CN101019625A - 生产半发酵蔬菜的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明是关于用活化的乳酸菌发酵生产半发酵和全发酵蔬菜的可规模化生产的工艺，包括对蔬菜的巴氏灭菌、灭菌蔬菜的匀浆、用筛选的乳酸菌培养物在发酵罐中用盐水发酵蔬菜放大培养制备成菜泥、在GMP条件下将新鲜的加热杀菌并被浸盐水的蔬菜和充分发酵的菜泥包装入容器，存贮，这种GMP条件下得到的乳酸菌可用于生产重组蛋白，这些蛋白可用于预防或治疗疾病，这种用活乳酸菌半发酵的蔬菜包括黄瓜、红萝卜、甜菜、芹菜和圆白菜等。

Description

生产半发酵蔬菜的工艺

技术领域

本发明是关于用活化的乳酸菌发酵生产半发酵蔬菜的大规模化生产的生产方法。该方法包括黄瓜泥的制备方法，用筛选的乳酸菌培养物在发酵罐中用黄瓜菜泥在GMP条件下放大：1)利用发酵的黄瓜泥，并将其冻干成干粉用于发酵蔬菜的起始菌种，便于长期保荐和客户随时用来制备新鲜的发酵蔬菜；2)利用发酵的黄瓜菜泥将新鲜的经杀菌并被浸盐水的蔬菜制成新鲜的发酵蔬菜.

背景技术

乳酸菌是一群革兰氏阳性菌，厌氧呼吸，不形成孢子，球状菌或棒状，消耗碳水化合物发酵的主要终产品为乳酸。他们是被用于食品发酵的最重要的乳酸菌，用于对酸面团的发酵生产面包、高梁啤酒的发酵生产、所有的发酵奶制品的生产、众多的″被腌制的″(被发酵的)蔬菜的生产等。

乳酸菌负责将碳水化合物代谢转换成乳酸、二氧化碳和其它有机酸，无氧呼吸。由于它们不消耗氧气，其代谢的变化不会引起食物结构的变化。用全发酵法，其终产物只有乳酸；用半发酵法，其终产物包括乳酸、其它挥发性的化合物和少量酒精。嗜酸性乳酸杆菌属，如Lactobacillus acidophilus，L.bulgaricus，L.planarum，L.caret，L.pentoaceticus，L brevis and L.thermophilus在食物发酵中是生产乳酸的范例。所有的乳酸菌都有各自的特异反应，但总体上，L.plantarum菌株在所有蔬菜发酵中产生高活性并充当主要角色。产酸的所有乳酸菌是非运动型的、革兰氏阳性菌、呈棒状，需要复杂的碳水化合物作为能源。发酵中产生的乳酸可以有效的抑制那些对食物有分解或损坏作用的其它细菌的生长。由于这群乳酸菌看似只完成一种简单的反应，产物只有一种物质，但事实远非如此。乳酸菌具有不同的分化种属，并且具有不同的新陈代谢容量。这些不同的分化种属使得它们非常能适应变化的条件，并能负责完成酸性食品发酵。

尽管乳酸菌发酵很复杂，但是乳酸发酵的整个基础就是围绕乳酸菌产生乳酸并抑制其它有害菌生长的能力。所有产乳酸的乳酸菌都是厌氧菌，它们只需要少量的氧气发挥作用。全发酵将糖主要转化成乳酸，而半发酵则生产大约50％乳酸、25％乙酸和乙醇及25％的二氧化碳。这些代谢副产物十分重要，因为它们对最终产品给予了特殊的口味和芳香。这种半发酵的乳酸杆菌属能产生甘露醇，其它一些菌属还能产生葡聚糖。

Leuconostoc mesenteroides是一种特殊的细菌，用于德国泡菜和腌制菜的发酵，这种菌起动这些产品中乳酸的发酵，不同于其它乳酸菌，它能耐受高浓度的盐和糖(高达50％的糖)。它代谢产生二氧化碳和酸，迅速地降低酸碱度，抑制有害微生物的生长，产生的二氧化碳代替了氧气，形成厌氧环境，适合lactobacillus属的乳酸菌的生长。氧气的驱除有利于保存菜的颜色，并能稳定代谢中形成的抗坏血酸。

德国泡菜是蔬菜的酸发酵的例子。德国泡菜从字面上可以翻译为酸圆白菜。德国泡菜的生产流程也适合于其它类型蔬菜产品的生产。由于在德国人的饮食中这个产品很重要，为了规范化商业化规模生产，进行了大量的制备工艺研究。结果，就较早地掌握了生产工艺和有益的微生物。其它较不知名的发酵水果和蔬菜很少受到研究者的注意，因此很少有人知道确切的生产过程。但是，可以设想基于这种生产工艺的蔬菜酸发酵过程是安全的。

乳酸发酵是在三种基本的条件下进行的：干盐，、浸盐和非盐条件。盐为乳酸菌提供了一个合适的生长环境，并给予蔬菜酸味。

切细的圆白菜或其它适当的菜被放置在瓶子中并加盐。用机械压力加压圆白菜轧出汁液，其中含有可发酵的糖和其它营养可供微生物活化。第一个开始发酵作用的微生物是产气的球菌(L.Mesenteroides)。这些微生物发酵产生酸。当酸度到达0.25-0.3％(以乳酸量计算)时，尽管酶还继续起作用，但这些菌生长缓慢并开始死亡。由L.mesenteroides菌起动的发酵活性可以由乳酸杆菌属(L.plantarum和L.Cucumeris)持续到酸度达到1.5-2％时为止。高盐浓度和低温在某种程度上抑制这些菌的生长。最后，L.pentoaceticus菌继续发酵，使酸度达到2-2.5％，因此完成发酵。

正常泡菜发酵的终产物是乳酸、少量乙酸和以二氧化碳为主混有少量酒精和芳香酯类的混合气体。酸与醇结合形成酯，赋予德国泡菜独具特色的味道。酸度有助于控制有害微生物的生长，有助于延长产品的贮存期。有益菌或有害菌出现顺序的变化会改变产品的品味与质量。

但现有技术中的泡菜发酵没有提供具有GMP条件的设备条件和操作流程，也没有将将增味剂加入全发酵的黄瓜泥中，然后将全发酵的黄瓜泥进一步的发酵蔬菜的步骤，因而其产品质量难以有效控制，可能引起味道过轻或过重。

在本发明中，将我们在大规模生物反应器发酵、GMP(药品生产管理规范)细胞建库方面的专门技术和治疗性重组蛋白质生产方面的知识整合入我们在中国制作发酵蔬菜的实验中，其重点是可满足FDA(食品药品管理局)要求的可产业化的GMP生产过程。更为重要的是将增味剂加入全发酵的黄瓜泥中，并利用它们发酵生产发酵的新鲜蔬菜，或者制备乳酸菌的培养物干粉作为发酵的种子，便于长期保存和客户随时便利地制备新鲜的发酵蔬菜。

这种GMP条件下利用黄瓜泥培养物生产的干粉菌种可以作为口服药物的给药途径，允许运用天然筛选的或经生物工程改造的乳酸菌生产重组蛋白(如leptin融合GLP-1或HPVE7抗原)用于病毒性疾病预防或肥胖性疾病的治疗目的。

发明内容

本发明提供一种发酵蔬菜的方法，本发明发现，利用黄瓜泥适应的乳酸菌株对黄瓜泥发酵，制备一种黄瓜泥和乳酸菌一同混合发酵产生的一种混合的乳酸菌发酵冻干粉，该冻干粉可以长期保藏，可以进一步的制备新鲜的发酵蔬菜。本发明的发酵是符合GMP的生产过程，可以满足食品监督部门的要求。

为此，本发明提供一种制备用黄瓜泥发酵得到的乳酸菌发酵冻干粉的方法和制备新鲜发酵蔬菜的方法，该方法经过以下步骤：

步骤1、对黄瓜冼涤、巴氏灭菌并制备黄瓜泥；

步骤2、将黄瓜泥和乳酸菌混合，加入盐水，在发酵罐中发酵，根据需要可以加入增味剂，如大蒜，番茄等，得到发酵的黄瓜泥；

步骤3a、将发酵的黄瓜泥制备成冻干粉，得到本发明的乳酸菌发酵冻干粉；

步骤3b、将新鲜的杀菌并被浸盐水的蔬菜和上述发酵的黄瓜泥混合，得到本发明的发酵蔬菜；

步骤4、包装并储存步骤3a得到的乳酸菌发酵冻干粉或步骤3b得到的发酵蔬菜。

以上步骤中，

所述蔬菜选自市售或农民在大地中生产的蔬菜，包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜和圆白菜等；

所述乳酸菌来源于市售的半腌汁产品或其他自然筛选的具有抗炎症功能的菌株或表达减肥蛋白GLP-1的工程菌或表达HPV E7等抗原的疫苗的菌株；

这些菌株被描述如下：

半腌汁产品所用的菌株来源于非巴氏灭菌的美国FDA批准的商品半腌法酸菜制品(Half sour pickles，BA-TAMPLE Pickle Products Inc，Brooklyn，NY11236)，菌株可经分离得到，并进行建库保存。这些菌株适应于在匀浆的黄瓜泥中生长，因此其味道就如黄瓜香味，发酵时可以使用分离的菌株，也可以使用半腌法酸菜制品，优选后者(即使用含有乳酸菌的半腌汁产品，也可以称为乳酸菌培养物，市场上有售)

表达减肥蛋白GLP-1的工程菌，系经基因工程手段将GLP-1基因克隆入乳酸菌表达质粒中，并经酶切鉴定确实重组成功，转化乳酸菌中所得，该重组质粒能在乳酸菌代谢中不断表达GLP-1蛋白。

表达HPV E7等抗原的疫苗的菌株，系经基因工程手段构建的重组菌株，将HPV E7基因重组入乳酸菌表达质粒中，并转化乳酸菌，该质粒能在乳酸菌中有效表达抗原。

所述黄瓜泥为将全发酵的黄瓜用匀浆机粉碎并搅拌成泥状，粒度可在1-500微米之间；

所述增味剂选自：大蒜，其与菜泥的比例为1％-0.1％；

发酵在GMP条件下进行，将新鲜的杀菌并被浸盐水的黄瓜和上述发酵的加入增味剂的黄瓜泥混合发酵，其中新鲜蔬菜和菜泥的比例为1％-10％；

其中GMP条件是：建立菌种库，菜泥及发酵蔬菜在密封的生物反应器中进，发酵时间为24-72小时。

所述存贮，菌种在-20℃贮存，半发酵蔬菜或全发酵蔬菜可在温度为4℃或室温条件下保存。

本发明可以采用以下操作步骤进行具体操作：

新鲜的整体黄瓜用水冼，在热水中杀菌，杀菌后的整体黄瓜与小量大蒜或番茄用搅拌器一起匀浆。匀浆的黄瓜泥加入2.0-2.5％的食盐后置生物反应器中。将上述乳酸菌(优选的是乳酸菌培养物，如市场销售的半腌汁产品)加入反应器，混合均匀，向反应器中充入二氧化碳或氮气以驱除空气，生物反应器置于20℃的恒温室中，不需搅拌经12-24小时发酵后，PH降至3.7以下，得到本发明的全发酵的黄瓜泥。

进一步将全发酵的黄瓜泥制成干粉(冻干粉或在4-55℃抽干粉)，包装，便于客户应用和保藏。或者进一步的将全发酵的黄瓜泥加入容器中，将冼净的杀菌后的和被浸盐水的新鲜的黄瓜(整体或切片)加入到此容器，室温发酵2-3天，在4℃存贮，即可得到本发明的半发酵蔬菜。

本发明的泡菜在18-20℃可以进一步发酵，制成全发酵的蔬菜，时间需要2-3天。该全发酵的蔬菜在4℃可以存放1-14天，可以使味道品尝起来更好而且脆嫩无比。

在上述的工作中，尽量努力使整体菜的巴氏灭菌以保留新鲜蔬菜味道，因为热并未完全穿入菜里面。密封的发酵系统、过滤的无菌水、用二氧化碳或氮气喷射驱除氧气，在低PH(＜4.5)制备起始培养物，并在净化的GMP生产环境中生产，目的是防止有害菌的污染，符合食品监管部门对发酵食品和工程菌株生产的相关条款。

对于其他蔬菜品种，可以采用混合加工的方法得到不同口味的发酵蔬菜，如：

将以上步骤中所述的全发酵的匀浆黄瓜泥加到盛有洗净的并经加热杀菌的新鲜红萝卜、芹菜，和甜菜的切片或整体的容器中，在室温(18-20℃)发酵3-4天后，上述半发酵或全发酵的蔬菜就可以食用了。在4℃存放1-14天后，口味更好，更脆。使用全发酵或腌制的匀浆黄瓜和大蒜混合物，就可以增加上述发酵产品的黄瓜和大蒜味。本发明利用发酵过程的易蒸发特性并在半发酵的蔬菜中增加了大蒜和黄瓜味。此过程除走了原蔬菜的异味，除了大蒜和黄瓜味，还可以通过此过程添加其它所需的口味。

在此发明过程中，没有污染机会，表明这是一个非常稳定的制造过程。成功的关键是将全发酵的低PH的含盐的匀浆黄瓜泥直接加入到杀菌的和被浸盐水的新鲜蔬菜中。在这样的低PH和乳酸菌占优势的环境中没有杂菌污染的机会。另外，所有半发酵或全发酵的菜没有异味，而呈黄瓜和大蒜味。这个生产过程的重要性在于可以放大，适宜于在GMP条件下进行工业化生产。更为重要的是，此工艺适于在GMP条件下，不破坏乳酸菌活性而能生产筛选的抗炎性菌或工程菌的产物。

本发明得到的蔬菜制品具有口感好，储存时间长，外观好，干净，没有污染，使用经过基因重组技术转染的的乳酸菌发酵得到的蔬菜还可用于预防和治疗肥胖等疾病。本发明得到的发酵干粉，可用于进一步的蔬菜发酵，使用方便，快捷。

具体实施方式：

以下通过实施例，进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1.

发酵的黄瓜

在水槽中用一个高压水龙头冲冼新鲜的黄瓜，并在88℃热水锅进行加热杀菌15秒。将加热杀菌的黄瓜与小量的大蒜一起匀浆。在蔬菜泥中加入大蒜味或其它增味剂为发酵产品增加口味，因为蔬菜发酵过程中会产生易蒸发的二氧化碳气体和异味。匀浆的黄瓜菜泥泵入20升的瓶状生物反应器中，将经0.22.um过滤器过滤的水和乳酸菌培养物(半腌汁产品)一起加入瓶中。用二氧化碳或N2从瓶状生物反应器中驱除空气，形成相对的无氧发酵，并较好地混合。瓶状生物反应器置于20℃的环境中。静置发酵24小时后，PH降为3.7或更低。发酵3-4天后，全发酵的黄瓜菜泥抽到冻干机或干燥机中干燥1-3天。然后，将冻于粉包成小包装，保藏或供客户应用。

用全发酵的上述冻干的黄瓜菜泥干粉作为商品，将黄瓜、红萝卜、芹菜、甜菜、圆白菜和其它菜蔬菜等洗净，并对其进行加热杀菌和浸盐。将它们切成所需的形状和大小后，装入容器中。加入上述例1全发酵的的黄瓜和大蒜菜泥发酵2-5天，就可以制成半被发酵的蔬菜。

在本例中，尽力于整体蔬菜的巴氏灭菌作用以保留新鲜蔬菜味道，因方热未能穿透蔬菜。采用密封的发酵系统、过滤的除菌的水系统、用CO2或N2喷射法驱除氧气、低PH(＜4.5)的种子菌培养物和净化的GMP生产房间，目的就是防止杂菌的污染，并能满足FDA对发酵食品的要求。

实施例2.

发酵的黄瓜

在水槽中用一个高压水龙头冲冼新鲜的黄瓜，并在88℃热水锅进行加热杀菌15秒。将加热杀菌的黄瓜与小量的大蒜一起匀浆。在蔬菜泥中加入大蒜味或其它增味剂为发酵产品增加口味，因为蔬菜发酵过程中会产生易蒸发的二氧化碳气体和异味。匀浆的黄瓜菜泥泵入20升的瓶状生物反应器中，将经0.22.um过滤器过滤的水和乳酸菌培养物(半腌汁产品)一起加入瓶中。用二氧化碳或N2从瓶状生物反应器中驱除空气，形成相对的无氧发酵，并较好地混合。瓶状生物反应器置于20℃的环境中。静置发酵24小时后，PH降为3.7或更低。发酵一天后，全发酵的黄瓜菜泥抽到玻璃容器中。将冼净并加热杀菌的新鲜的黄瓜(整体或切)加入容器，准备运输或存贮在4℃冰箱。在室温20-22℃再发酵2-3天后，美味的半发酵蔬菜就做成了，可在4℃贮存1-14天，口味更好。

在本例中，尽力于整体蔬菜的巴氏灭菌作用以保留新鲜蔬菜味道，因为热未能穿透蔬菜。采用密封的发酵系统、过滤的除菌的水系统、用CO2或N2喷射法驱除氧气、低PH(＜4.5)的种子菌培养物和净化的GMP生产房间，目的就是防止杂菌的污染，并能满足FDA对发酵食品的要求。

为了制备半发酵或全发酵的红萝卜、芹菜、甜菜、圆白菜和其它菜，将上述例1中全发酵的匀浆黄瓜菜泥加入盛有洗净的加热杀菌的和被浸盐水的新鲜的红萝卜、芹菜、甜菜和其它菜的玻璃容器中。在室温20-22℃继续发酵3-4天后，半发酵或全发酵的蔬菜就制备好了。在4℃存放1-14天后口味更好。使用全发酵或腌制的匀浆黄瓜和大蒜混合物，就可以增加上述发酵产品的黄瓜和大蒜味。本发明利用发酵过程的易蒸发特性并在半发酵的蔬菜中增加了大蒜和黄瓜味。此过程除走了原蔬菜的异味，除了大蒜和黄瓜味，还可以通过此过程添加其它所需的口味。

实施例3.

利用实施例1的发酵的黄瓜泥干粉作为以下基因工程药物的输送体系，GLP-1、exetind-4、GLP-1-leptin、Byetta-leptin、Byetta-IL-18、IL-18-leptin、Symlin-Leptin和PYY-leptin，这些蛋白属于现有技术，我们将上述重组蛋白的基因重组入乳酸菌表达质粒，并转化入上述黄瓜泥培养的乳酸菌中，该转化的乳酸菌可以进一步的制备本发明的发酵蔬菜，其制备步骤除所用菌株不同外，其他步骤同实施例1，以上所述基因重组技术属于现有技术。用实施例3方法发酵得到的蔬菜经过服用具有预防和治疗疾病的作用。

Claims (10)

1、一种制备用黄瓜泥发酵得到的乳酸菌发酵冻干粉的方法，其特征在于，该方法经过以下步骤：

步骤1、对黄瓜的冼涤、巴氏灭菌并制备黄瓜泥；

步骤2、将黄瓜泥和乳酸菌混合，加入盐水，在发酵罐中发酵，根据需要可以加入增味剂，得到发酵的黄瓜泥；

步骤3a、将发酵的黄瓜泥制备成干粉，得到本发明的乳酸菌发酵干粉；

步骤3b、将新鲜的杀菌并被浸盐水的蔬菜和上述发酵的黄瓜泥混合，得到本发明的发酵蔬菜；

步骤4、包装并储存步骤3a得到的乳酸菌发酵干粉或步骤3b得到的发酵蔬菜。

2、权利要求1的方法，所述乳酸菌来源于市售的半腌汁产品或其他自然筛选的具有抗炎症功能的菌株或表达减肥蛋白GLP-1的工程菌或表达HPV E7等抗原的疫苗的菌株；

3、权利要求1的方法，所述发酵是在生物反应器中进行，培养体积大于20升。

4、权利要求1的方法，所述发酵是在GMP条件下的操作过程。

5、权利要求1的方法，所述增味剂选自大蒜，番茄。

6、权利要求3的方法，所述生物反应器可以是搅拌浆型或者摇动型或者摇摆型的反应器。

7、权利要求1的方法，在生物反应器中的生产过程中采用一种厌氧培养过程，用N2或CO2驱除O2。

8、权利要求1的方法，所述制备成干粉是利用冷冻干燥的方法或真空干燥的方法进行制备。

9、权利要求1的方法，其中步骤3a得到的乳酸菌发酵干粉可以通过口服途径将重组蛋白药物或疫苗输送到人体内。

10、权利要求1的方法，步骤3b所述的蔬菜包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜和圆白菜。