CN111701581A - 低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂及其制备方法和应用,涉及生物医药技术领域,吸附剂包括载体和配基,载体和配基之间通过手臂共价连接;载体包括聚乙烯醇多孔微球;配基包括脑磷脂;手臂包括二元酸酐、小分子胺类化合物、聚环氧丙醇或聚丙烯酸中的一种。本发明缓解了现有LDL吸附剂成本高、吸附容量低等缺陷,本发明的吸附剂能够高效并特异性地清除或降低高脂血症患者血液或血浆中LDL、TC和TG,可作为一种有效的吸附剂用于高脂血症的体外血液灌流治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,尤其是涉及一种低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂及其制备方法和应用。
背景技术
低密度脂蛋白-胆固醇过高引起的高脂血症是动脉粥样硬化性心、脑血管疾病,如心肌梗死、脑血栓等发生发展的重要诱因。选择性清除或者降低患者体内致病性的低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇(TC)及甘油三酯(TG),而保留高密度脂蛋白(HDL)是临床治疗高脂血症的主要策略之一。
尽管饮食控制及各类降脂药物的应用给高脂血症患者的治疗带来很大改观。但鉴于药物的毒副作用及治疗严重性高脂血症(如纯合子家族高脂血症)方面的效果不甚理想,血液净化技术(血液灌流)便成为高脂血症治疗的另一重要途径。相交于药物疗法,血液灌流可直接从患者血液中清除LDL,在治疗过程中不引入其他物质进入血液,避免了传统药物治疗的毒副作用,且针对遗传性高脂血症患者的治疗效果明显。
血液灌流疗法的核心在于吸附剂的研发,目前在国际上具有代表性的临床应用吸附剂包括以下几种:1)免疫吸附剂,由德国PlasmaSelect公司开发的以抗apoB-100抗体为配基的Therasorb产品,用来特异性吸附血液中的LDL,此吸附剂可用来重复进行40次以上的治疗,且对血液中其他成分的吸附率相对较低,但价格和治疗费用高昂;2)磺化葡聚糖吸附系统,日本Kaneka公司Liposorber系列产品将磺化葡聚糖固载到多空纤维素载体上制备出的阴离子型吸附剂,此吸附剂的吸附容量大,选择性高,但该树脂的血液相容性较差,只能用于血浆灌流,仪器设备及治疗费用较高;3)DALI系统,德国Fresenius公司用聚丙烯酸酯包被的聚丙烯酰胺树脂作为吸附剂,用以清除患者血液中的LDL、TC和TG等,此系统具有良好的血液相容性和吸附选择性,仪器设备简单,可用于全血灌流,但此吸附剂的吸附容量较低,且吸附剂装置昂贵。
虽然近年来我国很多学者在LDL吸附剂这一领域中发表了许多相关的研究工作,但我们目前还没有可商品化的LDL吸附剂产品出现。且从国外进口的吸附剂价格昂贵、治疗费用高昂,这在很大程度上限制了此类产品在我国的临床应用。因此,开发一种高效、安全且价格适宜的LDL血液灌流吸附剂将具有重要的科学价值及临床意义。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂,能够高效并特异性地清除或降低高脂血症患者血液或血浆中LDL、TC和TG。
本发明的目的之二在于提供上述吸附剂的制备方法,该方法可操作性强,成本低。
本发明的目的之三在于提供上述吸附剂在制备血液净化材料或设备中的应用。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂,包括载体和配基,载体和配基之间通过手臂共价连接;
载体包括聚乙烯醇多孔微球;
配基包括脑磷脂;
手臂包括二元酸酐、C4-C6的小分子胺类化合物、聚环氧丙醇或聚丙烯酸中的一种。
第二方面,本发明提供了一种低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂的制备方法,包括以下步骤:
(a)获取聚乙烯醇多孔微球;
(b)在聚乙烯醇多孔微球上接枝手臂;
(c)将接枝手臂后的聚乙烯醇多孔微球和脑磷脂进行共价连接,得到所述低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂。
进一步地,接枝手臂后的聚乙烯醇多孔微球与脑磷脂的质量比为1:(0.5~8)。
优选地,当手臂为二元酸酐时,所述制备方法包括以下步骤:
(a)获取聚乙烯醇多孔微球;
(b)用二元酸酐对载体进行羧基化;
(c)将步骤(b)得到的聚乙烯醇多孔微球和脑磷脂进行共价连接,得到所述低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂;
优选地,步骤(b)得到的聚乙烯醇多孔微球的羧基量为0.1~0.3mmol/mL。
优选地,当手臂为小分子胺类化合物时,所述制备方法包括以下步骤:
(a)获取聚乙烯醇多孔微球;
(b)用环氧氯丙烷对聚乙烯醇多孔微球进行环氧化后进行小分子胺类手臂的接枝,然后用二元酸酐对手臂末端其进行羧基化;
(c)将步骤(b)得到的聚乙烯醇多孔微球和脑磷脂进行共价连接,得到所述低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂;
优选地,步骤(b)得到的聚乙烯醇多孔微球的羧基量为0.1~0.6mmol/mL。
优选地,当手臂为聚环氧丙醇时,所述制备方法包括以下步骤:
(a)获取聚乙烯醇多孔微球;
(b)以环氧丙醇为单体在聚乙烯醇多孔微球上进行枝化聚合,然后用二元酸酐对端基进行羧基化;
(c)将步骤(b)得到的聚乙烯醇多孔微球和脑磷脂进行共价连接,得到所述低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂;
优选地,步骤(b)得到的聚乙烯醇多孔微球的羧基量为0.1~0.6mmol/mL。
优选地,当手臂为聚丙烯酸时,所述制备方法包括以下步骤:
(a)获取聚乙烯醇多孔微球;
(b)先用二元酸酐对聚乙烯醇多孔微球的端基进行羧基化,再接枝二酰肼类交联剂,然后再与不同分子量的聚丙烯酸进行接枝;
(c)将步骤(b)得到的聚乙烯醇多孔微球和脑磷脂进行共价连接,得到所述低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂;
优选地,步骤(b)得到的聚乙烯醇多孔微球的羧基量为0.05~0.2mmol/mL。
第三方面,本发明提供了一种第一方面的低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂或第二方面的制备方法制得的低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂在制备血液净化材料或设备中的应用。
本发明的优点和有益效果:
本发明基于LDL的分子尺寸及表面化学性质,设计合成了大孔径聚乙烯醇载体微球,然后通过不同种类及分子量的手臂将脑磷脂极性端共价连接到载体表面,制备出具有两亲性的吸附剂。该两亲性吸附剂不仅具有丰富的大孔结构及高比表面积,使得LDL分子可以自由通过吸附剂内部,且脑磷脂非极性端的不饱和脂肪酸链与手臂上羧基提供的疏水及静电的协同作用,可有效提高吸附剂对LDL、TC、TG的吸附能力及对HDL的选择性。
吸附试验表明,本发明提供的两亲性吸附剂对血浆中的LDL、TC、TG具有特异性的吸附能力,吸附量可达3.045、3.933、0.864mg/mL,对HDL的吸附仅为0.469mg/mL,因此可作为一种有效的吸附剂用于高脂血症的体外血液灌流治疗。
本发明吸附剂及制备方法成本低,且血液相容性好,应用前景广阔。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的PVA微球整体形貌的扫描电子显微镜照片;
图2为本发明实施例提供的PVA微球表面孔结构的扫描电子显微镜照片;
图3为本发明吸附剂表面血小板的粘附情况。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
目前我国尚无可临床应用的国产LDL吸附剂,纵观国内外对这一领域的研究现状,大致可分为三个方面:①以抗体为配基的LDL免疫吸附剂,该类吸附剂对LDL具有特异性吸附作用,但抗体的生产、贮存及成本制约了此类吸附剂的广泛应用;②以纤维素、壳聚糖等天然高分子材料为载体、以生物大分子(类肝素物质、胆固醇等)为配基的LDL吸附剂,但该类载体材料的比表面积及配基负载量制约了其对LDL的吸附容量;③偶联电负性小分子配基(磺酸、羧酸和磷酸基团等)的LDL吸附剂,该类吸附剂基于静电作用对LDL进行吸附,但选择性与吸附容量相对较低。
在吸附剂的研究中,载体、配基与手臂是影响吸附效果的三个关键因素。载体孔径的大小决定着吸附剂对目标分子的有效吸附面积或吸附容量,配基的选择决定了吸附选择性或特异性,手臂的长短及活性端基的数量决定着吸附剂配基与清除目标相互作用时的空间位阻大小。
基于上述LDL吸附剂存在的问题,本发明提出一种低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂,包括载体和配基,载体和配基之间通过手臂共价连接;载体包括聚乙烯醇多孔微球;配基包括脑磷脂;手臂包括二元酸酐、C4-C6的小分子胺类化合物、聚环氧丙醇或聚丙烯酸中的一种。
[载体]
聚乙烯醇(PVA)多孔微球是以聚乙烯醇为主体形成的共聚物,呈球形。对聚乙烯醇多孔微球的来源不作限定,可通过市售购买获得,也可依据现有方法自行制备得到。
典型的例如为聚乙烯醇-三烯丙基异氰酸酯共聚物。
在一种实施方式中,聚乙烯醇多孔微球粒径分布在100~500μm之间(例如100、150、200、250、300、350、400、450或500μm);载体具有丰富的孔结构,孔径分布在50~500nm之间(例如50、100、150、200、250、300、350、400、450或500nm),优选50~150nm之间;聚乙烯醇载体骨架上的羟基含量为0.1~0.9mmol/mL(例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9mmol/mL)。
[配基]
脑磷脂(磷脂酰乙醇胺),分子量分布在250~800之间(例如250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750或800),可来源于生物提取(大豆、蛋黄、哺乳动物脑组织或脊髓分离等),纯度为80~98%,也可以为化学合成。脑磷脂极性端含有一个伯胺活性基团可通过手臂与载体共价连接。
[手臂]
手臂典型但非限制性的例如为二元酸酐(例如乙二酸酐、丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐,优选戊二酸酐)、小分子胺类化合物(例如1,4-丁二胺、1,6-己二胺、三乙烯四胺,优选三乙烯四胺)、聚环氧丙醇或聚丙烯酸,优选聚丙烯酸。小分子胺类化合物的链长为4~6个碳。
优选地,所述的聚丙烯酸手臂分子量分布为2,000~5,000(例如2000、3000、4000或5000)。
由于聚丙烯酸手臂具有丰富的羧基,可在一定程度上提供更强的静电吸附及抗污作用,所以具有更好的吸附效果及选择性。
本发明以聚乙烯醇多孔微球为载体,以脑磷脂为配基,利用二元酸酐、聚丙烯酸、小分子胺类化合物或聚环氧丙醇手臂将磷脂配基共价偶联到多孔性大孔载体微球上,使得磷脂的疏水端暴露在外侧,得到一种新型的两亲性吸附剂以清除血浆中的LDL、TC与TG。相比于天然载体材料,此吸附剂具有较高的比表面积与发达的大孔结构,更利于尺寸巨大的LDL分子等自由进入孔隙内部,以保障对致病性脂蛋白的高效吸附;聚丙烯酸等手臂的引入有效增加了配基偶联的活性位点,可以进一步提高吸附容量与吸附选择性;且相比抗体等生物制配基,磷脂具有更高的稳定性,易于储存且价格低廉。因此,以这种方法制备的吸附剂可作为一种理想的产品应用于高脂血症的血液灌流疗法。
根据本发明的第二个方面,提供了一种上述低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂的制备方法,包括以下步骤:
(a)获取聚乙烯醇多孔微球;
(b)在聚乙烯醇多孔微球上接枝手臂;
(c)将接枝手臂后的聚乙烯醇多孔微球和脑磷脂进行共价连接,得到所述低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂。
具体地,用于血液或血浆灌流清除LDL、TC、TG的吸附剂制备方法包括以下步骤:
(1)、微球载体(聚乙烯醇-三烯丙基异氰酸酯共聚物)合成:
采用悬浮聚合法对载体微球进行合成。
具体地包括:将单体乙酸乙烯酯,交联剂三烯丙基异氰脲酸酯,致孔剂乙酸乙烯酯与正庚烷各于40℃下在1.5%聚乙烯醇水溶液中混合均匀,并加入引发剂偶氮二异丁腈,调整搅拌速度为200~240rpm使体系中的油相分散成均匀的小油滴后,逐渐升温引发载体聚合与固化。反应结束后将产物过滤、洗涤后,用甲醇充分抽提去除致孔剂,并加入到3%的氢氧化钠甲醇溶液中进行酯交换反应,再经过滤、抽提及低温烘干后得到聚乙烯醇-三烯丙基异氰酸酯共聚多孔微球载体。
步骤(1)中,所述的单体、致孔剂、交联剂与引发剂的体积比为67.6:45:45:24.5:2;水相为1.5%聚乙烯醇水溶液(含0.5%NaH2PO4·2H2O和1.5%Na2HPO4·10H2O);升温固化的过程为,每15分钟升温5℃,先逐渐升温至65℃反应3小时,然后升温至75℃反应3小时。
(2)、手臂接枝
①二元酸酐手臂接枝:
用二元酸酐(例如乙二酸酐、丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐,优选戊二酸酐)对载体进行羧基化,以便后期偶联配基。
具体地包括:将载体、戊二酸酐与4-二甲氨基吡啶于无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡浸泡过夜使其充分溶胀,然后升温至70℃反应12小时,充分洗涤后备用。其活性端基(羧基)量为0.280mmol/mL。
②小分子胺类手臂接枝:
用环氧氯丙烷对聚乙烯醇多孔微球进行环氧化后接枝小分子胺类化合物(例如1,4-丁二胺、1,6-己二胺、三乙烯四胺,优选三乙烯四胺),然后用二元酸酐(例如乙二酸酐、丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐,优选戊二酸酐)对手臂末端其进行羧基化,以便后期偶联配基。
具体地包括:将微球载体于二甲基亚砜中浸泡过夜使其充分溶胀后加入环氧氯丙烷,在搅拌加热的条件下使体系升温至35℃,然后在30分钟内缓慢搅拌滴加2mol/L的氢氧化钠水溶液,恒温反应4小时,反应结束后充分洗涤,然后对环氧化的载体进行三乙烯四胺接枝。将载体与三乙烯四胺于无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡浸泡过夜使其充分溶胀,然后升温至70℃反应6小时。最后对载体端基进行羧基化,将载体、戊二酸酐与4-二甲氨基吡啶于无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡浸泡过夜使其充分溶胀,然后升温至70℃反应12小时,充分洗涤后备用。其活性端基(羧基)量为0.350mmol/mL。
③聚缩水甘油(聚环氧丙醇)手臂接枝:
以环氧丙醇为单体对聚乙烯醇多孔微球和聚环氧丙醇进行枝化聚合,然后用二元酸酐(例如乙二酸酐、丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐,优选戊二酸酐)对端基进行羧基化,以便后期偶联配基。
具体地包括:将微球载体于1mol/L氢氧化钠水溶液中溶胀过夜,然后加入硼氢化钠,并缓慢滴加环氧丙醇溶液,在此过程中保持体系温度不超过25℃。通过控制单体、催化剂的加入量及反应时间得到不同分子量的枝化手臂。反应结束后以去离子水、1mol/L氯化钠、去离子水的顺序充分洗涤,然后对接枝聚环氧丙醇的载体端基进行羧基化。将载体、戊二酸酐与4-二甲氨基吡啶于无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡浸泡过夜使其充分溶胀,然后升温至70℃反应12小时,充分洗涤后备用。其活性端基(羧基)量为0.238mmol/mL。
④聚丙烯酸手臂接枝:
先用二元酸酐(例如乙二酸酐、丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐,优选戊二酸酐)对聚乙烯醇多孔微球的端基进行羧基化,再接枝二酰肼类交联剂(例如乙二酸二酰肼、丁二酸二酰肼、己二酸二酰肼,优选己二酸二酰肼),然后再与不同分子量的聚丙烯酸进行接枝。
具体地包括:
将载体、戊二酸酐与4-二甲氨基吡啶于无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中震荡浸泡过夜使其充分溶胀,然后升温至70℃反应12小时,反应结束后分别用乙醇、去离子水充分洗涤、备用。将羧基化的微球载体于0.05M的MES缓冲液中溶胀过夜后加入己二酸二酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS),在4℃下反应2小时,然后升高温度至25℃反应24小时。
反应结束后将载体充分洗涤并与不同分子量的聚丙烯酸进行接枝。将载体、聚丙烯酸、偶联剂EDC及NHS于pH为4~6的条件下,于4℃振荡反应2小时,然后调节体系温度为25℃,反应24小时。反应结束后载体经去离子水充分洗涤,备用。
其中,酸酐偶联过程中,载体微球、戊二酸酐与4-二甲氨基吡啶的质量比为1:3.6:0.016,反应结束后测定羧基修饰量为0.25mmol/mL;在己二酸二酰肼活化过程中,载体微球、己二酸二酰肼、EDC与NHS的摩尔比为1:2:1.5:1.5,反应结束后测定酰肼的氨基值为0.2mmol/mL;在聚丙烯酸手臂接枝过程中,酰肼活化载体、聚丙烯酸、EDC与NHS的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5,聚丙烯酸分子量可以分别为2,000、3,000与5,000;接枝后聚丙烯酸手臂的端羧基量为0.05~0.2mmol/mL(0.066~0.129mmol/mL)。
(3)、磷脂配基偶联
将步骤(2)接枝手臂后的微球载体和0.5~8倍量(质量比,例如两者比例为1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8)的脑磷脂进行偶联,偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS),催化剂为三乙胺。
具体地包括:将载体先于N,N-二甲基甲酰胺中震荡过夜使其充分溶胀,然后加入不同体积的脑磷脂二氯甲烷溶液与偶联剂,于4℃条件下震荡反应2小时,然后升温至25℃,继续震荡反应24小时。反应结束后用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇与去离子水对产物进行充分洗涤,即得到目标吸附剂。
其中,脑磷脂二氯甲烷溶液的浓度为16.7%,加入量为0.125~20mL,优选10mL;载体、EDC、NHS及三乙胺的摩尔比为1:1.5:1.5:5。
步骤(3)所述的清洗指先用梯度浓度递增的二氯甲烷/N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂清洗,再依次用N,N-二甲基甲酰胺、乙醇与去离子水清洗。
对于上文所述的吸附剂的制备方法,优选情况下,上述步骤(1)、(2)、(3)所有清洗均为3次以上的充分清洗。
上述步骤④聚丙烯酸手臂接枝方法中,先用二元酸酐修饰再接枝二酰肼类交联剂的方式可以被替换为其他带有负电的聚合物手臂,如酸酐、酸酐修饰的小分子胺类、酸酐修饰的聚环氧丙醇枝化物等,其合成步骤分别如下:
a.酸酐手臂及其修饰方法:
将载体、戊二酸酐与4-二甲氨基吡啶于无水DMF中震荡浸泡过夜使其充分溶胀,然后升温至70℃反应12小时,反应结束后分别用乙醇、去离子水充分洗涤,载体酸酐活化后的羧基修饰量测量值为0.28mmol/mL。接枝完戊二酸酐后可直接接枝脑磷脂。
b.酸酐修饰的小分子胺类手臂及其修饰方法:
将微球载体于二甲基亚砜中浸泡过夜使其充分溶胀后加入环氧氯丙烷,在搅拌加热的条件下使体系升温至35℃,然后在30分钟内缓慢搅拌滴加2mol/L的氢氧化钠水溶液,恒温反应4小时,反应结束后充分洗涤,然后对环氧化载体进行三乙烯四胺的接枝。将载体与三乙烯四胺于无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡浸泡过夜使其充分溶胀,然后升温至70℃反应6小时。最后对载体端基进行羧基化,将载体、戊二酸酐与4-二甲氨基吡啶于无水DMF中震荡浸泡过夜使其充分溶胀,然后升温至70℃反应12小时,反应结束后分别用乙醇、去离子水充分洗涤,载体酸酐活化后的羧基修饰量测量值为0.35mmol/mL。
c.酸酐修饰的聚环氧丙醇枝化物手臂及其修饰方法:
将微球载体于1mol/L氢氧化钠水溶液中溶胀过夜,然后加入硼氢化钠,并缓慢滴加不同体积的环氧丙醇溶液,在此过程中保持体系温度不超过25℃。通过控制单体、催化剂的加入量及反应时间得到不同分子量的枝化手臂。在反应结束后以去离子水、1mol/L氯化钠、去离子水的顺序充分洗涤后,对其端基进行羧基化。将载体、戊二酸酐与4-二甲氨基吡啶于无水DMF中震荡浸泡过夜使其充分溶胀,然后升温至70℃反应12小时,反应结束后分别用乙醇、去离子水充分洗涤,对载体酸酐活化后的羧基修饰量测得为0.1~0.6(0.238~0.351)mmol/mL。
根据本发明的第三个方面,提供了一种上述低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂或上述制备方法制得的低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂在制备血液净化材料或设备中的应用。
本发明提供的吸附剂可用于血浆或全血灌流清除患者体内的LDL、TC、TG,用于治疗高脂血症相关的疾病。设备例如为血液灌流设备。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明,实施例中的材料为根据现有方法制备而得,或直接从市场上购得。
实施例1
(1)载体微球制备
预先配置1.5%聚乙烯醇水溶液(含0.5%NaH2PO4·2H2O和1.5%Na2HPO4·10H2O)作为水相。将单体乙酸乙烯酯67.6mL,交联剂三烯丙基异氰脲酸酯27g,致孔剂乙酸乙烯酯与正庚烷各45mL于40℃下混合均匀,并加入2.28g引发剂偶氮二异丁腈,使充分溶解后加入水相,调整搅拌速度为200~240rpm使体系中的油相分散成均匀的小油滴后,逐渐升温至75℃引发载体聚合与固化。反应结束后将产物过滤、洗涤后,用甲醇充分抽提去除致孔剂,并加入到3%的氢氧化钠甲醇溶液中进行酯交换反应,再经过滤、抽提及低温烘干后得到聚乙烯醇-三烯丙基异氰酸酯共聚多孔微球载体,如图1、图2所示。
(2)手臂接枝
对载体进行羧基化,将3g载体、5.5g戊二酸酐与0.05g 4-二甲氨基吡啶于60mL无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡浸泡过夜使其充分溶胀,然后升温至70℃反应12h,反应结束后依次用乙醇与去离子水充分洗涤产物至中性,测定其端羧基量为0.28mmol/mL。
(3)配基偶联
称取1g活化后的干燥载体于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡过夜,使其充分溶胀。然后加入10mL 0.4g/mL脑磷脂二氯甲烷溶液、0.41g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.25g N-羟基硫代琥珀酰亚胺及1mL三乙胺,于4℃条件下震荡反应2小时,然后升温至25℃,继续震荡反应24小时。反应结束后用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇与去离子水对产物进行充分洗涤,即得到目标吸附剂(吸附剂1)。
实施例2
(1)载体微球制备
预先配置1.5%聚乙烯醇水溶液(含0.5%NaH2PO4·2H2O和1.5%Na2HPO4·10H2O)作为水相。将单体乙酸乙烯酯67.6mL,交联剂三烯丙基异氰脲酸酯27g,致孔剂乙酸乙烯酯与正庚烷各45mL于40℃下混合均匀,并加入2.28g引发剂偶氮二异丁腈,使充分溶解后加入水相,调整搅拌速度为200~240rpm使体系中的油相分散成均匀的小油滴后,逐渐升温至75℃引发载体聚合与固化。反应结束后将产物过滤、洗涤后,用甲醇充分抽提去除致孔剂,并加入到3%的氢氧化钠甲醇溶液中进行酯交换反应,再经过滤、抽提及低温烘干后得到聚乙烯醇-三烯丙基异氰酸酯共聚多孔微球载体。
(2)手臂接枝
取5g干燥微球载体于25mL二甲基亚砜中浸泡过夜,使其充分溶胀后加入15mL环氧氯丙烷,在搅拌加热的条件下使体系升温至35℃,然后在30分钟内缓慢搅拌滴加50mL2mol/L的氢氧化钠水溶液,恒温反应4小时,反应结束后充分洗涤,测定环氧值为80μmol/mL。然后对环氧化的载体进行三乙烯四胺接枝,将5g载体与33.4mL三乙烯四胺于100mL无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡浸泡过夜使其充分溶胀,然后升温至70℃反应7h,三乙烯四胺接枝量为0.1625mmol/mL。最后对载体进行羧基化,将3g载体、5.5g戊二酸酐与0.05g 4-二甲氨基吡啶于60mL无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡浸泡过夜使其充分溶胀,然后升温至70℃反应12h,反应结束后依次用乙醇与去离子水充分洗涤产物至中性,测定其端羧基量为0.350mmol/mL。
(3)配基偶联
称取1g活化后的干燥载体于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡过夜,使其充分溶胀。然后加入10mL 0.4g/mL脑磷脂二氯甲烷溶液、0.41g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.25g N-羟基硫代琥珀酰亚胺及1mL三乙胺,于4℃条件下震荡反应2小时,然后升温至25℃,继续震荡反应24小时。反应结束后用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇与去离子水对产物进行充分洗涤,即得到目标吸附剂(吸附剂2)。
实施例3
(1)载体微球制备
预先配置1.5%聚乙烯醇水溶液(含0.5%NaH2PO4·2H2O和1.5%Na2HPO4·10H2O)作为水相。将单体乙酸乙烯酯67.6mL,交联剂三烯丙基异氰脲酸酯27g,致孔剂乙酸乙烯酯与正庚烷各45mL于40℃下混合均匀,并加入2.28g引发剂偶氮二异丁腈,使充分溶解后加入水相,调整搅拌速度为200~240rpm使体系中的油相分散成均匀的小油滴后,逐渐升温至75℃引发载体聚合与固化。反应结束后将产物过滤、洗涤后,用甲醇充分抽提去除致孔剂,并加入到3%的氢氧化钠甲醇溶液中进行酯交换反应,再经过滤、抽提及低温烘干后得到聚乙烯醇-三烯丙基异氰酸酯共聚多孔微球载体。
(2)手臂接枝
取3g干燥微球于15mL 1mol/L氢氧化钠水溶液中震荡浸泡过夜,使其充分溶胀后加入0.214g硼氢化钠,然后缓慢滴加5mL的环氧丙醇溶液,并在此过程中保持体系温度不超过25℃反应24小时,反应结束后以去离子水、1mol/L氯化钠、去离子水的顺序充分洗涤,然后对接枝聚环氧丙醇的载体端基进行羧基化。将3g载体、11g戊二酸酐与0.1g 4-二甲氨基吡啶于无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡浸泡过夜使其充分溶胀,然后升温至70℃反应12小时,反应结束后依次用乙醇、去离子水对产物进行充分洗涤至中性后,测定其端羧基量为0.395mmol/mL。
(3)配基偶联
称取1g活化后的干燥载体于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡过夜,使其充分溶胀。然后加入10mL 0.4g/mL脑磷脂二氯甲烷溶液、0.41g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.25g N-羟基硫代琥珀酰亚胺及1mL三乙胺,于4℃条件下震荡反应2小时,然后升温至25℃,继续震荡反应24小时。反应结束后用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇与去离子水对产物进行充分洗涤,即得到目标吸附剂(吸附剂3)。
实施例4
(1)载体微球制备
预先配置1.5%聚乙烯醇水溶液(含0.5%NaH2PO4·2H2O和1.5%Na2HPO4·10H2O)作为水相。将单体乙酸乙烯酯67.6mL,交联剂三烯丙基异氰脲酸酯27g,致孔剂乙酸乙烯酯与正庚烷各45mL于40℃下混合均匀,并加入2.28g引发剂偶氮二异丁腈,使充分溶解后加入水相,调整搅拌速度为200~240rpm使体系中的油相分散成均匀的小油滴后,逐渐升温至75℃引发载体聚合与固化。反应结束后将产物过滤、洗涤后,用甲醇充分抽提去除致孔剂,并加入到3%的氢氧化钠甲醇溶液中进行酯交换反应,再经过滤、抽提及低温烘干后得到聚乙烯醇-三烯丙基异氰酸酯共聚多孔微球载体。
(2)手臂接枝
取3g干燥微球于15mL 1mol/L氢氧化钠水溶液中震荡浸泡过夜,使其充分溶胀后加入0.428g硼氢化钠,然后缓慢滴加10mL的环氧丙醇溶液,并在此过程中保持体系温度不超过25℃反应48小时,反应结束后以去离子水、1mol/L氯化钠、去离子水的顺序充分洗涤,然后对接枝聚环氧丙醇的载体端基进行羧基化。将3g载体、11g戊二酸酐与0.1g 4-二甲氨基吡啶于无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡浸泡过夜使其充分溶胀,然后升温至70℃反应12小时,反应结束后依次用乙醇、去离子水对产物进行充分洗涤至中性后,测定其端羧基量为0.528mmol/mL。
(3)配基偶联
称取1g活化后的干燥载体于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡过夜,使其充分溶胀。然后加入10mL 0.4g/mL脑磷脂二氯甲烷溶液、0.41g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.25g N-羟基硫代琥珀酰亚胺及1mL三乙胺,于4℃条件下震荡反应2小时,然后升温至25℃,继续震荡反应24小时。反应结束后用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇与去离子水对产物进行充分洗涤,即得到目标吸附剂(吸附剂4)。
实施例5
(1)载体微球制备
预先配置1.5%聚乙烯醇水溶液(含0.5%NaH2PO4·2H2O和1.5%Na2HPO4·10H2O)作为水相。将单体乙酸乙烯酯67.6mL,交联剂三烯丙基异氰脲酸酯27g,致孔剂乙酸乙烯酯与正庚烷各45mL于40℃下混合均匀,并加入2.28g引发剂偶氮二异丁腈,使充分溶解后加入水相,调整搅拌速度为200~240rpm使体系中的油相分散成均匀的小油滴后,逐渐升温至75℃引发载体聚合与固化。反应结束后将产物过滤、洗涤后,用甲醇充分抽提去除致孔剂,并加入到3%的氢氧化钠甲醇溶液中进行酯交换反应,再经过滤、抽提及低温烘干后得到聚乙烯醇-三烯丙基异氰酸酯共聚多孔微球载体。
(2)手臂接枝
对载体进行羧基化,将3g载体、5.5g戊二酸酐与0.05g 4-二甲氨基吡啶于60mL无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡浸泡过夜使其充分溶胀,然后升温至70℃反应12h,反应结束后依次用乙醇与去离子水充分洗涤产物至中性,备用。将5g羧基化的微球载体于16.67mL0.05M的MES缓冲液中溶胀过夜后加入0.49g己二酸二酰肼、0.40g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及0.24g N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS),在4℃下反应2小时,然后升高温度至25℃反应24小时。
充分洗涤后将载体与3,000分子量的聚丙烯酸进行接枝。将5g载体、84mL5%聚丙烯酸水溶液混合后,调节体系pH值为4~6,然后加入0.32g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及0.19g N-羟基硫代琥珀酰亚胺,于4℃振荡反应2h,然后调节体系温度为25℃,反应24h。反应结束后载体经去离子水充分洗涤,测定其端羧基量为0.12mmol/mL。
(3)配基偶联
称取1g活化后的干燥载体于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡过夜,使其充分溶胀。然后加入10mL 0.4g/mL脑磷脂二氯甲烷溶液、0.41g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.25g N-羟基硫代琥珀酰亚胺及1mL三乙胺,于4℃条件下震荡反应2小时,然后升温至25℃,继续震荡反应24小时。反应结束后用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇与去离子水对产物进行充分洗涤,即得到目标吸附剂(吸附剂5)。
实施例6
(1)载体微球制备
预先配置1.5%聚乙烯醇水溶液(含0.5%NaH2PO4·2H2O和1.5%Na2HPO4·10H2O)作为水相。将单体乙酸乙烯酯67.6mL,交联剂三烯丙基异氰脲酸酯27g,致孔剂乙酸乙烯酯与正庚烷各45mL于40℃下混合均匀,并加入2.28g引发剂偶氮二异丁腈,使充分溶解后加入水相,调整搅拌速度为200~240rpm使体系中的油相分散成均匀的小油滴后,逐渐升温至75℃引发载体聚合与固化。反应结束后将产物过滤、洗涤后,用甲醇充分抽提去除致孔剂,并加入到3%的氢氧化钠甲醇溶液中进行酯交换反应,再经过滤、抽提及低温烘干后得到聚乙烯醇-三烯丙基异氰酸酯共聚多孔微球载体。
(2)手臂接枝
对载体进行羧基化,将3g载体、5.5g戊二酸酐与0.05g 4-二甲氨基吡啶于60mL无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡浸泡过夜使其充分溶胀,然后升温至70℃反应12h,反应结束后依次用乙醇与去离子水充分洗涤产物至中性,备用。将5g羧基化的微球载体于16.67mL0.05M的MES缓冲液中溶胀过夜后加入0.49g己二酸二酰肼、0.40g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及0.24g N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS),在4℃下反应2小时,然后升高温度至25℃反应24小时。
充分洗涤后将载体与5,000分子量的聚丙烯酸进行接枝。将5g载体、101.25mL5%聚丙烯酸水溶液混合后,调节体系pH值为4~6,然后加入0.32g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及0.19g N-羟基硫代琥珀酰亚胺,于4℃振荡反应2h,然后调节体系温度为25℃,反应24h。反应结束后载体经去离子水充分洗涤,测定其端羧基量为0.10mmol/mL。
(3)配基偶联
称取1g活化后的干燥载体于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺中震荡过夜,使其充分溶胀。然后加入10mL 0.4g/mL脑磷脂二氯甲烷溶液、0.41g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及0.25g N-羟基硫代琥珀酰亚胺,1mL三乙胺于4℃条件下震荡反应2h,然后升温至25℃,继续震荡反应24h。反应结束后用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇与去离子水对产物进行充分洗涤,即得到目标吸附剂(吸附剂6)。
试验例1吸附效果试验
以不偶联配基的聚乙烯醇载体为对照(吸附剂7),分别取上述的6种吸附剂,以吸附比(吸附剂和血浆的体积比)1:3的比例加入高脂血症患者血浆中,密封后,37℃于摇床中160rpm震荡3h,然后对血浆中剩余的LDL、HDL、TC、TG进行检测,计算吸附量与清除率。各吸附剂的吸附效果如表1所示,经过磷脂配基的固载,吸附剂对高脂血症患者血浆中的LDL、TC和TG的吸附量分别提高约为1.5~4倍,其中以在3,000分子量聚丙烯酸为手臂的吸附剂吸附效果最佳。
表1吸附剂对高脂血症患者血浆中LDL、TC和TG的吸附性能
试验例2凝血效果试验
取大耳白兔新鲜血液至枸橼酸钠抗凝采血管混匀后,以3000g转速离心10min取得血浆,取2mL血浆与0.1g经生理盐水浸泡、润洗、抽滤后的吸附剂混合,并以2mL不加入吸附剂的血浆做为对照,在37℃下于恒温振荡器中90rpm振荡1小时,然后以4600g转速离心5分钟将吸附剂分离,并在凝血功能测试仪上检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和纤维蛋白原(FIB)。结果如表2所示。
表2吸附剂凝血效果评价
试验例3血常规和溶血实验
血常规实验:取大耳白兔新鲜血液至EDTA.2K抗凝采血管混匀后,分别取2mL新鲜抗凝兔血与0.2g经生理盐水浸泡、润洗、抽滤后的吸附剂共混,并以2mL不加入吸附剂的新鲜血液做为对照,在37℃下于恒温振荡器中90rpm振荡1小时,再使用注射器对血液和吸附剂进行分离,并使用全自动血常规检测仪对血液进行检测。
溶血实验:取新鲜大耳白兔血液至肝素抗凝采血管混匀,并使用生理盐水稀释制成红细胞悬液。取0.1mL红细胞悬液配制以下混合液:①与5mL生理盐水混合,配成阴性对照;②与5mL去离子水混合,配成阳性对照;③与5mL生理盐水和湿重2g待测吸附剂混合,为实验组。将所有混合液在恒温水浴锅中37℃下孵育1h,每10min间隔将混合液颠倒混匀。将混合液取出后,于离心机中以2500rpm转速离心5分钟去除血细胞,取上清液用多功能酶标仪在545nm下测定吸光度值,计算溶血率。
溶血率计算方法如下:
结果如表3所示。
表3吸附剂血常规和溶血实验结果
试验例4:吸附剂血小板粘附实验
取大耳白兔新鲜血液至枸橼酸钠抗凝采血管混匀后,在转速1000rpm下离心得到富血小板血浆。将富血小板血浆每2mL与0.1g经生理盐水浸泡、润洗、抽滤后的吸附剂混合,在37℃下于恒温振荡器中90rpm振荡1小时,然后将吸附剂与血浆分离,用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤三次后,用质量分数为2.5%的戊二醛固定2小时后,将样品用梯度浓度(30%、50%、70%、90%、98%、100%)的乙醇进行脱水并在室温下晾干,最后使用扫描电子显微镜观察吸附剂表面血小板的粘附情况,实验结果见图3。
从图3可以看出,扫描电镜视野中聚乙烯醇吸附剂表面无明显血小板粘附。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂,其特征在于,所述低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂包括载体和配基,载体和配基之间通过手臂共价连接;
载体包括聚乙烯醇多孔微球;
配基包括脑磷脂;
手臂包括二元酸酐、C4-C6的小分子胺类化合物、聚环氧丙醇或聚丙烯酸中的一种。
2.根据权利要求1所述的低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂,其特征在于,所述聚乙烯醇多孔微球的粒径分布在100~500μm;孔径分布在50~500nm,优选50~150nm;
优选地,所述聚乙烯醇多孔微球骨架上的羟基含量为0.1~0.9mmol/mL。
3.根据权利要求1所述的低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂,其特征在于,所述脑磷脂的分子量分布在250~800。
4.根据权利要求1-3任一项所述的低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂,其特征在于,所述聚丙烯酸的分子量分布在2,000~5,000。
5.根据权利要求1-4任一项所述的低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(a)获取聚乙烯醇多孔微球;
(b)在聚乙烯醇多孔微球上接枝手臂;
(c)将接枝手臂后的聚乙烯醇多孔微球和脑磷脂进行共价连接,得到所述低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂;
优选地,接枝手臂后的聚乙烯醇多孔微球与脑磷脂的质量比为1:(0.5~8)。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,当手臂为二元酸酐时,所述制备方法包括以下步骤:
(a)获取聚乙烯醇多孔微球;
(b)用二元酸酐对载体进行羧基化;
(c)将步骤(b)得到的聚乙烯醇多孔微球和脑磷脂进行共价连接,得到所述低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂;
优选地,步骤(b)得到的聚乙烯醇多孔微球的羧基量为0.1~0.3mmol/mL。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,当手臂为C4-C6的小分子胺类化合物时,所述制备方法包括以下步骤:
(a)获取聚乙烯醇多孔微球;
(b)用环氧氯丙烷对聚乙烯醇多孔微球进行环氧化后进行小分子胺类化合物手臂的接枝,然后用二元酸酐对手臂末端其进行羧基化;
(c)将步骤(b)得到的聚乙烯醇多孔微球和脑磷脂进行共价连接,得到所述低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂;
优选地,步骤(b)得到的聚乙烯醇多孔微球的羧基量为0.1~0.6mmol/mL。
8.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,当手臂为聚环氧丙醇时,所述制备方法包括以下步骤:
(a)获取聚乙烯醇多孔微球;
(b)以环氧丙醇为单体对聚乙烯醇多孔微球进行枝化聚合,然后用二元酸酐对端基进行羧基化;
(c)将步骤(b)得到的聚乙烯醇多孔微球和脑磷脂进行共价连接,得到所述低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂;
优选地,步骤(b)得到的聚乙烯醇多孔微球的羧基量为0.1~0.6mmol/mL。
9.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,当手臂为聚丙烯酸时,所述制备方法包括以下步骤:
(a)获取聚乙烯醇多孔微球;
(b)先用二元酸酐对聚乙烯醇多孔微球的端基进行羧基化,再接枝二酰肼类交联剂,然后再与不同分子量的聚丙烯酸进行接枝;
(c)将步骤(b)得到的聚乙烯醇多孔微球和脑磷脂进行共价连接,得到所述低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂;
优选地,步骤(b)得到的聚乙烯醇多孔微球的羧基量为0.05~0.2mmol/mL。
10.权利要求1-4任一项所述的低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂或权利要求5-9任一项所述的制备方法制得的低密度脂蛋白、胆固醇及甘油三酯吸附剂在制备血液净化材料或设备中的应用。
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