys Pro Asn Asn Glu Trp Ser

    530                 535                 540

Tyr Gln Ser Glu Thr Ser Cys Phe Lys Arg Gln Leu Val Phe Leu Glu

545                 550                 555                 560

Leu Arg Glu His Thr Ser Trp Val Leu Leu Ala Ala Asn Thr Leu Leu

                565                 570                 575

Leu Leu Leu Leu Leu Gly Thr Ala Gly Leu Phe Ala Trp His Leu Asp

            580                 585                 590

Thr Pro Val Val Arg Ser Ala Gly Gly Arg Leu Cys Phe Leu Met Leu

        595                 600                 605

Gly Ser Leu Ala Ala Gly Ser Gly Ser Leu Tyr Gly Phe Phe Gly Glu

    610                 615                 620

Pro Thr Arg Pro Ala Cys Leu Leu Arg Gln Ala Leu Phe Ala Leu Gly

625                 630                 635                 640

Phe Thr Ile Phe Leu Ser Cys Leu Thr Val Arg Ser Phe Gln Leu Ile

                645                 650                 655

Ile Ile Phe Lys Phe Ser Thr Lys Val Pro Thr Phe Tyr His Ala Trp

            660                 665                 670

Val Gln Asn His Gly Ala Gly Leu Phe Val Met Ile Ser Ser Ala Ala

        675                 680                 685

Gln Leu Leu Ile Cys Leu Thr Trp Leu Val Val Trp Thr Pro Leu Pro

    690                 695                 700

Ala Arg Glu Tyr Gln Arg Phe Pro His Leu Val Met Leu Glu Cys Thr

705                 710                 715                 720

Glu Thr Asn Ser Leu Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu Tyr Asn Gly Leu

                725                 730                 735

Leu Ser Ile Ser Ala Phe Ala Cys Ser Tyr Leu Gly Lys Asp Leu Pro

            740                 745                 750

Glu Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Cys Val Thr Phe Ser Leu Leu Phe Asn

        755                 760                 765

Phe Val Ser Trp Ile Ala Phe Phe Thr Thr Ala Ser Val Tyr Asp Gly

    770                 775                 780

Lys Tyr Leu Pro Ala Ala Asn Met Met Ala Gly Leu Ser Ser Leu Ser

785                 790                 795                 800

Ser Gly Phe Gly Gly Tyr Phe Leu Pro Lys Cys Tyr Val Ile Leu Cys

                805                 810                 815

Arg Pro Asp Leu Asn Ser Thr Glu His Phe Gln Ala Ser Ile Gln Asp

            820                 825                 830

Tyr Thr Arg Arg Cys Gly Ser Thr

        835                 840

<210>27

<211>840

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>27

Met Leu Leu Cys Thr Ala Arg Leu Val Gly Leu Gln Leu Leu Ile Ser

 1               5                  10                  15

Cys Cys Trp Ala Phe Ala Cys His Ser Thr Glu Ser Ser Pro Asp Phe

            20                  25                  30

Thr Leu Pro Gly Asp Tyr Leu Leu Ala Gly Leu Phe Pro Leu His Ser

        35                  40                  45

Gly Cys Leu Gln Val Arg His Arg Pro Glu Val Thr Leu Cys Asp Arg

    50                  55                  60

Ser Cys Ser Phe Asn Glu His Gly Tyr His Leu Phe Gln Ala Met Arg

65                  70                  75                  80

Leu Gly Val Glu Glu Ile Asn Asn Ser Thr Ala Leu Leu Pro Asn Ile

                85                  90                  95

Thr Leu Gly Tyr Gln Leu Tyr Asp Val Cys Ser Asp Ser Ala Asn Val

            100                 105                 110

Tyr Ala Thr Leu Arg Val Leu Ser Leu Pro Gly Gln His His Ile Glu

        115                 120                 125

Leu Gln Gly Asp Leu Leu His Tyr Ser Pro Thr Val Leu Ala Val Ile

    130                 135                 140

Gly Pro Asp Ser Thr Asn Arg Ala Ala Thr Thr Ala Ala Leu Leu Ser

145                 150                 155                 160

Pro Phe Leu Val Pro Met Ile Ser TVr Ala Ala Ser Ser Glu Thr Leu

                165                 170                 175

Ser Val Lys Arg Gln Tyr Pro Ser Phe Leu Arg Thr Ile Pro Asn Asp

            180                 185                 190

Lys Tyr Gln Val Glu Thr Met Val Leu Leu Leu Gln Lys Phe Gly Trp

        195                 200                 205

Thr Trp Ile Ser Leu Val Gly Ser Ser Asp Asp Tyr Gly Gln Leu Gly

    210                 215                 220

Val Gln Ala Leu Glu Asn Gln Ala Thr Gly Gln Gly Ile Cys Ile Ala

225                 230                 235                 240

Phe Lys Asp Ile Met Pro Phe Ser Ala Gln Val Gly Asp Glu Arg Met

                245                 250                 255

Gln Cys Leu Met Arg His Leu Ala Gln Ala Gly Ala Thr Val Val Val

            260                 265                 270

Val Phe Ser Ser Arg Gln Leu Ala Arg Val Phe Phe Glu Ser Val Val

        275                 280                 285

Leu Thr Asn Leu Thr Gly Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ala Trp Ala

    290                 295                 300

Leu Ser Arg His Ile Thr Gly Val Pro Gly Ile Gln Arg Ile Gly Met

305                 310                 315                 320

Val Leu Gly Val Ala Ile Gln Lys Arg Ala Val Pro Gly Leu Lys Ala

                325                 330                 335

Phe Glu Glu Ala Tyr Ala Arg Ala Asp Lys Lys Ala Pro Arg Pro Cys

            340                 345                 350

His Lys Gly Ser Trp Cys Ser Ser Asn Gln Leu Cys Arg Glu Cys Gln

        355                 360                 365

Ala Phe Met Ala His Thr Met Pro Lys Leu Lys Ala Phe Ser Met Ser

    370                 375                 380

Ser Ala Tyr Asn Ala Tyr Arg Ala Val Tyr Ala Val Ala His Gly Leu

385                 390                 395                 400

His Gln Leu Leu Gly Cys Ala Ser Gly Ala Cys Ser Arg Gly Arg Val

                405                 410                 415

Tyr Pro Trp Gln Leu Leu Glu Gln Ile His Lys Val His Phe Leu Leu

            420                 425                 430

His Lys Asp Thr Val Ala Phe Asn Asp Asn Arg Asp Pro Leu Ser Ser

        435                 440                 445

Tyr Asn Ile Ile Ala Trp Asp Trp Asn Gly Pro Lys Trp Thr Phe Thr

    450                 455                 460

Val Leu Gly Ser Ser Thr Trp Ser Pro Val Gln Leu Asn Ile Asn Glu

465                 470                 475                 480

Thr Lys Ile Gln Trp His Gly Lys Asp Asn Gln Val Pro Lys Ser Val

                485                 490                 495

Cys Ser Ser Asp Cys Leu Glu Gly His Gln Arg Val Val Thr Gly Phe

            500                 505                 510

His His Cys Cys Phe Glu Cys Val Pro Cys Gly Ala Gly Thr Phe Leu

        515                 520                 525

Asn Lys Ser Asp Leu Tyr Arg Cys Gln Pro Cys Gly Lys Glu Glu Trp

    530                 535                 540

Ala Pro Glu Gly Ser Gln Thr Cys Phe Pro Arg Thr Val Val Phe Leu

545                 550                 555                 560

Glu Trp His Glu Ala Pro Thr Ile Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu

                565                 570                 575

Gly Phe Leu Ser Thr Leu Ala Ile Leu Val Ile Phe Trp Arg His Phe

            580                 585                 590

Gln Thr Pro Ile Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met

        595                 600                 605

Leu Thr Leu Leu Leu Val Ala Tyr Met Val Val Pro Val Tyr Val Gly

    610                 615                 620

Pro Pro Lys Val Ser Thr Cys Leu Cys Arg Gln Ala Leu Phe Pro Leu

625                 630                 635                 640

Cys Phe Thr Ile Cys Ile Ser Cys Ile Ala Val Arg Ser Phe Gln Ile

                645                 650                 655

Val Cys Ala Phe Lys Met Ala Ser Arg Phe Pro Arg Ala Tyr Ser Tyr

            660                 665                 670

Trp Val Arg Tyr Gln Gly Pro Tyr Val Ser Met Ala Phe Ile Thr Val

        675                 680                 685

Leu Lys Met Val Ile Val Val Ile Gly Met Leu Ala Thr Gly Leu Ser

    690                 695                 700

Pro Thr Thr Arg Thr Asp Pro Asp Asp Pro Lys Ile Thr Ile Val Ser

705                 710                 715                 720

Cys Asn Pro Asn Tyr Arg Asn Ser Leu Leu Phe Asn Thr Ser Leu Asp

                725                 730                 735

Leu Leu Leu Ser Val Val Gly Phe Ser Phe Ala Tyr Met Gly Lys Glu

            740                 745                 750

Leu Pro Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr Leu Ser Met Thr

        755                 760                 765

Phe Tyr Phe Thr Ser Ser Val Ser Leu Cys Thr Phe Met Ser Ala Tyr

    770                 775                 780

Ser Gly Val Leu Val Thr Ile Val Asp Leu Leu Val Thr Val Leu Asn

785                 790                 795                 800

Leu Leu Ala Ile Ser Leu Gly Tyr Phe Gly Pro Lys Cys Tyr Met Ile

                805                 810                 815

Leu Phe Tyr Pro Glu Arg Asn Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Ser Met Ile

            820                 825                 830

Gln Gly Tyr Thr Met Arg Arg Asp

        835                 840

<210>28

<211>1123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>28

Leu Gln Val Arg His Arg Pro Glu Val Thr Leu Cys Asp Arg Ser Cys

 1               5                  10                  15

Ser Phe Asn Glu His Gly Tyr His Leu Phe Gln Ala Met Arg Leu Gly

            20                  25                  30

Val Glu Glu Ile Asn Asn Ser Thr Ala Leu Leu Pro Asn Ile Thr Leu

        35                  40                  45

Gly Tyr Gln Leu Tyr Asp Val Cys Ser Asp Ser Ala Asn Val Tyr Ala

    50                  55                  60

Thr Leu Arg Val Leu Ser Leu Pro Gly Gln His His Ile Glu Leu Gln

65                  70                  75                  80

Gly Asp Leu Leu His Tyr Ser Pro Thr Val Leu Ala Val Ile Gly Pro

                85                  90                  95

Asp Ser Thr Asn Arg Ala Ala Thr Thr Ala Ala Leu Leu Ser Pro Phe

            100                 105                 110

Leu Val Pro Met Ile Ser Tyr Ala Ala Ser Ser Glu Thr Leu Ser Val

        115                 120                 125

Lys Arg Gln Tyr Pro Ser Phe Leu Arg Thr Ile Pro Asn Asp Lys Tyr

    130                 135                 140

Gln Val Glu Thr Met Val Leu Leu Leu Gln Lys Phe Gly Trp Thr Trp

145                 150                 155                 160

Ile Ser Leu Val Gly Ser Ser Asp Asp Tyr Gly Gln Leu Gly Val Gln

                165                 170                 175

Ala Leu Glu Asn Gln Ala Thr Gly Gln Gly Ile Cys Ile Ala Phe Lys

            180                 185                 190

Asp Ile Met Pro Phe Ser Ala Gln Val Gly Asp Glu Arg Met Gln Cys

        195                 200                 205

Leu Met Arg His Leu Ala Gln Ala Gly Ala Thr Val Val Val Val Phe

    210                 215                 220

Ser Ser Arg Gln Leu Ala Arg Val Phe Phe Glu Ser Val Val Leu Thr

225                 230                 235                 240

Asn Leu Thr Gly Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ala Trp Ala Leu Ser

                245                 250                 255

Arg His Ile Thr Gly Val Pro Gly Ile Gln Arg Ile Gly Met Val Leu

            260                 265                 270

Gly Val Ala Ile Gln Lys Arg Ala Val Pro Gly Leu Lys Ala Phe Glu

        275                 280                 285

Glu Ala Tyr Ala Arg Ala Asp Lys Lys Ala Pro Arg Pro Cys His Lys

    290                 295                 300

Gly Ser Trp Cys Ser Ser Asn Gln Leu Cys Arg Glu Cys Gln Ala Phe

305                 310                 315                 320

Met Ala His Thr Met Pro Lys Leu Lys Ala Phe Ser Met Ser Ser Ala

                325                 330                 335

Tyr Asn Ala Tyr Arg Ala Val Tyr Ala Val Ala His Gly Leu His Gln

            340                 345                 350

Leu Leu Gly Cys Ala Ser Gly Ala Cys Ser Arg Gly Arg Val Tyr Pro

        355                 360                 365

Trp Gln Leu Leu Glu Gln Ile His Lys Val His Phe Leu Leu His Lys

    370                 375                 380

Asp Thr Val Ala Phe Asn Asp Asn Arg Asp Pro Leu Ser Ser Tyr Asn

385                 390                 395                 400

Ile Ile Ala Trp Asp Trp Asn Gly Pro Lys Trp Thr Phe Thr Val Leu

                405                 410                 415

Gly Ser Ser Thr Trp Ser Pro Val Gln Leu Asn Ile Asn Glu Thr Lys

            420                 425                 430

Ile Gln Trp His Gly Lys Asp Asn Gln Val Pro Lys Ser Val Cys Ser

        435                 440                 445

Ser Asp Cys Leu Glu Gly His Gln Arg Val Val Thr Gly Phe His His

    450                 455                 460

Cys Cys Phe Glu Cys Val Pro Cys Gly Ala Gly Thr Phe Leu Asn Lys

465                 470                 475                 480

Ser Asp Leu Tyr Arg Cys Gln Pro Cys Gly Lys Glu Glu Trp Ala Pro

                485                 490                 495

Glu Gly Ser Gln Thr Cys Phe Pro Arg Thr Val Val Phe Leu Glu Trp

            500                 505                 510

Ser Asp Ile Glu Ser Ile Ile Ala Ile Ala Phe Ser Cys Leu Gly Ile

        515                 520                 525

Leu Val Thr Leu Phe Val Thr Leu Ile Phe Val Leu Tyr Arg Asp Thr

    530                 535                 540

Pro Val Val Lys Ser Ser Ser Arg Glu Leu Cys Tyr Ile Ile Leu Ala

545                 550                 555                 560

Gly Ile Phe Leu Gly Tyr Val Cys Pro Phe Thr Leu Ile Ala Lys Pro

                565                 570                 575

Thr Thr Thr Ser Cys Tyr Leu Gln Arg Leu Leu Val Gly Leu Ser Ser

            580                 585                 590

Ala Met Cys Tyr Ser Ala Leu Val Thr Lys Thr Asn Arg Ile Ala Arg

        595                 600                 605

Ile Leu Ala Gly Ser Lys Lys Lys Ile Cys Thr Arg Lys Pro Arg Phe

    610                 615                 620

Met Ser Ala Trp Ala Gln Val Ile Ile Ala Ser Ile Leu Ile Ser Val

625                 630                 635                 640

Gln Leu Thr Leu Val Val Thr Leu Ile Ile Met Glu Pro Pro Met Pro

                645                 650                 655

Ile Leu Ser Tyr Pro Ser Ile Lys Glu Val Tyr Leu Ile Cys Asn Thr

            660                 665                 670

Ser Asn Leu Gly Val Val Ala Pro Val Gly Tyr Asn Gly Leu Leu Ile

        675                 680                 685

Met Ser Cys Thr Tyr Tyr Ala Phe Lys Thr Arg Asn Val Pro Ala Asn

    690                 695                 700

Phe Asn Glu Ala Lys Tyr Ile Ala Phe Thr Met Tyr Thr Thr Cys Ile

705                 710                 715                 720

Ile Trp Leu Ala Phe Val Pro Ile Tyr Pne Gly Ser Asn Tyr Lys Ile

                725                 730                 735

Ile Thr Thr Cys Phe Ala Val Ser Leu Ser Val Thr Val Ala Leu Gly

            740                 745                 750

Cys Met Phe Thr Pro Lys Met Tyr Ile Ile Ile Ala Lys Pro Glu Arg

        755                 760                 765

Asn Val Arg Ser Ala Phe Thr Thr Ser Asp Val Val Arg Met His Val

    770                 775                 780

Gly Asp Gly Lys Leu Pro Cys Arg Ser Asn Thr Phe Leu Asn Ile Phe

785                 790                 795                 800

Arg Arg Lys Lys Pro Gly Ala Gly Asn Ala Asn Ser Asn Gly Lys Ser

                805                 810                 815

Val Ser Trp Ser Glu Pro Gly Gly Arg Gln Ala Pro Lys Gly Gln His

            820                 825                 830

Val Trp Gln Arg Leu Ser Val His Val Lys Thr Asn Glu Thr Ala Cys

        835                 840                 845

Asn Gln Thr Ala Val Ile Lys Pro Leu Thr Lys Ser Tyr Gln Gly Ser

    850                 855                 860

Gly Lys Ser Leu Thr Phe Ser Asp Ala Ser Thr Lys Thr Leu Tyr Asn

865                 870                 875                 880

Val Glu Glu Glu Asp Asn Thr Pro Ser Ala His Phe Ser Pro Pro Ser

                885                 890                 895

Ser Pro Ser Met Val Val His Arg Arg Gly Pro Pro Val Ala Thr Thr

            900                 905                 910

Pro Pro Leu Pro Pro His Leu Thr Ala Glu Glu Thr Pro Leu Phe Leu

        915                 920                 925

Ala Asp Ser Val Ile Pro Lys Gly Leu Pro Pro Pro Leu Pro Gln Gln

    930                 935                 940

Gln Pro Gln Gln Pro Pro Pro Gln Gln Pro Pro Gln Gln Pro Lys Ser

945                 950                 955                 960

Leu Met Asp Gln Leu Gln Gly Val Val Thr Asn Phe Gly Ser Gly Ile

                965                 970                 975

Pro Asp Phe His Ala Val Leu Ala Gly Pro Gly Thr Pro Gly Asn Ser

            980                 985                 990

Leu Arg Ser Leu Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln His Leu Gln Met

        995                 1000                1005

Leu Pro Leu His Leu Ser Thr Phe Gln Glu Glu Ser Ile Ser Pro Pro

    1010                1015                1020

Gly Glu Asp Ile Asp Asp Asp Ser Glu Arg Phe Lys Leu Leu Gln Glu

1025                1030                1035                1040

Phe Val Tyr Glu Arg Glu Gly Asn Thr Glu Glu Asp Glu Leu Glu Glu

                1045                1050                1055

Glu Glu Asp Leu Pro Thr Ala Ser Lys Leu Thr Pro Glu Asp Ser Pro

            1060                1065                1070

Ala Leu Thr Pro Pro Ser Pro Phe Arg Asp Ser Val Ala Ser Gly Ser

        1075                1080                1085

Ser Val Pro Ser Ser Pro Val Ser Glu Ser Val Leu Cys Thr Pro Pro

    1090                1095                1100

Asn Val Thr Tyr Ala Ser Val Ile Leu Arg Asp Tyr Lys Gln Ser Ser

1105                1110                1115                1120

Ser Thr Leu

<210>29

<211>1172

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>29

Met Gly Pro Arg Ala Lys Thr Ile Cys Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp

 1               5                  10                  15

Val Leu Ala Glu Pro Ala Glu Asn Ser Asp Phe Tyr Leu Pro Gly Asp

            20                  25                  30

Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Leu His Ala Asn Met Lys Gly Ile

        35                  40                  45

Val His Leu Asn Phe Leu Gln Val Pro Met Cys Lys Glu Tyr Glu Val

    50                  55                  60

Lys Val Ile Gly Tyr Asn Leu Met Gln Ala Met Arg Phe Ala Val Glu

65                  70                  75                  80

Glu Ile Asn Asn Asp Ser Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu Leu Gly Tyr

                85                  90                  95

Glu Ile Val Asp Val Cys Tyr Ile Ser Asn Asn Val Gln Pro Val Leu

            100                 105                 110

Tyr Phe Leu Ala His Glu Asp Asn Leu Leu Pro Ile Gln Glu Asp Tyr

        115                 120                 125

Ser Asn Tyr Ile Ser Arg Val Val Ala Val Ile Gly Pro Asp ASn Ser

    130                 135                 140

Glu Ser Val Met Thr Val Ala Asn Phe Leu Ser Leu Phe Leu Leu Pro

145                 150                 155                 160

Gln Ile Thr Tyr Ser Ala Ile Ser Asp Glu Leu Arg Asp Lys Val Arg

                165                 170                 175

Phe Pro Ala Leu Leu Arg Thr Thr Pro Ser Ala Asp His His Val Glu

            180                 185                 190

Ala Met Val Gln Leu Met Leu His Phe Arg Trp Asn Trp Ile Ile Val

        195                 200                 205

Leu Val Ser Ser Asp Thr Tyr Gly Arg Asp Asn Gly Gln Leu Leu Gly

    210                 215                 220

Glu Arg Val Ala Arg Arg Asp Ile Cys Ile Ala Phe Gln Glu Thr Leu

225                 230                 235                 240

Pro Thr Leu Gln Pro Asn Gln Asn Met Thr Ser Glu Glu Arg Gln Arg

                245                 250                 255

Leu Val Thr Ile Val Asp Lys Leu Gln Gln Ser Thr Ala Arg Val Val

            260                 265                 270

Val Val Phe Ser Pro Asp Leu Thr Leu Tyr His Phe Phe Asn Glu Val

        275                 280                 285

Leu Arg Gln Asn Phe Thr Gly Ala Val Trp Ile Ala Ser Glu Ser Trp

    290                 295                 300

Ala Ile Asp Pro Val Leu His Asn Leu Thr Glu Leu Gly His Leu Gly

305                 310                 315                 320

Thr Phe Leu Gly Ile Thr Ile Gln Ser Val Pro Ile Pro Gly Phe Ser

                325                 330                 335

Glu Phe Arg Glu Trp Gly Pro Gln Ala Gly Pro Pro Pro Leu Ser Arg

            340                 345                 350

Thr Ser Gln Ser Tyr Thr Cys Asn Gln Glu Cys Asp Asn Cys Leu Asn

        355                 360                 365

Ala Thr Leu Ser Phe Asn Thr Ile Leu Arg Leu Ser Gly Glu Arg Val

    370                 375                 380

Val Tyr Ser Val Tyr Ser Ala Val Tyr Ala Val Ala His Ala Leu His

385                 390                 395                 400

Ser Leu Leu Gly Cys Asp Lys Ser Thr Cys Thr Lys Arg Val Val Tyr

                405                 410                 415

Pro Trp Gln Leu Leu Glu Glu Ile Trp Lys Val Asn Phe Thr Leu Leu

            420                 425                 430

Asp His Gln Ile Phe Phe Asp Pro Gln Gly Asp Val Ala Leu His Leu

        435                 440                 445

Glu Ile Val Gln Trp Gln Trp Asp Arg Ser Gln Asn Pro Phe Gln Ser

    450                 455                 460

Val Ala Ser Tyr Tyr Pro Leu Gln Arg Gln Leu Lys Asn Ile Gln Asp

465                 470                 475                 480

Ile Ser Trp His Thr Val Asn Asn Thr Ile Pro Met Ser Met Cys Ser

                485                 490                 495

Lys Arg Cys Gln Ser Gly Gln Lys Lys Lys Pro Val Gly Ile His Val

            500                 505                 510

Cys Cys Phe Glu Cys Ile Asp Cys Leu Pro Gly Thr Phe Leu Asn His

        515                 520                 525

Thr Glu Asp Glu Tyr Glu Cys Gln Ala Cys Pro Asn Asn Glu Trp Ser

    530                 535                 540

Tyr Gln Ser Glu Thr Ser Cys Phe Lys Arg Gln Leu Val Phe Leu Glu

545                 550                 555                 560

Trp Ser Asp Ile Glu Ser Ile Ile Ala Ile Ala Phe Ser Cys Leu Gly

                565                 570                 575

Ile Leu Val Thr Leu Phe Val Thr Leu Ile Phe Val Leu Tyr Arg Asp

            580                 585                 590

Thr Pro Val Val Lys Ser Ser Ser Arg Glu Leu Cys Tyr Ile Ile Leu

        595                 600                 605

Ala Gly Ile Phe Leu Gly Tyr Val Cys Pro Phe Thr Leu Ile Ala Lys

    610                 615                 620

Pro Thr Thr Thr Ser Cys Tyr Leu Gln Arg Leu Leu Val Gly Leu Ser

625                 630                 635                 640

Ser Ala Met Cys Tyr Ser Ala Leu Val Thr Lys Thr Asn Arg Ile Ala

                645                 650                 655

Arg Ile Leu Ala Gly Ser Lys Lys Lys Ile Cys Thr Arg Lys Pro Arg

            660                 665                 670

Phe Met Ser Ala Trp Ala Gln Val Ile Ile Ala Ser Ile Leu Ile Ser

        675                 680                 685

Val Gln Leu Thr Leu Val Val Thr Leu Ile Ile Met Glu Pro Pro Met

    690                 695                 700

Pro Ile Leu Ser Tyr Pro Ser Ile Lys Glu Val Tyr Leu Ile Cys Asn

705                 710                 715                 720

Thr Ser Asn Leu Gly Val Val Ala Pro Val Gly Tyr Asn Gly Leu Leu

                725                 730                 735

Ile Met Ser Cys Thr Tyr Tyr Ala Phe Lys Thr Arg Asn Val Pro Ala

            740                 745                 750

Asn Phe Asn Glu Ala Lys Tyr Ile Ala Phe Thr Met Tyr Thr Thr Cys

        755                 760                 765

Ile Ile Trp Leu Ala Phe Val Pro Ile Tyr Phe Gly Ser Asn Tyr Lys

    770                 775                 780

Ile Ile Thr Thr Cys Phe Ala Val Ser Leu Ser Val Thr Val Ala Leu

785                 790                 795                 800

Gly Cys Met Phe Thr Pro Lys Met Tyr Ile Ile Ile Ala Lys Pro Glu

                805                 810                 815

Arg Asn Val Arg Ser Ala Phe Thr Thr Ser Asp Val Val Arg Met His

            820                 825                 830

Val Gly Asp Gly Lys Leu Pro Cys Arg Ser Asn Thr Phe Leu Asn Ile

        835                 840                 845

Phe Arg Arg Lys Lys Pro Gly Ala Gly Asn Ala Asn Ser Asn Gly Lys

    850                 855                 860

Ser Val Ser Trp Ser Glu Pro Gly Gly Arg Gln Ala Pro Lys Gly Gln

865                 870                 875                 880

His Val Trp Gln Arg Leu Ser Val His Val Lys Thr Asn Glu Thr Ala

                885                 890                 895

Cys Asn Gln Thr Ala Val Ile Lys Pro Leu Thr Lys Ser Tyr Gln Gly

            900                 905                 910

Ser Gly Lys Ser Leu Thr Phe Ser Asp Ala Ser Thr Lys Thr Leu Tyr

        915                 920                 925

Asn Val Glu Glu Glu Asp Asn Thr Pro Ser Ala His Phe Ser Pro Pro

    930                 935                 940

Ser Ser Pro Ser Met Val Val His Arg Arg Gly Pro Pro Val Ala Thr

945                 950                 955                 960

Thr Pro Pro Leu Pro Pro His Leu Thr Ala Glu Glu Thr Pro Leu Phe

                965                 970                 975

Leu Ala Asp Ser Val Ile Pro Lys Gly Leu Pro Pro Pro Leu Pro Gln

            980                 985                 990

Gln Gln Pro Gln Gln Pro Pro Pro Gln Gln Pro Pro Gln Gln Pro Lys

        995                 1000                1005

Ser Leu Met Asp Gln Leu Gln Gly Val Val Thr Asn Phe Gly Ser Gly

    1010                1015                1020

Ile Pro Asp Phe His Ala Val Leu Ala Gly Pro Gly Thr Pro Gly Asn

1025                1030                1035                1040

Ser Leu Arg Ser Leu Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln His Leu Gln

                1045                1050                1055

Met Leu Pro Leu His Leu Ser Thr Phe Gln Glu Glu Ser Ile Ser Pro

            1060                1065                1070

Pro Gly Glu Asp Ile Asp Asp Asp Ser Glu Arg Phe Lys Leu Leu Gln

        1075                1080                1085

Glu Phe Val Tyr Glu Arg Glu Gly Asn Thr Glu Glu Asp Glu Leu Glu

    1090                1095                1100

Glu Glu Glu Asp Leu Pro Thr Ala Ser Lys Leu Thr Pro Glu Asp Ser

1105                1110                1115                1120

Pro Ala Leu Thr Pro Pro Ser Pro Phe Arg Asp Ser Val Ala Ser Gly

                1125                1130                1135

Ser Ser Val Pro Ser Ser Pro Val Ser Glu Ser Val Leu Cys Thr Pro

            1140                1145                1150

Pro Asn Val Thr Tyr Ala Ser Val Ile Leu Arg Asp Tyr Lys Gln Ser

        1155                1160                1165

Ser Ser Thr Leu

    1170

<210>30

<211>1175

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>30

Met Leu Gly Pro Ala Val Leu Gly Leu Ser Leu Trp Ala Leu Leu His

 l               5                  10                  15

Pro Gly Thr Gly Ala Pro Leu Cys Leu Ser Gln Gln Leu Arg Met Lys

            20                  25                  30

Gly Asp Tyr Val Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Glu Ala Glu Glu

        35                  40                  45

Ala Gly Leu Arg Ser Arg Thr Arg Pro Ser Ser Pro Val Cys Thr Arg

    50                  55                  60

Phe Ser Ser Asn Gly Leu Leu Trp Ala Leu Ala Met Lys Met Ala Val

65                  70                  75                  80

Glu Glu Ile Asn Asn Lys Ser Asp Leu Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly

                85                  90                  95

Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Cys Ser Glu Pro Val Val Ala Met Lys Pro

            100                 105                 110

Ser Leu Met Phe Leu Ala Lys Ala Gly Ser Arg Asp Ile Ala Ala Tyr

        115                 120                 125

Cys Asn Tyr Thr Gln Tyr Gln Pro Arg Val Leu Ala Val Ile Gly Pro

    130                 135                 140

His Ser Ser Glu Leu Ala Met Val Thr Gly Lys Phe Phe Ser Phe Phe

145                 150                 155                 160

Leu Met Pro Gln Val Ser Tyr Gly Ala Ser Met Glu Leu Leu Ser Ala

                165                 170                 175

Arg Glu Thr Phe Pro Ser Phe Phe Arg Thr Val Pro Ser Asp Arg Val

            180                 185                 190

Gln Leu Thr Ala Ala Ala Glu Leu Leu Gln Glu Phe Gly Trp Asn Trp

        195                 200                 205

Val Ala Ala Leu Gly Ser Asp Asp Glu Tyr Gly Arg Gln Gly Leu Ser

    210                 215                 220

Ile Phe Ser Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Ile Cys Ile Ala His Glu

225                 230                 235                 240

Gly Leu Val Pro Leu Pro Arg Ala Asp Asp Ser Arg Leu Gly Lys Val

                245                 250                 255

Gln Asp Val Leu His Gln Val Asn Gln Ser Ser Val Gln Val Val Leu

            260                 265                 270

Leu Phe Ala Ser Val His Ala Ala His Ala Leu Phe Asn Tyr Ser Ile

        275                 280                 285

Ser Ser Arg Leu Ser Pro Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ala Trp Leu

    290                 295                 300

Thr Ser Asp Leu Val Met Gly Leu Pro Gly Met Ala Gln Met Gly Thr

305                 310                 315                 320

Val Leu Gly Phe Leu Gln Arg Gly Ala Gln Leu His Glu Phe Pro Gln

                325                 330                 335

Tyr Val Lys Thr His Leu Ala Leu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Cys Ser

            340                 345                 350

Ala Leu Gly Glu Arg Glu Gln Gly Leu Glu Glu Asp Val Val Gly Gln

        355                 360                 365

Arg Cys Pro Gln Cys Asp Cys Ile Thr Leu Gln Asn Val Ser Ala Gly

    370                 375                 380

Leu Asn His His Gln Thr Phe Ser Val Tyr Ala Ala Val Tyr Ser Val

385                 390                 395                 400

Ala Gln Ala Leu His Asn Thr Leu Gln Cys Asn Ala Ser Gly Cys Pro

                405                 410                 415

Ala Gln Asp Pro Val Lys Pro Trp Gln Leu Leu Glu Asn Met Tyr Asn

            420                 425                 430

Leu Thr Phe His Val Gly Gly Leu Pro Leu Arg Phe Asp Ser Ser Gly

        435                 440                 445

Asn Val Asp Met Glu Tyr Asp Leu Lys Leu Trp Val Trp Gln Gly Ser

    450                 455                 460

Val Pro Arg Leu His Asp Val Gly Arg Phe Asn Gly Ser Leu Arg Thr

465                 470                 475                 480

Glu Arg Leu Lys Ile Arg Trp His Thr Ser Asp Asn Gln Lys Pro Val

                485                 490                 495

Ser Arg Cys Ser Arg Gln Cys Gln Glu Gly Gln Val Arg Arg Val Lys

            500                 505                 510

Gly Phe His Ser Cys Cys Tyr Asp Cys Val Asp Cys Glu Ala Gly Ser

        515                 520                 525

Tyr Arg Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ala Cys Thr Phe Cys Gly Gln Asp

    530                 535                 540

Glu Trp Ser Pro Glu Arg Ser Thr Arg Cys Phe Arg Arg Arg Ser Arg

545                 550                 555                 560

Phe Leu Glu Trp Ser Asp Ile Glu Ser Ile Ile Ala Ile Ala Phe Ser

                565                 570                 575

Cys Leu Gly Ile Leu Val Thr Leu Phe Val Thr Leu Ile Phe Val Leu

            580                 585                 590

Tyr Arg Asp Thr Pro Val Val Lys Ser Ser Ser Arg Glu Leu Cys Tyr

        595                 600                 605

Ile Ile Leu Ala Gly Ile Phe Leu Gly Tyr Val Cys Pro Phe Thr Leu

    610                 615                 620

Ile Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ser Cys Tyr Leu Gln Arg Leu Leu Val

625                 630                 635                 640

Gly Leu Ser Ser Ala Met Cys Tyr Ser Ala Leu Val Thr Lys Thr Asn

                645                 650                 655

Arg Ile Ala Arg Ile Leu Ala Gly Ser Lys Lys Lys Ile Cys Thr Arg

            660                 665                 670

Lys Pro Arg Phe Met Ser Ala Trp Ala Gln Val Ile Ile Ala Ser Ile

        675                 680                 685

Leu Ile Ser Val Gln Leu Thr Leu Val Val Thr Leu Ile Ile Met Glu

    690                 695                 700

Pro Pro Met Pro Ile Leu Ser Tyr Pro Ser Ile Lys Glu Val Tyr Leu

705                 710                 715                 720

Ile Cys Asn Thr Ser Asn Leu Gly Val Val Ala Pro Val Gly Tyr Asn

                725                 730                 735

Gly Leu Leu Ile Met Ser Cys Thr Tyr Tyr Ala Phe Lys Thr Arg Asn

            740                 745                 750

Val Pro Ala Asn Phe Asn Glu Ala Lys Tyr Ile Ala Phe Thr Met Tyr

        755                 760                 765

Thr Thr Cys Ile Ile Trp Leu Ala Phe Val Pro Ile Tyr Phe Gly Ser

    770                 775                 780

Asn Tyr Lys Ile Ile Thr Thr Cys Phe Ala Val Ser Leu Ser Val Thr

785                 790                 795                 800

Val Ala Leu Gly Cys Met Phe Thr Pro Lys Met Tyr Ile Ile Ile Ala

                805                 810                 815

Lys Pro Glu Arg Asn Val Arg Ser Ala Phe Thr Thr Ser Asp Val Val

            820                 825                 830

Arg Met His Val Gly Asp Gly Lys Leu Pro Cys Arg Ser Asn Thr Phe

        835                 840                 845

Leu Asn Ile Phe Arg Arg Lys Lys Pro Gly Ala Gly Asn Ala Asn Ser

    850                 855                 860

Asn Gly Lys Ser Val Ser Trp Ser Glu Pro Gly Gly Arg Gln Ala Pro

865                 870                 875                 880

Lys Gly Gln His Val Trp Gln Arg Leu Ser Val His Val Lys Thr Asn

                885                 890                 895

Glu Thr Ala Cys Asn Gln Thr Ala Val Ile Lys Pro Leu Thr Lys Ser

            900                 905                 910

Tyr Gln Gly Ser Gly Lys Ser Leu Thr Phe Ser Asp Ala Ser Thr Lys

        915                 920                 925

Thr Leu Tyr Asn Val Glu Glu Glu Asp Asn Thr Pro Ser Ala His Phe

    930                 935                 940

Ser Pro Pro Ser Ser Pro Ser Met Val Val His Arg Arg Gly Pro Pro

945                 950                 955                 960

Val Ala Thr Thr Pro Pro Leu Pro Pro His Leu Thr Ala Glu Glu Thr

                965                 970                 975

Pro Leu Phe Leu Ala Asp Ser Val Ile Pro Lys Gly Leu Pro Pro Pro

            980                 985                 990

Leu Pro Gln Gln Gln Pro Gln Gln Pro Pro Pro Gln Gln Pro Pro Gln

        995                 1000                1005

Gln Pro Lys Ser Leu Met Asp Gln Leu Gln Gly Val Val Thr Asn Phe

    1010                1015                1020

Gly Ser Gly Ile Pro Asp Phe His Ala Val Leu Ala Gly Pro Gly Thr

1025                1030                1035                1040

Pro Gly Asn Ser Leu Arg Ser Leu Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln

                1045                1050                1055

His Leu Gln Met Leu Pro Leu His Leu Ser Thr Phe Gln Glu Glu Ser

            1060                1065                1070

Ile Ser Pro Pro Gly Glu Asp Ile Asp Asp Asp Ser Glu Arg Phe Lys

        1075                1080                1085

Leu Leu Gln Glu Phe Val Tyr Glu Arg Glu Gly Asn Thr Glu Glu Asp

    1090                1095                1100

Glu Leu Glu Glu Glu Glu Asp Leu Pro Thr Ala Ser Lys Leu Thr Pro

1105                1110                1115                1120

Glu Asp Ser Pro Ala Leu Thr Pro Pro Ser Pro Phe Arg Asp Ser Val

                1125                1130                1135

Ala Ser Gly Ser Ser Val Pro Ser Ser Pro Val Ser Glu Ser Val Leu

            1140                1145                1150

Cys Thr Pro Pro Asn Val Thr Tyr Ala Ser Val Ile Leu Arg Asp Tyr

        1155                1160                1165

Lys Gln Ser Ser Ser Thr Leu

    1170                1175

<210>31

<211>867

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>31

Met Val Arg Leu Leu Leu Ile Phe Phe Pro Met Ile Phe Leu Glu Met

 1               5                  10                  15

Ser Ile Leu Pro Arg Met Pro Asp Arg Lys Val Leu Leu Ala Gly Ala

            20                  25                  30

Ser Ser Gln Arg Ser Val Ala Arg Met Asp Gly Asp Val Ile Ile Gly

        35                  40                  45

Ala Leu Phe Ser Val His His Gln Pro Pro Ala Glu Lys Val Pro Glu

    50                  55                  60

Arg Lys Cys Gly Glu Ile Arg Glu Gln Tyr Gly Ile Gln Arg Val Glu

65                  70                  75                  80

Ala Met Phe His Thr Leu Asp Lys Ile Asn Ala Asp Pro Val Leu Leu

                85                  90                  95

Pro Asn Ile Thr Leu Gly Ser Glu Ile Arg Asp Ser Cys Trp His Ser

            100                 105                 110

Ser Val Ala Leu Glu Gln Ser Ile Glu Phe Ile Arg Asp Ser Leu Ile

        115                 120                 125

Ser Ile Arg Asp Glu Lys Asp Gly Leu Asn Arg Cys Leu Pro Asp Gly

    130                 135                 140

Gln Thr Leu Pro Pro Gly Arg Thr Lys Lys Pro Ile Ala Gly Val Ile

145                 150                 155                 160

Gly Pro Gly Ser Ser Ser Val Ala Ile Gln Val Gln Asn Leu Leu Gln

                165                 170                 175

Leu Phe Asp Ile Pro Gln Ile Ala Tyr Ser Ala Thr Ser Ile Asp Leu

            180                 185                 190

Ser Asp Lys Thr Leu Tyr Lys Tyr Phe Leu Arg Val Val Pro Ser Asp

        195                 200                 205

Thr Leu Gln Ala Arg Ala Met Leu Asp Ile Val Lys Arg Tyr Asn Trp

    210                 215                 220

Thr Tyr Val Ser Ala Val His Thr Glu Gly Asn Tyr Gly Glu Ser Gly

225                 230                 235                 240

Met Asp Ala Phe Lys Glu Leu Ala Ala Gln Glu Gly Leu Cys Ile Ala

                245                 250                 255

His Ser Asp Lys Ile Tyr Ser Asn Ala Gly Glu Lys Ser Phe Asp Arg

            260                 265                 270

Leu Leu Arg Lys Leu Arg Glu Arg Leu Pro Lys Ala Arg Val Val Val

        275                 280                 285

Cys Phe Cys Glu Gly Met Thr Val Arg Gly Leu Leu Ser Ala Met Arg

    290                 295                 300

Arg Leu Gly Val Val Gly Glu Phe Ser Leu Ile Gly Ser Asp Gly Trp

305                 310                 315                 320

Ala Asp Arg Asp Glu Val Ile Glu Gly Tyr Glu Val Glu Ala Asn Gly

                325                 330                 335

Gly Ile Thr Ile Lys Leu Gln Ser Pro Glu Val Arg Ser Phe Asp Asp

            340                 345                 350

Tyr Phe Leu Lys Leu Arg Leu Asp Thr Asn Thr Arg Asn Pro Trp Phe

        355                 360                 365

Pro Glu Phe Trp Gln His Arg Phe Gln Cys Arg Leu Pro Gly His Leu

    370                 375                 380

Leu Glu Asn Pro Asn Phe Lys Lys Val Cys Thr Gly Asn Glu Ser Leu

385                 390                 395                 400

Glu Glu Asn Tyr Val Gln Asp Ser Lys Met Gly Phe Val Ile Asn Ala

                405                 410                 415

Ile Tyr Ala Met Ala His Gly Leu Gln Asn Met His His Ala Leu Cys

            420                 425                 430

Pro Gly His Val Gly Leu Cys Asp Ala Met Lys Pro Ile Asp Gly Arg

        435                 440                 445

Lys Leu Leu Asp Phe Leu Ile Lys Ser Ser Phe Val Gly Val Ser Gly

    450                 455                 460

Glu Glu Val Trp Phe Asp Glu Lys Gly Asp Ala Pro Gly Arg Tyr Asp

465                 470                 475                 480

Ile Met Asn Leu Gln Tyr Thr Glu Ala Asn Arg Tyr Asp Tyr Val His

                485                 490                 495

Val Gly Thr Trp His Glu Gly Val Leu Asn Ile Asp Asp Tyr Lys Ile

            500                 505                 510

Gln Met Asn Lys Ser Gly Met Val Arg Ser Val Cys Ser Glu Pro Cys

        515                 520                 525

Leu Lys Gly Gln Ile Lys Val Ile Arg Lys Gly Glu Val Ser Cys Cys

    530                 535                 540

Trp Ile Cys Thr Ala Cys Lys Glu Asn Glu Phe Val Gln Asp Glu Phe

545                 550                 555                 560

Thr Cys Arg Ala Cys Asp Leu Gly Trp Trp Pro Asn Ala Glu Leu Thr

                565                 570                 575

Gly Cys Glu Pro Ile Pro Val Arg Tyr Leu Glu Leu Arg Glu His Thr

            580                 585                 590

Ser Trp Val Leu Leu Ala Ala Asn Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

        595                 600                 605

Gly Thr Ala Gly Leu Phe Ala Trp His Leu Asp Thr Pro Val Val Arg

    610                 615                 620

Ser Ala Gly Gly Arg Leu Cys Phe Leu Met Leu Gly Ser Leu Ala Ala

625                 630                 635                 640

Gly Ser Gly Ser Leu Tyr Gly Phe Phe Gly Glu Pro Thr Arg Pro Ala

                645                 650                 655

Cys Leu Leu Arg Gln Ala Leu Phe Ala Leu Gly Phe Thr Ile Phe Leu

            660                 665                 670

Ser Cys Leu Thr Val Arg Ser Phe Gln Leu Ile Ile Ile Phe Lys Phe

        675                 680                 685

Ser Thr Lys Val Pro Thr Phe Tyr His Ala Trp Val Gln Asn His Gly

    690                 695                 700

Ala Gly Leu Phe Val Met Ile Ser Ser Ala Ala Gln Leu Leu Ile Cys

705                 710                 715                 720

Leu Thr Trp Leu Val Val Trp Thr Pro Leu Pro Ala Arg Glu Tyr Gln

                725                 730                 735

Arg Phe Pro His Leu Val Met Leu Glu Cys Thr Glu Thr Asn Ser Leu

            740                 745                 750

Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu Tyr Asn Gly Leu Leu Ser Ile Ser Ala

        755                 760                 765

Phe Ala Cys Ser Tyr Leu Gly Lys Asp Leu Pro Glu Asn Tyr Asn Glu

    770                 775                 780

Ala Lys Cys Val Thr Phe Ser Leu Leu Phe Asn Phe Val Ser Trp Ile

785                 790                 795                 800

Ala Phe Phe Thr Thr Ala Ser Val Tyr Asp Gly Lys Tyr Leu Pro Ala

                805                 810                 815

Ala Asn Met Met Ala Gly Leu Ser Ser Leu Ser Ser Gly Phe Gly Gly

            820                 825                 830

Tyr Phe Leu Pro Lys Cys Tyr Val Ile Leu Cys Arg Pro Asp Leu Asn

        835                 840                 845

Ser Thr Glu His Phe Gln Ala Ser Ile Gln Asp Tyr Thr Arg Arg Cys

    850                 855                 860

Gly Ser Thr

865

<210>32

<211>866

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>32

Met Val Arg Leu Leu Leu Ile Phe Phe Pro Met Ile Phe Leu Glu Met

 1               5                  10                  15

Ser Ile Leu Pro Arg Met Pro Asp Arg Lys Val Leu Leu Ala Gly Ala

            20                  25                  30

Ser Ser Gln Arg Ser Val Ala Arg Met Asp Gly Asp Val Ile Ile Gly

        35                  40                  45

Ala Leu Phe Ser Val His His Gln Pro Pro Ala Glu Lys Val Pro Glu

    50                  55                  60

Arg Lys Cys Gly Glu Ile Arg Glu Gln Tyr Gly Ile Gln Arg Val Glu

65                  70                  75                  80

Ala Met Phe His Thr Leu Asp Lys Ile Asn Ala Asp Pro Val Leu Leu

                85                  90                  95

Pro Asn Ile Thr Leu Gly Ser Glu Ile Arg Asp Ser Cys Trp His Ser

            100                 105                 110

Ser Val Ala Leu Glu Gln Ser Ile Glu Phe Ile Arg Asp Ser Leu Ile

        115                 120                 125

Ser Ile Arg Asp Glu Lys Asp Gly Leu Asn Arg Cys Leu Pro Asp Gly

    130                 135                 140

Gln Thr Leu Pro Pro Gly Arg Thr Lys Lys Pro Ile Ala Gly Val Ile

145                 150                 155                 160

Gly Pro Gly Ser Ser Ser Val Ala Ile Gln Val Gln Asn Leu Leu Gln

                165                 170                 175

Leu Phe Asp Ile Pro Gln Ile Ala Tyr Ser Ala Thr Ser Ile Asp Leu

            180                 185                 190

Ser Asp Lys Thr Leu Tyr Lys Tyr Phe Leu Arg Val Val Pro Ser Asp

        195                 200                 205

Thr Leu Gln Ala Arg Ala Met Leu Asp Ile Val Lys Arg Tyr Asn Trp

    210                 215                 220

Thr Tyr Val Ser Ala Val His Thr Glu Gly Asn Tyr Gly Glu Ser Gly

225                 230                 235                 240

Met Asp Ala Phe Lys Glu Leu Ala Ala Gln Glu Gly Leu Cys Ile Ala

                245                 250                 255

His Ser Asp Lys Ile Tyr Ser Asn Ala Gly Glu Lys Ser Phe Asp Arg

            260                 265                 270

Leu Leu Arg Lys Leu Arg Glu Arg Leu Pro Lys Ala Arg Val Val Val

        275                 280                 285

Cys Phe Cys Glu Gly Met Thr Val Arg Gly Leu Leu Ser Ala Met Arg

    290                 295                 300

Arg Leu Gly Val Val Gly Glu Phe Ser Leu Ile Gly Ser Asp Gly Trp

305                 310                 315                 320

Ala Asp Arg Asp Glu Val Ile Glu Gly Tyr Glu Val Glu Ala Asn Gly

                325                 330                 335

Gly Ile Thr Ile Lys Leu Gln Ser Pro Glu Val Arg Ser Phe Asp Asp

            340                 345                 350

Tyr Phe Leu Lys Leu Arg Leu Asp Thr Asn Thr Arg Asn Pro Trp Phe

        355                 360                 365

Pro Glu Phe Trp Gln His Arg Phe Gln Cys Arg Leu Pro Gly His Leu

    370                 375                 380

Leu Glu Asn Pro Asn Phe Lys Lys Val Cys Thr Gly Asn Glu Ser Leu

385                 390                 395                 400

Glu Glu Asn Tyr Val Gln Asp Ser Lys Met Gly Phe Val Ile Asn Ala

                405                 410                 415

Ile Tyr Ala Met Ala His Gly Leu Gln Asn Met His His Ala Leu Cys

            420                 425                 430

Pro Gly His Val Gly Leu Cys Asp Ala Met Lys Pro Ile Asp Gly Arg

        435                 440                 445

Lys Leu Leu Asp Phe Leu Ile Lys Ser Ser Phe Val Gly Val Ser Gly

    450                 455                 460

Glu Glu Val Trp Phe Asp Glu Lys Gly Asp Ala Pro Gly Arg Tyr Asp

465                 470                 475                 480

Ile Met Asn Leu Gln Tyr Thr Glu Ala Asn Arg Tyr Asp Tyr Val His

                485                 490                 495

Val Gly Thr Trp His Glu Gly Val Leu Asn Ile Asp Asp Tyr Lys Ile

            500                 505                 510

Gln Met Asn Lys Ser Gly Met Val Arg Ser Val Cys Ser Glu Pro Cys

        515                 520                 525

Leu Lys Gly Gln Ile Lys Val Ile Arg Lys Gly Glu Val Ser Cys Cys

    530                 535                 540

Trp Ile Cys Thr Ala Cys Lys Glu Asn Glu Phe Val Gln Asp Glu Phe

545                 550                 555                 560

Thr Cys Arg Ala Cys Asp Leu Gly Trp Trp Pro Asn Ala Glu Leu Thr

                565                 570                 575

Gly Cys Glu Pro Ile Pro Val Arg Tyr Leu Glu Trp His Glu Ala Pro

            580                 585                 590

Thr Ile Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gly Phe Leu Ser Thr Leu

        595                 600                 605

Ala Ile Leu Val Ile Phe Trp Arg His Phe Gln Thr Pro Ile Val Arg

    610                 615                 620

Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met Leu Thr Leu Leu Leu Val

625                 630                 635                 640

Ala Tyr Met Val Val Pro Val Tyr Val Gly Pro Pro Lys Val Ser Thr

                645                 650                 655

Cys Leu Cys Arg Gln Ala Leu Phe Pro Leu Cys Phe Thr Ile Cys Ile

            660                 665                 670

Ser Cys Ile Ala Val Arg Ser Phe Gln Ile Val Cys Ala Phe Lys Met

        675                 680                 685

Ala Ser Arg Phe Pro Arg Ala Tyr Ser Tyr Trp Val Arg Tyr Gln Gly

    690                 695                 700

Pro Tyr Val Ser Met Ala Phe Ile Thr Val Leu Lys Met Val Ile Val

705                 710                 715                 720

Val Ile Gly Met Leu Ala Thr Gly Leu Ser Pro Thr Thr Arg Thr Asp

                725                 730                 735

Pro Asp Asp Pro Lys Ile Thr Ile Val Ser Cys Asn Pro Asn Tyr Arg

            740                 745                 750

Asn Ser Leu Leu Phe Asn Thr Ser Leu Asp Leu Leu Leu Ser Val Val

        755                 760                 765

Gly Phe Ser Phe Ala Tyr Met Gly Lys Glu Leu Pro Thr Asn Tyr Asn

    770                 775                 780

Glu Ala Lys Phe Ile Thr Leu Ser Met Thr Phe Tyr Phe Thr Ser Ser

785                 790                 795                 800

Val Ser Leu Cys Thr Phe Met Ser Ala Tyr Ser Gly Val Leu Val Thr

                805                 810                 815

Ile Val Asp Leu Leu Val Thr Val Leu Asn Leu Leu Ala Ile Ser Leu

            820                 825                 830

Gly Tyr Phe Gly Pro Lys Cys Tyr Met Ile Leu Phe Tyr Pro Glu Arg

        835                 840                 845

Asn Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Ser Met Ile Gln Gly Tyr Thr Met Arg

    850                 855                 860

Arg Asp

865

<210>33

<211>876

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；注释＝

     人造构建体

<400>33

Met Val Arg Leu Leu Leu Ile Phe Phe Pro Met Ile Phe Leu Glu Met

 1               5                  10                  15

Ser Ile Leu Pro Arg Met Pro Asp Arg Lys Val Leu Leu Ala Gly Ala

            20                  25                  30

Ser Ser Gln Arg Ser Val Ala Arg Met Asp Gly Asp Val Ile Ile Gly

        35                  40                  45

Ala Leu Phe Ser Val His His Gln Pro Pro Ala Glu Lys Val Pro Glu

    50                  55                  60

Arg Lys Cys Gly Glu Ile Arg Glu Gln Tyr Gly Ile Gln Arg Val Glu

65                  70                  75                  80

Ala Met Phe His Thr Leu Asp Lys Ile Asn Ala Asp Pro Val Leu Leu

                85                  90                  95

Pro Asn Ile Thr Leu Gly Ser Glu Ile Arg Asp Ser Cys Trp His Ser

            100                 105                 110

Ser Val Ala Leu Glu Gln Ser Ile Glu Phe Ile Arg Asp Ser Leu Ile

        115                 120                 125

Ser Ile Arg Asp Glu Lys Asp Gly Leu Asn Arg Cys Leu Pro Asp Gly

    130                 135                 140

Gln Thr Leu Pro Pro Gly Arg Thr Lys Lys Pro Ile Ala Gly Val Ile

145                 150                 155                 160

Gly Pro Gly Ser Ser Ser Val Ala Ile Gln Val Gln Asn Leu Leu Gln

                165                 170                 175

Leu Phe Asp Ile Pro Gln Ile Ala Tyr Ser Ala Thr Ser Ile Asp Leu

            180                 185                 190

Ser Asp Lys Thr Leu Tyr Lys Tyr Phe Leu Arg Val Val Pro Ser Asp

        195                 200                 205

Thr Leu Gln Ala Arg Ala Met Leu Asp Ile Val Lys Arg Tyr Asn Trp

    210                 215                 220

Thr Tyr Val Ser Ala Val His Thr Glu Gly Asn Tyr Gly Glu Ser Gly

225                 230                 235                 240

Met Asp Ala Phe Lys Glu Leu Ala Ala Gln Glu Gly Leu Cys Ile Ala

                245                 250                 255

His Ser Asp Lys Ile Tyr Ser Asn Ala Gly Glu Lys Ser Phe Asp Arg

            260                 265                 270

Leu Leu Arg Lys Leu Arg Glu Arg Leu Pro Lys Ala Arg Val Val Val

        275                 280                 285

Cys Phe Cys Glu Gly Met Thr Val Arg Gly Leu Leu Ser Ala Met Arg

    290                 295                 300

Arg Leu Gly Val Val Gly Glu Phe Ser Leu Ile Gly Ser Asp Gly Trp

305                 310                 315                 320

Ala Asp Arg Asp Glu Val Ile Glu Gly Tyr Glu Val Glu Ala Asn Gly

                325                 330                 335

Gly Ile Thr Ile Lys Leu Gln Ser Pro Glu Val Arg Ser Phe Asp Asp

            340                 345                 350

Tyr Phe Leu Lys Leu Arg Leu Asp Thr Asn Thr Arg Asn Pro Trp Phe

        355                 360                 365

Pro Glu Phe Trp Gln His Arg Phe Gln Cys Arg Leu Pro Gly His Leu

    370                 375                 380

Leu Glu ASn Pro Asn Phe Lys Lys Val Cys Thr Gly Asn Glu Ser Leu

385                 390                 395                 400

Glu Glu Asn Tyr Val Gln Asp Ser Lys Met Gly Phe Val Ile Asn Ala

                405                 410                 415

Ile Tyr Ala Met Ala His Gly Leu Gln Asn Met His His Ala Leu Cys

            420                 425                 430

Pro Gly His Val Gly Leu Cys Asp Ala Met Lys Pro Ile Asp Gly Arg

        435                 440                 445

Lys Leu Leu Asp Phe Leu Ile Lys Ser Ser Phe Val Gly Val Ser Gly

    450                 455                 460

Glu Glu Val Trp Phe Asp Glu Lys Gly Asp Ala Pro Gly Arg Tyr Asp

465                 470                 475                 480

Ile Met Asn Leu Gln Tyr Thr Glu Ala Asn Arg Tyr Asp Tyr Val His

                485                 490                 495

Val Gly Thr Trp His Glu Gly Val Leu Asn Ile Asp Asp Tyr Lys Ile

            500                 505                 510

Gln Met Asn Lys Ser Gly Met Val Arg Ser Val Cys Ser Glu Pro Cys

        515                 520                 525

Leu Lys Gly Gln Ile Lys Val Ile Arg Lys Gly Glu Val Ser Cys Cys

    530                 535                 540

Trp Ile Cys Thr Ala Cys Lys Glu Asn Glu Phe Val Gln Asp Glu Phe

545                 550                 555                 560

Thr Cys Arg Ala Cys Asp Leu Gly Trp Trp Pro Asn Ala Glu Leu Thr

                565                 570                 575

Gly Cys Glu Pro Ile Pro Val Arg Tyr Leu Glu Trp Gly Glu Pro Ala

            580                 585                 590

Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Leu Val Leu

        595                 600                 605

Ala Ala Leu Gly Leu Phe Val His His Arg Asp Ser Pro Leu Val Gln

    610                 615                 620

Ala Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Phe Gly Leu Val Cys Leu Gly Leu

625                 630                 635                 640

Val Cys Leu Ser Val Leu Leu Phe Pro Gly Gln Pro Ser Pro Ala Arg

                645                 650                 655

Cys Leu Ala Gln Gln Pro Leu Ser His Leu Pro Leu Thr Gly Cys Leu

            660                 665                 670

Ser Thr Leu Phe Leu Gln Ala Ala Glu Ile Phe Val Glu Ser Glu Leu

        675                 680                 685

Pro Leu Ser Trp Ala Asp Arg Leu Ser Gly Cys Leu Arg Gly Pro Trp

    690                 695                 700

Ala Trp Lau Val Val Leu Leu Ala Met Leu Val Glu Val Ala Leu Cys

705                 710                 715                 720

Thr Trp Tyr Leu Val Ala Phe Pro Pro Glu Val Val Thr Asp Trp His

                725                 730                 735

Met Leu Pro Thr Glu Ala Leu Val His Cys Arg Thr Arg Ser Trp Val

            740                 745                 750

Ser Phe Gly Leu Ala His Ala Thr Asn Ala Thr Leu Ala Phe Leu Cys

        755                 760                 765

Phe Leu Gly Thr Phe Leu Val Arg Ser Gln Pro Gly Arg Tyr Asn Arg

    770                 775                 780

Ala Arg Gly Leu Thr Phe Ala Met Leu Ala Tyr Phe Ile Thr Trp Val

785                 790                 795                 800

Ser Phe Val Pro Leu Leu Ala Asn Val Gln Val Val Leu Arg Pro Ala

                805                 810                 815

Val Gln Met Gly Ala Leu Leu Leu Cys Val Leu Gly Ile Leu Ala Ala

            820                 825                 830

Phe His Leu Pro Arg Cys Tyr Leu Leu Met Arg Gln Pro Gly Leu Asn

        835                 840                 845

Thr Pro Glu Phe Phe Leu Gly Gly Gly Pro Gly Asp Ala Gln Gly Gln

    850                 855                 860

Asn Asp Gly Asn Thr Gly Asn Gln Gly Lys His Glu

865                 870                 875

Claims (62)

1.非天然存在的化合物，该化合物与由hT1R2/hT1R3组成的T1R2/T1R3受体特异性结合，而不与由rT1R2/rT1R3组成的T1R2/T1R3受体特异性结合。

2.非天然存在的化合物，该化合物与由hT1R2/rT1R3组成的T1R2/T1R3受体特异性结合，而不与由rT1R2/hT1R3组成的T1R2/T1R3受体特异性结合。

3.非天然存在的化合物，该化合物与hT1R2/hT1R3受体的T1R2的N-末端胞外域特异性结合。

4.非天然存在的化合物，该化合物与由rT1R2/hT1R3组成的T1R2/T1R3受体特异性结合，而不与由hT1R2/rT1R3组成的T1R2/T1R3受体特异性结合。

5.非天然存在的化合物，该化合物与hT1R2/hT1R3和rT1R2/r3-h3特异性结合，但是不与rT1R2/rT1R3或hT1R2/h3-r3特异性结合。

6.非天然存在的化合物，该化合物与hT1R2/hT1R3和r2-h2/rT1R3特异性结合，但不与rT1R2/rT1R3或h2-r2/hT1R3特异性结合。

7.非天然存在的化合物，该化合物与hT1R2/hT1R3和hT1R2/rT1R3受体的T1R2的维纳斯捕蝇域(VFD)特异性结合。

8.非天然存在的化合物，该化合物与T1R2/T1R3受体的T1R2亚基的人类N-末端维纳斯捕蝇域的氨基酸残基144和氨基酸残基302特异性结合。

9.非天然存在的化合物，该化合物与T1R2/T1R3受体的T1R2亚基的N-末端维纳斯捕蝇域特异性结合，其中所述化合物约为12埃×5埃×5埃。

10.非天然存在的化合物，该化合物与hT1R2/hT1R3受体的T1R2的富含半胱氨酸的区域特异性结合。

11.非天然存在的化合物，该化合物与hT1R2/hT1R3受体的T1R2的跨膜结构域(TM)特异性结合。

12.非天然存在的化合物，该化合物与T1R2/T1R3的T1R3亚基的人类N-末端胞外域特异性结合。

13.非天然存在的化合物，该化合物与hT1R2/hT1R3受体的T1R3的维纳斯捕蝇域(VFD)特异性结合。

14.非天然存在的化合物，该化合物与hT1R2/hT1R3受体的T1R3的跨膜结构域(TM)特异性结合。

15.非天然存在的化合物，该化合物与T1R2/T1R3的T1R3亚基的人类跨膜结构域的胞外环2和胞外环3特异性结合。

16.如权利要求1～15任一项所述的化合物，该化合物显示：在采用FLIPR(Molecular Devices公司)仪器的基于荧光的测定中，相对于果糖的最大活性，荧光活性以化合物依赖性方式增加至少25％。

17.如权利要求1～16任一项所述的化合物，该化合物显示：在采用FLIPR(Molecular Devices公司)仪器的基于荧光的测定中，甜味剂的EC₅₀以化合物依赖性方式降低至少两倍。

18.如权利要求1～17中任一项所述的化合物，该化合物导致用野生型或嵌合受体所转染的100个细胞中的至少10个显示出化合物依赖性的荧光加强。

19.如权利要求1～18任一项所述的化合物，该化合物显示：在对亚最大水平的甜味剂的应答中，荧光细胞数目以化合物依赖性方式增加至少2倍。

20.如权利要求1～16任一项所述的化合物，该化合物显示：细胞对亚最大水平的甜味剂的应答相对于对单独的甜味剂的应答以化合物依赖性方式增加至少1.25倍。

21.如权利要求20所述的化合物，其中，所述的应答是通过荧光、钙水平、IP₃水平、cAMP水平、GTPγS结合或报道基因活性(例如荧光素酶、β-半乳糖苷酶)进行测定的。

22.如权利要求1～21中任一项所述的化合物，该化合物在细胞中具有一项或一项以上的以下特征：

相对于对照，EC₅₀下降50％，

胞内Ca²⁺水平上升至少约25％，

胞内cAMP上升至少约25％，

胞内cGMP上升至少约25％，

胞内IP₃上升至少约25％，或

G蛋白与GTPγS的结合上升至少约25％。

23.嵌合的T1R2/T1R3受体，该受体包含人类T1R2亚基和大鼠T1R3亚基。

24.嵌合的T1R2/T1R3受体，该受体包含大鼠T1R2亚基和人类T1R3亚基。

25.嵌合的T1R2受体亚基，该亚基包含人类的胞外域、大鼠的跨膜结构域和大鼠的胞内域。

26.嵌合的T1R3受体亚基，该亚基包含大鼠的胞外域、人类的跨膜结构域和人类的胞内域。

27.非天然存在的化合物，该化合物与T1R1/hT1R3受体的T1R1的N-末端胞外域结合。

28.非天然存在的化合物，该化合物与T1R1/T1R3味觉受体的T1R1的维纳斯捕蝇域结合。

29.非天然存在的化合物，该化合物与T1R1/hT1R3受体的T1R1的富含半胱氨酸的区域结合。

30.非天然存在的化合物，该化合物与T1R1/T1R3香味受体的T1R1的跨膜结构域结合。

31.非天然存在的化合物，该化合物与T1R1/hT1R3受体的T1R3的N-末端胞外域结合。

32.非天然存在的化合物，该化合物与T1R1/T1R3香味受体的T1R3的维纳斯捕蝇域结合。

33.非天然存在的化合物，该化合物与T1R1/hT1R3受体的T1R3的富含半胱氨酸的区域结合。

34.非天然存在的化合物，该化合物与T1R1/T1R3香味受体的T1R3的跨膜结构域结合。

35.非天然存在的化合物，该化合物与由h1TM/h3TM组成的截断的香味受体的T1R1的跨膜结构域结合。

36.非天然存在的化合物，该化合物与由h1TM/h3TM组成的截断的甜味受体的T1R3的跨膜结构域结合。

37.非天然存在的化合物，该化合物与由mGluR-h1/mGluR-h3组成的嵌合受体的T1R1的跨膜结构域结合。

38.非天然存在的化合物，该化合物与由mGluR-h1/mGluR-h3组成的嵌合受体的T1R3的跨膜结构域结合。

39.如权利要求27～38任一项所述的化合物，该化合物显示在采用FLIPR(Molecular Devices公司)仪器的基于荧光的测定中，相对于谷氨酸的最大活性，荧光活性以化合物依赖性方式增强至少25％。

40.如权利要求27～38任一项所述的化合物，该化合物显示：在采用FLIPR(Molecular Devices公司)仪器的基于荧光的测定中，谷氨酸的EC₅₀以化合物依赖性方式降低至少两倍。

41.如权利要求27～38任一项所述的化合物，该化合物导致100个感染细胞中的至少10个显示出化合物依赖性的荧光增强，所述荧光是用荧光显微镜测定的。

42.如权利要求27～38任一项所述的化合物，该化合物导致在对亚最大水平的谷氨酸的应答中，荧光细胞数目以化合物依赖性方式增加至少2倍。

43.如权利要求27～38任一项所述的化合物，该化合物导致细胞对亚最大水平的谷氨酸的应答相对于对单独的谷氨酸的应答，以化合物依赖性方式增加至少1.25倍。

44.如权利要求43所述的化合物，其中，所述的应答是通过荧光、钙水平、IP₃水平、cAMP水平、GTPγS结合或报道基因活性进行测定的。

45.调节味觉感觉的化合物的鉴定方法，该方法通过对结合到、激活、抑制、增强、和/或调节权利要求23～26任一项所述的一个或一个以上的受体的化合物进行鉴定来进行。

46.调节甜味感觉的化合物的鉴定方法，该方法包括将待测化合物对甜味受体的作用与权利要求1～22任一项所述化合物对甜味受体的作用进行比较，若待测化合物的甜味感觉增强约等于或大于所述化合物的甜味增强，则表明待测化合物为增强甜味感觉的化合物。

47.调节鲜味感觉的化合物的鉴定方法，该方法包括将待测化合物对鲜味受体的作用与权利要求27～44任一项所述化合物对鲜味受体的作用进行比较，若待测化合物的香味感觉增强约等于或大于所述化合物的香味增强，则表明待测化合物为增强鲜味感觉的化合物。

48.调节味觉感觉的化合物的鉴定方法，该方法通过对结合到、激活、抑制和/或调节细胞所表达的受体的化合物进行鉴定来进行，所述细胞稳定表达权利要求23～26任一项所述的一个或一个以上的受体。

49.调节食用或药用产品的香味的方法，该方法包括：

提供至少一种食用或药用产品或其前体，和

将食用或药用产品或其前体与至少香味调节量的至少一种如权利要求27～44任一项所述的非天然存在的化合物或其膳食上可接受的盐组合，从而形成经调节的食用或药用产品；

据此调节食用或药用产品的香味。

50.抑制食用或药用产品的香味的方法，该方法包括：

提供至少一种食用或药用产品或其前体，和

将食用或药用产品或其前体与至少香味抑制量的至少一种如权利要求27～44任一项所述的非天然存在的化合物或其膳食上可接受的盐组合，从而形成经调节的食用或药用产品；

据此抑制食用或药用产品的香味。

51.增强食用或药用产品的香味的方法，该方法包括：

提供至少一种食用或药用产品或其前体，和

将食用或药用产品或其前体与至少香味提高量的至少一种如权利要求27～44任一项所述的非天然存在的化合物或其膳食上可接受的盐组合，从而形成经调节的食用或药用产品；

据此增强食用或药用产品的香味。

52.调节食用或药用产品的甜味的方法，该方法包括：

提供至少一种食用或药用产品或其前体，和

将食用或药用产品或其前体与至少甜味调节量的至少一种如权利要求1～22和权利要求60～61任一项所述的非天然存在的化合物或其膳食上可接受的盐组合，从而形成经调节的食用或药用产品；

据此调节食用或药用产品的甜味。

53.抑制食用或药用产品的甜味的方法，该方法包括：

提供至少一种食用或药用产品或其前体，和

将食用或药用产品或其前体与至少甜味抑制量的至少一种如权利要求1～22和权利要求60～61任一项所述的非天然存在的化合物或其膳食上可接受的盐组合，从而形成经调节的食用或药用产品；

据此抑制食用或药用产品的甜味。

54.增强食用或药用产品的甜味的方法，该方法包括：

提供至少一种食用或药用产品或其前体，和

将食用或药用产品或其前体与至少甜味提高量的至少一种如权利要求1～22或权利要求60～61任一项所述的非天然存在的化合物或其膳食上可接受的盐组合，从而形成经调节的食用或药用产品；

据此增强食用或药用产品的甜味。

55.增强鲜味感觉的方法，该方法包括将鲜味受体与环己基氨基磺酸盐和NHDC以及它们的衍生物接触。

56.增强鲜味感觉的方法，该方法包括将鲜味受体与lactisole衍生物接触。

57.增强甜味感觉的方法，该方法包括将甜味受体与环己基氨基磺酸盐和NHDC以及它们的衍生物接触。

58.增强甜味感觉的方法，该方法包括将甜味受体与lactisole衍生物接触。

59.如权利要求27～44任一项所述的化合物，该化合物不是蔗糖、果糖、葡萄糖、赤藓糖醇、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、某些已知的天然萜类化合物、黄酮类化合物，或蛋白甜味剂、二肽、三肽、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、三氯蔗糖、卤代糖、乙酰舒泛钾、环己基氨基磺酸盐、三氯蔗糖、天胺甜素、谷氨酸单钠(“MSG”)、肌苷一磷酸(IMP)、腺苷一磷酸或鸟苷一磷酸(GMP)。

60.如权利要求1～22任一项所述的化合物，该化合物不是蔗糖、果糖、葡萄糖、赤藓糖醇、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、某些已知的天然萜类化合物、黄酮类化合物，或蛋白甜味剂、二肽、三肽、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、三氯蔗糖、卤代糖、乙酰舒泛钾、环己基氨基磺酸盐、三氯蔗糖、天胺甜素、纽甜、紫苏葶、SC-45647、SC-40014、应乐果甜蛋白、NC-002740-01、奇异果甜蛋白、CC-00100、NC-00420、天胺甜素、SC-44102、对乙氧基苯脲、NC-00576、甘草酸、蛇菊苷、糖精钠、D-色氨酸、环己基氨基磺酸盐、DHB、乙醇酸、甘氨酸、D(-)果糖、高呋喃、D(-)塔格糖、麦芽糖、D(+)葡萄糖、D-山梨糖醇、D(+)半乳糖、α-乳糖、L()果糖、L(+)、化合物403249或葡萄糖。

61.如权利要求1～22任一项所述的化合物，其中所述化合物不是蔗糖、果糖、葡萄糖、赤藓糖醇、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、某些已知的天然萜类化合物、黄酮类化合物，或蛋白甜味剂、二肽、三肽、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、三氯蔗糖、卤代糖、乙酰舒泛钾、环己基氨基磺酸盐、三氯蔗糖、天胺甜素、纽甜、紫苏葶、SC-45647、SC-40014、应乐果甜蛋白、NC-002740-01、奇异果甜蛋白、CC-00100、NC-00420、天胺甜素、SC-44102、对乙氧基苯脲、NC-00576、甘草酸、蛇菊苷、糖精钠、D-色氨酸、环己基氨基磺酸盐、DHB、乙醇酸、甘氨酸、D(-)果糖、高呋喃、D(-)塔格糖、麦芽糖、D(+)葡萄糖、D-山梨糖醇、D(+)半乳糖、α-乳糖、L()果糖、L(+)、化合物403249、葡萄糖或化合物6364395。

62.如权利要求27～44任一项所述的化合物，其中所述化合物不是蔗糖、果糖、葡萄糖、赤藓糖醇、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、某些已知的天然萜类化合物、黄酮类化合物，或蛋白甜味剂、二肽、三肽、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、三氯蔗糖、卤代糖、乙酰舒泛钾、环己基氨基磺酸盐、三氯蔗糖、天胺甜素、谷氨酸单钠(“MSG”)、肌苷一磷酸(IMP)、腺苷一磷酸或化合物6364395、鸟苷一磷酸(GMP)。

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