CN101018856B

CN101018856B - 使用透明质酸的小型肝细胞选择性培养方法和分离方法

Info

Publication number: CN101018856B
Application number: CN2005800292530A
Authority: CN
Inventors: 三高俊广; 今纯子
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2004-06-29
Filing date: 2005-06-29
Publication date: 2010-06-02
Anticipated expiration: 2025-06-29
Also published as: EP1783209A4; CN101018856A; WO2006001473A1; JPWO2006001473A1; US20070128720A1; JP4758347B2; EP1783209A1; DE602005020638D1; EP1783209B1

Abstract

本发明提供一种小型肝细胞的培养方法，该方法包括在表面结合有透明质酸的载体和/或以透明质酸为主要成分的载体存在下培养小型肝细胞。此外，本发明还提供一种小型肝细胞的培养方法，该方法包括，在表面结合有透明质酸的载体和/或以透明质酸为主要成分的载体存在下培养小型肝细胞，和将附着于透明质酸的细胞与未附着于透明质酸的细胞进行分离。

Description

使用透明质酸的小型肝细胞选择性培养方法和分离方法

技术领域

本发明涉及来自包括人在内的哺乳动物的增殖性肝细胞(小型肝细胞)的分离方法和选择性培养方法。

背景技术

肝脏和肝细胞具有多种功能从而被称为体内的化工厂。例如，90％以上的血清蛋白质是由肝脏产生的，对体内所摄入或者所产生的有害物质进行代谢，具有解毒功能。因此，各研究机构正在进行研究，培养肝细胞，以利用其具有的功能检出有害物质(生物传感器)、利用其在体外生产人体所需的物质。由于目前尚无保持已分化肝细胞功能的细胞株，所以为了供给用于这些研究的肝细胞，在每次实验中都必须分离成熟肝细胞。在这种情况下，所获得的细胞数依赖于每个个体的肝细胞数。之所以这样，是由于还没有充分建立起来在维持肝细胞功能的同时增殖成熟细胞的方法。因此亟待稳定而大量供给具有较多的成熟肝细胞功能的细胞。虽然开发将包括人在内的动物肝细胞冷冻、长期保存、再次使用的方法是非常重要的课题，其已在世界范围进行研究，但是迄今为止，只报告了冷冻保存后复苏的肝细胞能够在培养皿中存活，短期保持70～80％左右的肝细胞功能。而且，在该报告中，复苏的肝细胞几乎没有增殖能力，在短期内就死亡了。

此外，人体因种种疾病，例如肝炎、肝硬化、肝癌等而进入肝功能不全的状态。由于目前人工肝脏尚未进入实用阶段，所以，目前的现状是这些疾病的根本治疗不得不依赖于肝脏移植。但是，在包括日本在内的世界各国，尽管需要肝脏移植的患者大量存在，但是提供脏器的供体数却只满足需要数量的1成。因此，需要在体外(in vitro)形成能够用于肝脏移植的肝组织的方法，和能够用于该方法的肝组织的前体细胞集落及其体外制备方法。

另一方面，本发明者报告了在肝脏组织中存在由小型细胞构成的细胞集团，该小型细胞虽然在白蛋白、转铁蛋白、细胞角蛋白(CK)8、CK18等标记物上表现出与成熟肝细胞几乎相同的表型、在超微结构上也具有肝细胞的特征，但是增殖能力强，将其命名为“小型肝细胞”(small hepatocyte)(Mitaka T.等人，Hepatology，16，440-447，(1992)；Mitaka T.，Sato F，Mizuguchi T等人，Hepatology 29，111-135(1999))。

进而，本发明者报告了从肝脏中获得富含小型肝细胞的组分的方法(WO 01/92481)、能够保持肝细胞的功能和增殖能力的小型肝细胞冷冻保存方法、和适于该方法的小型肝细胞制备方法(WO 01/92481)。此外，本发明者报告了适用于制备可移植肝组织的小型肝细胞集落、其制备方法、由该小型肝细胞集落诱导肝组织的方法(WO02/088332)，也报告了体外推定药物作用，特别是与正常的肝功能相关联的作用的方法(WO 02/088332)。但是，来自包括人在内的哺乳动物的增殖性肝细胞(小型肝细胞)的特异性标志蛋白质尚未明确，因此在高效的分离方法上还存在有改善的余地。

此外，也出现了若干涉及小型肝细胞与具有增殖能力的肝实质细胞的报告(特许第3211941号、特开2002-078481、特开平09-313172、特开平08-112092)。此外，在特开2002-045087中报告了具有由包括人在内的异种动物由来的肝细胞所构成的肝脏的嵌合体动物，和使用该嵌合体动物的实验方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来自包括人在内的哺乳动物的增殖性肝细胞(小型肝细胞)的分离方法和培养方法，特别是选择性培养方法。

本发明提供一种高效分离、培养在小型肝细胞的培养中成熟化而失去作为小型肝细胞的永久增殖能力的细胞(至少具有一部分成熟肝细胞功能的细胞)和小型肝细胞的培养方法，即，小型肝细胞的选择性培养方法。

目前，来自包括人在内的哺乳动物的增殖性肝细胞(小型肝细胞)的特异性标记蛋白质尚不明确，难以提高分离方法和培养的效率。本发明者发现，小型肝细胞特异性表达CD44，作为其配体的透明质酸对该细胞的分离·培养是极为有用的，从而完成本发明。

即，本发明提供一种小型肝细胞的培养方法，该方法包括在表面结合有透明质酸的载体和/或以透明质酸为主要成分的载体存在下培养小型肝细胞。

进而，本发明提供一种小型肝细胞的培养方法，该方法包括，在表面结合有透明质酸的载体和/或以透明质酸为主要成分的载体存在下培养小型肝细胞，以及将附着于透明质酸的细胞和未附着于透明质酸的细胞分离。

本发明提供一种小型肝细胞的培养方法，该方法包括以下步骤：

i)在表面结合有透明质酸的载体和/或以透明质酸为主要成分的载体存在下培养小型肝细胞的步骤；

ii)在i)中获得的培养物中，将附着于透明质酸的细胞和未附着于透明质酸的细胞分离的步骤；

iii)将在步骤ii)中获得的附着于透明质酸的小型肝细胞与上述透明质酸解离的步骤；和

iv)针对步骤在iii)中获得的小型肝细胞，重复步骤i)～iii)1个以上的循环的步骤。

此外，本发明还提供一种小型肝细胞的培养方法，该方法包括以下步骤：

i)在表面结合有透明质酸的载体和/或以透明质酸为主要成分的载体存在下培养哺乳动物肝脏由来的细胞的步骤；

iii)将附着于透明质酸的小型肝细胞与上述透明质酸解离的步骤；

iv)重复步骤i)～iii)1个以上的循环的步骤；和

v)回收与上述透明质酸解离的细胞的步骤。

具体实施方式

本发明为小型肝细胞的高效分离方法和培养方法。在本说明书中，所谓“小型肝细胞”不只是意味着来自肝脏的小型的细胞，而是意味使用下述方法、或者基于该方法的方法从肝脏中分离出来的细胞，其是具有强增殖能力，在白蛋白、转铁蛋白、细胞角蛋白(CK)8、CK18等标记物上表现出与成熟肝细胞几乎相同的表型、在超微结构上也具有肝细胞的特征的、来自肝脏的特殊种类的小型细胞。该细胞是由本发明者发现的，在Mitaka T.等，Hepatology，16，440-447，(1992)，Mitaka T，Sato F，Mizuguchi T.等，29，111-135(1999)中有更详细的记载。

在本发明中，可以将从肝脏制备的细胞组分直接通过本发明在透明质酸存在下进行培养和分离，也可以通过简单方法制备富含小型肝细胞的组分后，再将该组分应用于本发明的方法。

富含小型肝细胞的组分，例如，能够依照如下所述进行制备。将从人或者其他动物采集的肝脏组织以含有胶原酶等的溶液处理，即可获得来自肝脏的细胞。此时，可以使用通常的胶原酶肝灌流法，例如，基于Seglen的方法(Selgen，PO.，Methods Cell Biol.，1976，13，29-83)的灌流法。根据需要，也可以将所获得的细胞悬液通过适当大小的筛孔等，除去未消化的组织残渣或者其他的组织碎片等。虽然以本发明的方法能够直接从该细胞悬液中分离小型肝细胞，但是优选将实质细胞和不需要的组织碎片等尽可能除去后再应用本发明的方法。

实质细胞的去除可以通过如下所述的低速离心来进行。所谓低速离心是指，用于将含有较多实质细胞和不需要的组织碎片等的组分与含有较多非实质细胞的轻组分分离的必要条件，优选为用于将含有实质细胞和不需要的组织碎片等为主的组分与含有较多小型肝细胞和非实质细胞、而几乎不含有实质细胞的轻组分分离的必要条件。若以该条件将上述方法所获得的、来自肝脏的细胞进行分离，则能够在上述的轻组分中获得更多的小型肝细胞。更具体来说，例如，通过将该细胞悬液低速离心，例如以50×g离心1分钟，能够将含有实质细胞为主的重组分和含有肝脏星状细胞(Ito cell)、枯否细胞、肝窦内皮细胞(sinusoidal endothelial cell)等非实质细胞为主的相对轻的细胞的轻质上清组分进行分离。在该离心条件下的上清组分中能够获得较多的小型肝细胞。

加速度越大，或者离心时间越长，则上清组分中的实质细胞的比率越少，但是沉淀的小型肝细胞的比率也增加了，所以离心优选以约50×g进行约1分钟以下。也可以将上清组分进一步反复离心、沉淀、悬浮，将实质细胞和不需要的组织碎片去除。更具体来说，例如，将上清组分以50×g离心5分钟，以适量培养基将沉淀悬浮，进一步以50×g离心5分钟。以同样的培养基将沉淀悬浮，再次以50×g离心5分钟。以同样的培养基将所获得的沉淀悬浮，以150×g离心5分钟，将沉淀的细胞悬浮于新鲜的培养基中。计数细胞悬液中的细胞数，然后培养，或者调节至处理所需要的细胞密度。通常调节至1×10⁴～5×10⁵的密度。

通过本发明的方法能够培养所制备的含有较多小型肝细胞的组分和/或从所制备的含有较多小型肝细胞的组分中高效分离小型肝细胞。为了诱导以透明质酸为配体的细胞表面受体的充分表达，优选将所制备的含有较多小型肝细胞的组分在透明质酸存在下培养3天以上，特别优选培养5天以上后分离小型肝细胞。在培养初期，优选在培养开始24小时内以无血清培养基培养，以避免细胞的非特异性贴壁。RT-PCR的研究显示，作为透明质酸受体，CD44的表达在原代培养第2～3天左右开始显著，在培养开始第3～5天后几乎达到最大值。另一方面，已知成熟肝细胞不表达CD44(Terpe H-J，Stark H，Prehm P，Guenthert U.，Histochemistry，101，79-89(1994)；Goodison S，Urquidi V，Tarin D.，J.Clin.Pathol：Mol Pathol.，189-196(1999))。

本发明者认为，通过从肝脏制备细胞组分这种损伤来活化潜在存在的小型肝细胞，可能至少需要2天～3天。而且，本发明者发现，CD44的表达随着小型肝细胞的成熟化而降低。此外，本发明者确认，在大鼠中，在以半乳糖胺等引起强肝损伤时，在给药几天后，肝脏组织中出现CD44阳性细胞，这与上述的研究是一致的。因此，当从该预先引起强肝损伤的个体的肝脏来制备细胞组分时，能够在透明质酸存在下，通过更短时间的培养以分离小型肝细胞。

或者，也可以在非透明质酸存在下将所制备的含有较多小型肝细胞的组分培养一段时间(前培养)使小型肝细胞增殖后，再通过本发明的方法培养和/或高效分离小型肝细胞。而且，也可以将不经过上述小型肝细胞浓缩操作而获得的细胞组分、或者已经在培养中的成熟肝细胞转移至存在透明质酸的条件下进行培养，以培养和/或分离小型肝细胞。这些细胞组分中当然含有小型肝细胞。而且，认为在成熟肝细胞的培养中能够出现小型肝细胞。本发明者在WO 02/24875中记载了用于培养正常人成熟肝细胞的培养基和条件，使用该培养基和条件培养的正常人成熟肝细胞也可以进而采用本发明的、在透明质酸存在下培养并分离。

在前培养时，可以在37℃下将上述制备好的、富含小型肝细胞的组分(细胞群)于含有血清、烟酰胺、维生素C、抗生素、生长因子、以及其他在细胞培养中通常使用的添加物的培养基中培养，例如，添加了上述添加物的DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium)等。用于增殖或者维持小型肝细胞的培养基优选含有烟酰胺、维生素C、生长因子、DMSO等。维生素C通常作为抗坏血酸-2-磷酸而添加，其浓度优选为0.1mM～1.0mM，更优选为0.5mM～1.0mM。烟酰胺以较高的浓度使用，优选以1～20mM使用，更优选以5mM～10mM使用。作为生长因子，可以使用表皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子α(TGFα)等，特别优选TGFα。添加TGFα时，优选以1μg/l～100μg/l，更优选以5μg/l～50μg/l的浓度使用。此外，在原代培养时，从培养开始第4天起，优选以约0.1～约2％(v/v)，更优选以约0.5～约1.5％(v/v)的浓度添加DMSO。

作为用于前培养的培养容器，可以使用后述的透明质酸结合的培养容器，也可以使用在通常的细胞培养中使用的培养皿，例如，可商购包被了来自牛真皮、鼠尾的胶原的各种大培养皿，或者也可根据需要制备这样的培养皿，但是优选使用未经包被胶原的培养皿。这是因为，细胞外的基质越少就越容易以温和的条件剥离细胞。当适用本发明的分离或培养法时，经过前培养后的细胞虽然能够在金属螯合剂和/或酶的存在下分离为单个细胞，但是对细胞的损伤大，所以优选以非酶方法将集落从培养容器中剥离。可使用的金属螯合剂，只要是对细胞毒性小的即可，可以将通常用于剥离贴壁细胞的，例如EDTA、EGTA和/或其盐在其各自的通常浓度下使用。作为非酶细胞剥离剂，可以使用在不含Ca、Mg的Hanks缓冲液(pH值7.3～7.5)中添加了EDTA、甘油、枸橼酸钠等的溶液，例如，可以从Sigma公司购买名为Celldissociation solution的制备好的非酶细胞剥离剂。可以使用通常的5％二氧化碳培养箱进行培养。二氧化碳的浓度和培养温度在通常培养细胞时所容许的范围内即可。更具体来说，采用WO 01/92481所述方法和条件就能够获得前培养后的富含小型肝细胞的细胞悬液。

在本发明的一个实施方式中，将透明质酸结合(包被)于载体上，在该结合了透明质酸的载体存在下，培养小型肝细胞和/或哺乳动物肝脏由来的细胞。作为载体，可以使用能够包被透明质酸并且适合细胞培养的任何一种载体。该载体包括：塑料制品或者玻璃制品(例如，培养皿、培养瓶(flask)、培养瓶(bottle)、塑料或者玻璃珠)、琼脂糖(セファロ-ス)，例如琼脂糖珠、包被有透明质酸的多孔物质(例如海绵)、金属、纤维素。当使用细胞培养容器作为载体时，优选使用细胞原本难以贴壁的载体，例如，无包被细胞培养容器，和细菌培养用的培养容器。

此外，在本发明的其他实施方式中，在由透明质酸所构成的载体，或者以透明质酸为主要成分的载体，例如以透明质酸构成的、或者以透明质酸为主要成分的多孔物质，例如海绵这样的载体存在下培养小型肝细胞和/或哺乳动物肝脏由来的细胞。此时的培养容器与在上述透明质酸包被载体共存下的培养时一样即可。由于多孔物质包被透明质酸后小型肝细胞能够附着的表面积大，所以优选将其作为载体。该多孔物质可以是能够包被透明质酸，只要不含任何一种对细胞、特别是小型肝细胞有害的物质即可。

将透明质酸包被于载体，例如，能够如下进行。透明质酸可商购获得。此外，透明质酸通常以分子量约100万为界，分为低分子量透明质酸和高分子量透明质酸，在本发明中，优选使用高分子量透明质酸。将透明质酸，优选高分子量透明质酸以适当的浓度，在适当的培养基或者缓冲液中制备为溶液，例如，使得将1ml～5ml制备好的溶液接触载体表面时，相对于载体的表面积的量为10μg/cm²～1000μg/cm²，更优选为50μg/cm²～500μg/cm²。一般来说，将透明质酸溶液在适量的培养基或者缓冲液中制备为10～20mg/ml左右的储存溶液是方便的。所使用的缓冲液可以使用对细胞无害的任何一种缓冲液，例如，可以使用Hanks液、普通的细胞培养基、生理盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)等。缓冲液的pH值处于透明质酸的溶解范围内即可，一般优选为7.1～8.5。溶解透明质酸时的温度只要是透明质酸溶解且不分解的温度即可，考虑到通常的培养箱设定温度，例如，能够方便地使用30℃～40℃、特别是37℃左右的温度范围。

将所制备的透明质酸溶液直接、或者根据情况适当的缓冲液或培养基稀释，使其与上述载体共存，将透明质酸包被于载体上。当包被相对防水性的载体时，若包被用的透明质酸溶液较少，则可能无法充分覆盖载体的表面，因此，将透明质酸溶液稀释而增加液体量是特别有用的。将0.5～20mg/mL，优选1～10mg/mL的透明质酸溶液与载体表面接触用于包被，每1cm²的载体表面优选为10μg～1000μg，更优选为50μg～500μg。例如，当用透明质酸包被60mm培养皿时，会通过下述方法进行包被：以PBS等将所制备的10mg/ml的透明质酸稀释到1mg/ml，将1ml该稀释液注入培养皿进行包被。透明质酸溶液和载体的接触优选在30℃～40℃，特别优选在37℃左右孵育1小时～24小时左右。孵育的温度和时间只要使透明质酸溶液充分包被于载体上即可，虽然用于包被的孵育时间即使超过24小时也没有问题，但是长时间包被是没有优势的。

经过充足时间的包被后，将透明质酸溶液除去，以对细胞无害的缓冲液，例如PBS洗净载体表面。根据需要，可以通过UV照射等对载体进行灭菌。当载体本身为培养容器时，添加后述的适于小型肝细胞培养的培养基，当载体为珠子或海绵等时，可以转移至适当的培养容器中后再添加上述培养基。能够将认为含有小型肝细胞的细胞悬液添加于该准备好的培养容器中。此时的初期细胞密度优选为1×10⁴～5×10⁵细胞/ml。

能够在上述含有血清、烟酰胺、维生素C、抗生素、生长因子、其他在细胞培养中通常使用的添加物的基本培养基中，例如，添加了上述物质的DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)等中，在37℃下，在上述结合了透明质酸的载体存在下进行培养。在本发明的实施方式中，该结合了透明质酸的载体为涂布有透明质酸的培养皿，或者涂布有透明质酸的培养瓶。此外，在其他实施方式中，该结合了透明质酸的载体为透明质酸包被的塑料珠、玻璃珠、琼脂糖珠、或者透明质酸包被的磁珠。此外，在其他实施方式中，该结合了透明质酸的载体为由透明质酸制成的载体、或者以透明质酸为主要成分的载体。特别优选多孔物质(海绵)作为由透明质酸制成的载体、或者以透明质酸为主要成分的载体。

培养基优选进一步含有烟酰胺、维生素C、生长因子、DMSO等。维生素C通常作为抗坏血酸-2-磷酸添加，其浓度优选为0.1mM～1.0mM，更优选为0.5mM～1.0mM。烟酰胺以较高的浓度使用，优选以1～20mM使用，更优选以5mM～10mM使用。作为生长因子，可以使用表皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子α(TGFα)等，特别优选TGFα。添加TGFα时，优选以1μg/l～100μg/l，更优选以5μg/l～50μg/l的浓度使用。当将从哺乳动物肝脏制备的含有小型肝细胞的细胞组分，而非继代培养细胞直接培养时(原代培养)，从培养开始第4天起，优选以约0.1～约2％(v/v)，更优选以约0.5～约1.5％(v/v)的浓度添加DMSO。而且，通过在最初的24小时使用无血清培养基培养，能够减少例如肝窦内皮细胞等非特异性贴壁。而且，为了防止血清中含有的玻璃体结合蛋白、纤连蛋白的混入，也优选在初期进行这种无血清培养。

优选使用二氧化碳培养箱进行培养，基本上以大约每两天一次(每周三次)的频率更换培养基。

更具体来说，能够使用以下培养基：

Dulbecco’s Modified Eagle Medium(GIBCO Laboratories)

+20mM HEPES (Dojindo)

+25Mm NaHCO₃ (Katayama Chemical Co.)

+30mg/l脯氨酸 (Sigma Chemical Co.)

+0.5mg/l胰岛素 (Sigma Chemical Co.)

+10^-7M地塞米松 (Sigma Chemical Co.)

+10％FBS (Hyclone Laboratories，Inc.)

+10mM烟酰胺 (Katayama Chemical Co.，)

+1mM L-抗坏血酸-2-磷酸盐 (Wako Pure Chemical Ind.)

+10μg/l EGF (Collaborative Research Inc.)

+抗生素

1％二甲基亚砜(DMSO) (ALDRICH)

(DMSO在培养第四天更换培养基时添加)

当从没有预先引起肝损伤的个体制备细胞时，为了保证与透明质酸的充分结合，培养期间至少进行2天以上，优选进行大约3天以上，进一步优选进行3天～30天，特别优选进行大约3天～21天；当从以半乳糖胺等预先引起肝损伤的个体制备细胞时，或者从已经进行继代培养的细胞制备细胞时，能够通过较短期间的培养并分离小型肝细胞。当以半乳糖胺引起损伤时，例如，以10mg～100mg/200μlPBS/100g体重的浓度向成熟大鼠(8～10周龄)腹腔内注射D-半乳糖胺(ACROSS)，在注射后第3天～第6天，基于Seglen方法可从肝脏中分离细胞。

在更换培养基时，由于未附着于透明质酸的细胞处于悬浮状态，或者易于从载体上剥落，所以易于从培养物中除去，而且，易于从培养物中回收附着于透明质酸的细胞。在本发明中，从培养物中除去未附着于透明质酸的细胞和从培养物中回收附着于透明质酸的细胞是相同的。

当结合透明质酸的载体为培养皿、培养瓶、或者海绵这样的比较大型的载体时，通过以适当的缓冲液或者培养基，例如，PBS或者上述小型肝细胞培养用培养基对载体表面进行冲洗，能够容易地除去未附着于透明质酸的细胞。当载体为珠子这种比较小型的载体时，通过离心，或者，若为磁珠时，通过磁性固定，然后弃去培养基，根据需要，通过以适当的缓冲液或者培养基洗净，就能够容易地回收附着于透明质酸的细胞，或者能够容易地除去未附着于透明质酸的细胞。然后，可以添加新鲜培养基，在透明质酸存在下或者非存在下继续培养，也可以提供下述的从载体上将小型肝细胞解离的处理。

在进行上述培养之后，弃去培养基，根据需要将载体用培养基或者PBS等适当的缓冲液洗净之后，通过透明质酸酶的作用能够将附着于透明质酸的小型肝细胞从载体上解离下来。可以商购获得透明质酸酶，在适当的培养基中配制使用。所使用的适当的缓冲液只要是能够溶解透明质酸酶，并对透明质酸酶的活性没有显著损害的缓冲液即可，例如，可以使用Hanks液、通常的细胞培养基、生理盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)。此外，对透明质酸酶的浓度也没有特别限定，例如，能够以0.1～20mg/ml的浓度，优选以1～10mg/ml的浓度配制。使该配制好的透明质酸酶作用于载体-透明质酸-细胞复合体，将小型肝细胞从载体解离下来。对作用的透明质酸的量没有特别限定，可以根据使用量调节孵育时间。但是，一般来说，可以使用每1cm²的载体表面优选为约5μg～1000μg，更优选为约50μg～500μg的透明质酸酶。

例如，弃去培养液后，以PBS洗净，加入1mM EDTA/PBS，在室温下孵育1分钟。弃去1mM EDTA/PBS后，添加预热到与培养温度相同，例如37℃的上述浓度的透明质酸酶溶液，在37℃的5％的二氧化碳培养箱内培养适当的时间。例如，当使用60mm培养皿时，优选使用大约1ml的5mg/ml或者10mg/ml的透明质酸酶溶液。当使用涂布有透明质酸的载体，例如，透明质酸包被的培养皿或者培养瓶时，孵育时间典型的为大约30分钟～大约2小时。特别是当处理以透明质酸制成，或者以透明质酸为主要成分的载体时，孵育到该载体全部、或者透明质酸成分充分溶解为止。在任何情况下，都可以在观察细胞游离状态的同时将孵育温度和时间调节到最适。然后，添加适量冰冷的培养液，轻轻吹打后，回收入试管内，通过50×g离心5分钟而能够回收小型肝细胞。

根据培养时间等条件，有时小型肝细胞以透明质酸酶的处理也可能不完全游离出来。此时，可以使用市售的细胞解离溶液，例如可以从Sigma公司获得的Cell dissociation solution。例如，弃去培养液后，以PBS等适当的缓冲液洗净，加入适量的1mM EDTA/PBS，在室温下孵育1～3分钟左右。接下来，弃去1mM EDTA/PBS后，添加适量的预热到与培养温度相同，例如37℃的Cell dissociation solution，在5％的二氧化碳培养箱内孵育例如5～15分钟左右，通过上述方法能够容易地将小型肝细胞从载体中解离出来。可以在观察细胞游离状态的同时将孵育温度和时间调节到最适。

可以单独使用上述细胞解离溶液处理，也可以合用透明质酸酶处理。

孵育后，可通过适当的方法回收从载体解离下来的小型肝细胞。例如，孵育后，向培养容器内添加适量的PBS等对细胞无害的适当缓冲液或者培养基，制备游离的小型肝细胞的细胞悬液，根据需要反复离心和重悬，能够将从载体-透明质酸中游离出来的小型肝细胞洗净并回收。为了不对小型肝细胞造成过度的损伤，以较低速进行短时间离心，例如，优选以50×g离心5分钟左右。此外，当载体为珠子等小型载体时，能够通过更加低速和/或更短时间的离心，或者数秒钟～数分钟左右，优选在1分钟以下的单纯静止来分离小型肝细胞悬液和载体-透明质酸。也可以将这样所获得的小型肝细胞进一步在表面结合透明质酸的载体和/或以透明质酸为主要成分的载体存在下进行选择性培养，重复上述操作。

使用各种标记物能够证实，这样分离和/培养的小型肝细胞具有肝细胞的部分功能。作为这样的标记物，除了分泌于培养基中的白蛋白之外，能够利用转铁蛋白、尿素的产生、糖原量、氨基酸代谢酶、细胞色素P450等。通过培养基或者细胞抽提液的ELISA、Western印迹分析、RT-PCR等，或者直接将细胞免疫染色来证实。小型肝细胞具有作为成熟肝细胞标记物的白蛋白、CK8、CK18、糖原、过氧化物酶体等标记物，另一方面，没有作为胆管上皮细胞标记物的CK7、CK19等，从这一点上能够与其他的细胞相区别。例如，已知卵形细胞(ovalcell)作为肝干细胞的一种，具有CK7、CK19等胆管上皮细胞标记物，没有糖原、过氧化物酶体等成熟肝细胞标记物，从这一点上能够与小型肝细胞相区别。此外能够证实，其他的非实质细胞标记物[[ED1/2(枯否细胞的标记物)、SE-1(肝窦内皮细胞的标记物)、结蛋白(desmin)(肝脏星状细胞的标记物)、波形蛋白(vimentin)(肝上皮样细胞标记物)]也是阴性的。

与培养从肝脏中获得的含有较多小型肝细胞的组分时相同，像这样高效分离并维持培养的小型肝细胞可以使用上述培养基和培养容器进行培养。此时，可以使用上述结合了透明质酸的培养容器，也可以使用在通常的细胞培养中使用的培养容器。虽然可以使用通常用于的贴壁细胞培养的胶原包被的培养容器，但是，如果在制备冷冻保存用集落或者制备适合肝组织形成的小型肝细胞集落时而希望将小型肝细胞从培养容器中剥离下来时，则优选未包被胶原的培养皿。这是因为，细胞外基质越少，就容易以越温和的条件剥离细胞，并且，当未以胶原等包被时，小型肝细胞倾向于优先从容器中剥离。在培养时，可以使用通常的5％二氧化碳培养箱。二氧化碳的浓度和培养温度处于通常的培养细胞所容许的范围内即可。

上述高效分离并维持培养的小型肝细胞也能够根据WO 01/92481所述方法冷冻保存，也可以根据WO 02/088332所述方法使其向肝组织成熟化，进而使用成熟化的肝组织用于推定药物的功能。

此外，本发明书中所述文献的公开内容通过引用而全部纳入本说明书中。

实施例

实施例1富含小型肝细胞的细胞组分的制备

根据Seglen的方法，将添加了0.2mM EGTA的不含钙、镁的Hanks液从门静脉向成熟大鼠(10～15周龄)的肝脏灌流。以40ml/分的流速灌流大约4分钟后，将含有0.02％胶原酶(Yakult)的Hanks液以20ml/分的流速灌流10分钟。根据规定的方法从消化后的肝脏中将肝细胞振落于烧杯中。以250μm筛孔和70μm筛孔的滤器过滤细胞悬液，以50×g离心1分钟。收集上清，再以50×g离心1分钟，重复2次。收集该上清，以50×g离心5分钟。将沉淀的细胞以培养液(Leivobitz L-15+10％胎牛血清+10-7M地塞米松+0.5mg/l胰岛素+抗生素)洗净，再以50×g离心5分钟。重复相同的操作后，以150×g离心5分钟。重复相同的操作后，再以50×g离心5分钟。将沉淀的细胞以新培养液悬浮后，计数活细胞数量，制成1×10⁴～5×10⁵cell/ml。

实施例2CD44在小型肝细胞中的表达谱

研究了在实施例1中制备的小型肝细胞的CD44的表达谱。

1)CD44的表达谱的经时变化

从新鲜制备的小型肝细胞、培养开始后的小型肝细胞、和成熟肝细胞中制备总RNA，以RT-PCR法研究CD44的表达。使用GPDH(甘油-3-磷酸脱氢酶)作为阳性对照(管家基因)。使用以下培养基进行培养。

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (GIBCO Laboratories)

+20mM HEPES (Dojindo)

+25Mm NaHCO₃ (Katayama Chemical Co.)

+30mg/l脯氨酸 (Sigma Chemical Co.)

+0.5mg/l胰岛素 (Sigma Chemical Co.)

+10^-7M地塞米松 (Sigma Chemical Co.)

+10％FBS (Hyclone Laboratories，Inc.)

+10mM烟酰胺 (Katayama Chemical Co.，)

+1mM L-抗坏血酸-2-磷酸盐 (Wako Pure Chemical Ind.)

+10μg/l EGF (Collaborative Research Inc.)

+抗生素

1％二甲基亚砜(DMSO) (ALDRICH)

(DMSO在培养第四天更换培养基时添加)

从大约1.0～1.5×10⁵个小型肝细胞中抽提总RNA。使用ISOGEN(NIPPON GENE)，根据技术人员推荐的实验方案将细胞溶解，然后添加氯仿，充分混和后，在4℃以10000×g离心15分钟。取出上层，添加异丙醇，在4℃以10000×g离心15分钟后，将所获得的沉淀以70％乙醇洗净，溶解于DEPC水中。灌注之后立即以同样的方法从成熟肝细胞中抽提出RNA。

使用10ng的获得的总RNA进行RT-PCR。将PCR产物进行电泳，以密度计读取所获得的各条带，将CD44的条带强度除以GPDH的条带强度，计算相对强度。使用的引物如下：

5’-cccgaattcatggacaaggtttggtggca-3’(序列编号1)

5’-cccgaattcctacaccccaatcttcatat-3’(序列编号2)

此外，使用下述引物用于GPDH：

5’-accacagtccatgccatcac-3’(序列编号3)

5’-tccaccaccctgttgctgta-3’(序列编号4)

PCR的条件如下：95℃15秒，60℃30秒，68℃1分钟，循环数＝25。

结果明确，在原代培养开始后，大约2～3天后可见显著的CD44表达，此后表达量逐渐增大，在培养开始第3～5天后几乎达到最大值，在增殖中的小型肝细胞中几乎维持CD44的表达水平(图1)。此外也显示，当以该条件培养时，在40天后小型肝细胞达到一定程度的成熟度，CD44的表达降低(图1)。

2)小型肝细胞和成熟肝细胞中CD44的表达谱的比较

依照WO 01/92481所述方法，将冷冻保存的细胞(约1.0～1.5×10⁵个细胞)以常规方法复苏，通过和1)相同的步骤从培养2周后的细胞中提取总RNA。从成熟肝细胞抽提RNA是以相同的方法从刚灌流后的细胞中抽提的。使用所获得的10ng总RNA，与1)相同进行RT-PCR，检测CD44的相对表达量。但是PCR的循环数设为35。将PCR产物进行电泳，以密度计读取所获得的各条带，将CD44的条带的强度除以GPDH的条带的强度，比较小型肝细胞和成熟肝细胞中CD44的表达(图2)。

结果明确，在成熟肝细胞中，CD44的表达始终非常低(图1、图2)。

通过Northern印迹也获得同样的结果(图3)。此时也使用了作为管家基因的GPDH。如上所述，以密度计读取所获得的各条带，将CD44的条带的强度除以GPDH的条带的强度，比较小型肝细胞和成熟肝细胞中CD44的表达。所使用的探针为编码CD44区域的全长(序列编号5)。使用Alkphos Direct标记试剂盒(Amersham Biosciences)标记探针。

依照WO 02/088332所述方法，将Matrigel添加于培养中的小型肝细胞中，诱导小型肝细胞成熟化，通过Northern印迹检测CD44的表达变化。结果显示，在添加Matrigel后第二天开始成熟化(WO02/088332)，CD44的表达伴随着成熟化而降低(图4)。

这些结果显示，CD44是小型肝细胞特异性表达的，同时，通过制备来自肝脏的细胞组分这样的损伤，诱导了CD44的表达，由此提示，在构成肝脏的细胞群中潜在存在的小型肝细胞及其前体细胞能够表现出作为小型肝细胞的本来性质。

实施例3在透明质酸存在下的培养

以PBS配制浓度为10mg/ml的透明质酸储存溶液，保持在37℃。使用的透明质酸是从Sigma购买的(Sigma Hyaluronic acid(人脐带；Human imbilical cords)，货号H-1504)。向所获得的透明质酸储液添加适量的PBS，配制成透明质酸稀释溶液，使得在总体积3ml中含有1～10mg透明质酸。将获得的各种浓度的透明质酸溶液加入60mm的未处理培养皿(Kord-Valmark)中。将该培养皿在37℃下孵育过夜，以PBS洗净后使用。

将在1)中制备的富含小型肝细胞的细胞组分接种于该培养皿中。在最初的24小时使用下述培养基，然后更换为向该培养基中添加了10％FBS(Hyclone Laboratories，Inc.)的培养基。使用二氧化碳培养箱进行培养，基本上以每两天一次(每周3次)的频率更换培养基。

培养基的组成如下：

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (GIBCO Laboratories)

+20mM HEPES (Dojindo)

+25Mm NaHCO₃ (Katayama Chemica l Co.)

+30mg/l脯氨酸 (Sigma Chemical Co.)

+0.5mg/l胰岛素 (Sigma Chemical Co.)

+10^-7M地塞米松 (Sigma Chemical Co.)

+10mM烟酰胺 (Katayama Chemical Co.，)

+1mM L-抗坏血酸-2-磷酸盐 (Wako Pure Chemical Ind.)

+10μg/l EGF (Collaborative Research Inc.)

+抗生素

1％二甲基亚砜(DMSO) (ALDRICH)

(DMSO在培养第四天更换培养基时添加)

使用1mg、5mg、10mg透明质酸包被60mm培养皿，在第7天、第14天、和第21天在显微镜下观察在涂布了透明质酸的培养皿中的小型肝细胞的增殖。结果示于图5。

由图5可明确，在非贴壁细胞用的培养皿(阴性对照)上培养的小型肝细胞几乎没有形成集落，与在贴壁细胞用的培养皿(阳性对照)中的培养相比，在涂布了透明质酸的培养皿中的小型肝细胞的面积大。而且，若培养时间延长，则会发生小型肝细胞的分化，即成熟化，从而取代小型肝细胞的增殖，小型肝细胞集落面积的增加率就会降低，但是至少到第21天为止，其面积仍然大于未涂布透明质酸时的面积。此外，通过显微镜的观察，未发现增殖中的小型肝细胞的形态变化。

实施例4小型肝细胞的分离

a)透明质酸酶处理

在涂布了透明质酸的培养皿中培养6天和3周后，以透明质酸酶(Sigma Chemical Co.)进行处理。将培养液从培养皿中弃去后，以PBS洗净，加入1mM EDTA/PBS 1ml，在室温下孵育1分钟。弃去1mMEDTA/PBS后，添加1ml预热到37℃的透明质酸酶(5mg/ml或10mg/ml)，在37℃的5％的二氧化碳培养箱内孵育2小时。然后，添加1ml冰冷的培养液，轻轻吹打后，回收入试管内，以50×g离心5分钟，回收小型肝细胞。

培养6天的小型肝细胞集落能够剥离，所以能够回收细胞，但是单独以透明质酸酶无法充分剥离培养3周的细胞。因此，使用b)所示的分散液。

b)以细胞解离溶液(Cell dissociation solution)的处理

在涂布了透明质酸的培养皿中培养3周后，使用细胞解离溶液(Cell dissociation solution)(Sigma Chemical Co.)，根据技术人员推荐的实验方案对培养皿中贴壁的细胞进行处理。

弃去培养液后，以PBS洗净，加入1ml的1mM EDTA/PBS，在室温下孵育1分钟左右。弃去1mM EDTA/PBS后，添加1ml的预热到37℃的Cell dissociation solution，在37℃的5％的二氧化碳培养箱内孵育5～15分钟。然后，添加1ml冰冷的培养液，回收入试管内，以50×g离心5分钟，回收小型肝细胞。

所获得的细胞在形态学上与小型肝细胞相同，CD44为阳性。该细胞能够增殖形成集落。形成集落的细胞分泌白蛋白，通过免疫染色分析的结果证实，非实质细胞标记物[ED1/2(枯否细胞的标记物)、SE-1(肝窦内皮细胞的标记物)、结蛋白(desmin)(肝星状细胞的标记物)、波形蛋白(vimentin)(肝上皮样细胞标记物)]都是阴性的。因此证实所获得的细胞为小型肝细胞。

实施例5成熟肝细胞的制备

以含有胶原酶的溶液灌流成熟大鼠的肝脏，将所获得的细胞悬液在4℃下以50×g离心1分钟，回收沉淀。将沉淀悬浮于Hanks缓冲液中，在4℃下以50×g离心1分钟，重复该操作3次。

将所获得的沉淀悬浮于25ml的Hanks缓冲液中，加入21.6ml的Percoll(Amersham)、2.4ml的10×Hanks缓冲液，颠倒混合。在4℃下以50×g离心15分钟，弃去上清。以PBS将细胞悬浮，在4℃下以50×g离心1分钟，回收沉淀，获得成熟肝细胞。

实施例6小型肝细胞和成熟肝细胞在透明质酸存在下培养的比较

将以实施例1和实施例4的方法制备的小型肝细胞和成熟肝细胞接种于以实施例3的方法涂布后的培养皿中。培养方法与实施例3相同。

在最初的24小时使用下述培养基，然后更换为添加了10％FBS(Hyclone Laboratories，Inc.)的培养基。使用二氧化碳培养箱进行培养，以每周3次的频率更换培养基。

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (GIBCO Laboratories)

+20mM HEPES (Dojindo)

+25Mm NaHCO₃ (Katayama Chemical Co.)

+30mg/l脯氨酸 (Sigma Chemical Co.)

+0.5mg/l胰岛素 (Sigma Chemical Co.)

+10^-7M地塞米松 (Sigma Chemical Co.)

+10mM烟酰胺 (Katayama Chemical Co.，)

+1mM L-抗坏血酸-2-磷酸盐 (Wako Pure Chemical Ind.)

+10μg/l EGF (Collaborative Research Inc.)

+抗生素

1％二甲基亚砜(DMSO) (ALDRICH)

(DMSO在培养第四天更换培养基时添加)

在培养后第1天和第7天计数培养皿中生长的细胞。以第1天的细胞数量作为1，表示在第7天的比率(图6)。成熟肝细胞在培养第7天几乎没有生长，相反地，小型肝细胞在第7天达到了第1天的大约7倍的细胞数。

采用本发明，能够从包括人在内的哺乳动物的肝脏中高效分离小型肝细胞。而且，采用本发明能够选择性地培养小型肝细胞。进而，采用本发明，能够将小型肝细胞与在培养中成熟化而失去小型肝细胞的永久增殖能力的细胞高效分离并培养。

例如，当在透明质酸包被的培养皿中分别培养小型肝细胞和成熟肝细胞时，成熟肝细胞在培养第7天几乎没有生长，相反地，小型肝细胞在第7天达到了第1天的大约7倍或者7倍以上的细胞数，因此，采用本发明能够区别成熟肝细胞而选择性地培养和分离小型肝细胞。

附图说明

图1为通过RT-PCR检测的在制备和培养开始后的各时间点的CD44的mRNA水平的表达结果。纵轴表示相对强度，横轴表示培养天数。

图2为通过RT-PCR比较在小型肝细胞和成熟肝细胞中CD44的mRNA水平表达的结果。SH：小型肝细胞；MH：成熟肝细胞。纵轴表示相对强度。

图3为以Northern印迹(Northern印记杂交)比较在小型肝细胞和成熟肝细胞中CD44的mRNA水平的表达结果。SH：小型肝细胞；MH：成熟肝细胞。纵轴表示相对强度。Upper表示在被检出的mRNA中的大小大的RNA，Lower表示大小小的RNA。

图4为通过Northern lot检测的在以Matrigel诱导成熟化后的小型肝细胞中CD44表达的结果。SH：小型肝细胞；MH：成熟肝细胞。纵轴表示相对强度。

图5表示在包被了不同量的透明质酸的培养皿中，小型肝细胞集落增殖的经过时间。纵轴为mm²单位面积×10^-3。阳性对照：贴壁细胞用培养皿；阴性对照：非贴壁细胞用培养皿；胶原：胶原涂布培养皿；1mg HA、5mg HA、10mg HA：分别以1mg、5mg、10mg的透明质酸处理过的容器。

图6为在涂布了透明质酸的培养皿中的成熟肝细胞和小型肝细胞的相差显微镜照片。A：成熟肝细胞培养第1天；B：成熟肝细胞培养第7天；C：小型肝细胞培养第1天；D：小型肝细胞培养第7天。以3×10⁵的细胞浓度将成熟肝细胞(MH)和小型肝细胞(SH)接种于涂布了透明质酸的过的60mm培养皿中，进行培养。分别表示第1天和第7天的生长状态。小型肝细胞增殖而形成集落，与此相对，成熟肝细胞变为球状而剥离，在第7天几乎没有存活的细胞。图中的线表示200微米。

图7为表示在涂布了透明质酸的培养皿中的成熟肝细胞和小型肝细胞的增殖的图表。计测存活细胞数，以第1天的细胞数作为1，相对表示第7天的细胞数。

参考文献：

1.WO 01/92481号小册子

2.WO 02/088332号小册子

3.特许第3211941号公报

4.特开2002-078481号公报

5.特开平09-313172号公报

6.特开平08-112092号公报

7.特开2002-045087号公报

8.Mitaka T.等人，Hepatology，16，440-447，(1992)

Mitaka T.，Sato F，Mizuguchi T等人，Hepatology 29，111-135(1999)

序列表

<110>Japan Science and Technology Agency

<120>使用透明质酸的小型肝细胞选择性培养方法和分离方法

<130>Y1M0397

<150>JP 2004-191477

<151>2004-06-29

<160>5

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>1

cccgaattca tggacaaggt ttggtggca 29

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>2

cccgaattcc tacaccccaa tcttcatat 29

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>3

accacagtcc atgccatcac 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>4

tccaccaccc tgttgctgta 20

<210>5

<211>1095

<212>DNA

<213>Rattus norvegicus

<400>5

atggacaagg tttggtggca cacagcttgg ggactacttt gcctcttaca gttgagcctg 60

gcacagcagc agatcgattt gaatataacc tgccgttacg caggtgtatt ccatgtggag 120

aaaaatggcc gctacagtat ctccaggact gaagcagctg acctctgcga ggctttcaac 180

accaccttgc ccaccatggc tcagatggag ttagccctga gaaaggggtt tgaaacatgc 240

aggtatgggt tcatagaagg acacgtggta atcccgagga tccaccccaa cgctatctgt 300

gcagccaaca acacaggagt gtatatcctc ctcgcatcca acacctccca ctatgacaca 360

tattgcttca atgcctcagc tcctcttgaa gaagactgta catcagtcac agacctaccc 420

aattccttcg atggaccagt taccataact attgtcaacc gtgatggcac ccgctacagc 480

aagaagggcg agtatagaac acaccaagaa gacatcgatg cctcaaacat tatagatgag 540

gatgtcagca gtggatccac cattgagaag agcaccccag aaggctacat tttgcacacc 600

gaccttccca cttcacagcc tactggagac cgggatgacg ccttctttat tgggagcacc 660

ctggccacca gtgatggaga ctcatccatg gaccccaggg gtggtttcga cactgtgact 720

catggatccg aattagctgg acactcaagt gggaatcaag acagtggagt gaccacaact 780

tctggtcctg cgaggagacc tcagattcca gagtggctta tcatcttggc atccctcctg 840

gcgctggctc tgattcttgc cgtctgcatt gctgtcaaca gtaggagaag gtgtgggcag 900

aagaagaagc tggtgatcaa cagtggcaat ggaacagtgg aagacaggaa accaagtgaa 960

ctcaacgggg aggccagcaa gtctcaggaa atggtgcatt tggtgaacaa ggaaccaaca 1020

gagactccgg accagtttat gacagctgat gagacccgga atctgcagag tgtggatatg 1080

aagattgggg tgtag 1095

Claims

1.一种培养并增殖小型肝细胞的方法，其特征在于：包括在表面结合有透明质酸的载体和/或以透明质酸为主要成分的载体存在下培养并增殖小型肝细胞，其中所述的小型肝细胞以50×g离心1分钟不沉淀，但以50×g离心5分钟沉淀且增殖。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养方法包括在表面结合有透明质酸的载体和/或以透明质酸为主要成分的载体存在下培养小型肝细胞，以及将附着于透明质酸的细胞和未附着于透明质酸的细胞分离。

3.一种小型肝细胞的培养方法，其中所述的小型肝细胞以50×g离心1分钟不沉淀，但以50×g离心5分钟沉淀且增殖，其特征在于所述方法包括以下步骤：

iii)将在步骤ii)中获得的附着于透明质酸的小型肝细胞与所述透明质酸解离的步骤；和

iv)针对在步骤iii)中获得的小型肝细胞，重复步骤i)～iii)1个以上的循环的步骤。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于：所述载体选自多孔物质、玻璃、琼脂糖、塑料、金属、纤维素。

5.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于：通过将相对于载体表面为10～1000μg/cm²的透明质酸与载体一同孵育，将透明质酸结合于载体表面。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：通过将相对于载体表面为10～1000μg/cm²的透明质酸与载体一同孵育，将透明质酸结合于载体表面。

7.一种小型肝细胞的分离方法，其中所述的小型肝细胞以50×g离心1分钟不沉淀，但以50×g离心5分钟沉淀且增殖，其特征在于所述方法包括以下步骤：

ii)从i)中所获得的培养物中回收附着于透明质酸的细胞的步骤；

8.如权利要求7所述的小型肝细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

ii)在i)中所获得的培养物中，将附着于透明质酸的细胞和未附着于透明质酸的细胞分离的步骤；

iii)将步骤ii)中所获得的附着于透明质酸的细胞与所述透明质酸解离的步骤；

iv)针对在步骤iii)中获得的小型肝细胞重复步骤i)～iii)1个以上的循环的步骤；和

v)回收与所述透明质酸解离的细胞的步骤。

9.如权利要求7所述的小型肝细胞的分离方法，其特征在于：所述载体选自多孔物质、玻璃、琼脂糖、塑料、金属、纤维素。

10.如权利要求8所述的小型肝细胞的分离方法，其特征在于：所述载体选自多孔物质、玻璃、琼脂糖、塑料、金属、纤维素。

11.如权利要求7～10中任一项所述的小型肝细胞的分离方法，其特征在于：通过将相对于载体表面为10～1000μg/cm²的透明质酸与载体一同孵育，将透明质酸结合于载体表面。

12.如权利要求7～10中任一项所述的小型肝细胞的分离方法，其特征在于：通过透明质酸酶的作用将小型肝细胞与透明质酸解离。

13.如权利要求11所述的小型肝细胞的分离方法，其特征在于：通过透明质酸酶的作用将小型肝细胞与透明质酸解离。