用于纯化和分离生物高分子的单片成型体
本发明涉及新的单片成型体、其制备方法以及它们在纯化和分离生物高分子中的应用。
由于生物技术领域自动化和小型化的发展,近年来已经在日益寻找可迅速有效处理尤其是小量样品的溶液。具体地说,完全自动化的高通量工作站的使用不断要求研发可在尽可能短的时间内处理很高量的样品,同时可复制性地检测最小量的生物材料。在本文中,需要小型化过滤和分离装置,例如所谓的微滴定板或多孔板。除了常规的96孔板,每孔体积为50μl的384孔板也已经成为标准。此外,每孔体积为5-10μl的1536孔板也已经使用一段时间了。
然而,就纯化和分离生物高分子的常规过滤材料而言,使用如此小的孔,尤其是当过滤和分离材料在纯化生物高分子时必需同时具备非常好的选择特性和高结合容量时,已经达到了技术发展的极限。
因此,由于过滤和分离表面太小而无法得到满意的效率和结合容量,因此目前用于96孔板的玻璃纤维和二氧化硅膜只有限适用于384孔板。此外,除了制造费用增加,穿孔的微型膜通常太薄,因此不适合在没有辅助物的时候用于孔内,例如可在孔内插入其它基板和/或其它稳定剂,这样会造成制造费用较高。
此外,常规的玻璃纤维和二氧化硅膜会由于老化而功效大大降低,即便是在短期之后,因此它们不适合长期保存。此外,老化的膜的活化不仅非常不方便,而且不足以获得可复制的结果。
本文中,在色谱领域,单片过滤和分离材料在毛细柱的制备中不断受到重视。这里采用所谓的溶胶-凝胶法,首先制备可聚合的低分子量化合物(溶胶),然后在聚合反应中将其转化成聚集的或聚合的材料(凝胶)。反应在各色谱柱内直接发生。然而,这些方法仅适用于直径非常小(<300μm)的毛细柱,这是由于无机单片过滤和分离材料通常尤其会发生皱缩而在单片过滤和分离材料与分离装置之间形成死体积,这通常极大削弱了柱的分离特性(参见DE OS 100 28 572)。为消除这种死体积,曾提出在聚合和随后老化及干燥熔块(frit)之后在分离装置中再次填满聚合溶液并重复制备方法的所有阶段。然而,在可以进行新的聚合之前,老化的熔块必需首先用活化溶液复活,这总体上是时间和花费非常密集的制造方法。
这些多次聚合的单片熔块的另一个缺点是,由于它们的结构,因此不太稳定,因此随着过滤或分离装置直径的增加,单片材料的磨损也会增加。尤其,当与压力装置联用时磨损增加通常会导致污染,这随后也可影响随后的分析步骤,甚至造成错误结果。
为克服已知色谱分离材料的上述缺点,本发明的目的是提供一种能够选择性纯化和分离生物高分子同时有效的并可复制性的处理大量样品的、尤其用于自动化和/或小型化分析过程的稳定的过滤和分离材料。所述过滤和分离材料在储存时也应稳定并且可在长期储存后快速利用。
用本发明对单片成型体的规定可解决这一目的,所述单片成型体是通过包括以下加工步骤的方法获得的:
a)将二氧化硅置于反应容器内;
b)加入含有至少一种或多种碱性硅酸盐和硼酸钾的溶液A,
c)加入含有至少一种或多种造孔剂(porogen)和水的溶液B,
d)加入至少一种有机酰胺,以及
e)干燥该反应混合物。
上述单片成型体可按照本发明通过聚合步骤获得。根据加工步骤a),首先将胶体硅胶置入反应容器。根据本发明优选的实施方案,以二氧化硅含水分散体或硅胶的形式加入二氧化硅。可使用各种具有不同粒度、二氧化硅含量和稳定类型(例如稳定于氨水、氢氧化钠溶液等)的市售二氧化硅分散体。除了聚集的硅胶,根据本发明也可使用胶体硅胶。在本发明中,“聚集的”表示平均粒径约40nm的存在于水中的交联的、无孔的、球形二氧化硅。根据一特别优选的本发明的实施方案,二氧化硅以二氧化硅小颗粒的含水胶体分散体形式存在。这些是单分散或多分散的胶体二氧化硅分散体,诸如例如,Ludox(W.R.Grace & Co.,Columbia,US)或Levasil(BayerAG,Leverkusen,DE)等,在本发明中,“胶体”表示存在于水中的非交联的、单独的球形二氧化硅颗粒。优选地,这种胶体分散体含有30-50重量%,优选40-45重量%二氧化硅颗粒,其平均粒径为5-100nm,优选10-40nm,特别优选15-25nm。
根据本发明方法的加工步骤b),然后在已有二氧化硅中加入溶液A。溶液A包含至少一种或多种碱性硅酸盐和市售硼酸钾(Honeywell Special Chemicals(GmbH,Seelze,DE)。我们惊奇地发现,加入硼酸钾,尤其是加入本发明的单片成型体,能改善间隙孔的孔表面的结合特性并因此得到较高产量的分离的生物高分子。然而,为将硼酸钾溶于反应混合物,优选将其溶于碱性硅酸盐溶液。在本发明中,“碱性硅酸盐”应理解为硅酸的碱性盐,尤其是硅酸钠和硅酸钾。根据本发明优选的实施方案,在制备溶液A时,优选将0.1-4重量%,优选0.5-2重量%,尤其优选0.5-1.0重量%的硼酸钾(相对于总的反应混合物)溶于市售的无色胶体硅酸钾溶液,诸如例如,购自Cognis Deutschland GmbH & Co.KG.,Düsseldorf,DE的硅酸钾28°/30°Bé(波美度28/30,相当于密度为1.240/1.261g/cm3),具有20.5%的优选二氧化硅含量。
为进一步获得机械稳定性更好的本发明的单片成型体,需要永久性大孔聚合物。这是使合适的造孔剂出现在分散相中来形成的。因此,在进一步的加工步骤c)中加入含有至少一种或多种造孔剂和水的溶液B。水溶性化合物被有利地用作形成更多孔的物质(所谓的孔建造者(pore builder)或造孔剂)。高度水可溶解或水可混溶的表面活性剂和/或乳化剂特别适用。这种孔建造者是已知的。用于本发明的造孔剂应是单体的热力学良好溶剂,但是聚合物的弱溶剂,这样可以很晚导致相分离。用这种方法可以有利地确定反应混合物的均匀性,从而可以用非常稳定的可渗透膜制备单片成型体。而对于最初连通的膜,通过加入造孔剂制造连续的大孔,通过加入胶体形成位于大孔壁上的间隙孔。
根据本发明优选的实施方案,在制备溶液B时多元醇被优选用作造孔剂。乙二醇、二甘醇、甘油和/或双甘油特别适用;但也可适用聚丙二醇(PPG)和/或聚乙二醇(PEG)。所有上述化合物都可单独存在或者作为混合物存在。
奇怪的是,加入一种或多种溶于水的上述造孔剂可大大提高按照本发明形成的单片成型体的稳定性。这里,水(蒸馏水或完全去离子的水)的体积能极大影响孔的形成。根据所用造孔剂,宜用约1-4ml水,优选2-3ml水,来溶解造孔剂或制备5-40%,优选10-20%的造孔剂溶液。
已经证实联合使用PEG(例如PEG 3000/Fluka,Buchs,CH)和甘油(MerckKGaA,Darmstadt,DE)或双甘油(Fluka,Buchs,CH)与水的混合物最为有利。如此制备的单片成型体的孔具有最佳平均孔径和狭窄的孔径分布。这样可有利地增加比表面积并因此提高本发明单片的结合容量。此外,加入甘油和/或双甘油可在相当程度上降低或者甚至避免形成的单片成型体的磨损,例如在过滤过程中加入等等,所有这些都需要使用加压设备。此外,提高甘油的量能得到结构更加均匀的本发明的单片。
从现有溶胶-凝胶法可知,降低pH值的物质如有机或无机酸被作为引发剂加入反应混合物(溶胶)以启动凝胶形成,即将反应混合物的溶胶形式转变为凝胶形式。然而,有机或无机酸的缺点在于,它们会迅速降低pH值,从而导致立即形成凝胶,就要形成的单片成型体的形状和大小而言,这可能是不均匀或者甚至不完全的。具体地说,反应混合物向相应模压装置的转移需要随时间延迟形成凝胶。在本发明中,模压装置被理解为一方面是用于纯化和分离生物高分子的市售装置,例如旋转柱、多孔板、吸管尖端等,另一方面是用作制造熔块、团块或者单片过滤和分离材料所有其它可能想到的形状(例如,球形、柱形等)的模压装置。根据本发明优选的实施方案,在碱性条件下热分解并通过其水解降低反应混合物pH值的低分子量化合物被加入反应混合物以启动缩聚反应。我们奇怪地发现,使用有机酰胺尤其有利于均匀且缓慢地形成凝胶。因此,在特别优选的本发明的实施方案中,根据加工步骤d),至少一种有机酰胺(例如聚丙烯酰胺、乙酰胺、尿素、甲酰胺等)随后被缓慢加入反应混合物。在本文中,采用市售甲酰胺和/或尿素(Merck KGaA,Darmstadt,DE)最为有利,这是由于这些化合物随低分子量化合物形成而分解从而在制备过程中消失,或者后来可以容易地从形成的单片成型体中除去,因此不会导致在用本发明的单片进行的分析中造成干扰或者导致错误结果。
这些化合物一个更重要的优点是,用甲酰胺和/或尿素处理的反应混合物能在加入后的30分钟内转移到各模压装置而不会对凝胶形成过程造成有害影响。
在模压装置内成功转移或聚合反应混合物后,为适合之后的应用,按照加工步骤e)干燥凝胶型材以形成本发明的单片成型体。干燥在30-80℃,优选40-60℃的适当干燥装置如烘箱、干燥箱或干燥室等内进行约12-25小时,优选17-22小时,尤其优选最多20小时。
在加工步骤a)到d)中,使反应混合物保持持续运动是有利的,例如通过振荡、搅拌、涡漩或者使用超声等,从而可使离析物在反应混合物中均匀分布并因此确保形成结构均匀的本发明的单片成型体。
基于本发明的制备过程,可以制备具有预调节孔径和预调节孔径分布的单片过滤和分离材料。在用作纯化和分离生物高分子的色谱分离材料时其优点非常明显。具体地说,与常规的过滤和分离材料如玻璃纤维膜不同,本发明的单片具有更大稳定性和结合容量。
奇怪的是,按照本发明形成的单片成型体的有益特性可通过在过滤材料中加入硼酸钾形式的硼而增强。具体地说,可通过加入硼化合物来影响或者甚至控制在本发明的单片成型体的制备过程中形成的有益的间隙孔孔径。
含有0.1-0.3重量%硼,优选0.15-0.25重量%硼,尤其优选0.18-0.22重量%硼的本发明的单片成型体显示出特别有益的过滤和分离特性,如结合容量明显增加。
上述方法的另一个优点是,可以简便且迅速地使形成本发明的单片成型体所需的离析物进入非常小的成型装置,例如吸管尖端或384多孔板等,并且可在原位形成单片成型体。
此外,使用完全不同的模压装置也是有效且便宜的。不同于常规的玻璃纤维板(尤其是384多孔板),按照本发明制备的成型体可被更加经济且迅速地制成任何不含压紧环和基板的结构。此外,按照本发明制备的成型体在使用之后可方便地用新的成型体代替,这样可能节省材料开支。此外,团块制品尤其适用于快速灵活使用本发明的单片成型体。它们具有一些好的和可复制的分离特性,也可方便地改变直径和密度。
此外,在本发明文中,我们惊奇地发现,本发明的单片成型体同样适合用作选择性分离生物高分子的色谱分离材料。在第一个例子中,这是通过有目的的调节间隙孔的孔径而实现的。然而,在本发明的其它实施方案中,间隙孔内的结合化学可任选地受到诸如一种或多种能掺入本发明单片成型体的结构内或附于在本发明的单片成型体中形成的孔表面的过渡金属的影响。出于该目的,在本发明的改进方法中,制备了含有一种或多种过渡金属的盐的水溶液C。
为将过渡金属掺入本发明的单片成型体,在本发明所述方法一开始将溶液C与溶液A混合。很明显,铜盐、锌盐和/或锰盐的水溶液特别适合,优选溶液含有0.2-1.7重量%硫酸铜或0.8-2.9重量%高锰酸钾。
为粘附过渡金属,尤其是粘附于在本发明的单片成型体内形成的间隙孔的表面,将干燥的过滤或分离材料用溶液C浸泡并室温干燥约18小时。或者,根据材料的特性,可在130℃进行更加迅速的干燥(见实施例1b和3)。所用溶液实质上是锆盐和/或钛盐的溶液,优选1-10%的ZrCl4或TiCl4溶液,其中,这些化合物也可溶于其它常用溶剂(例如二乙醚、THF等)。
总之,根据本发明的优选实施方案可知,本发明的单片成型体是用以下组分的反应混合物制备的(表示为重量%):
35-85%硅酸钾,
0.1-25%至少一种胶体硅胶,
0.1-30%水,
0.1-12%至少一种造孔剂,
6-12%至少一种有机酰胺,
0.1-5%硼酸钾,
0-10%至少一种过渡金属的盐。
特别优选具有以下组分的反应混合物(表示为重量%):
50-60%硅酸钾(28/30),
5-10%至少一种胶体硅胶,
10-25%水,
3-6%聚乙二醇和/或二甘醇,
5-10%甲酰胺和/或尿素,
0.5-2%硼酸钾,
0-2%甘油和
0-10%至少一种过渡金属的盐。
下面将通过附图和实施例中的其它试验细节更加具体地例证本发明。
其中:
图1在电子显微镜下看到的以PEG作为造孔剂的本发明单片成型体的结构;
图2在电子显微镜下看到的没有造孔剂的本发明单片成型体的结构;
从图1和图2所示的本发明单片成型体的照片可以清楚看出,在反应混合物中加入聚乙二醇明显产生了较大的大孔,这样可以得到较好的流速。通过电子显微术确定大孔和间隙孔的孔径以及它们各自的比表面积。样品的比表面积约为10m2g-1。
实施例
实施例1:本发明单片的一般制备方法
首先制备溶液A和溶液B(见表1)。然后将不同量的市售胶体二氧化硅置于50mlPE管,在其中缓慢滴加溶液A和溶液B,同时恒定振荡以形成溶胶。在有轻微絮状物但无沉淀的反应混合物(RG)中加入不同量的甲酰胺(见表1)以形成凝胶。然后,在30分钟内加入有机酰胺,在(1)市售旋转柱或(2)市售孔板的孔洞中每次滴加150μl反应混合物,旋转柱或孔板的出口最初是封闭的(例如用胶带)。聚合后,一些模压装置的上部入口也被盖上。最后将模压装置在干燥箱内于40℃温暖20小时。
应理解,在缩聚和/或干燥过程中覆盖模压装置能够使本发明的单片成型体更缓慢地干掉,这样促进了更加一致地形成单片结构。
a)使用不同模压装置
(1)在旋转柱内获得的单片完全填满旋转柱的下部区域。通过插入压紧环,可将单片固定在旋转柱内,并直接用于分离来自血液样品、大鼠肝组织和大鼠脑组织的基因组DNA和RNA。
(2)从孔板取出获自孔板的的单片团块并固定到旋转柱内。如此制得的旋转柱直接用于分离来自血液样品、大鼠肝组织和大鼠脑组织的基因组DNA和RNA。为确保团块在旋转柱内有特别好的固定,用来制备团块的孔板的直径大于旋转柱的内径。这样就无需使用压紧环因此该方法更加经济。
b)本发明单片的干燥时间
为研究本发明单片的干燥时间,将制备的凝胶置于模压装置内并在干燥箱内于约40℃保温。每小时进行核查以确定需要干燥多久才能形成单片熔块(成型体)。基于进行的一系列试验,可以证明本发明的单片在约2小时后硬化并基本稳定。然而,它们还不够稳定,不足以防止二氧化硅磨损,从而用它们获得成功的分析结果。在17-20小时后得到熔块的全部容量。
已经进一步证实干燥时间对皱缩有影响。高温和快速干燥时间导致的皱缩小于低温缓慢干燥。通常可以通过模压材料的材料来确定极限干燥温度。这就是说,如果未干燥的成型体取自模压装置,则最高400℃的温度是合适的。
还研究了在干燥过程中能否通过,例如,微波辐射或使用热混合器(thermomixer)来防止反应混合物可能的相分离以及能够达到什么程度,因为已知可通过在凝胶化过程中恒定振荡来抑制反应混合物的分离。这可有利地导致本发明单片的结构明显更加均匀,因此具有更高容量。我们发现在30-70℃,优选40-60℃的热混合器内完全缩聚样品特别有益。
为确保没有来自本发明单片成型体的与制备有关的杂质在分离步骤,尤其是敏感性分析过程中干扰分析结果,随后任选用蒸馏水冲洗形成的单片成型体一次或多次,然后于40-120℃干燥。
c)按照本发明制备的单片的比较
为了能够将按照本发明制备的单片相互比较,从一系列不同组成的反应混合物制备单片并研究它们的特性。以下选择是例子,仅是为了例证本发明单片的特殊性质。
反应混合物(RG) | 溶液A | 溶液B | 二氧化硅(Ludox AS 40,粒度20nm,40wt% SiO<sub>2</sub> | 甲酰胺 |
RG 1 | 32.7mg硼酸钾,溶于4ml硅酸钾 | 400mg PEG 3000,溶于2ml水 | 0.5ml | 0.5ml |
RG 2 | 65.45mg硼酸钾,溶于4ml硅酸钾 | 400mg PEG 3000,溶于2ml水 | 0.5ml | 0.5ml |
RG 3 | 32.7mg硼酸钾,溶于3.5ml硅酸钾 | 400mg PEG 3000,溶于2ml水 | 1ml | 0.5ml |
RG 4 | 65.45mg硼酸钾,溶于3.5ml硅酸钾 | 400mg PEG 3000,溶于2ml水 | 1ml | 0.5ml |
RG 5 | 4ml硅酸钾 | 400mg PEG 3000,溶于2ml水 | 0.5ml | 0.5ml |
RG 6 | 65.45mg硼酸钾,溶于4ml硅酸钾 | 400mg PEG 3000,溶于2ml水 | 0.5ml | 0.6ml |
RG 7 | 65.45mg硼酸钾,溶于4ml硅酸钾 | 400mg PEG 3000,溶于2ml水 | 0.5ml | 0.7ml |
RG 8 | 65.45mg硼酸钾,溶于4ml硅酸钾 | 360mg PEG 3000和40mg甘油,溶于2ml水 | 0.5ml | 0.5ml |
RG 9 | 65.45mg硼酸钾,溶于4ml硅酸钾 | 320mg PEG 3000和80mg甘油,溶于2ml水 | 0.5ml | 0.5ml |
RG 10 | 65.45mg硼酸钾,溶于4ml硅酸钾 | 280mg PEG 3000和120mg甘油,溶于2ml水 | 0.5ml | 0.5ml |
RG 11 | 65.45mg硼酸钾,溶于4ml硅酸钾 | 360mg PEG 3000和40mg双甘油,溶于2ml水 | 0.5ml | 0.5ml |
RG 12 | 65.45mg硼酸钾,溶于4ml硅酸钾 | 320mg PEG 3000和80mg双甘油,溶于2ml水 | 0.5ml | 0.5ml |
RG 13 | 65.45mg硼酸钾,溶于4ml硅酸钾 | 280mg PEG 3000和120mg双甘油,溶于2ml水 | 0.5ml | 0.5ml |
RG 14 | 65.45mg硼酸钾,溶于4ml硅酸钾 | 200mg PEG 3000,溶于1ml水 | 0.5ml | 0.5ml |
表1:用于制备本发明单片的反应混合物的组成
除了测试稳定性和磨损以及目测颜色和形状,首先进行了容量试验。出于该目的,特别从不同生物样品纯化了基因组脱氧核糖核酸(gDNA)和/或核糖核酸(RNA)。纯化用按照本发明制备的单片柱材料进行,并采用常规玻璃纤维柱材料作为参比。优选采用Rneasy和Qiaprep(QIAGEN GmbH,Hilden,DE)作为参比材料。此外,根据样品材料,按照相应的现有纯化方法进行纯化,例如“QIAamp DNA Blood Miniprotocol”或“RNeasy MINI protocol”等。
基于从反应混合物RG1-5制备的单片的容量测量,可预测例如各物质的影响。因此,根据表2,例如,使用硼酸钾能提高本发明单片的容量。
来自RG的柱材料 | 容量(μg) |
RG 1/1 | 7.14 |
RG 1/2 | 7.95 |
RG 2/1 | 8.15 |
RG 2/2 | 8.63 |
RG 3/1 | 6.64 |
RG 3/2 | 5.56 |
RG 4/1 | 5.68 |
RG 4/2 | 4.96 |
RG 5/1 | 0.36 |
RG 5/2 | 0.73 |
QIAQuick | 6.45 |
表2:硼酸钾的影响
已知在本发明的单片中使用硼酸钾能使容量相比常规旋转柱材料提高达30%或更高。
同样,也显示通过改变反应混合物中甲酰胺的量能进一步改进本发明单片的特性。通过增加甲酰胺的量可以在总体上避免磨损但不会使容量损失。
来自RG的柱材料 | 容量(μg) |
RG 2/1 | 20.7 |
RG 2/2 | 29.6 |
RG 6/1 | 27.4 |
RG 6/2 | 26.7 |
RG 7/1 | 26.8 |
RG 7/2 | 27.6 |
QIAQuick | 16.1 |
表2:甲酰胺量的变化
改变造孔剂的量也有助于改进单片的结构。已知加入,尤其是,甘油和/或双甘油可使单片的结构变得更加均匀。此外,加入甘油和/或双甘油也有助于防止磨损。
表4:甘油的作用 表5:双甘油的作用
更加均匀的单片结构的再一个优点是,使用造孔剂也能明显提高RNA产量(也参见实施例2)。
实施例2:RNA选择性单片的制备
a)制备含有硫酸铜的RNA选择性单片
为制备溶液C,将15.9mg硫酸铜(Fluka,Buchs,CH)和39.8mg酒石酸钾(Fluka,Buchs,CH)溶于0.5ml水并用15.0mg氢氧化钾(Fluka,Buchs,CH)缓慢处理。将所得蓝色悬浮液移入如实施例1制备的溶液A,同时涡漩振荡。得到澄清的蓝色溶液。将溶液缓慢移入50ml聚乙烯试管内的0.5ml胶体二氧化硅中。然后,边涡漩振荡边缓慢加入含有溶于2ml水的360mg PEG 3000和40mg甘油的溶液B。加入0.5ml甲酰胺后,每次将100μl溶液移入相应制备的旋转柱并在干燥箱内于40℃温暖20小时。实现从组织样品分离不含gDNA且可复制的RNA。
样品1:按照纤维组织法(Fibrous-Tissue Protokoll)(QIAGEN GmbH,Hilden,DE)确定20mg大鼠肾脏组织内的RNA含量:
产量:a)每10mg组织20μg总RNA(无gDNA污染)
b)每10mg组织19μg总RNA(无gDNA污染)
c)每10mg组织19μg总RNA(无gDNA污染)
d)每10mg组织20μg总RNA(无gDNA污染)
b)制备含有高锰酸钾的RNA选择性单片
为制备溶液C,将0.0625g高锰酸钾(Fluka,Buchs,CH)溶于0.5ml去离子水。边涡漩振荡变将将高锰酸钾溶液移入按实施例1制备的溶液A。然后将0.5ml胶体硅胶置于50ml聚乙烯试管,并在其中缓慢滴加上述硅酸钾和高锰酸钾的混合物。然后再次涡漩振荡,加入含有溶于2ml去离子水的360mg PEG 3000和40mg甘油的溶液B。最后,缓慢加入0.5ml甲酰胺并加入分别制备的旋转柱。在干燥箱内于40℃干燥20小时,所得单片可用于从不同组织分离RNA。实现从不同组织样品分离不含gDNA且可复制的RNA。
样品2:按照脂质组织法(Lipid-Tissue Protokoll)(QIAGFN GmbH,Hilden,DE)确定40mg大鼠脑组织内的RNA含量:
产量:a)每10mg组织7μg总RNA(无gDNA污染)
b)每10mg组织8μg总RNA(无gDNA污染)
c)通过额外涂层制备RNA选择性单片
为涂布如该实施例所述从RG2制备的本发明的单片成型体的表面,将干燥的过滤或分离材料浸入两种不同溶液。一种情况下将单片成型体置于5%四氯化锆/THF溶液(L1)中18小时???,另一种情况下置于5%异丙醇锆(IV)-异丙醇复合物/乙醇溶液(L2)。
室温干燥18小时后所得单片(M1和M2)可用于从不同组织分离RNA组织。(将M1和M2与从RG 2制备的未涂布的单片成型体M0比较)。
样品3:按照Rneasy纤维组织法(Rneasy Fibrous-Tissue Protokoll)(QIAGEN GmbH,Hilden,DE)(1)确定20mg大鼠肾脏组织中的RNA含量。在第二种试验过程中(2),在洗涤步骤RW1之前进行用两倍的GITC(1.8M)的洗涤步骤,在第三种试验过程中(3),在洗涤步骤RW1之后进行用一半的GITC(0.45M)的洗涤步骤。
产量,μg:(每10mg组织)
| (1) | (2) | (3) | gDNA污染 |
M0M1M2 | 1883 | 16153 | 141013 | 可检测不可检测极弱可检 |
用不同洗涤缓冲液也从组织样品实现了不含gDNA的经过选择的RNA分离。
实施例3:模压装置的不同填装体积:
为进行比较,除了150μl,有将100μl制备的反应混合物RG2置于旋转柱并在干燥箱内于40℃温暖20小时。然后将本发明单片成型体的容量与QIAQuick旋转柱(QIAGEN GmbH,Hilden,DE)的容量进行比较。
来自RG的柱材料 | 容量(μg) |
RG 2a1 | 56.2 |
RG 2a/2 | 52.3 |
RG 2b/1 | 29.1 |
RG 2b/2 | 24.5 |
QIAQuick | 32.1 |
表6:不同填装体积
可以证实,尽管使用体积减少了,但装有单片成型体的旋转柱的容量可与QIAQuick旋转柱的容量相当。同时,用50μl填装体积和较小体积进行的试验非常成功,因此,在较小的纯化装置如384多孔板中加载本发明的单片成型体的有益的。
此外,采用较小填装体积可完全防止单片材料的磨损。
此外,可知单片材料比常规的玻璃纤维和二氧化硅膜更加稳定,因此尤其适合过滤和分离材料的小型化,例如,可以无需使用额外的基板或压紧环。除了材料费用减少,这还有益于更加迅速地制备过滤和分离材料。
样品4:
每次将100μl反应混合物RG2移入旋转柱。旋转柱在干燥箱内于40℃干燥20小时。用单片填装旋转柱的下部区域。通过插入压紧环将单片固定于旋转柱并直接用于从血液纯化gDNA。按照QIAamp DNA血迷你法(QIAamp DNA Blood MiniProtokoll)(QIAGEN GmbH,Hilden,DE)纯化200μl全血。必需的试剂也来自QIAamp试剂盒(QIAamp-Kit)(QIAGEN GmbH,Hilden,DE)。
产量:a)8.7μg gDNA
b)10.4μg gDNA,
c)8.5μg gDNA,
d)10.5μg gDNA,
实施例4:单片成型体的老化
该实施例中,将本发明的单片成型体(从反应混合物RG2制备)在干燥箱内放置较长时间以将其老化。在制备的30个单片熔块中,15个在干燥箱内于60℃再干燥40小时(空气循环阶段3)。
通过目测可知标准熔块和额外干燥的熔块之间没有区别。此外,即便在室温长期储存后也未出现老化相关的容量损失。