CN101024149A - 一种血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜材料、制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明旨在提供一种血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料、制备方法以及相关应用。该聚合物多孔膜载体材料是以平均孔径为0.05～100μm医用聚合物无纺布为出发原材料，通过⁶⁰Co－射线共辐照接枝共聚合聚丙烯酸表面改性后，进一步在所得多孔膜的表面借助羧基与含有0～10碳原子手臂胆固醇配基的共价偶联固定具有增强吸附分离效果胆固醇配基，最终得到具有血浆脂质选择性吸附分离能力的聚合物多孔膜载体材料。本发明所提供的相关制备方法简便、安全、有效、易于大规模推广生产。并且所得材料血液相容性良好，可以应用作为作为血浆脂质成份的吸附分离、临床高血脂症病人的血液动态灌流净化以及废弃血浆分离再生利用辅助材料。

Description

一种血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜材料、制备及其应用

技术领域

本发明提供了一种新型功能聚合物多孔膜材料、制备方法及其在血浆脂质成份吸附或分离中的应用。该发明所提供的聚合物多孔膜材料涉及临床血液净化应用中血浆脂质成份的选择性吸附、分离介质材料，属于生物医用材料以及医疗器械材料领域。该发明所涉及的一种新型聚合物多孔膜由不同平均孔径尺寸的医用等级聚合物无纺布作为出发材料，经过表面核辐照接枝改性以及表面共价偶联固定系列手臂胆固醇吸附配基等过程制备得到。

背景技术

当前心脑血管系统疾病已经发展成为威胁人类健康的三大主要临床疾病之一，全世界每年有800～1000万人死于心血管相关疾病。据2006年12月1日发布的《中国心血管病报告2005》统计数据，现在中国临床死于心血管病的人数每年已经达到约三百万，占所有总死亡人数的45％左右，并且这些心脑血管疾病死亡病例又绝大多数死于高血脂所导致的动脉硬化。临床医学研究表明高脂血症是引起动脉硬化乃至冠心病和心肌梗塞的重要因素[New Eng.J.Med.1990，322，1700]，同时发现临床冠心病与患者血浆脂质成份中低密度脂蛋白(LDL)浓度异常，其含量过高存在紧密关系[Mayo Clin Proc，1999，74，466]。降低患者血浆脂质成份中过高低密度脂蛋白(LDL)的含量被发现能够有效地改善临床病例的心脑血管流变性和状况[New Eng.J.Med，1995，333，1301]，有益于高血脂症所导致的心血管疾病的治疗。因而，最新美国国家胆固醇教育计划(National Cholesterol Education Program，NCEP)指南强调指出，降低血浆脂质成份中低密度脂蛋白(LDL)的浓度已经成为预防动脉硬化、降低冠心病发病率的重要有力措施，尤其是对于通过膳食控制和临床药物治疗都没有效果的遗传性高胆固醇血症患者显得更加重要。

为了更高效率、安全地去除临床高血脂症病人血浆中的有害脂质成份，如低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)以及过高的胆固醇与甘油三酯(TG)。近二十年来，临床医学和生物材料科学研究者持续、不断探索新的高效临床治疗方法与开发相应的新型生物医疗器械，希望研究得到生物相容性良好、吸附分离选择性高、人体生物微环境中稳定、后功能化容易的低成本新型血液净化材料，以期应用实现降低临床高血脂症患者血浆中有害脂质成份的含量。血液净化材料的已有研究发展表明：早期研发的血浆交换净化法(Plasma Exchange)、血浆双重滤过法(Double-Filtration PlasmaPheresis)到目前临床已经极少使用，新的免疫吸附(Immuno-adsorption)、肝素诱导沉淀(HELP)等血液净化方法与材料得到进一步的发展。同时大量的医学临床应用实验表明这些新的净化材料与治疗方法将会导致新的免疫反应、体内过敏反应，并且血液净化操作流程复杂，相关医疗设备造价昂贵，难以大范围应用推广，因此逐渐呈淘汰的趋势。目前临床上应用相对较多的血液净化方法磺化葡聚糖纤维素吸附法(DSC)，应用结果表明仍然存在纤维素微珠机械强度差、制造成本高等现实缺点，有待进一步改进。

另一方面，血液净化技术的最新发展表明，全血直接吸附法(DALI)正在得到越来越多的关注，而其相关血液净化吸附分离材料是该项技术的核心关键。到目前为止，世界范围内尚没有能够真正应用到临床全血动态灌流吸附低密度脂蛋白(LDL)的优良吸附剂，特别是运用多孔生物分离膜材料吸附分离LDL的成功报道较少。美国Parham等人报道系列借助羧基负电性聚丙烯酸修饰聚砜纤维微孔膜净化低密度脂蛋白LDL的方法[US Patent 54 96637，5187010，5236644，5258149]。但是该方法存在微孔膜制备过程很复杂，条件要求较高，而且制备过程中需要使用溶剂等问题。同时为了在膜表面更好地锚定聚丙烯酸，需要加入的致孔剂，这些是否会在血浆动态灌流净化过程中导致不良反应的发生，成为新的关注疑点。另外日本H.Yokota等人报道运用涤纶(PET)无纺布为基材，通过通过高能电子辐射诱导表面接枝共聚合丙烯酸。在此基础上，通过一定长度的手臂将基材表面的丙烯酸羧基(COOH)与低密度脂蛋白LDL的特异性结合小分子(如短链的多肽、硫酸葡聚糖小分子等)共价键合固定，从而制备得到一系列LDL吸附材料(如特開平6-178807，特開平6-237997，特開平5-301043)。然而，尽管上述方法所得LDL净化材料的动态灌流效果较为理想，但是生产上述吸附净化材料所需高能电子辐射设备昂贵，并且表面接枝共聚合效率不高。同时存在特异性结合小分子试剂合成与基材表面羧基偶联过程复杂，净化材料的血液相容性、生物毒性不清楚等现实问题，因此距离临床实际应用尚有较长距离。

关于血液净化材料的研究，国内南开大学生物材料研究中心报道了几种性能优良的低密度脂蛋白LDL吸附剂，如郭贤权等最近报道了珠状交联聚乙烯醇凝胶固载的牛磺酸吸附配体的LDL吸附剂[中国生物医学工程学报，2001，20(4)，317]，同时还报道了以交联聚甲基丙烯酸缩水甘油酯为出发原料，合成制备得到的一系列不同距离上含有两个磺酸基团的高分子吸附剂[中国生物医学工程学报，2001，20(1)，17]。傅国旗等在活化多孔壳聚糖珠表面上，通过一定长度的碳氢手臂化学偶联色氨酸作为配基，制备成功LDL吸附剂，并且试验表明其对低密度脂蛋白LDL具有较高的吸附容量和较好的吸附选择性，同时具有良好的血液相容性[科学通讯，2003，48(17)，1840]。袁毅等在类似吸附载体的基础上，通过磺化和固定胆固醇配体制备成功一种具有双亲性的低密度脂蛋白LDL吸附剂[离子交换与吸附，2003，19(1)，49]。总体来看，上述几种相对比较好的LDL吸附剂的介质载体都为聚合物凝胶体系，其机械力学强度能否长时间承受血液净化动态灌流过程中伴生的压力与多向剪切力，同时其作为吸附剂的材料血液相容性、生物毒性还有待进一步研究，并且制备方法与工程相对比较复杂，规模化生产有一定困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜材料；

本发明的目的还提供一种血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜材料的制备方法；

本发明的另一目的是提供一种血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜材料的应用。以应用于血浆动态灌流选择性地吸附分离有害脂质成份低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)以及过高的总胆固醇(TC)与甘油三酯(TG)。

本发明是以水不溶性、生物稳定性良好的系列平均孔径的医用聚合物无纺布为出发载体材料，通过⁶⁰Co γ-射线共辐照接枝共聚合聚丙烯酸表面导入亲水性、负电性羧基官能团以后，进一步借助系列长度的碳氢手臂试剂的设计与共价偶联，在多孔膜载体材料表面固定能够与低密度脂蛋白(LDL)等疏水缔合的胆固醇配基，从而最终制备得到基于上述吸附载体表面负电性羧基以及胆固醇配基的血浆脂质成份吸附分离材料。本发明所提供的新型聚合物多孔膜材料的吸附机制在于综合利用基于低密度脂蛋白(LDL)生物结构模型的疏水缔合相互作用(LDL的胆固醇组分与吸附载体表面的胆固醇配基)与静电吸引力(LDL的表面正电性载脂蛋白B结构部分与吸附载体的负电性丙烯酸羧基基团)，也就是偶联的胆固醇配基能够与低密度脂蛋白(LDL)的内核胆固醇部分产生疏水作用，插入LDL内部，同时改性聚合物无纺布多孔膜载体剩余的负电性羧基基团能够促进吸附载体与LDL载脂蛋白B所带正电荷的静电相互吸引作用，提高综合吸附分离能力以及多种脂蛋白的吸附选择性(高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白)。由于该发明所提供的一种新型血浆脂质成份吸附分离多孔膜材料载体制备中采用丙烯酸与胆固醇配基已经被大量实验证明具有良好生物相容性、血液相容性及血浆脂质成份选择性结合亲和力，并且采用了比较便利的⁶⁰Co γ-射线共辐照接枝共聚合载体改性技术，因此本发明将提供一种生物体内微环境安全、血浆脂质成份分离有效、生物相容性良好、制造成本价廉的载体材料。本发明提供的新型载体材料将有可能应用于由于血浆脂质成份如低密度脂蛋白LDL等异常偏高所诱发的冠心病、动脉粥样硬化等临床患者的血液净化治疗。

本发明的一种血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料是于辐照接枝共聚合丙烯酸的医用聚合物无纺布表面的羧基共价偶联固定疏水性胆固醇吸附配基。所述的辐照接枝共聚合丙烯酸的医用聚合物无纺布表面的羧基与胆固醇配基的摩尔比为8∶1～4。

所述的辐照接枝共聚合聚丙烯酸的医用聚合物无纺布是以平均孔径为0.05～100μm水不溶性医用聚合物无纺布经过⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚合丙烯酸。

所述的医用聚合物无纺布是医用涤纶无纺布或者医用聚丙烯无纺布，材质为每平方厘米5～30毫克。

所述的共辐照接枝共聚合丙烯酸的医用聚合物无纺布是丙烯酸的接枝率为5～150％重量。

本发明所提供的一种血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜载体材料，其制备过程中以水不溶性、生物微环境稳定、无毒性的不同平均孔径尺寸规格的医用聚合物无纺布为出发材料。

上述制备过程中所采用的无纺布出发材料可以是医用涤纶无纺布或者是聚丙烯无纺布，其应用可能的材质规格为每平方厘米5～30毫克，比较理想的为每平方厘米5～20毫克，最理想的为每平方厘米8～15毫克。

根据本发明所提供的一种血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜载体材料的制备方法，从合成出发采用医用聚合物无纺布的平均孔径可能的范围为0.05～100μm，比较理想的平均孔径尺寸为0.05～20μm，比较适合制备和吸附应用的平均孔径是0.1～10.0μm。

上述系列不同平均孔径的医用无纺布出发材料，首先经过预先裁剪、加工成5.0cm×5.0cm²尺寸的实验样品。然后依次顺序在丙酮溶液、水溶液中运用超声波清洗15～30分钟，取出真空干燥至恒重备后续制备工序使用。

根据本发明所提供的一种血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜载体材料的制备方法，将上述经过超声波清洗、干燥以后的不同材质规格、不同平均孔径尺寸的医用聚合物无纺布试样浸泡于一定浓度的丙烯酸溶液中，采用⁶⁰Co γ-射线共辐照接枝共聚合方法，制备表面接枝共聚合丙烯酸改性的系列聚合物多孔膜吸附载体材料。

上述⁶⁰Co γ-射线共辐照接枝共聚合丙烯酸过程中，丙烯酸水溶液单体浓度的可能范围是1～50wt％，可以避免溶液中丙烯酸发生明显竞争性均聚反应的比较理想的丙烯酸水溶液浓度为1～30wt％，应用最为理想的共辐照接枝共聚合丙烯酸水溶液单体浓度为5～20wt％。其中，wt表示重量。

根据本发明所提供的一种血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜载体材料的制备方法，采用⁶⁰Co γ-射线共辐照接枝共聚合丙烯酸制备改性试样过程中，为了有效地防止水溶液中丙烯酸单体的自聚合，提高载体材料表面的接枝率，因此需要加入合适的阻聚剂。以常用的硫酸亚铁盐为例，丙烯酸水溶液中可能的阻聚剂用量范围是0.1～5.0wt％，相对接枝共聚合效果比较理想的阻聚剂用量为0.5～2.5wt％。

同时上述共辐照接枝共聚合过程中，催化剂能够促进该发明所提供的一种血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜载体材料的⁶⁰Co γ-射线共辐照表面接枝共聚合丙烯酸的效率。以常用硫酸催化剂为例，可能有效的用量是含有0.1～5％重量的硫酸，比较理想的用量为0.5～1.0％。

上述不同材质规格、不同平均孔径的医用聚合物无纺布出发原材料，在⁶⁰Co γ-射线共辐照接枝共聚合过程中，经过含有上述浓度丙烯酸单体、阻聚剂、催化剂的水溶液浸泡16～24小时后，置于⁶⁰Co γ-射线源辐射场中，通过辐照剂量的控制，制备系列接枝率的共聚丙烯酸改性多孔膜载体材料。⁶⁰Co γ-射线共辐照接枝共聚合制备过程发现，上述⁶⁰Co γ-射线应用可能的辐照总剂量范围是10～50kGy，比较理想的辐照总剂量为20～50kGy。

根据本发明所提供的一种血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜载体材料的制备方法，上述不同材质规格、不同平均孔径的医用聚合物无纺布出发原材料试样在⁶⁰Co γ-射线辐照接枝共聚合丙烯酸后，从溶液中取出，用纯水反复洗净后真空干燥至恒重后得到系列规格、平均孔径以及接枝程度的聚丙烯酸改性聚合物多孔膜载体材料。通过接枝共聚合反应前后载体材料重量的变化，可以定量计算相应接枝率5～150wt％，通过酸碱滴定可以定量测出膜表面羧基的含量为10～200μmol/cm²。

根据本发明所提供的一种血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜载体材料的制备方法，为了有效提高制备所得吸附载体的选择性与吸附分离效率，将在上述经过⁶⁰Co γ-射线共辐照接枝共聚合丙烯酸改性的系列多孔膜载体材料表面进一步固定具有通过疏水缔合作用增强吸附分离效果的胆固醇吸附配基，并且上述胆固醇吸附配基在多孔载体膜材料表面的固定是采用手臂试剂共价偶联的方法实现。

上述的共价偶联的手臂通常由脂肪族二醇类有机化合物合成得到，二醇类有机化合物分子结构中可能的碳原子数范围为2～10，如乙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丙二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、1，6-己二醇、1，7-庚二醇、1，8-辛二醇，1，10-癸二醇等，其中比较理想的是乙二醇、1，4-丁二醇或1，6-己二醇。

根据本发明所提供的一种血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜载体材料的制备方法，为了在⁶⁰Co γ-射线共辐照接枝共聚合丙烯酸改性的系列多孔膜载体材料表面羧基上共价偶联固定具有不同碳原子长度碳氢手臂(碳原子数为2～10)的胆固醇配基，因此需要预先合成具有不同碳原子长度碳氢手臂的单官能度胆固醇配基[HO-(CH₂)_n-O-CHOL]，其中CHOL是胆固醇基。其制备方法是：在除水、除氧容器中或在氮气保护下，迅速将对甲基苯磺酸(OTs)装入其中，然后缓慢滴加溶有胆固醇的干燥吡啶，溶液逐渐变成粉红色，继续搅拌反应5～24小时，得手臂胆固醇配基的合成前驱体CHOL-OTs；制备过程中可采用如下方法后处理：将反应液倒入5％碳酸钾溶液中，冰浴搅拌1小时，抽滤后的固体溶于二氯甲烷中，用水反复洗涤、分液，无水硫酸钠干燥过夜，抽滤后旋干二氯甲烷，丙酮重结晶得以纯化。进一步将所述的合成前驱体加入已经除水、除氧的反应器中，同时加入一定量上述可能的脂肪族二元醇手臂试剂化合物，在含氧有机溶剂中回流5～24小时，所述的含氧有机溶剂可以是二氧六环、乙醚等。其后减压除去溶剂，剩余物溶于乙酸乙酯中，继续用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次、饱和氯化钠水溶液洗涤三次，无水硫酸钠干燥过夜，最终得到含n＝2～10碳原子长度碳氢手臂的单羟基官能度胆固醇配基[HO-(CH₂)_n-O-CHOL]。上述反应可能的物料摩尔比为：对甲苯磺酸/脂肪二醇/胆固醇＝2～10∶5～20∶1，比较理想的范围是：对甲苯磺酸/脂肪二醇/胆固醇＝2～5∶5～10∶1。

根据本发明所提供的一种血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜载体材料的制备方法，上述具有不同碳原子长度碳氢手臂的单羟基官能度胆固醇配基在接枝共聚合丙烯酸改性的聚合物多孔膜载体材料表面共价偶联固定的方法为：首先在除水、除氧条件下，根据上述接枝共聚合丙烯酸改性的聚合物多孔膜载体材料表面已经含有的丙烯酸羧基(COOH)含量，按一定的设计偶联配体比例，在通氮气条件下加入单羟基官能度胆固醇配基[HO-(CH₂)_n-O-CHOL]、偶联促进剂N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)。然后注入40～80ml的二氯甲烷溶剂，搅拌5～10分钟后，将上述已经接枝共聚合丙烯酸改性的不同规格、不同平均孔径的聚合物多孔膜载体材料放入反应器中，保持在室温下继续搅拌反应24～48小时。反应完成以后将接枝共聚合胆固醇配基的上述多孔膜载体材料取出，以二氯甲烷为溶剂，采用索氏提取管抽提24小时除去未反应的小分子反应物，真空干燥得到表面共价偶联固定手臂胆固醇配基的丙烯酸改性的聚合物多孔膜载体材料。

上述共价偶联反应中使用的物料比例应用可能的范围是：丙烯酸表面接枝共聚合改性的聚合物多孔膜载体表面羧基量(COOH)/胆固醇配基(HO-CHOL)或者连有不同碳氢手臂的单羟基官能度胆固醇配基[HO-(CH₂)_n-O-CHOL]/N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)/4-二甲氨基吡啶(DMAP)＝5～10∶1～5∶3～5∶1～3，偶联反应效果比较理想的范围是丙烯酸表面接枝共聚合改性的聚合物多孔膜载体表面羧基量(COOH)/胆固醇配基(HO-CHOL)或者连有不同碳氢手臂的单羟基官能度胆固醇配基[HO-(CH₂)_n-O-CHOL]/N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)/4-二甲氨基吡啶(DMAP)＝8∶1～4∶3～5∶2。

本发明的优点

根据该发明所提供的一种新型血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜材料、制备及其应用，具有如下优点：

(1)制备方法简单、工艺条件易于控制，载体材料制备重复性良好。整个制备工艺流程中的关键控制参数是：辐射总剂量、接枝共聚合反应丙烯酸水溶液单体浓度、胆固醇配基的浓度。多孔吸附分离膜材料的实验结果表明制备受其它参数影响较小，而上述几个关键工艺参数易于精确控制，重复性好，适合规模工业化生产。

(2)本发明所采用的出发原材料来源广泛，生产成本低。本发明所采用的主要出发材料医用聚合物无纺布与丙烯酸价格低廉，并且其它辅助制备材料，如胆固醇配基、偶联催化剂、偶联手臂试剂脂肪二醇价格也不高。

(3)本发明所提供的一种新型血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜材料，其血液相容性良好、浸提液无毒、适合紫外等常规医用消毒方法。

(4)根据本发明所提供的一种新型血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜材料，其血浆有害脂质成份低密度脂蛋白(LDL)吸附膜活性效率，低密度脂蛋白(LDL)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的静态吸附能力达到比吸附分离前最高下降54.1％、48.3％、49.5％。同时，本发明所提供的聚合物多孔膜载体动态灌流吸附表明，LDL、TC和TG比吸附分离前最高降低32.0％、55.3％、49.4％。

(5)本发明所提供的一种新型血浆脂质成份吸附分离聚合物多孔膜材料应用前景广泛。不仅可能应用于临床高血脂症患者血液净化，同时可能应用于血液制品加工产业，从不符合输血标准废弃血浆中通过该发明所提供的吸附分离载体材料以及相关分离辅助设备回收血浆，加工血液制品。

具体实施方法

以下通过实施例对本发明进行具体说明，将有助于对本发明的理解，但并不限制本发明的内容。实施例中所采用的化学分析方法具体说明如下：

(1)多孔吸附分离膜表面羧基含量的定量分析方法

取经过⁶⁰Co-射线共辐照接枝共聚合丙烯酸制备改性所得试样一块(5×5cm²)，放入100ml容积的锥形瓶中，然后加入50mol/L浓度的NaOH溶液50ml，室温下静止浸泡24小时。提取浸泡液10ml，用已经标定浓度的盐酸溶液滴定，记录滴定终点时所用盐酸溶液的体积，并且每个试样滴定分析三次，取平均值。因此，多孔膜表面接枝丙烯酸羧基的含量可以通过以下公式计算得到：

$\left[\mathrm{COOH}\right]=\frac{n(\mathrm{Vi}-V_0)}{25}\×5$

其中n为盐酸的浓度，V_i为试样滴定所用盐酸溶液的体积，V₀为未经丙烯酸接枝共聚合改性的多孔膜载体空白参照滴定所用盐酸溶液的体积。

(2)血浆低密度脂蛋白LDL浓度的分析方法

采用一步法(即酶法)分析，其原理为：人血清与试剂R1中的聚阴离子及聚离子反应，在表面活性剂的作用下，除低密度脂蛋白LDL以外的其它脂蛋白与胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶等发生化学反应而被消除。当加入试剂R2后，其中的表面活性剂迅速发生作用，并释放LDL，并在酶作用下单一催化LDL-C反应，发生现色反应，其显色程度与血清中LDL-C含量成正比。

测定所用试剂的规格及成份：(试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司 沪食药监械(准)字2005第2401199号)

R1：2*40ml  R2：2*10ml，校准液：1*1ml(使用时1ml蒸馏水复溶)。

R1：由聚阴离子及胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、酚、过氧化氢酶、表面活性剂等组成。

R2：由过氧化物酶、4-氨基安替比林、缓冲液及表面活性剂等组成。

工作液配制：

试剂：R1：4ml与试剂R2：1ml混匀。

工作液在2～8℃可稳定3天。(最好使用前临时配制)。

测试程序：将待测样品10μl加入1ml工作液中充分混匀，37℃水浴10分钟后，以空白管(10μl蒸馏水加入1ml工作液)调零，分别读取样本管和校准管(10μl标准液加入1ml工作液)的在546nm处紫外吸光度值，计算低密度脂蛋白LDL的含量

(3)高密度脂蛋白HDL浓度测定方法

采用一步法(即酶法)测定，其原理：人血清与试剂R1中的聚阴离子及聚离子反应，在表面活性剂的作用下于脂蛋白周围形成稳定的保护层，当加入试剂R2后，表面活性剂迅速释放HDL，并在酶作用下单一催化HDL-C反应，其显色程度与血清中高密度脂蛋白HDL-C含量成正比。

测定所用试剂的规格及成份：(试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司 沪食药监械(准)字2005第2401199号)

R1：2*40ml  R2：2*10ml，校准液：1*1ml(使用时1ml蒸馏水复溶)

R1：聚阴离子及胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、酚、过氧化氢酶、表面活性剂等组成。

R2：过氧化物酶、4-氨基安替比林、缓冲液及表面活性剂等组成。

工作液配制：4ml R1与1ml的R2试剂混匀，可在2～8℃下可稳定3天。(最好使用前临时配制)。

测试程序：将待测试样10μl加入1ml工作液中充分混匀，37℃中水浴10分钟后，以空白管(10μl蒸馏水加入1ml工作液)调零，分别读取样本管和校准管(10μl标准液加入1ml工作液)的在546nm处的紫外吸光度值，由此计算高密度脂蛋白HDL的浓度：

(4)血浆总胆固醇TC浓度的测定方法

采用CHOD-PAP法，其原理：待测试样中游离及脂化的胆固醇，经下述反应产生醌亚胺，可用紫外分光光度计在500nm处测定其吸光度，根据吸光度的变化，计算血浆胆固醇的含量。

测定所用试剂的规格及成份：(上海荣盛生物技术有限公司沪食药监械(准)字2005第2401199号)

R1(缓冲液)：2×25ml  R2(酶试剂)：2×25ml

校准液：(5.16mmol/l或200mg/dl)：1×1ml

PiPes：35mmol/L，胆酸钠：0.5mmol/L

胆固醇脂酶＞0.2U/ml，胆固醇氧化酶＞0.1U/ml

酚：28mmol/l，过氧化物酶＞0.8U/ml

4-氨基安替比林：0.5mmol/l，pH7.0

工作液配制：缓冲液1份与酶试剂1份等量混匀，储存于2～8℃可稳定30天。

测试程序：将待测10μl加入1ml工作液中，充分混匀，37℃水浴10分钟后，以空白管(10μl蒸馏水加入1ml工作液)调零，分别读取样本管和校准管(10μl标准液加入1ml工作液)在500nm处的紫外吸光值，由此计算

总胆固醇mmol/l＝mg/dl×0.0258

(5)三酯TG浓度的测定方法

采用TRIGLYCERIDES KIT(酶比色法)法，其原理：待测样品中的甘油三酯经下述反应产生红紫色色素，可用紫外分光光度计定量测定。

测定所用试剂的规格及成份：(上海荣盛生物技术有限公司 沪食药监械(准)字2005第2401199号)

2×25ml

Pipes：45mmol/L；氯化镁：5mmol/L；过氧化物酶＞0.8U/ml；

脂蛋白酯酶＞100U/ml；ESBmT 3mmol/l；4-氨基安替比：0.75mmol/L；

3-磷酸甘油氧化酶＞4U/ml；甘油激酶＞1.5U/ml； ATP：0.9mmol/l，pH7.5.

测试程序：将待测样品10μl加入1ml工作液中充分混匀，37℃水浴10分钟后，以空白管(10μl蒸馏水加入1mlT作液)调零，分别读取样本管和校准管(10μl标准液加入1ml工作液)在500nm处紫外分光光度计吸光度值，由此计算甘油三酯TG的浓度：

甘油三酯mg/dl＝甘油三酯mmol/L×88.5

(6)表面全反射红外光谱ATR-FITR分析

将样品剪成10mm×80ml的长条在付里叶变换红外光谱仪AVATAR-360上进行测试。

实施例1

将平均孔径0.1μm的医用聚丙烯无纺布裁剪成5cm×5cm²的试样，依次在丙酮和水中超声波清洗15～30分钟，真空干燥备用。然后，将上述试样浸泡于含丙烯酸单体10％(质量百分比)的水溶液中，溶液中另含有1.0％硫酸亚铁阻聚剂、0.5％硫酸催化剂，浸泡24小时后，将样品置于⁶⁰Co γ-射线源辐射场中，控制累计辐照总剂量30kGy。取出上述辐照处理试样后，洗净、干燥、称重并计算得到丙烯酸的共聚接枝率为30wt％，相应所得多孔膜载体材料的表面羧基含量为25μmol/cm²，ATR-FITR红外光谱分析发现该试样在1700cm^-1处新出现一个很强的吸收带，是羧基吸收的特征信号，表明丙烯酸已被成功接枝共聚合引入聚丙烯无纺布表面，得到聚丙烯酸改性的聚丙烯无纺布多孔膜载体材料。

实施例2

将0.45μm的医用聚丙烯无纺布裁剪成5cm×5cm²的试样，依次在丙酮和水中超声波清洗15～30分钟，真空干燥备用。然后将上述试样浸泡于含有15％丙烯酸单体的水溶液中。溶液中同时含有0.5％的硫酸亚铁阻聚剂、1.0％的硫酸催化剂，浸泡24小时候后，将样品置于⁶⁰Co γ-射线源辐射场中，控制累计辐照总剂量为20kGy。取出上述辐照处理试样后，洗净、干燥、称重并计算得到丙烯酸的共聚合接枝率为84％，定量滴定表面羧基含量为70μmol/cm²。ATR-FITR红外光谱分析发现在1700cm^-1处出现一个很强的吸收峰，对应于羧基的特征吸收信号，表明84％接枝率、0.45μm平均孔径的聚丙烯酸改性的聚丙烯无纺布多孔膜载体材料。

实施例3

取250ml容积三口瓶一只，除水、除氧后，在氮气保护下，迅速将对甲基苯磺酸25克装入其中，然后缓慢滴加溶有25克胆固醇的200ml干燥吡啶，溶液逐渐变成粉红色。继续搅拌反应24小时后，反应液倒入5％碳酸钾溶液中，冰浴搅拌1小时，抽滤后的固体溶于二氯甲烷中，用水反复洗涤、分液，无水硫酸钠干燥过夜。抽滤后旋干二氯甲烷，丙酮中重结晶，得到对甲苯磺酸保护的胆固醇配基中间体(CHOL-OTs)。然后将其移入已除水、除氧的反应瓶中，加入20ml的1，4-丁二醇，以二氧六环为溶剂，回流24小时后，减压除去溶剂，并将剩余物溶于乙酸乙酯中，依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次、饱和氯化钠水溶液洗涤三次，无水硫酸钠干燥过夜，最终得到含有4个碳原子长度手臂单羟基官能度胆固醇配基[HO-(CH₂)₄-O-CHOL]。

实施例4

取250ml三口瓶一支，除水、除氧后，在氮气保护下，迅速将对甲基苯磺酸25克装入，然后缓慢滴加溶有25克胆固醇的200ml干燥吡啶，溶液逐渐变成粉红色，继续搅拌反应24小时，反应液倒入5％碳酸钾溶液中，冰浴搅拌1小时。抽滤后的固体溶于二氯甲烷中，用水反复洗涤、分液，无水硫酸钠干燥过夜，抽滤后旋干二氯甲烷，丙酮重结晶，得到对甲苯磺酸保护的胆固醇配基中间体CHOL-OTs。将上述胆固醇配基中间体CHOL-OTs加入已经除水、除氧处理的反应瓶中，再加入15克1，6-己二醇，以二氧六环为溶剂，回流24小时。然后，减压除去溶剂，将剩余物溶于乙酸乙酯中，依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次、饱和氯化钠水溶液洗涤三次，无水硫酸钠干燥过夜，最终得到含有6个碳原子长度手臂单羟基官能度胆固醇配基[HO-(CH₂)₆-O-CHOL]。

实施例5

取100ml容积的反应管除水、除氧后，根据上述实施例2所得的丙烯酸接枝改性的聚丙烯无纺布多孔膜的表面羧基含量，按羧基/胆固醇配基(HO-CHOL)/N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)/4-二甲氨基吡啶(DMAP)＝8∶1∶5∶2的物料摩尔比例，在通氮气条件下，加入无碳氢手臂的胆固醇配基(HO-CHOL)、偶联催化剂N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)与4-二甲氨基吡啶(DMAP)。然后注入50ml二氯甲烷，搅拌5～10分钟后，将上述实施例2所得的丙烯酸接枝改性的聚丙烯无纺布多孔膜放入反应管中，室温下搅拌反应24小时。胆固醇配基偶联反应结束以后，将偶联胆固醇配基的丙烯酸接枝改性的聚丙烯无纺布多孔膜取出，以二氯甲烷作溶剂，运用索氏提取管抽提24小时以除去未反应物质，真空干燥，最终得到无手臂直接偶联胆固醇吸附配基的聚合物多孔膜载体材料。

实施例6

取100ml容积的反应管除水、除氧后，根据上述实施例2所得的丙烯酸接枝改性的聚丙烯无纺布多孔膜的表面羧基含量，按羧基/胆固醇配基/N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)/4-二甲氨基吡啶(DMAP)＝8∶4∶3∶2的物料摩尔比例，在通氮气条件下，加入上述实施例3制备所得4个碳原子长度手臂单羟基官能度胆固醇配基[HO-(CH₂)₄-O-CHOL]、偶联催化剂N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)与4-二甲氨基吡啶(DMAP)。然后注入50ml二氯甲烷，搅拌5～10分钟后，将上述实施例2所得的丙烯酸接枝改性的聚丙烯无纺布多孔膜放入反应管中，室温下搅拌反应24小时。胆固醇配基偶联反应结束以后，将偶联胆固醇配基的丙烯酸接枝改性的聚丙烯无纺布多孔膜取出，以二氯甲烷作溶剂，运用索氏提取管抽提24小时以除去未反应物质，真空干燥，最终得到偶联4个碳原子手臂的胆固醇吸附配基的聚合物多孔膜载体材料。

实施例7

取100ml容积的反应管除水、除氧后，根据上述实施例2所得的丙烯酸接枝改性的聚丙烯无纺布多孔膜的表面羧基含量，按羧基/胆固醇配基/N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)/4-二甲氨基吡啶(DMAP)＝8∶2∶5∶2的比例，在通氮气条件下，加入上述实施例4制备所得6个碳原子长度手臂单羟基官能度胆固醇配基[HO-(CH₂)₆-O-CHOL]、偶联催化剂N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)与4-二甲氨基吡啶(DMAP)。然后注入50ml二氯甲烷，搅拌5～10分钟后，将上述实施例2所得的丙烯酸接枝改性的聚丙烯无纺布多孔膜放入反应管中，室温下搅拌反应24小时。胆固醇配基偶联反应结束以后，将偶联胆固醇配基的丙烯酸接枝改性的聚丙烯无纺布多孔膜取出，以二氯甲烷作溶剂，运用索氏提取管抽提24小时以除去未反应物质，真空干燥，最终得到偶联6个碳原子手臂的胆固醇吸附配基的聚合物多孔膜载体材料。

实施例8

将上述实施例5、6、7制备所得聚合物多孔膜载体材料剪成碎片，装入10ml样品瓶中，吸取6ml模拟生理溶液(pH＝7.4)将其充分溶胀，然后用注射器将样品瓶中的模拟生理溶液彻底抽干，加入2ml人血浆。然后密封在37℃下振荡3小时后，检测等温吸附前后LDL、HDL、TG、TC的变化情况，结果如下表所示(其中空白对照样是孔径为0.45um，未接枝丙烯酸的聚丙烯无纺布)

吸附载体	LDL吸附量(mg/g)	HDL吸附量(mg/g)	TC吸附量(mg/g)	TG吸附量(mg/g)
					空白对照(实施例2出发原料)	0.48	0.16	0.33	2.70
实施例5	1.36	0.74	1.94	6.80
					实施例6	1.48	0.82	2.38	7.96
实施例7	1.86	0.61	1.57	6.92

实施例9

将采样于高血脂症患者的分离血浆5ml动态灌流经过装有6层实施例4所得的多孔膜载体材料吸附分离器，动态灌流速度1ml/min，灌流2小时后，血浆中的LDL的浓度由111.64mg/dl降低为75.9mg/dl、HDL的浓度由51.77mg/dl降低为28.00mg/dl、TC的含量由160.31mg/dl下降为71.65mg/dl、TG的含量由522.80mg/dl下降为274.47mg/dl。

Claims (13)

1.一种血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料，其特征在于所述多孔膜载体材料是由辐照接枝共聚合丙烯酸的医用聚合物无纺布表面的羧基共价偶联固定疏水性胆固醇吸附配基得到；所述的辐照接枝共聚合聚丙烯酸的医用聚合物无纺布表面的羧基与胆固醇配基的摩尔比为8∶1～4。

2.如权利要求1所述的一种血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料，其特征是所述的辐照接枝共聚合聚丙烯酸的医用聚合物无纺布是以平均孔径为0.1～50μm水不溶性医用聚合物无纺布经过⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚合丙烯酸，膜表面羧基的含量为10～200μmol/cm²。

3.如权利要求2所述的一种血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料，其特征是所述的医用聚合物无纺布是医用涤纶无纺布或者医用聚丙烯无纺布，平均孔径为0.05～100μm，材质为每平方厘米5～30毫克。

4.如权利要求1或2所述的一种血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料，其特征是所述的共辐照接枝共聚合丙烯酸的医用聚合物无纺布是聚丙烯酸的接枝率为5～150％重量。

5.如权利要求1的一种血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料的制备方法，其特征是包括以下步骤：

(1)⁶⁰Coγ-射线共辐照表面接枝共聚合丙烯酸

将清洗过医用聚合物无纺布在含1～50％重量的丙烯酸、0.1～5.0％重量的阻聚剂和[H⁺]＝0.1～0.2M浓度催化剂的水溶液中浸泡16～24小时后；然后置于⁶⁰Coγ-射线辐射场中，控制辐照总剂量10～50kGy；取出、洗净、干燥，得到丙烯酸表面接枝共聚改性的聚合物多孔膜载体材料；

(2)表面共价偶联固定疏水性胆固醇吸附配基

在无水、无氧条件下，将胆固醇配基、N，N′-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶混合，所述的羧基∶羟基单官能度胆固醇配基∶N，N′-二环己基碳二亚胺∶4-二甲氨基吡啶的摩尔比为＝8∶1～4∶3～5∶2；加入上述步骤(1)制备所得的丙烯酸表面接枝共聚改性的聚合物多孔膜载体材料，室温下反应12～48小时，干燥；所述的羟基单官能度胆固醇配基具有如下分子式HO-(CH₂)_n-O-CHOL，其中，n＝0～10，CHOL是胆固醇基。

6.如权利要求5所述的血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料的制备方法，其特征是步骤(1)所述的医用聚合物无纺布的清洗是将孔径为0.1～50μm的医用聚合物无纺布依次在丙酮和水中超声波清洗15～30分钟，真空干燥。

7.如权利要求5所述的血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料的制备方法，其特征是步骤(1)所述的浸泡是医用聚合物无纺布在含1～30％重量的丙烯酸单体、0.5～2.5％重量的阻聚剂和[H⁺]＝0.1～0.2M浓度的催化剂水溶液中浸泡。

8.如权利要求5所述的一种血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料的制备方法，其特征是步骤(1)所述的阻聚剂是硫酸亚铁。

9.如权利要求5所述的血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料的制备方法，其特征是步骤(2)所述的羟基单官能度胆固醇配基通过显示方法合成：在氮气保护下，对甲基苯磺酸中缓慢滴加溶有胆固醇的干燥吡啶，反应5～24小时，得胆固醇配基的反应前驱体CHOL-OTs，将该前驱体在除水、除氧的条件下、含氧有机溶剂中，与碳原子数为2～10的手臂试剂脂肪族二元醇回流5～24小时，得到含n＝2～10碳原子长度碳氢手臂的羟基官单能度胆固醇配基，其中，OTs是对甲基苯磺酸基，CHOL是胆固醇基，所述的对甲苯磺酸、脂肪二醇和胆固醇的摩尔比为2～10∶5～20∶1。

10.如权利要求9所述的血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料的制备方法，其特征是所述反应物料的摩尔比为对甲苯磺酸∶脂肪二醇∶胆固醇＝2～10∶5～20∶1。

11.如权利要求10所述的血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料的制备方法，其特征是所述的反应物料的摩尔比范围是：对甲苯磺酸∶脂肪二醇∶胆固醇＝2～5∶5～10∶1。

12.如权利要求9所述的血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料的制备方法，其特征是所述手臂的合成试剂脂肪族二醇化合物是乙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丙二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、1，6-己二醇、1，7-庚二醇、1，8-辛二醇或1，10-丁二醇。

13.如权利要求1所述一种血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料的用途，其特征是主要应用于血浆脂质成份的吸附分离、临床高血脂症病人的血液动态灌流净化材料或废弃血浆分离再生利用辅助材料。