CN101035575B - 用于防止脊髓粘连的由硫酸化透明质酸和吉兰糖胶组成的生物材料 - Google Patents

用于防止脊髓粘连的由硫酸化透明质酸和吉兰糖胶组成的生物材料 Download PDF

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Abstract

用作防止腹部手术、骨盆手术特别是脊柱手术后粘连的高效屏障的、由硫酸化透明质酸和吉兰糖胶的组合(以及不与其它多聚体结合的吉兰糖胶)组成的新生物材料。

Description

用于防止脊髓粘连的由硫酸化透明质酸和吉兰糖胶组成的生物材料
发明主题 
本发明涉及由硫酸化透明质酸和吉兰糖胶(gellan)(以及未与其它多聚体结合的吉兰糖胶)的组合组成的新生物材料，其用作防止腹部手术、骨盆手术、特别是脊柱手术后粘连的高效屏障。 
发明背景 
手术后粘连的形成是非常普遍的并发症，在腹部或骨盆手术中发生率高达40％(Holmdahl L.等人，Eur J Surg 1997，163(3)：169-174)并且在脊柱手术中发生率高达70-90％(Einhaus SL等人，Spine 1997，22(13)：1440-1447)。 
许多因素决定和/或影响手术后粘连的形成，例如机械损伤、手术后出血、缺血和炎症的发作以及可能的微生物感染。 
因手术外伤而形成的浆液性渗出物，如果不迅速地再次吸收，则会产生明显的成纤维细胞募集，结果导致胶原分子沉积，这导致与邻近组织形成粘连。 
总之，手术后粘连的形成似乎是炎症反应的直接结果。 
在脊柱外科领域，硬膜外纤维化的形成是主要的术后危险。的确，在椎板切除术和/或椎间盘切除术之后，纤维性星状胶质细胞(具有神经胶质特征的细胞)产生胶质性瘢痕组织，其功能是防止神经元物质从硬脊膜基质(dura matrix)中渗漏，硬脊膜基质是由纤维性结缔组织形成的覆盖脊髓的脊膜最外层。 
这在损伤脊髓组织的愈合过程中是正常现象，但是在术后的炎症过程 中，这种完全无弹性的连接组织会过量产生并且干扰神经根和硬脊膜基质的神经运动过程、挤压邻近组织和解剖结构，从而脊髓和四肢的的正常运动会发生疼痛。 
任何后期手术都将会更复杂，需要更长时间的住院治疗并且预后更差。 
由于上述原因，防止和/或抑制手术后粘连、特别是硬脊膜纤维化成为了医学和药学科学研究的主要目标。 
有效的抗粘连屏障的必不可少的特征是：具有生物可降解性和生物适应性、低毒或无毒、不干扰损伤组织的天然愈合过程，但是最重要的是具有防止在腹部或脊柱手术后与邻近组织粘连的能力。 
已经测试(体外和体内)了作为可能的新抗粘连材料的许多不同材料，例如合成或半合成的聚对苯二甲酸乙二醇酯膜(Dacron
Figure 200580034030310000210003_0
)、丙烯酸酯膜、聚乳酸膜(Klopp LS等人，Neurosurg Focus 2004，16(3)：E2)、聚四氟乙烯膜(Gore-tex
Figure 200580034030310000210003_1
)(Llado A等人，Eur Spine 1999，8(2)：144-150)。 
其它实验研究了用类固醇和非类固醇药物冲洗伤口的作用，但是这些材料不能满足对在临床实践中有效且安全的抗粘连的所有必需要求(上述)。 
美国专利5,017,229、5,527,893和5,760,200公开了一种新型抗粘连膜(Seprafilm)，其由两种化学结合的多聚体如透明质酸(HA)和羧甲基纤维素组成；由于使用诸如碳二亚胺的活性剂(在两个多聚体间形成化学键所必需)所带来的毒性问题，使得该种新屏障的功效被降低。 
US 5,605,938公开了一种抗粘连医学装置(ADCON
Figure 200580034030310000210003_3
-L)，其由可再吸收和可挤出的凝胶构成，凝胶由猪明胶和硫酸葡聚糖组成。已经证实，ADCON
Figure 200580034030310000210003_4
-L凝胶在防止手术后粘连中非常有效，基于该原因，本申请人将其作为下文所述动物实验中的对照装置。 
相反地，EP 1323436公开了源自羧甲基纤维素与吉兰糖胶以1∶(0.2-5)的重量比组合的抗粘连屏障。在该专利案中，纤维素衍生物代表着防止粘连过程中的活性剂，然而已知，与本发明主题的新抗粘连屏障中的活性剂-硫酸化透明质酸(SHA)(EP0702699 B1)不同，这种活性剂完全没有抗炎症 和/或抗微生物特性。 
还研究了未进行化学修饰的透明质酸(US 4,141,973)作为抗粘连屏障的特性，但是其作为多聚体可容易地水合和生物降解，其在体内的存留时间太短以致于不能够完全防止粘连。 
基于该原因，对透明质酸进行修饰以在分子内部形成酯键(EP 0341745B1)，这通过显著提高多聚体在损伤部位的存留时间而有效地防止腹部和骨盆粘连(基于ACP
Figure 200580034030310000210003_5
凝胶的Hyalobarrier
Figure 200580034030310000210003_6
凝胶)(EP 0850074)。 
已经证明，透明质酸酯(EP 0216453 B1)、特别是其苄酯(Hyaff
Figure 200580034030310000210003_7
-11)在防止手术后粘连(US 6,723,709)以及尤其用于制造固体结构如非纺织毡(non-woven felts)(EP 0618817 B1)中是有效的。 
然而，从来没有测试过经修饰的透明质酸在脊柱手术中的有效性。 
本发明涉及源自硫酸化透明质酸和吉兰糖胶组合的新生物材料以及由吉兰糖胶多聚体单独形成的新生物材料。经证实，本发明的生物材料在防止腹部和骨盆手术后粘连中是高效的，并且在完全防止脊柱手术如椎板切除术和椎间盘切除术后粘连中是特别有效的。 
发明详述 
本发明涉及由硫酸化透明质酸或透明质酸的其它硫酸化衍生物和吉兰糖胶组合组成的新生物材料以及由吉兰糖胶单独形成的新生物材料，其用作完全防止腹部和骨盆手术后粘连以及特别是脊柱手术后所形成的粘连的新的医学装置。 
的确，经证实本发明的生物材料在完全防止椎板切除术/椎间盘切除术后经常形成的粘连或者多种类型脊柱手术后的粘连中是有效的。 
已经发现，硫酸化透明质酸在防止粘连中起着基础作用：事实上，就成纤维细胞而言，多糖的羧基以及硫酸化基团的存在决定着具有强静电排斥性，从而抑制了损伤脊髓组织的细胞入侵。另一方面，吉兰糖胶作为结构基质能够控制所治疗组织对硫酸化透明质酸的吸收，而作为生物材料的支持物(优选以凝胶的形式)能保持最初稠度直到其能有效地行使抗粘连屏 障的作用。 
硫酸化透明质酸、相关制备方法以及其作为抗粘连装置的用途在EP0702699 B1中描述并要求保护。然而，SHA的化学-物理特性使得由所述多聚体单独构成的凝胶具有与未进行化学修饰的HA可比的粘度。的确，SHA比非硫酸化多糖更容易水合，并且它们具有相同的生物降解性。由于这些原因，SHA本身不能用作防止手术后粘连的生物材料，因为其在原位的存留时间不足以完全防止粘连。 
在另一方面，硫酸化透明质酸和吉兰糖胶的组合证明是最佳的，因为在动物中开展的实验(后面描述)表明，与未处理对照和ADCON
Figure 200580034030310000210003_8
-L装置(在临床实践中长期用于抗粘连)相比，在硬脊膜基质脊膜周围形成的纤维性组织可以忽略不计，并且瘢痕组织没有与硬脊膜基质粘连或者挤压硬脊膜基质。 
EP 0702699 B1公开了用于制备新医学装置的新的透明质酸衍生物，该透明质酸衍生物是通过导致形成具有特异性抗凝血和抗血栓形成特性的硫酸化透明质酸分子(它们被不同程度地硫酸化)的多糖硫酸化过程得到的。 
相反，申请人证明，本发明生物材料中化学结合至透明质酸的硫酸化基团的存在不干扰正常的血液凝固过程。 
此外，本发明生物材料还具有抗炎症和抗微生物特性，而从具有有效的抗粘连剂所需要的全部特征。 
吉兰糖胶是微生物来源的外泌多糖，其由需氧发酵的Sphingomonaselodea产生的。天然吉兰糖胶是由重复的四糖单位(由葡萄糖、葡糖醛酸和鼠李糖以2∶1∶1的分子比组成)连接形成的杂聚糖。 
将吉兰糖胶脱酰基(通过碱水解)得到商品Gelrite
Figure 10003_9
，其用于本发明或者与硫酸化透明质酸或其硫酸化衍生物组合用于本发明。 
天然状态的吉兰糖胶所形成的凝胶较软但是具有弹性和柔韧性，而脱乙酰基的吉兰糖胶在相同条件下形成紧密的凝胶。 
吉兰糖胶可以用于食品、生物工程和药物领域。在食物中其可用作增 稠剂和稳定剂，在植物生物工程中其用作细菌培养的基质(固体)。由于吉兰糖胶具有在阳离子存在下形成凝胶的能力，所以在制药业中其用于形成缓释制剂微胶囊。 
透明质酸是由交互的D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺残基组成的杂聚糖。取决于来源和制备方法，它可以是分子量为50,000和13×106道尔顿(Da)之间的直链多聚体。其天然存在于细胞外凝胶、脊椎动物结缔组织的基础物质(其为主要成分之一)、关节滑液、玻璃体液和脐带中。 
HA在生物体中起着重要的作用，尤其是作为多种组织(例如皮肤、腱、肌肉和软骨)细胞的机械支持物。而且，由于其为细胞外基质的主要成分，所以其起着和/或参与其它生物学功能，例如组织的水合功能、关节润滑、细胞迁移和分化。 
由于透明质酸及其盐(特别是可能的、适宜的、衍生的钠、钾、镁和钙盐)具有生物/粘膜粘附特性和组织相容性，已经提出将其用于药物控释系统和制备医学装置如假肢。 
在本发明中使用的HA可以来自任何来源，例如可以从鸡冠提取(EP0138572 B1)、通过发酵得到(EP 0716688 B1)或者通过技术手段得到，并且其分子量范围可以为400至3×106Da、特别是10,000至1×106Da并且更加特别地在100,000和250,000Da之间。 
对透明质酸及其衍生物进行硫酸化的过程可以以本领域技术人员已知的方式开展，但是优选地如EP 0702699 B1中所公开开展。 
可以用于硫酸化过程的HA衍生物列于下文： 
1.与有机和/或无机碱形成盐的具有50-730Kda的分子量(EP0138572 B1)或者具有750-1230Kda的高分子量(EP 535200 B1)、优选具有100和250Kda间分子量的HA； 
2.Hyaff：HA与脂肪族、araliphatic、脂环族、芳香族、环和杂环系列醇的酯(EP 216453 B1)；由于所得到的产物必须是水溶性的，所以根据所使用的醇的类型和长度，随后进行硫酸化的透明质酸的酯化百分数在5％和65％之间； 
3.ACP
Figure 10003_11
：HA的内酯(EP 0341745 B1)；由于所得到的产物必须是水溶性的，所以随后进行硫酸化的透明质酸的内酯化百分数在1％和15％之间； 
4.HyoxxTM：通过N-乙酰-葡糖胺的伯羟基氧化得到的过羧酸酯化HA衍生物(EP 1339753)；随后进行硫酸化的透明质酸的过羧酸酯化百分数在1％和50％之间。 
HA的所有游离羧基可与有机和/或无机碱形成盐。 
在每一重复单元的硫酸化基团数量方面，上面所列的透明质酸和/或其衍生物的硫酸化程度可以在0.5和3.5之间，优选为3。 
多种药理学和/或生物学活性材料可能与本发明的生物材料的主要成分结合以提高其抗粘连效果。具体而言为归为蛋白质抑制剂类的抗生素和药物，例如白细胞介素(IL)-10、IL-13、IL-1、TNF和干扰素。 
本发明的抗粘连装置可以制造成多种形式：海绵、凝胶或水凝胶、泡沫或粉末，优选形式为凝胶或水凝胶。 
吉兰糖胶(G)和SHA(或者G和HA的硫酸化衍生物)之间的重量比可以在1.5∶1、2∶1和2∶1.5之间；优选的是重量比2∶1。备选地，如前面所述，同样可以使用吉兰糖胶(优选以凝胶或水凝胶的形式)作为新的抗脊髓粘连的生物材料。 
本发明还涉及药物组合物，其包含本发明的生物材料与载体和/或可药用赋形剂的组合。 
在下面报道了本发明的抗粘连生物材料的制备的一些实施例和体内实验结果。 
实施例1： 
由吉兰糖胶与硫酸化HA以2∶1的重量比的组合组成的水凝胶形式生物材料的制备 
根据EP 0702699 B1将HA硫酸化，硫酸化程度为3。 
通过加热(75-85℃)并在50ml的0.9％NaCl中溶解1g吉兰糖胶来制备20mg/ml的脱乙酰基吉兰糖胶(Gelrite)溶液。一旦完全溶解，加入500mg的硫酸化HA并使其完全溶解。将混合物冷却至室温直到得到水凝胶， 然后蒸汽灭菌。 
实施例2： 
由吉兰糖胶与硫酸化HA以1.5∶1的重量比的组合组成的水凝胶形式生物材料的制备 
方法如实施例1所述，溶解750mg吉兰糖胶和500mg硫酸化HA。 
实施例3： 
由吉兰糖胶与硫酸化HA苄酯(25％酯化)以2∶1的重量比的组合组成的水凝胶形式生物材料的制备 
如实施例1中所述制备吉兰糖胶溶液。然后加入500mg的硫酸化HA苄酯并使其完全溶解。然后冷却至室温得到水凝胶，然后蒸汽灭菌。 
实施例4： 
由吉兰糖胶与硫酸化HA以2∶1的重量比的组合组成的粉末形式生物材料的制备 
如实施例1所述进行，但是在硫酸化HA溶解之后，将仍然温的溶液慢慢倒入冷却至4℃的无水乙醇中。然后通过过滤将所得到的沉淀从溶剂中分离出来。借助于高真空系统将所得到的粉末干燥。 
实施例5： 
由吉兰糖胶与硫酸化HA以2∶1的重量比的组合组成的海绵形式生物材料的制备 
如实施例1所述进行。将冷却至室温后得到的终溶液冻干。从而得到 海绵形式的三维结构。 
实施例6： 
仅由吉兰糖胶构成的水凝胶形式生物材料的制备 
通过在加热后(75-85℃)将1g吉兰糖胶Kelcogel
Figure 10003_13
CG-LA(粘度为32Cp)溶解于50ml的0.9％NaCl中制备20mg/ml的脱乙酰基吉兰糖胶溶液(浓度在1和50mg/ml之间变化)。完全溶解通常需要3-5分钟(将吉兰糖胶粉末溶解所需要的时间依赖于其粘度，粘度可以在26和39Cp之间)。将溶液冷却至室温直到得到水凝胶，然后蒸汽灭菌。 
临床前实验 
在实验动物上开展实验以证明本发明的新生物材料完全有效且安全。 
所测试的抗粘连装置
在实验动物上测试的生物材料为： 
●ADCON
Figure 10003_14
-L，其为凝胶形式的医学装置，由猪明胶和硫酸化葡聚糖组成，证明在临床抗粘连中有效，用作对照； 
●ACP
Figure 10003_15
凝胶，由具有5％内酯化的HA内酯组成，在盐水中制备成60mg/ml的浓度； 
●Hyaff
Figure 10003_16
-11凝胶：酯化程度为50％的HA的苄酯；在盐水中制备成70mg/ml的浓度； 
●G/SHA凝胶：由G和SHA的组合形成；在盐水中制备成吉兰糖胶与硫酸化HA的重量比为2∶1(见实施例1)； 
●G/CMC-S凝胶：由吉兰糖胶和羧甲基纤维素硫酸盐(CMC-S)的组合组成，在盐水中制备成1.5∶1的重量比； 
●ACP
Figure 10003_17
/SHA凝胶：由ACP
Figure 10003_18
和SHA形成，在盐水中制备成重量比为5∶1的多聚体的结合物； 
●根据实施例6制备的吉兰糖胶凝胶 
脊柱手术后形成粘连的实验模型 
使用平均重量为2.5kg的24只新西兰兔。通过静脉内施用舒泰/盐酸甲苄噻嗪/盐水(1∶0.5∶3.5v/v/v，0.25ml/kg)将每一只动物麻醉；所有动物均在腰骶水平的两个不同脊椎部位L2和L4实施手术。 
在沿着相应区域的棘突切开5cm之后，然后下面的肌肉筋膜被切开，通过烧灼术止住任何过量出血。随后，在L2和L4腰椎开展椎板切除术(大小为5×10mm)，从而暴露出硬脊膜基质和从相应脊髓区域形成的神经根。 
手术至此，应用先前所列的抗粘连装置并且将肌肉筋膜和所覆盖的皮肤缝合。 
三只动物用作阴性对照。对它们也以同样方式进行手术，但是没有接受抗粘连处理，以便评价所形成的纤维性组织与硬脊膜基质的粘连和对硬脊膜基质的挤压。 
在两个不同部位对总共24只动物进行了手术，并且分析了7种装置。考虑到阴性对照，在3只动物中测试每一装置，每一装置总共6个脊椎部位。 
分析 
凝血酶原时间(PT) 
手术一个月后，杀死所有的动物。在手术前3天和处理的第21天从3只阴性对照动物和3只用G/SHA凝胶处理的动物中抽取血液样品用于特异的血液动力学测试(PT)，以便通过比较处理动物和未处理对照的血液来评价SHA对血液凝固的任何影响(Mennmeyer ST等人，JAMA 1993，269(8)：1030-1033)。 
组织学分析 
从用G/SHA处理的动物和用ADCON
Figure 10003_19
-L处理的动物以及阴性对照动物的棘突(L2和L4区)获得样品。制备用于组织学分析的样品：在10％福尔马林中固定样品，然后浸入由福尔马林/硝酸/蒸馏水(10/5/85)组成的脱钙溶液中。样品在醇中脱水，石蜡包埋然后切成5μm厚的切片并且用苏木精和伊红染色。 
随后的分析表明形成了纤维性组织并且与硬脊膜基质粘连，在所有样品分析之后表示为分值如下： 
0分＝在硬脊膜基质附近不存在纤维性组织； 
1分＝在新形成的瘢痕组织和硬脊膜基质之间可见薄的纤维性组织； 
2分＝存在与硬脊膜基质粘连的纤维性组织，其影响椎板切除术所处理面积的几乎2/3； 
3分＝存在挤压硬脊膜基质并与硬脊膜基质完全粘连的纤维性组织，其影响椎板切除术所处理面积的2/3以上。 
解剖学观察 
在杀死动物后，检查所有动物的椎板切除术部位。因此再次暴露硬脊膜基质和神经根，以便按照下面的评分系统评价粘连和挤压的存在： 
0分＝在硬脊膜基质附近不存在纤维性组织； 
1分＝可见到与硬脊膜基质粘连的薄层纤维性组织； 
2分＝存在与硬脊膜基质适度粘连的纤维性组织； 
3分＝存在明显挤压硬脊膜基质和与硬脊膜基质明显粘连的纤维性组织； 
4分＝存在足够数量以至于占据手术所影响的整个空间的纤维性组织。 
所得到的结果 
评价凝血酶原时间(PT)： 
表1显示了从使用G/SHA处理的动物和未处理对照动物得到的血液 样品的PT数值。 
                              表1 
  未处理样品：  手术前3天测定  的PT   未处理样品：  手术后28天测定  的PT  处理样品： 手术前3天测定 的PT   处理样品：  手术后28天测定  的PT
  PT＝7.5秒   PT＝7.6秒  PT＝7.6秒   PT＝7.8秒
结果显示，在对照动物和处理动物中，手术之前和之后的PT没有变化，这表明用作抗粘连生物材料的SHA与吉兰糖胶的组合在处理动物中不以任何方式影响血液凝固。 
组织学评价： 
表2显示了从如上所述处理动物和用作阴性对照的未处理动物得到的分值。 
                        表2 
 样品   根据纤维性组织的形成评  定的平均分值   根据与硬脊膜基质形成粘  连评定的平均分值
 对照   1.5分   2分
 G/SHA   0.3分   0分
 ADCON
Figure 10003_20
-L 		  1.1分   1.8分
结果明确显示，本发明的生物材料在防止与硬脊膜基质脊膜以及从脊髓突出的神经根粘连和挤压它们的纤维性组织形成中完全有效。 
解剖学观察： 
附图图解说明从对所测试抗粘连装置和相关未处理对照进行解剖学评价所得到的结果，表示为分值0至4。 
可以从图中清楚地看出，本发明的新抗粘连剂G/SHA和吉兰糖胶同 样完全防止了术后脊髓粘连的形成，其结果远远好于在临床实践中通常所用的有效的ADCON
Figure 10003_21
-L装置。 
最后，上面的图表显示，SHA与任何其它半合成的硫酸化多聚体如CMC-S是不等效的并且也不能被它们替代。实际上，其与吉兰糖胶的组合(G/CMC-S)给出了明显的阴性结果，特别是与使用G/SHA凝胶所得到的结果相比较时。 
在此已经描述了本发明，但是很明显，可以以多种方式修改制备本发明生物材料的实施例。此种修改被认为没有偏离本发明的精神和目的，并且任何此种修改对于本领域的专家是显而易见的并且处于后附权利要求的范围内。 

Claims (23)

1.脱乙酰基吉兰糖胶和硫酸化透明质酸或其硫酸化衍生物组合组成的生物材料，其用于防止手术后脊髓粘连，其中硫酸化透明质酸或其硫酸化衍生物的硫酸化程度在0.5和3.5之间，并且其中脱乙酰基吉兰糖胶和硫酸化透明质酸或其硫酸化衍生物的重量比在2∶1.5到2∶1之间。
2.根据权利要求1所述的生物材料，其中所述重量比为1.5∶1到2∶1。
3.根据权利要求1或2所述的生物材料，其中所述重量比为2∶1。
4.根据权利要求1或2所述的生物材料，其中硫酸化透明质酸或其硫酸化衍生物的硫酸化程度为3。
5.根据权利要求3所述的生物材料，其中硫酸化透明质酸或其硫酸化衍生物的硫酸化程度为3。
6.根据权利要求1、2或5的任一项所述的生物材料，其中硫酸化透明质酸或其硫酸化衍生物的分子量范围为10,000至1×106Da。
7.根据权利要求3所述的生物材料，其中硫酸化透明质酸或其硫酸化衍生物的分子量范围为10,000至1×106Da。
8.根据权利要求4所述的生物材料，其中硫酸化透明质酸或其硫酸化衍生物的分子量范围为10,000至1×106Da。
9.根据权利要求6所述的生物材料，其中硫酸化透明质酸或其硫酸化衍生物的分子量范围在100,000和250,000Da之间。
10.根据权利要求7或8所述的生物材料，其中硫酸化透明质酸或其硫酸化衍生物的分子量范围在100,000和250,000Da之间。
11.根据权利要求1、2、5、7-9中任一项所述的生物材料，其与药理学和/或生物学活性物质组合。
12.根据权利要求3所述的生物材料，其与药理学和/或生物学活性物质组合。
13.根据权利要求4所述的生物材料，其与药理学和/或生物学活性物质组合。
14.根据权利要求6所述的生物材料，其与药理学和/或生物学活性物质组合。
15.根据权利要求10所述的生物材料，其与药理学和/或生物学活性物质组合。
16.根据权利要求1、2、5、7-9、12-15中任一项所述的生物材料，其制造成海绵、凝胶、水凝胶、泡沫或粉末的形式。
17.根据权利要求3所述的生物材料，其制造成海绵、凝胶、水凝胶、泡沫或粉末的形式。
18.根据权利要求4所述的生物材料，其制造成海绵、凝胶、水凝胶、泡沫或粉末的形式。
19.根据权利要求6所述的生物材料，其制造成海绵、凝胶、水凝胶、泡沫或粉末的形式。
20.根据权利要求10所述的生物材料，其制造成海绵、凝胶、水凝胶、泡沫或粉末的形式。
21.根据权利要求11所述的生物材料，其制造成海绵、凝胶、水凝胶、泡沫或粉末的形式。
22.药物组合物，其包含根据权利要求1-21任一项所述的生物材料与可药用载体的组合。
23.药物组合物，其包含根据权利要求1-21任一项所述的生物材料与可药用赋形剂的组合。
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