CN101046472A - 一种生物芯片及其制备方法以及应用该芯片的试剂盒 - Google Patents

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王建霞
陈春生
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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Abstract

本发明公开含纳米结构探针点的生物芯片，包括片基和其上的纳米结构探针点，该探针点含活化纳米结构及固定在该结构上的探针分子，特征是：在该探针点中活化纳米结构分布密度大于1个活化纳米结构/μm2，而活化纳米结构含有纳米结构、共价键合在纳米结构上的偶联基团、共价键合在偶联基团上的活化基团，活化基团选自－NH2、通式为－RNH2的基团和不含－NH2的有机基团；在活化纳米结构中：当活化基团选自－NH2或/和不含－NH2的有机基团时，偶联基团在其表面上的平均分布密度大于1.85μmol/m2，或/和活化基团在其表面上的平均分布密度大1.85μmol/m2；这种新组成，使本发明生物芯片上纳米结构探针点有更高的反应效率，提高检测灵敏度、或/和降低探针分子耗量、或/和增加芯片选择性。

Description

一种生物芯片及其制备方法以及应用该芯片的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种含纳米结构探针点的生物芯片；还涉及制备这种生物芯片的方法；以及涉及应用本发明生物芯片的试剂盒。
背景技术
本发明术语“生物芯片”简称为“芯片”，包括但不限于英语中的Biochip、Microarray、Bioarray，是指定性和/或定量分析中的一种检测装置，其反应器中含探针分子，同样品中的目标分子发生特异反应的结果，可以以可寻址的方式进行识别。芯片的核心是其中的反应器，反应器的核心是其中的芯片片基和固定在芯片片基上的探针分子。芯片包括微流路芯片(相当于英语中的Microchannel Biochip)和微阵列芯片(相当于英语中的Biochip、Microarray、Bioarray)。本发明的芯片含有单反应器或多反应器。生物芯片由于其高通量和微型化特点，有着广泛的应用范围，包括基因表达检测、基因筛选、药物筛选、疾病诊断治疗、环境监测和治理、司法鉴定等领域。灵敏度和特异性是生物芯片检测的两个主要质量指标，而载体、特别是活性载体是决定灵敏度和特异性的关键之一。
目前，已公开了一些包含纳米结构的生物芯片。例如，申请号为WO0183825、US20030207296、和CN96193700.9的专利申请。这些生物芯片中纳米结构的制备方法，要么是基于效率不高的非特异性吸附，要么是基于造价昂贵的亚微米须晶结构。实际上，具体的纳米载体与探针之间的结合方式，对活化纳米结构的基本性质，有着特别重要的影响。因而，仍是包含纳米结构的生物芯片的重要研究内容。
发明内容
本发明的目的是：提供一种含纳米结构探针点的生物芯片，这种芯片中的纳米结构探针点具有更高的反应效率，从而提高了现有芯片的检测灵敏度、或/和降低探针分子耗量、或/和增加了对芯片的选择性；本发明的第二个目的是提供制备这种生物芯片方法；本发明的再一个目的是提供具有这种芯片结构的生物芯片试剂盒。
本发明的目的是通过实施下述技术方案来实现的：
一种生物芯片，至少包括片基和在片基上的一个以上的纳米结构探针点，该纳米结构探针点含有活化纳米结构，并在活化纳米结构上固定有探针分子，其特征是：
a.在纳米结构探针点中，所述活化纳米结构的分布密度大于1个活化纳米结构/μm2、优选大于5个活化纳米结构/μm2；和
b.所述活化纳米结构，含有纳米结构、共价键合在纳米结构上的偶联基团、共价键合在偶联基团上的活化基团，且所述活化基团选自：
a).-NH2；
b).通式为-RNH2的基团；和
c).不含-NH2的有机基团，
其中：
(1).所述R为有机基团；
(2).在所述活化纳米结构中：当所述活化基团选自-NH2或/和不含-NH2的有机基团时，所述偶联基团在其表面上的平均分布密度大于1.85μmol/m2，或/和所述活化基团在其表面上的平均分布密度大于1.85μmol/m2。
需要说明的是，本发明中所述活化基团的平均分布密度的计算基于元素分析(Microanalysis)。元素分析也许不一定是最佳方法，但在其误差范围内并不影响本发明的成立，既只有当活化纳米粒子表面固定的功能基团、尤其是活化基团数目达到一定值时，用其与探针分子一起制备的纳米结构探针点才具有特定的性质，从而达到本发明的目的。专业人员应当知道，尽管利用其它分析方法可能得出不同的数值，但其原则仍在本发明的权利要求之内。本发明的生物芯片有确定的技术特征(例如，活化纳米粒子的组成)。本发明芯片的这些技术特征，是达到本发明目的所必须的。正如本发明实施例所述，同不具备这些技术特征的生物芯片相比，本发明的生物芯片可以有明显较高的检测灵敏度，或/和明显较低的探针分子耗量，从而明显增加可用芯片的选择性。
本发明生物芯片，其特征是：所述通式为-RNH2的基团，包括氨基肼基团。
本发明生物芯片，其特征是：所述通式为-RNH2的基团，包括氨基酸基团。
本发明的生物芯片，其特征是：所述通式为-RNH2的基团在活化纳米结构表面上的平均分布密度大于0.5μmol/m2。
本发明的生物芯片，其特征是：所述通式为-RNH2的基团在活化纳米结构表面上的平均分布密度大于1.0μmol/m2。显然，与简单氨基(-NH2)比较，通式为-RNH2的基团中的-NH2不直接与所述偶联基团共价键合，除可能有不同的反应方式外，至少具有更为有利的反应动力学条件。在本发明实施例中，一项方案中所述氨基酸基团为精氨酸基团，另一项方案中为天冬酰氨基团，另一项方案中为甘氨酸基团。
本发明的生物芯片，其特征是：所述不含-NH2的有机基团包括醛基。
本发明的生物芯片，其特征是：所述不含-NH2的有机基团包括环氧基。
本发明的生物芯片，其特征是：所述不含-NH2的有机基团包括羧基、或-SH、等等。
本发明的生物芯片，其特征是：
a).所述片基包括纳米结构片基，其中所述纳米结构片基含有纳米结构区，并在该结构区有纳米凸体，并且纳米凸体的分布密度大于1个纳米凸体/μm2，优选纳米凸体的分布密度大于5个纳米凸体/μm2；和
b).所述活化纳米结构包括活化纳米凸体，其中所述活化纳米凸体含有：所述纳米凸体、共价键合在纳米凸体上的所述偶联基团、共价键合在偶联基团上的所述活化基团。
本发明的生物芯片，其特征是：
a).所述片基包括非纳米结构片基；和
b).所述活化纳米结构包括活化纳米粒子，其中所述活化纳米粒子含有纳米粒子、共价键合在纳米粒子上的所述偶联基团、共价键合在偶联基团上的所述活化基团。
本发明的生物芯片，其特征是：
a).所述片基包括纳米结构片基，其中所述纳米结构片基含有纳米结构区，并在该结构区有纳米凸体，并且纳米凸体的分布密度大于1个纳米凸体/μm2、优选纳米凸体的分布密度大于5个纳米凸体/μm2；和
b).所述活化纳米结构包括活化纳米粒子，其中所述活化纳米粒子含有纳米粒子、共价键合在纳米粒子上的所述偶联基团、共价键合在偶联基团上的所述活化基团。
本发明的生物芯片，其特征是：所述生物芯片包括流动式生物芯片。
本发明的生物芯片，其特征是：所述生物芯片还含有非纳米结构探针点。
本发明的生物芯片，其特征是：其中所述纳米粒子包括无机纳米粒子。在本发明芯片的一项方案中：所述无机纳米粒子包括无机氧化物纳米粒子。所述无机纳米粒子包括非磁性无机纳米粒子和磁性无机纳米粒子(例如氧化铁纳米粒子)，所述非磁性无机纳米粒子包括非磁性金属纳米粒子(例如金纳米粒子)和非磁性非金属纳米粒子(例如，氧化硅纳米粒子、氧化钛纳米粒子、氧化铝纳米粒子)。在本发明实施例中，一项方案中所述无机氧化物纳米粒子包括氧化硅纳米粒子，另一项方案中所述无机氧化物纳米粒子包括氧化铝纳米粒子，另一项方案中所述无机氧化物纳米粒子包括氧化钛纳米粒子。本发明芯片的一项方案中，所述纳米粒子粒径为1-500nm、优选1-100nm、更优选1-50nm。
本发明芯片的一项方案中：所述偶联基团包括有机硅偶联剂提供的偶联基团。在本发明实施例中，本发明方法的一项方案中所述有机硅偶联剂包括3-氨丙基三甲氧基硅烷，另一项方案中所述有机硅偶联剂包括氨丙基三乙氧基硅烷，另一项方案中所述有机硅偶联剂包括3-异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷。
本发明的生物芯片，其特征是：其中所述活化纳米粒子与片基上共价键合有相同的所述活化基团。从而使生物芯片上有尽可能少的活化基团，有利于提高生物芯片的反应特异性。
本发明芯片的一项方案中，纳米结构探针点内有多重探针分子或/和多重活化纳米粒子，例如配基2-活化纳米粒子2-配基2-配基1-活化纳米粒子1-配基1-片基。
上述生物芯片的制备方法，至少含以下步骤：
第一步，提供所述纳米结构、偶联基团和活化基团，并制备所述活化纳米结构；第二步，提供所述探针分子和在第一步中制备出来活化纳米结构，并制备所述纳米结构探针点。
本发明的生物芯片的制备方法，其特征在于：所述制备出的活化纳米结构，包括所述活化纳米凸体。
本发明的生物芯片的制备方法，其特征在于：所述制备出的活化纳米结构，包括活化纳米粒子，并至少含有以下步骤：
第一步，提供所述探针分子和所制备出的活化纳米粒子，并制备含探针分子/活化纳米粒子复合物的制备物；
第二步，提供所述片基和第一步中所制备出的含探针分子/活化纳米粒子的制备物，并制备所述纳米结构探针点。
本发明的生物芯片的制备方法，其特征在于：其中在所述含探针分子/活化纳米粒子复合物的制备物中，未固定探针分子的含量小于探针分子总量的50％。一般而言，所述制备物含探针分子/活化纳米粒子复合物、未结合在纳米粒子上的探针分子(未固定探针分子)、和未结合探针分子的纳米粒子。既使纯化，也只是使某一组分比例尽可能大(或小)。在本发明实施例中，本发明方法的一项方案中所含未固定探针分子的含量小于探针分子总量的30％，在一项方案中甚至小于20％，在一项方案中甚至小于5％。
本发明的生物芯片的制备方法，其特征在于：其中所述含探针分子/活化纳米粒子复合物的制备物中，非亲和纳米粒子的含量小于纳米粒子总量的50％。在本发明实施例中，本发明方法的一项方案中非亲和纳米粒子的含量小于纳米粒子总量的30％，在一项方案中甚至小于20％。
本发明的生物芯片的制备方法，其特征在于：所述制备出的活化纳米粒子，含有纳米粒子、共价键合在纳米粒子上的所述偶联基团、共价键合在偶联基团上的所述活化基团。
本发明的生物芯片的制备方法，其特征在于：所述制备出的含探针分子/活化纳米粒子复合物的制备物，其中未固定探针分子的含量小于探针分子总量的50％。
本发明的生物芯片的制备方法，其特征在于：所述制备出的含探针分子/活化纳米粒子复合物的制备物，其中非亲和纳米粒子的含量小于纳米粒子总量的50％。
本发明的生物芯片试剂盒，其特征在于：在试剂盒内设置有本发明的生物芯片。
本发明的生物芯片试剂盒，其特征在于：在试剂盒中还设置有标记系统，且所述标记系统如此配置：使得在进行标记反应时，其标记物的标记探针分子浓度小于5ug/ml。另一项方案中，标记探针分子浓度小于2ug/ml。另一项方案中，标记探针分子浓度小于0.5ug/ml。
本发明的优点在于：
由于本发明芯片有新的组成，尤其是芯片上活性纳米结构的新组成，所以使本发明生物芯片上的纳米结构探针点有更高的反应效率，从而提高了检测灵敏度、或/和降低探针分子耗量、或/和增加芯片选择性。本发明芯片的新组成是指：在其纳米结构探针点中，所述活化纳米结构的分布密度大于1个活化纳米结构/μm2、优选大于5个活化纳米结构/μm2；而所述活化纳米的特性。
具体实施方式
术语定义
本发明中，术语“探针分子”是指用以固定在反应器内、通过相互作用(包括亲和作用)捕获目标物的物质。探针分子包括多肽或/和与多肽相互作用的药物。公知的可与目标多肽作用的探针分子很多，例如离子交换剂、药物、多肽、多糖、维生素、抗生素、功能有机物、抗原、以及病毒、细胞或它们的组成。探针分子也包括核酸或/和与核酸相互作用的药物。
本发明中，术语“探针点”是指固定有探针分子的区域；术语“非纳米结构探针点”是指基本不含有纳米结构的探针点；术语“纳米结构探针点”是指明显含有纳米结构的探针点，其中至少部分探针分子固定在纳米结构上；术语“含纳米结构探针点的生物芯片”是指至少含有一个纳米结构探针点的生物芯片。
本发明术语“标记探针分子”是指包含于标记物中、通过其与目标物相互作用(包括亲和作用)实现对目标物标记的物质，包括配基(相当于英语中的Ligand)，例如：抗原、抗体、配体、配体指数增强系统进化技术筛选的适配分子、配基、多肽、多糖、共酶、辅因子、抗生素、类固醇、病毒、细胞等。
本发明术语“多肽”相当于英语中的“polypeptide”，包括天然或合成蛋白质、蛋白质片断、合成肽、等等，免疫检测中通常的目标物和检测中通用的配基、例如抗原、抗体、等等都属于多肽。
本发明术语“探针分子/纳米粒子复合物”是指固定有探针分子的纳米粒子。探针分子在纳米粒子上的固定有很多方式，本发明的方法中制备的探针分子/纳米粒子复合物中的一种固定方式例子为共价健合。需要注意的是，芯片制备中的含探针分子/纳米粒子复合物的制备物，一般为含探针分子/纳米粒子复合物的混合物(简称探针分子/纳米粒子混合物)，因其还含或多或少未固定至纳米粒子的探针分子、和或多或少基本上未固定有探针分子的纳米粒子。
本发明术语“纳米粒子”是指在三维空间中至少有一维小于1000nm的固相载体粒子；术语“活化纳米粒子”，是指活化基团与纳米粒子通过共价结合形成的复合物。
本发明术语“生物芯片片基”，简称片基，是指用以在其上形成探针点的固相载体。本发明的固相载体包括常规载体和纳米结构载体，其中所述常规载体为表面基本上无纳米结构的固相载体，所述纳米结构载体为表面上有纳米结构的固相载体。片基上通常有可与探针分子反应的活性基团。
本发明中，术语“纳米凸体”是指至少一维具有尺寸1-1000nm的仅有一个顶部的凸体，例如一个固定于芯片片基、或其它结构上的纳米粒子。术语“纳米结构”是指由纳米凸体为结构单元构成的结构，例如由纳米凸体形成的树枝状、深丘状、网状、或其它几何形貌，或其间纳米凸体的相互关系。
本发明术语“基片”是指以片基为基础的、结合有无其它结构(例如隔离结构)的用以在固定配基后形成芯片的产品。基片上可以有一个或多个片基池。单片基池基片上通常没有隔离结构，此时基片既是片基(例如市售的氨基玻片)。多片基池基片上有隔离结构，此时基片包括片基和隔离结构。片基池在固定上配基后形成反应器，多片基池片基形成多反应器芯片。片基是用以固定配基及其它助剂(假如有的话)的片基，其表面化学性质和光学性质是影响芯片性能及成本的重要因素。
本发明术语“片基池”是指片基与其隔离结构形成的结构。
本发明术语“标记物质”是指用以形成或参与形成检出信号的物质，例如罗丹明、CY3、CY5等。
本发明术语“纳米结构”是指具有纳米尺寸且反应出部分或全部纳米效应(例如表面效应、尺寸效应等)的结构。
本发明术语“凸出距离”是指上述凸体沿其顶部至其底部的距离。
本发明术语“凸出半距处横断面”是指上述凸体在其凸出距离一半处垂直于这一距离的面。
本发明术语“反应器”是指探针与目标物的反应的场所及与之连通的全部结构组成的整体。反应器包括边界或隔离结构、片基、固定在片基上的探针、及相连通的其它相关结构(例如流路、进液结构、出液结构、固定化标记物、等等)。此外，本发明中：按照芯片上反应器的数目n，芯片被定义为单反应器芯片(n＝1)和多反应器芯片(n等于或大于2)；按照检测过程中所加入的液相介质能否在反应器中定向流动，反应器被定义为流动反应器和非流动反应器，且将以流动反应器和非流动反应器为特征的芯片分别定义为流动芯片和非流动芯片
以下将通过实施例更为详细地说明本发明。
实施例
实施例1：活化纳米粒子的制备方法
本实施例中，活化纳米粒子制备方法一般包括：
1).提供纳米粒子、偶联剂和活化剂
本实施例中，所用纳米粒子如表1所示。
表1
  纳米粒子   基质尺寸   M2/g   制造商
  氧化硅纳米粒子(SS1)   25-35nm   160   浙江舟山明日纳米材料有限公司
  氧化硅(LUDOX AS-40)   25nm   135   Sigma-Aldrich公司
  氧化钛纳米粒子(HR3)   15nm   240   浙江舟山明日纳米材料有限公司
  氧化铝纳米粒子(MC2R)   25-35nm   180   浙江舟山明日纳米材料有限公司
本发明中，偶联剂为含偶联基团的试剂。本实施例中，所用偶联剂选自有机硅偶联剂(表2)。有机硅偶联剂包括硅烷偶联剂，其通式为：YSiX。其中：SiX为硅氧烷基，在本实施例中，用以同无机物表面进行化学反应；Y为有机官能团，具有反应活性。在本实施例中，Y包括通式为Y’R’的基团。其中：Y’用作活性基团(例如-NH2活性基团)或进一步固定活性基团；R’为有机官能团与硅氧烷基之间的“臂”。
表2
  化学名称   提供者
  3-氨丙基三甲氧基硅烷   国泰华荣化工新材料公司
  氨丙基三乙氧基硅烷   国泰华荣化工新材料公司
  3-异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷   华盛化学有限公司
2).进行纳米粒子、偶联基团和活化基团间的共价键合反应
本实施例中，纳米粒子、偶联基团和活化基团间的共价键合反应一般包括：
(1).去离子处理
本实施例中，先制备纳米粒子悬浮液，其中纳米粒子浓度(w/v)在5-30％之间。如果必要，选用已知的离子交换层析方法，将纳米粒子悬浮液中的阴、阳离子分别去除。然后，对悬浮液进行离心(2-8℃，20000g)并获得纳米粒子沉积物。
(2).在纳米粒子表面共价键合偶联剂
将上述纳米粒子沉积物制成纳米粒子悬浮液，并与偶联剂溶液混合、反应。通过调节公知的反应控制条件(例如反应物浓度，反应介质，反应温度，反应时间，等等)可以控制反应。本实施例中共价键合反应时，纳米粒子的浓度(w/v)在5％至5‰之间调节；偶联剂浓度(v/v)在1％至5％之间调节；反应介质为含水的甲醇；反应温度在室温至反应介质沸点以下5℃之间调节；反应时间在0.5至2小时之间调节。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需的优化条件。要强调的是，偶联剂与纳米粒子间的键合反应是能否获得本发明的生物芯片的关键步骤之一。
反应完成后，对悬浮液进行多次离心(2-8℃，20000g)以去除未固定在纳米粒子上的反应物和反应介质，然后获得以DMF为分散介质的纳米粒子悬浮液。
本实施例中，通过调节偶联反应参数获得不同的结合有偶联基团的纳米粒子。一些纳米粒子在元素分析中的氮含量在0.25-0.65N％之间变动，理论上相当于1g纳米粒子上固定的偶联基团在179-464umol之间变动，或1m2纳米粒子表面上固定的偶联基团在1.3-3.4umol之间变动。本实施例中，只有当偶联基团含量超过一个最低含量时，纳米粒子才能满足本发明的方法的要求，被选作进一步制备本发明的活化纳米粒子。具体而言，这个最低含量是指元素分析中的氮含量大于0.35N％、优选大于0.5N％(或1g纳米粒子上固定的偶联基团大于250umol、优选大于357umol，或1m2纳米粒子表面上固定的偶联基团大于1.85umol、优选大于2.64umol)。此外，偶联基团的含量也可用元素分析中的碳含量表征，但本质上是一样的。
(3).将活化基团共价键合至偶联基团上
本实施例中，对于以氨基之外的其它基团为活化基团的活化纳米粒子，其制备还包括将活化基团共价键合至偶联基团上
将纳米粒子悬浮液与活化剂溶液(例如以DMF为溶剂)混合、反应。通过调节公知的反应控制条件(例如反应物浓度，反应介质，反应温度，反应时间，等等)可以控制反应。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需的优化条件。此一键合反应也是能否获得本发明生物芯片的关键步骤之一。
反应完成后，对悬浮液进行多次离心(2-8℃，20000g)以去除未固定在纳米粒子上的反应物和反应介质，然后获得纳米粒子的悬浮液。若活化剂含保护基团(例如Fmoc)，还要脱去这些保护基团。脱保护方法选自已知的肽合成中的脱保护方法。
本发明的方法的另一方案，是先将活化剂(例如氨基肼)与偶联剂(例如3-异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷)反应，使活化基团共价键合至偶联基团上，再将此一键合有活化基团的偶联基团共价键合至无机物纳米粒子表面上。制备键合有活化基团的偶联基团的方法是公知方法。
更具体的制备方法由以下实施例补充。
实施例1.1：含氨基活化基团的活化纳米粒子的制备方法
本实施例中，对于以氨基(-NH2)为活化基团的活化纳米粒子，在使用3-氨丙基三甲氧基硅烷或氨丙基三乙氧基硅烷时，偶联基团与活化基团同时固定在纳米粒子上，偶联基团与活化基团在纳米粒子上的分布密度相同。本实施例中，只有当氨基密度超过一个最低含量时，纳米粒子才能满足本发明的方法的要求，被选作活化纳米粒子。具体而言，这个最低含量是指元素分析中的氮含量大于0.38N％、优选大于0.5N％(或1g纳米粒子上固定的偶联基团大于270umol、优选大于357umol，或1m2纳米粒子表面上固定的偶联基团大于2.0umol、优选大于2.6umol)。
实施例1.2：含-RNH2活化基团的活化纳米粒子的制备方法
本发明中，活化剂为含活化基团的试剂，活化基团为用以特征性地固定探针分子的基团，尽管其它基团(例如偶联基团)上也可能固定探针分子。本实施例中，所用活化剂如表3所示。此外，应用其它含-RNH2活化基团的活化剂，例如氨基酸衍生物、聚氨基酸(例如聚耐氨酸)、聚氨基衍生物，也可利用本实施例的方法制作本发明的活化纳米粒子。
表3
  活化剂   活化基团   活化基团分子量   保护基团   提供者
  氨基肼   氨基肼基   30   Fmoc   成都凯泰新技术有限责任公司
  精氨酸   精氨酸基   157.2   Fmoc，PBF   成都泰格化工研究所
  天冬酰氨   天冬酰氨基   115.1   Fmoc   成都泰格化工研究所
  甘氨酸   甘氨酸基   58.1   Fmoc   成都泰格化工研究所
  耐氨酸   耐氨酸基   129   Fmoc   成都泰格化工研究所
  谷氨酰氨   谷氨酰氨基   129   Fmoc   成都泰格化工研究所
本实施例中，通过调节活化反应参数获得不同的结合有活化基团的活化纳米粒子。一些活化纳米粒子在元素分析中的氮含量在0.58-1.50N％之间变动。减去结合有偶联基团的纳米粒子的元素分析氮含量后，与活化基团有关的氮含量在0.10-0.85N％之间变动，理论上相当于1g纳米粒子上固定的活化基团在35-245umol之间变动，或1m2纳米粒子表面上固定的活化基团在0.26-1.8umol之间变动。本实施例中，只有当活化基团含量超过一个最低含量时，纳米粒子才能满足本发明的方法的要求，被选作进一步制备本发明生物芯片的活化纳米粒子。具体而言，这个最低含量是指，与活化基团有关的元素分析氮含量大于0.20N％、优选大于0.40N％(或1g纳米粒子上固定的活性基团大于70umol、优选大于140umol，或1m2纳米粒子表面上固定的活化基团大于0.5umol、优选大于1umol)。此外，活化基团的含量也可用元素分析中的碳含量表征，但本质上是一样的。所含活化基团量小于此一最低含量的纳米粒子，被称作非活化纳米粒子，用以与活化纳米粒子进行比较研究。本实施例中，非活化纳米粒子包括未活化纳米粒子(共价键合活化基团量为0)和弱活化纳米粒子(1m2纳米粒子表面上固定的活化基团小于0.5umol)。
表4列出了实施例1.1中制备的部份活化纳米粒子的组成。
表4
  活化纳米粒子   纳米粒子   提供偶联基团的偶联剂   活化基团
  种类  数量*   种类   数量**
  A1   氧化硅(LUDOXAS-40)   3-氨丙基三甲氧基硅烷   0.62N％   甘氨酸基   0.34N％
  A2   氧化硅(LUDOXAS-40)   3-氨丙基三甲氧基硅烷   0.62N％   天冬酰氨基   0.68N％
  A3   氧化硅(LUDOXAS-40)   3-氨丙基三甲氧基硅烷   0.62N％   精氨酸基   0.83N％
  A4   氧化硅(LUDOXAS-40)   氨丙基三乙氧基硅烷   0.56N％   甘氨酸基   0.28N％
  A5   氧化硅(LUDOXAS-40)   3-异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷   0.43N％   氨基肼基   0.59N％
  A6   氧化硅纳米粒子(SS1)   3-氨丙基三甲氧基硅烷   0.51N％   甘氨酸基   0.28N％
  A7   氧化铝纳米粒子   3-氨丙基三甲氧基硅烷   0.53N％   甘氨酸基   0.24N％
*：偶联后元素分析中的N百分比
**：与活化基团有关的元素分析氮含量(N％)＝活化纳米粒子元素分析中的N百分比-未活化前含偶联基团的纳米粒子的元素分析中的N百分比
实施例1.3：活化基团含有不含-NH2的有机基团的活化纳米粒子的制备方法
本实施例中，本实施例中，所用活化剂分别为戍二醛和1，4-丁二醇二缩水甘油醚。本实施例的方法，也适于其它含有不含-NH2的活化基团(例如羰基、巯基、等等)的活化剂。
纳米粒子上固定的偶联剂中含氨基时，纳米粒子与1，4-丁二醇二缩水甘油醚反应，在偶联基团上共价键合带有碳原子链的环氧基；纳米粒子与戍二醛反应，在偶联基团上共价键合醛基。
本实施例中，只有用所固定的偶联剂中氨基含量大于1.85umol/1m2纳米粒子表面、优选大于2.6umol/1m2纳米粒子的纳米粒子，结合活化基团制成的制备物，才被选作活化纳米粒子。
实施例2探针分子/活化纳米粒子混合物的制备
本发明中，探针分子/活化纳米粒子混合物，是指含探针分子/活化纳米粒子复合物的制备物。其制备方法一般包括：
1).提供探针分子和本发明的活化纳米粒子
本实施例中，所用活化纳米粒子选自实施例1制备的合乎要求的活化纳米粒子；所用探针分子如表5所示。
表5
  探针分子   来源
  EBV-VCA-P18抗原   自制*
  丙肝病毒抗原(HCV AG)   北京大学人民医院肝病研究所
  爱滋病毒抗原(HIV AG)   北京大学人民医院肝病研究所
  梅毒抗原   北京大学人民医院肝病研究所
  抗乙肝病毒表面抗体(HBS Ab)   北京大学人民医院肝病研究所
  蛋白质A   上海生物制品研究所
  蛋白质G   上海生物制品研究所
*：制作方法参考：Tranchand-Bunel，D.，Auriault，C.，Diesis，E.，Gras-Masse，H.(1998)Detection of human antibodies using“convergent”combinatorialpeptide libraries or“mixotopes”designed form a nonvariable antigen：Application to the EBV viral capsid antigen p18，J.Peptide Res.52，1998，495-508。
本实施例所用探针分子包括多肽(例如合成肽EBV VCA-P18)、抗原(例如HCV、HIV和Syphilis抗原)、及抗体(例如HBs抗体)。本实施例的方法也适于其它探针分子，例如：药物、多糖、维生素、抗生素、功能有机物、单链或多链DNA、RNA、以及病毒、细胞或它们的组成。
2).制备探针分子/活化纳米粒子复合物
本发明中，术语“探针分子/活化纳米粒子复合物”是指探针分子结合在活化纳米粒子上形成的复合物。优选的结合方式之一为，在高盐(例如0.5MNaCl)溶液中不解离的结合方式，例如共价键合。
制备方法为：通过离心分离获得活化纳米粒子沉积物，再将其均匀分布在缓冲液中制成活化纳米粒子均匀分布的悬浮液，并与探针分子溶液混合、反应。通过调节公知的反应控制条件(例如反应物浓度，反应介质，反应温度，反应时间，等等)可以控制反应。本实施例中：反应时纳米粒子的浓度(w/v)在5％至5‰之间调节，探针分子浓度在0.1mg/ml至1mg/ml之间调节；反应介质为缓冲液(PBS或pH9.3的0.1M碳酸盐缓冲液)；反应温度在室温至40℃之间调节；反应时间在0.5至24小时之间调节。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需的优化条件。要强调的是，活化纳米粒子和探针分子之间的反应，也是能否获得本发明生物芯片的关键步骤之一。
反应完成后，对悬浮液进行离心(2-8℃，20000g)，取上清液测定探针分子浓变，以测定未固定在纳米粒子上的探针分子量。其中，上清液蛋白质浓度的测定使用常规测定方法。如有必要，也可再离心(2-8℃，20000g)，以减少探针分子/活化纳米粒子混合物中未固定探针分子。本发明中，术语“未固定探针分子”是指探针分子/活化纳米粒子混合物中未固定在纳米粒子上的探针分子。
探针分子/活化纳米粒子混合物中，也可能含非亲和纳米粒子。本发明中，术语“非亲和纳米粒子”是指未固定有探针分子的纳米粒子，或虽固定有探针分子但其含量太少、以至并无无探针分子/活化纳米粒子复合物的明显反应性的纳米粒子。本实施例中，探针分子/活化纳米粒子混合物中无亲和的纳米粒子的比例通过公知的亲和层析法来测定。例如，在HBS Ab、蛋白质G或蛋白质A作为探针分子的情况下，分别用HBS Ag和人IgG作配基固定至活化层析胶上，再比较亲和层析上清液和探针分子/活化纳米粒子混合物悬浮液中纳米粒子的量(通过离心分离比较沉淀量)，可得此一比例。亲和层析胶的制备方法及亲和层析的进行方法为常规方法。
如有必要，还可用生物芯片片基常规钝化处理方法对混合物中活化纳米粒子表面进行钝化处理。
本实施例中，通过调节反应参数获得不同的探针分子/活化纳米粒子混合物。利用实施例1制备的活化纳米粒子，在优化条件下制备的探针分子/活化纳米粒子混合物中，自由探针分子的含量小于50％，非亲和纳米粒子的含量小于50％。然而，利用弱活化纳米粒子或非活化纳米粒子在相同条件下的制备中，自由探针分子的含量可以大于50％，非亲和纳米粒子的含量可以大于50％。从而，本发明的活化纳米粒子的使用改变了探针分子/纳米粒子混合物的组成，从而改变了芯片上纳米结构探针点的组成，也就是改变了芯片的组成。下面我们将看到，这是有实际意义的。
本实施例中，只有当探针分子/活化纳米粒子混合物的组成超过一个最低标准时，其才能满足本发明的方法的要求，被选作进一步制备本发明生物芯片的探针分子/活化纳米粒子混合物。具体而言，这个最低标准是指，所述混合物中自由探针分子的含量小于探针分子总量的50％，或/和所述混合物中无亲和的纳米粒子的比例小于50％。低于这个最低标准的制备物(例如以非活化纳米粒子制备的探针分子/非活化纳米粒子混合物)，被用以与本发明的探针分子/活化纳米粒子混合物进行比较研究。
更具体的制备方法由以下实施例补充。
实施例2.1：探针分子/活化纳米粒子混合物的制备方法(活化纳米粒子含-RNH2活化基团)
本实施例中，所用活化纳米粒子含-RNH2活化基团，其选自实例例1.2制备的活化纳米粒子。
本实施例中：一些探针分子/活化纳米粒子混合物中，自由探针分子的含量小于50％，某些甚至小于20％，个别甚至小于5％；一些探针分子/活化纳米粒子混合物中，无亲和的纳米粒子的比例小于50％，某些甚至小于20％。
表6列出了实施例2.1中制备的部份探针分子/活化纳米粒子混合物的组成。
表6
  探针分子/活化纳米粒子混合物   活化纳米粒子*   探针分子   自由探针分子含量(％)**   低亲和/无亲和粒子比例(％)***
  B1   A1   蛋白质A   ＜20   ＜20
  B2   A2   蛋白质A   ＜20   ＜20
  B3   A3   蛋白质A   ＜20   ＜20
  B4   A4   EBV-VCA-P18抗原   ＜20   -
  B5   A4   HCV AG   ＜20   -
  B6   A4   HIV AG   ＜20   -
  B7   A4   梅毒抗原   ＜20   -
  B8   A4   HBS Ab   ＜20   ＜20
  B9   A4   蛋白质A   ＜20   -
  B10   A4   蛋白质G   ＜20   -
  B11   A5   蛋白质A   ＜20   -
  B12   A6   蛋白质A   ＜20   -
  B13   A7  蛋白质A ＜35 -
*：参考表4
**：(离心上清液中探针分子含量/探针分子总加入量)×100％
***：(亲和层析透过液的离心沉淀量/探针分子/活化纳米粒子混合物的等体积液的离心沉淀量)×100％
实施例2.2：探针分子/活化纳米粒子混合物的制备方法(活化纳米粒子含-NH2活化基团)
本实施例中，所用活化纳米粒子含-NH2活化基团，其选自实例例1.1制备的活化纳米粒子。
实施例2.3：探针分子/活化纳米粒子混合物的制备方法(活化纳米粒子含有不含NH2的活化基团)
本实施例中，所用活化纳米粒子含有不含NH2的活化基团，其选自实例例1.3制备的活化纳米粒子。
本实施例中，在优化条件下制备的探针分子/活化纳米粒子混合物中，自由探针分子的含量小于50％，非亲和纳米粒子的含量小于50％。然而，利用弱活化纳米粒子或非活化纳米粒子在相同条件下的制备中，自由探针分子的含量可以大于50％，非亲和纳米粒子的含量可以大于50％。从而，本发明的活化纳米粒子的使用改变了探针分子/纳米粒子混合物的组成，从而改变了芯片上纳米结构探针点的组成，也就是改变了芯片的组成。下面我们将看到，这是有实际意义的。
实施例3.生物芯片的制备方法(1)
本实施例中，所用片基为非纳米结构片基，所用活化纳米结构为选自实施1制备的活化纳米粒子。其制备方法一般包括：
1).提供生物芯片片基和本发明的探针分子/活化纳米粒子混合物
本实施例中，所用探针分子/活化纳米粒子混合物，选自实施2制备的合乎要求的探针分子/活化纳米粒子混合物；所用芯片片基包括载玻片衍生物，如下表7所示。
表7
  芯片   片基   片基上活化基团   来源
  C1   醛基玻片   醛基   自制*
  C2   环氧基玻片   环氧基   自制*
  C3   氨基肼玻片   氨基肼基   自制**
  C4   精氨酸玻片   精氨酸基   自制***
  C5   天冬酰氨玻片   天冬酰氨基   自制***
*：制作方法参考Melnyk O等，Peptide arrays for highiy sensitive and specialantibody-binding fluorescence arrays，Bioconjug Chem.13：713-20.2002。
**：制作方法简述：1).使载玻片表面上的羟基与3-氨丙基三甲氧基硅烷反应；2).将含保护基团Fmoc的精氨酸或天冬酰氨与固定在载玻片表面上的氨基接触并进行反应；3).脱去固定化精氨酸或天冬酰氨中的保护基团Fmoc。
本实施例的制备方法同样适于由以下材料或其衍生物制成的芯片片基：硅片、硅胶、陶瓷、金属氧化物、金属、其它聚合物材料及它们的复合物。同理，本实施例所用芯片片基还可以是含纳米结构的片基。
2.制备生物芯片
本实施例中制备生物芯片的方法包括使探针分子/活化纳米粒子复合物与芯片片基反应。通过调节公知的反应控制条件(例如反应物浓度，反应介质，反应温度，反应时间，等等)可以控制反应。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需的优化条件。
1).点样
将探针分子/活化纳米粒子混合物制成悬浮液，其中：纳米粒子浓度在1％至万分之一之间选择(优选五百分之一至万分之一)，所含探针分子的浓度在0.1-2.0mg/ml之间选择(优选0.1-0.3mg/ml)。再按常规的点样方法将悬浮液加至芯片片基，形成探针点。每种探针分子/活化纳米粒子混合物点2个点。在一些情况下，除上述探针点外，还将探针分子溶液(探针分子浓度在0.5-2.0mg/ml之间选择)按常规的点样方法加至芯片片基，形成非纳米结构探针点。每种探针分子/活化纳米粒子混合物和探针分子点2个点。所有探针点在芯片片基上形成M×N探针阵列。其中M大于1，N大于1。所用点样仪为DY-2003生物芯片点样仪(中国科学院电工研究所制备)。
2).孵化
点样后，在一定温度(4-37℃内选择)下和一定时间(1-24小时)内进行片基上的固定化反应。
3).钝化
孵化后，使芯片在一定温度(4-37℃内选择)下和一定时间(1-15小时)内与一定浓度(1-30mg/ml)的钝化剂(小牛血清或牛奶或其它已知钝化剂)反应，以减小芯片上的非特异吸附活性。纳米结构
本实施中，生物芯片上探针点中的纳米凸体及其高度、半高处的最小尺寸及其分布密度的测定，均利用SPA-300HV型扫描探针显微镜(DFM)和电子扫描显微镜进行。
本实施例中，通过调节反应参数获得不同的生物芯片，其上有不同的含纳米结构的探针点。一些生物芯片中探针点上的纳米凸体分布密度大于1个/μm2，某些生物芯片中探针点上的纳米凸体分布密度大于5个/μm2，某些生物芯片中探针点上的纳米凸体分布密度甚至大于10个/μm2。本实施例中，只有当探针点上的纳米凸体分布密度超过一个最低标准时，其才能达到本发明的目的，被选作本发明生物芯片。具体而言，这个最低标准是指，所述的生物芯片上含纳米结构探针点，其中所述纳米结构探针点包含凸出高度大于3nm、且凸出半高处至少一维尺寸在1-500nm、优选1-100nm之间的纳米凸体，且所述纳米凸体在所述纳米结构探针点中的分布密度大于1个/μm2。低于这个最低标准的制备物(例如以探针分子/活化纳米粒子混合物制备的、纳米凸体分布密度大于1个/μm2的生物芯片)，被用以与本发明的生物芯片进行比较研究。
本实施例的方法当然也适于各种芯片，例如单反应池芯片、多反应池芯片、流动芯片、非流动芯片、等等。
本实施例制备的非流动生物芯片，为多反应池非流动芯片，制备方法参考我们的另一专利申请《反应器高度最小化的高集成度分析芯片及其应用》(PCT申请号CN20040169)中的实施例1。简言之：用高疏水有机硅涂料(成都晨光化工研究院)涂在芯片片基上反应器边界位置上，按供货方的使用说明在室温干燥后固化，形成高度25-115μm、宽度2.0-2.5mm的高疏水凸体。高疏水凸体包围的表面可以取3mm×3mm矩形。在基片此一表面上，横向共有12个片基池，纵向有4个片基池，共有48个片基池。然后，对片基池进行上述“点样”操作和其它操作，制得非流动芯片(例如表6中的芯片D1-D11)。
本实施例制备的流动生物芯片，芯片上探针分子与检测样品中的反应，包括检测样品在流动状态下进行的反应。流动生物芯片的例子，有我们的另一专利申请《反应器高度最小化的高集成度分析芯片及其应用》(PCT申请号CN20040169)中的实施例9或10。本实施例流动生物芯片的制备方法，参考其制备方法。简言之：对片基上预留固定探针的4个区域(每个区域宽4mm，长15mm)进行上述“点样”、“孵化”和“钝化”操作。本实施例中的顶面元件为可重复使用的、有进出液口、进出液管的、和与4个区域相适应的不锈钢板。其与片基接触的面上有密封结构。其密封结构为与片基上4区域之外的区域对应的弹性材料层(自干硅橡胶溶液，成都晨光化工研究院)(层厚小于0.5mm)。其每一对进出液口与底面元件上的每一个反应池的进出液区相对应。使用机械卡具压力将顶面元件与片基之间形成密封连结，从而制得非流动芯片(例如表6中的芯片D12-D14)。
更具体的制备方法由以下实施例补充。
实施例3.1.生物芯片的制备方法(活化纳米粒子含-RNH2活化基团)
本实施例中，所用活化纳米粒子含-RNH2活化基团；所用探针分子/活化纳米粒子混合物，选自实施2.1制备的合乎要求的探针分子/活化纳米粒子混合物。
表8列出了实施例5中制备的部份本发明的生物芯片的组成。
表8
芯片   片基*   纳米结构探针点   非纳米结构探针点   芯片结构
  混合物**   密度***
  D1   C1   B1-B3，B9-B13   ＞5   -   非流动芯片
  D2   C2   B1-B3，B9-B13   ＞5   -   非流动芯片
  D3   C3   B1-B3，B9-B13 ＞8   -   非流动芯片
  D4   C4   B1-B3，B9-B13 ＞10   -   非流动芯片
  D5   C5   B1-B3，B9-B13 ＞10   -   非流动芯片
  D6   C6   B1-B3，B9-B13 ＞10   -   非流动芯片
  D7   C6   B4-B7 ＞10   -   非流动芯片
  D8   C6   B4-B7 ＞10   蛋白质A   非流动芯片
  D9   C6   B4-B7 ＞10   b4-b7****   非流动芯片
  D10   C6   B8，B9 ＞10   -   非流动芯片
  D11   C6   B8，B9 ＞10   蛋白质A   非流动芯片
  D12   C4   B1-B3，B9-B13 ＞10   蛋白质A   流动式芯片
  D13   C5   B1-B3，B9-B13 ＞10   蛋白质A   流动式芯片
  D14   C6   B4-B7 ＞10   蛋白质A   流动式芯片
  D15   C6   B8，B9 ＞10   蛋白质A   流动式芯片
*：参考表7
**：探针分子/活化纳米粒子混合物，参考表6
***：纳米凸体密度(个纳米凸体/μm2)
****：b4：EBV-VCA-P18抗原；b5：HCV AG；b6：HIV AG；b7：梅毒抗原
实施例3.2.生物芯片的制备方法(活化纳米粒子含-NH2活化基团)
本实施例中，所用活化纳米粒子含-NH2活化基团；所用探针分子/活化纳米粒子混合物，选自实施2.2制备的合乎要求的探针分子/活化纳米粒子混合物。
实施例3.3.生物芯片的制备方法(活化纳米粒子含有不含胺基的活化基团)
本实施例中，所用活化纳米粒子含有不含胺基的活化基团；所用探针分子/活化纳米粒子混合物，选自实施2.3制备的合乎要求的探针分子/活化纳米粒子混合物。
实施例4.生物芯片的制备方法(2)
本实施例中，所用片基为纳米结构片基，所用活化纳米结构为纳米结构片基上的活化凸体。其制备方法一般包括：
1).提供纳米结构片基
本实施例所用纳米结构片基为纳米结构玻片，其制备方法参考我们的另一项专利申请PCT CN2004000437。简言之：将载玻片放入优化浓度的、选自于表4的纳米粒子的悬浮液中浸泡2小时以上，然后洗涤烘干。
本实施中，纳米凸体及其高度、半高处的最小尺寸及其分布密度的测定，利用SPA-300HV型扫描探针显微镜(DFM)及分析软件进行。只有那些纳米凸体(高度大于3nm、且凸出半高处至少一维尺寸在1-500nm)分布密度大于5个/μm2的制备物被选作纳米结构片基，来制备本实施例的生物芯片。
特别要强调的是，含其它纳米结构、特别是纳米凸体的芯片片基，也可以用作本实施例的纳米结构片基。这些纳米凸体的例子，包括：定向排列的、不连续的亚微米须晶结构(参考中国专利申请号96193700.9)，纳米管道、等等。
2).制备活化纳米结构
本实施例中，偶联剂与实施例1中的偶联剂相同；活化剂与实施例1中的活化剂相同。
活化方法一般包括：
(1).清洗芯片片基
(2).在纳米凸体表面共价键合偶联剂
将上述片基与偶联剂溶液混合、反应。通过调节公知的反应控制条件(例如反应物浓度，反应介质，反应温度，反应时间，等等)可以控制反应。本实施例中，偶联剂浓度(v/v)在1％至5％之间调节；反应介质为含水的甲醇；反应温度在室温至反应介质沸点以下5℃之间调节；反应时间在0.5至5小时之间调节。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需的优化条件。要强调的是，偶联剂与片基上纳米凸体间的键合反应是能否获得本发明的生物芯片的活性纳米结构的关键步骤之一。
反应完成后，先后用甲醇和无离子蒸馏水清洗，高温干燥后备用。
(3).将活化基团共价键合至偶联基团上
将(2)的制备物与活化剂溶液(以DMF为溶剂)混合、反应。通过调节公知的反应控制条件(例如反应物浓度，反应介质，反应温度，反应时间，等等)可以控制反应。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需的优化条件。此一键合反应也是能否获得本发明生物芯片的活性纳米结构的关键步骤之一。
若活化剂含保护基团，还要脱去这些保护基团。脱保护方法选自已知的肽合成中的脱保护方法。
表9列出了本实施例中制备的部份活化纳米结构片基的组成。
表9
  活化纳米结构片基   活化纳米结构
  纳米结构   提供偶联基团的偶联剂   活化基团
  E1   纳米凸体   3-氨丙基三甲氧基硅烷   甘氨酸基
  E2   纳米凸体   3-氨丙基三甲氧基硅烷   天冬酰氨基
  E3   纳米凸体   3-氨丙基三甲氧基硅烷   精氨酸基
  E4   纳米凸体   3-氨丙基三甲氧基硅烷   氨基肼基
  E5   纳米凸体   3-异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷   氨基肼基
  E6   纳米凸体   氨丙基三乙氧基硅烷   甘氨酸基
3).制备生物芯片
本实施例中，所用探针分子选自表5；所用片基选自上述制备。
本实施例中，制备生物芯片(包括非流动生物芯片和流动生物芯片)的方法，与实施例3中“制备生物芯片”的方法相同，只不过：在其使用非纳米结构片基的地方，本实施例使用活化纳米结构片基；而在其使用含探针分子/纳米粒子复合物的制备的地方，本实施例使用探针分子。
实施例5.生物芯片的制备方法(3)
本实施例中，所用片基为纳米结构片基，所用活化纳米结构为实施例1制备的合乎要求的活化纳米粒子。其制备方法一般包括：
1).提供纳米结构片基
本实施例所用纳米结构片基与实施例4中所用纳米结构片基相同。
2).制备活化纳米结构片基
本实施例所用活化纳米结构片基选自实施例4所制备的活化纳米结构片基。
3).制备生物芯片
本实施例中，所用探针分子/活化纳米粒子混合物选自表6；所用活化纳米结构片基选自上述制备(表9)。
本实施例中，制备生物芯片(包括非流动生物芯片和流动生物芯片)的方法，与实施例3中“制备生物芯片”的方法相同，只不过：在其使用非纳米结构片基的地方，本实施例使用活化纳米结构片基。
实施例6：生物芯片试剂盒的制备
本实施例中，生物芯片试剂盒包含生物芯片和生物芯片标记系统，其制备一般地包括：
1).制备生物芯片
制备本发明的生物芯片试剂盒时，本实施例中所用生物芯片选自上述实施例制备的本发明的生物芯片。
2).制备生物芯片标记系统
本实施例中，标记系统为标记物，其包含标记探针分子和与之结合的标记物质。本实施例中，所用标记探针分子为羊抗人二抗(北京天坛生物制品股份有限公司)和标记用HBS Ab(北京大学人民医院肝病研究所)；所用标记物质为罗丹明(Molecular probes公司)。
本实施例中，标记物制备方法为公知的罗丹明标记物的制备方法。如有必要纯化，将混合产物滴入装有凝胶的旋转管，在4000r/min条件下离心，取收集管液体。
3).为生物芯片配置标记系统
本实施例中，制备本发明的生物芯片试剂盒时，为本发明的生物芯片配置的标记系统要使得在进行标记反应时有确定的标记物浓度(以标记探针分子浓度表示)。在本实施例制备的本发明的生物芯片试剂盒中，标记物这样配置，使得在进行标记反应时标记探针分子浓度在20ug/ml至0.05ug/ml之间选择。
表10列出了本实施例制备的部份生物芯片试剂盒的组成。
表10
  试剂盒  生物芯片*   标记物
  种类   含量(ug/ml)**
  F1   D4   罗丹明标记羊抗人二抗   20
  F2   D4   罗丹明标记羊抗人二抗   5
  F3   D4   罗丹明标记羊抗人二抗   2
  F4   D4   罗丹明标记羊抗人二抗   0.5
  F5   D8   罗丹明标记羊抗人二抗   20
  F6   D8   罗丹明标记羊抗人二抗   5
  F7   D8   罗丹明标记羊抗人二抗   2
  F8   D8   罗丹明标记羊抗人二抗   0.5
  F9   D13   罗丹明标记羊抗人二抗   20
  F10   D13   罗丹明标记羊抗人二抗   5
  F11   D13   罗丹明标记羊抗人二抗   2
  F12   D13   罗丹明标记羊抗人二抗   0.5
*：参考表8
**：标记时标记探针分子浓度
实施例7：本发明的生物芯片的比较研究及应用(1)
本实施例中，用来研究的本发明的生物芯片选自实施例3.1制备的生物芯片。比较研究的一般方法为：
1).提供样品
在本实施例中，样品分别为：HCV抗体阳性血清，HIV1+2抗体阳性人血清，HBS Ag阳性血清，EBV抗体阳性血清，梅毒抗体阳性血清，和阴性血清(HCV抗体、HIV1+2抗体、HBS Ag和梅毒抗体都为阴性的血清)。所有的样品均经使用经典的ELISA方法在血清10倍稀释反应条件下预先检测。
2).提供对照芯片
用作对照的生物芯片的片基一样、制备方法一样(参考实施例3.1)。在本实施例中，对照芯片包括：
(1).不含纳米结构探针点的生物芯片(I类对照芯片)
这种芯片与用来研究的本发明的生物芯片的制备方法基本相似，只是这种芯片是直接使用探针分子、而不是探针分子/纳米粒子混合物来制成的，其上的探针点均为非纳米结构探针点。
(2).基于未活化纳米粒子制备的生物芯片(II类对照芯片)
这种芯片与用来研究的本发明的生物芯片的制备方法基本相似，只是这种芯片使用上述4种未经化学改性的商品纳米粒子与相应探针分子制备探针分子/纳米粒子混合物来制成，而不象本发明的生物芯片使用本发明的活化纳米粒子与相应探针分子制备探针分子/活化纳米粒子混合物来制成。用作对照的生物芯片的片基一样、制备方法一样(参考实施例3.1)。
(3)基于弱活化纳米粒子制备的生物芯片(III类对照芯片)
这种芯片与用来研究的本发明的生物芯片的制备方法基本相似，只是这种芯片使用弱活化纳米粒子(参考实施例1)与相应探针分子制备探针分子/弱活化纳米粒子混合物来制成，而不象本发明的生物芯片使用本发明的活化纳米粒子与相应探针分子制备探针分子/活化纳米粒子混合物来制成。用作对照的生物芯片的片基一样、制备方法一样(参考实施例3.1)。
(4)选自实施例3.1制备的生物芯片(IV类对照芯片)
(5)选自实施例3.2和3.3制备的生物芯片(V类对照芯片)
3).芯片测试
本实施例中，芯片测试方法如下：
(1).非流动芯片的测试
实验时将50倍稀释测试样品分别加入所述芯片的反应池中。加样量为5μl，37℃反应30分钟后用洗涤液冲洗。标记物(常规浓度)加入量为5μl，37℃反应30分钟后用洗涤液冲洗。干燥后进行扫描。扫描仪为共聚焦激光扫描仪(Afymetrix公司GMS 418芯片扫描仪)，扫描激发光波长532nm，发射光波长570nm，激光强度35/50-55/70，读取的信号经处理软件(JAGUAR II)处理，然后取平均值后得到结果。
(2)流动芯片的测试
实验时，将50倍稀释样品加热至37℃，以流速10-50ul/min加入芯片反应器。加样时间60分钟。加样后流速50-100ul/min加入洗液。然后取下基片再洗涤。再在每个反应器加入标记物(常规浓度)溶液，加入量约为10ul，反应温度37℃，反应时间5分钟。标记反应后洗涤反应器。干燥后进行扫描。扫描仪为共聚焦激光扫描仪(Afymetrix公司GMS 418芯片扫描仪)，扫描激发光波长532nm，发射光波长570nm，激光强度35/50-55/70，读取的信号经处理软件(JAGUARII)处理，然后取平均值后得到结果。
实施例7.1：不同类芯片的比较
本实施例中，含有纳米结构探针点的芯片，分别为上述II-V类比较芯片。这些芯片在点样时的探针分子/不同活化程度纳米粒子混合物中的物质浓度相同：纳米粒子浓度(w/v)为0.5％；探针分子浓度(w/v)为0.20mg/ml。上述I类比较芯片不含纳米结构探针点，点样时的探针分子溶液浓度(w/v)为0.20mg/ml。其它制备条件相同。
所获得的芯片检测结果是：使用同一样品，IV类比较芯片的纳米结构探针点上获得的信号值，是在III类对照芯片的含纳米结构的探针点上获得的信号值的350％以上；在III类对照芯片的含纳米结构的探针点上获得的信号值，是在II类对照芯片的含纳米结构的探针点上获得的信号值的150％以上；在II类对照芯片的含纳米结构的探针点上获得的信号值，比I类对照芯片的非纳米结构探针点上获得的信号值高。此外，在活化纳米粒子具有相同类型和相同数量的偶合基团的条件下，IV类比较芯片与V类比较芯片比较，其纳米结构探针点上获得的信号值要高150％以上、甚至有时高200％以上。
此结果说明，本发明的方法制备的生物芯片具有明显提高的灵敏度，或以本发明的方法去制备生物芯片，可明显降低探针分子的用量，这对生物芯片的制备，具有非常现实的意义。
实施例7.2：本发明的生物芯片间的比较
在本发明的生物芯片中，有的仅含纳米结构探针点，有的含两种探针点(纳米结构探针点和非纳米结构探针点)。
与实施例7.1中的结果一致，使用同一弱阳性样品，在纳米结构探针点上获得的信号值，是在非纳米结构探针点上获得的信号值的400％以上。但是，当阳性样品的阳性提高时，在纳米结构探针点上获得的信号升值，不如在非纳米结构探针点上获得的信号升值明显，尤其当阳性样品的阳性较高时更如此。
此结果说明，本发明的方法制备的含两种探针点(纳米结构探针点和非纳米结构探针点)的生物芯片，对于检测不同的阳性值有特别的用处，尤其要进行阳性比较时更如此。
在本发明的生物芯片中，还包括流动芯片和非流动芯片。在优选条件下使用同一弱阳性样品，在流动芯片纳米结构探针点上获得的信号值，可以是在非流动芯片纳米结构探针点上获得的信号值的300％以上。可能是在流动芯片上的纳米结构探针点，比在非流动芯片上的纳米结构探针点具有更加有利的反应动力学条件。
实施例8：本发明的生物芯片的比较研究及应用(2)
本实施例中，用来研究的本发明的生物芯片选自实施例3.2和3.3制备的生物芯片。比较研究的方法与实施例7中的方法相同。
本实施例中，所用对照芯片片基一样、制备方法一样(参考实施例3)。对照芯片包括：
(1).不含纳米结构探针点的生物芯片(I类对照芯片，参考实施例7)；
(2).基于未活化纳米粒子制备的生物芯片(II类对照芯片，参考实施例7)；
(3)基于弱活化纳米粒子制备的生物芯片(III类对照芯片，参考实施例7)，弱活化纳米粒子中偶联基团的密度小于2.0umol/m2，
(4)选自实施例3.2和3.3制备的生物芯片(IV类对照芯片)
本实施例中，含有纳米结构探针点的芯片，分别为上述II-IV类比较芯片。这些芯片在点样时的探针分子/纳米粒子混合物中的物质浓度相同：纳米粒子浓度(w/v)为0.5％；探针分子浓度(w/v)为0.20mg/ml。上述I类比较芯片不含纳米结构探针点，点样时的探针分子溶液浓度(w/v)为0.20mg/ml。其它制备条件相同。
所获得的芯片检测结果是：使用同一样品，IV类比较芯片的纳米结构探针点上获得的信号值，是在III类对照芯片的含纳米结构的探针点上获得的信号值的250％以上；在III类对照芯片的含纳米结构的探针点上获得的信号值，是在II类对照芯片的含纳米结构的探针点上获得的信号值的150％以上；在II类对照芯片的含纳米结构的探针点上获得的信号值，比I类对照芯片的非纳米结构探针点上获得的信号值高。
此结果说明，本发明的方法制备的生物芯片具有明显提高的灵敏度，或以本发明的方法去制备生物芯片，可明显降低探针分子的用量，这对生物芯片的制备，具有非常现实的意义。
此外，在优选条件下使用同一弱阳性样品，在流动芯片纳米结构探针点上获得的信号值，可以是在非流动芯片纳米结构探针点上获得的信号值的350％以上。
实施例9：本发明的生物芯片的比较研究及应用(3)
本实施例中，用来研究的本发明的生物芯片选自实施例4制备的生物芯片。比较研究的方法与实施例7中的方法相同。
本实施例中，所用对照芯片片基一样、制备方法一样(参考实施例4)。对照芯片包括：
(1).基于未活化纳米凸体制备的生物芯片(I类对照芯片，参考实施例4)，所用片基为实施例4中的纳米结构片基；
(2)选自实施例4制备的含活化纳米凸体的生物芯片(II类对照芯片)，所用片基为实施例4中的活化纳米结构片基。
本实施例中，芯片在点样时的探针分子溶液浓度(w/v)，为0.20mg/ml。其它制备条件相同。
所获得的芯片检测结果是：使用同一样品，II类比较芯片的纳米结构探针点上获得的信号值，是在I类对照芯片的含纳米结构的探针点上获得的信号值的350％以上。此结果说明，本发明的方法制备的生物芯片具有明显提高的灵敏度，或以本发明的方法去制备生物芯片，可明显降低探针分子的用量，这对生物芯片的制备，具有非常现实的意义。
此外，在优选条件下使用同一弱阳性样品，在流动芯片纳米结构探针点上获得的信号值，可以是在非流动芯片纳米结构探针点上获得的信号值的250％以上。
实施例10：本发明的生物芯片的比较研究及应用(4)
本实施例中，用来研究的本发明的生物芯片选自实施例5制备的生物芯片。比较研究的方法与实施例7中的方法相同。
本实施例中，所用对照芯片片基一样、制备方法一样(参考实施例5)。对照芯片包括：
(1).基于活化纳米结构片基和探针分子制备的生物芯片(I类对照芯片)，所用片基为实施例5中的活化纳米结构片基；
(2)选自实施例5制备的生物芯片(II类对照芯片)，所用片基为实施例5中的活化纳米结构片基，且纳米结构探针点含探针分子/活化纳米粒子复合物。
本实施例中，芯片在点样时的探针分子溶液浓度(w/v)为0.20mg/ml。其它制备条件相同。所获得的芯片检测结果是：使用同一样品，II类比较芯片的纳米结构探针点上获得的信号值，是在I类对照芯片的含纳米结构的探针点上获得的信号值的150％以上。此结果说明，本发明的方法制备的生物芯片具有明显提高的灵敏度，或以本发明的方法去制备生物芯片，可明显降低探针分子的用量，这对生物芯片的制备，具有非常现实的意义。
此外，在优选条件下使用同一弱阳性样品，在流动芯片纳米结构探针点上获得的信号值，可以是在非流动芯片纳米结构探针点上获得的信号值的250％以上。
实施例11：本发明的生物芯片试剂盒的比较研究及应用
本实施例中，提供的样品和芯片测试方法与实施例7相同。本实施例中，所用生物芯片试剂盒分别为本发明的生物芯片试剂盒(参考实施例9)。试剂盒不同之处在于所用标记系统不同(即所提供物溶液标记时标记探针分子浓度分别为20、5、2、0.5ug/ml。
对大多数情况而言，使用5ug标记探针分子/ml的标记系统的试剂盒，与使用20ug标记探针分子/ml的标记系统的试剂盒的检测结果相同；对多数情况而言，使用2ug标记探针分子/ml的标记系统的试剂盒，与使用20ug标记探针分子/ml的标记系统的试剂盒的检测结果相同；对部份情况而言，即使使用0.5ug标记探针分子/ml的标记系统的试剂盒，也与使用20ug标记探针分子/ml的标记系统的试剂盒的检测结果相同。
此结果说明，本发明的含低浓度标记探针分子的标记系统的试剂盒，所用标记探针分子更少。

Claims (23)

1、一种生物芯片，至少包括片基和在片基上的一个以上的纳米结构探针点，该纳米结构探针点含有活化纳米结构，并在活化纳米结构上固定有探针分子，其特征在于：
a.在纳米结构探针点中，所述活化纳米结构的分布密度大于1个活化纳米结构/μm2、优选大于5个活化纳米结构/μm2；和
b.所述活化纳米结构，含有纳米结构、共价键合在纳米结构上的偶联基团、共价键合在偶联基团上的活化基团，且所述活化基团选自：
a).-NH2；
b).通式为-RNH2的基团；和
c).不含-NH2的有机基团，
其中：
(1).所述R为有机基团；
(2).所述活化纳米结构中：当所述活化基团选自-NH2或/和不含-NH2的有机基团时，所述偶联基团在其表面上的平均分布密度大于1.85μmol/m2，或/和所述活化基团在其表面上的平均分布密度大于1.85μmol/m2。
2、按照权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述通式为-RNH2的基团包括氨基肼基团。
3、按照权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述通式为-RNH2的基团包括氨基酸基团。
4、按照权利要求2或3所述的生物芯片，其特征在于：所述通式为-RNH2的基团在活化纳米结构表面上的平均分布密度大于0.5μmol/m2。
5、按照权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述不含-NH2的有机基团包括醛基。
6、按照权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述不含-NH2的有机基团包括环氧基。
7、按照权利要求1-6之一所述的生物芯片，其特征在于：
a).所述片基包括纳米结构片基，其中所述纳米结构片基含有纳米结构区，并在该结构区有纳米凸体，并且纳米凸体的分布密度大于1个纳米凸体/μm2，优选纳米凸体的分布密度大于5个纳米凸体/μm2；和
b).所述活化纳米结构包括活化纳米凸体，其中所述活化纳米凸体含有：所述纳米凸体、共价键合在纳米凸体上的所述偶联基团、共价键合在偶联基团上的所述活化基团。
8、按照权利要求1-6之一所述的生物芯片，其特征在于：
a).所述片基包括非纳米结构片基；和
b).所述活化纳米结构包括活化纳米粒子，其中所述活化纳米粒子含有纳米粒子、共价键合在纳米粒子上的所述偶联基团、共价键合在偶联基团上的所述活化基团。
9、按照权利要求1-6之一所述的生物芯片，其特征在于：
a).所述片基包括纳米结构片基，其中所述纳米结构片基含有纳米结构区，并在该结构区有纳米凸体，并且纳米凸体的分布密度大于1个纳米凸体/μm2、优选纳米凸体的分布密度大于5个纳米凸体/μm2；和
b).所述活化纳米结构包括活化纳米粒子，其中所述活化纳米粒子含有纳米粒子、共价键合在纳米粒子上的所述偶联基团、共价键合在偶联基团上的所述活化基团。
10、按照权利要求1-9之一所述的生物芯片，其特征在于：所述生物芯片包括流动式生物芯片。
11、根据权利要求1-10之一所述的生物芯片，其特征在于：所述生物芯片还含有非纳米结构探针点。
12、根据权利要求8-11之一所述的生物芯片，其特征在于：其中所述纳米粒子包括无机纳米粒子。
13、根据权利要求8-12之一所述的生物芯片，其特征在于：其中所述活化纳米粒子与片基含有相同的所述活化基团。
14、一种制备权利要求1-13所述生物芯片的方法，至少含以下步骤：第一步，提供所述纳米结构、偶联基团和活化基团，并制备所述活化纳米结构；第二步，提供所述探针分子和第一步制备出来的活化纳米结构，并制备所述纳米结构探针点。
15、按照权利要求14所述的生物芯片的制备方法，其特征在于：所述制备出的活化纳米结构，包括所述活化纳米凸体。
16、接照权利要求14所述的生物芯片的制备方法，其特征在于：所述制备出的活化纳米结构，包括活化纳米粒子，并至少含有以下步骤：
第一步，提供所述探针分子和所制备出的活化纳米粒子，并制备含探针分子/活化纳米粒子复合物的制备物；
第二步，提供所述片基和第一步所制备出的含探针分子/活化纳米粒子的制备物，并制备所述纳米结构探针点。
17、按照权利要求16所述的生物芯片的制备方法，其特征在于：其中在所述含探针分子/活化纳米粒子复合物的制备物中，未固定探针分子的含量小于探针分子总量的50％。
18、按照权利要求16或17所述的生物芯片的制备方法，其特征在于：其中所述含探针分子/活化纳米粒子复合物的制备物中，非亲和纳米粒子的含量小于纳米粒子总量的50％。
19、按照权利要求16-18之一所述的生物芯片的制备方法，其特征在于：所述制备出的活化纳米粒子，含有纳米粒子、共价键合在纳米粒子上的所述偶联基团、共价键合在偶联基团上的所述活化基团。
20、按照权利要求16-18之一所述的生物芯片的制备方法，其特征在于：所述制备出的含探针分子/活化纳米粒子复合物的制备物，其中未固定探针分子的含量小于探针分子总量的50％。
21、按照权利要求16-18之一所述的生物芯片的制备方法，其特征在于：所述制备出的含探针分子/活化纳米粒子复合物的制备物，其中非亲和纳米粒子的含量小于纳米粒子总量的50％。
22、一种生物芯片试剂盒，其特征在于：在该试剂盒内包含有权利要求1-13之一所述的生物芯片。
23、按照权利要求22所述的生物芯片试剂盒，其特征在于：在该试剂盒中还有标记系统，且所述标记系统如此配置：使得在进行标记反应时，其标记物的标记探针分子浓度小于5ug/ml。
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