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Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Flüssigchromatographie und betrifft Trägermaterialien für Anwendungen bevorzugt in der Affinitätschromatographie.
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Übliche affinitätschromatographische Träger sind für die Niederdruck-Chromatographie ausgelegt, wobei häufig makroporöse und typischerweise sphärische Polymer(gel)partikel eingesetzt werden. Die Stabilität der Partikelpackungen gegenüber höheren Flußraten ist jedoch deutlich eingeschränkt.
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Insbesondere sind konventionelle affinitätschromatographische Säulenpackungen nicht druckstabil, können nur mit sehr niedrigen Flußraten betrieben werden, sind nicht sehr langzeitstabil und haben ungünstige kinetische Parameter. Sie können meist nicht in der umgekehrten Flußrichtung betrieben werden, obzwar das für Elution oder Reinigung oft wünschenswert ist und können nur sehr begrenzt regeneriert werden. Zudem können affinitätschromatographische Säulen zu Zwecken der Sterilisation oft nicht autoklaviert werden. Weiterhin sind affinitätschromatographische Säulen bzw. Materialien typischerweise sehr teuer.
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Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Chromatographiesäule, bzw. ein Säulenmaterial für die Affinitätschromatographie bereitzustellen, die/das diese Nachteile nicht aufweist. Ein wesentliches Ziel ist es, eine verbesserte stationäre Phase insbesondere für die Affinitätschromatographie, aber auch für die Festphasenextraktion und generell für die Niederdruck-Chromatographie bereitzustellen, die aber auch bei höheren Drücken und damit höheren Flüssen betrieben werden kann.
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Diese Aufgabe wird gelöst durch einen porösen Monolithen nach Anspruch 1. Weitere Ausführungsformen, Modifikationen und Verbesserungen ergeben sich anhand der folgenden Beschreibung und der beigefügten Ansprüche.
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Gemäß einer Ausführungsform wird ein Trägermaterial für die Chromatographie vorgeschlagen, wobei das Trägermaterial monolithisch in Form einer Fritte ausgebildet ist und wobei wenigstens an einem Teil der Porenoberflächen der Fritte ein Ligand für eine Wechselwirkung mit einer oder mehreren Zielsubstanzen gebunden ist.
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In diesem Zusammenhang wird unter einer Fritte ein Werkstoff verstanden, der miteinander teilweise verschmolzene (gesinterte) Partikel aus Glas, aus einem Metall, aus einer Keramik oder aus einem Polymer umfasst. Diese Partikel weisen ursprünglich typischerweise eine unregelmäßige Form auf und liegen beispielsweise in Form eines Pulvers vor.
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Vorteilhaft ist ein solches Trägermaterial druckstabil und kann, vorausgesetzt der Ligand hält den jeweiligen Bedingungen stand, unter erhöhtem Druck betrieben und bei erhöhter Temperatur sterilisiert, z.B. autoklaviert werden. Gemäß einer Modifikation dieser Ausführungsform ist der Ligand an der Fritte gebunden oder liegt adsorbiert daran vor. Er kann beispielsweise kovalent gebunden vorliegen.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die Chromatographie ausgewählt unter einer Affinitätschromatographie, unter einer Liganden-Austausch-Chromatographie und/oder unter einer Ionenaustauschchromatographie.
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Vorteilhaft können mit diesen chromatographische Verfahren Zielsubstanzen aus Substanzgemischen extrahiert, selektiv angereichert oder zumindest zurückgehalten werden, sodass eine Fraktionierung komplexer Substanzgemische im Ergebnis einer Chromatographie ermöglicht wird.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die Zielsubstanz ausgewählt unter einem Protein, einem Hormon, einem Zytokin, einem Immunmodulator und einer pharmakologisch aktiven Substanz. Besonders geeignete Zielsubstanzen können humane bzw. humanisierte Antikörper oder vergleichbare Konstrukte sein, Antikörper aus Maus, Ratte, Kaninchen oder anderen Spezies (monoklonal oder polyklonal), rekombinante Proteine mit His-Tag oder ähnlichen Strukturelementen, die für die Aufreinigung verwendet werden. Auch Viren, Bakterien, Hefen und andere Mikroorganismen, sowie suspendierte Zellen oder Zellorganellen können Zielsubstanzen in diesem Sinne sein. Zudem können Mykotoxine, Algentoxine oder andere unerwünschte Substanzen eine Zielsubstanz darstellen.
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Gerade die bezeichneten Zielsubstanzen werden typischerweise affinitätschromatographisch aus einer Flüssigkeit angereichert und/oder aufgereinigt bzw. zur Analyse extrahiert. Unerwünschte Zielsubstanzen können in der betreffenden Flüssigkeit auch abgereichert bzw. aus dieser vollständig entfernt werden.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der Ligand ausgewählt unter einem Nukleinsäure-Oligomer, einem Aptamer, einem Peptid, einem Antikörper oder einem Antikörperfragment, einem Hormon, einem zur Erzeugung eines Antikörpers genutzten Epitop und einer pharmakologisch aktiven Substanz. Geeignete Liganden sind auch natürliche oder rekombinante Bindeproteine, wie Protein A, Protein G, Protein A/G, Protein L und vergleichbare Binder für Immunglobuline. Gleichfalls geeignet sind metallbindende Liganden, wie Nitrilotriessigsäure-Derivate (NTA), die für die Herstellung von Nickel- oder Kobalt-Ionen-beladenen Säulen für die Aufreinigung von His-Tag-markierten Proteinen verwendet werden. Zudem sind alle Liganden in Betracht zu ziehen, die in Standardwerken der Affinitätschromatographie [siehe https://roempp.thieme.de/roempp4.0/do/data/RD-01-00981] erwähnt werden, unter anderen auch Reaktivfarbstoffe, wie beispielsweise Cibacron Blue F3G-A und Procion Red HE-3B. [https://roempp.thieme.de/roempp4.0/do/data/RD-06-00214]. Biotin-(Strept-)Avidin-Systeme und deren reversibleren Varianten, Lektine, Oligoglycane sind gleichfalls geeignete Liganden. Auch chemische Interaktionspaare, wie freie Thiole, elektrophile Reagenzien, redoxaktive Substanzen und ähnliches kommen zur Verwendung als Liganden in Betracht.
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Die bezeichneten Liganden sind für eine hochspezifische Wechselwirkung mit entsprechenden Zielsubstanzen bekannt und können zur Substanzanreicherung eingesetzt werden. Aber auch weniger selektive Oberflächen, die der Ionenchromatographie entsprechen (z.B. Äquivalent zur DEAE-Cellulose [https://roempp.thieme.de/roempp4.0/do/data/RD-04-00227]), sind geeignete Systeme zur Aufreinigung oder Abreicherung von Zielsubstanzen.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die Fritte ein Material, das ausgewählt ist unter einem Glas, einem Metall, einem Polymer oder einer Keramik.
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Vorteilhaft zeichnen sich die bezeichneten Materialien in Form der entsprechenden Fritte durch Festigkeit und hydrostatischer sowie chemischer Stabilität aus.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine Chromatographiesäule vorgeschlagen, die ein Rohr mit einem ersten und einem zweiten Ende umfasst, wobei das erste und das zweite Ende jeweils einen Kapillar- oder Schlauchanschluss aufweisen und das Rohr mit einem Trägermaterial gemäß den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen so gefüllt ist, dass ein Fluid, welches die Chromatographiesäule durchströmt, gezwungen ist, das Trägermaterial zu durchströmen. Gemäß einer Modifikation dieser Ausführungsform können an den beiden Enden des Rohres Verteilerplatten vorgesehen sein, um die Ausbildung von Totvolumina zu vermeiden und eine gleichmäßigere Durchströmung des Monolithen zu erreichen.
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Vorteilhaft ist ein hydrostatischer Widerstand einer solchen Chromatographiesäule unabhängig davon, in welcher Richtung sie durchströmt wird.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Herstellungsverfahren für eine Chromatographiesäule vorgeschlagen, umfassend:
- - Bereitstellen einer Fritte (kreis)zylindrischer Form;
- - Bereitstellen eines Rohres;
- - Fluidisch dichtes Anordnen der Fritte im Rohr, sodass ein das Rohr durchströmendes Fluid die im Rohr angeordnete Fritte durchströmt;
- - Bereitstellen eines ersten und eines zweiten Fluidanschlusses an jeweils einem Ende des Rohres,
wobei die Fritte und der erste und der zweite Fluidanschluss an den jeweiligen Enden des Rohres so angeordnet sind, dass kein von dem Monolith freies Volumen verbleibt, und ein über den ersten Fluidanschluss einströmendes Fluid unmittelbar auf die Fritte trifft, diese durchströmt und das Rohr mit dem Verlassen der Fritte verlässt und in den zweiten Fluidanschluss einströmt. Zusätzlich können nach dem Stand der Technik noch strukturierte Verteilerplatten an den Monolith-Stirnflächen aufgebracht werden, um einen gleichmäßigen Flüssigkeitsfluss zu gewährleisten.
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Das beschriebene Herstellungsverfahren ist einfach und kostengünstig.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die beim vorgeschlagenen Herstellungsverfahren verwendete Fritte ein Material, das ausgewählt ist unter einem Glas, einem Metall, einem Polymer oder einer Keramik.
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Diese Materialien lassen sich problemlos zu einer Fritte verarbeiten und gemäß dem beschriebenen Herstellungsverfahren verwenden.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird vorgeschlagen, eine Fritte als monolithischen chromatographischen Träger zur Anreicherung, Rückhaltung und/oder Entfernung einer löslichen Substanz aus einem die Fritte durchströmendem oder benetzendem Fluid zu verwenden, in dem die Substanz gelöst vorliegt.
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Insbesondere ist die lösliche Substanz ausgewählt unter einer bei ihrer Herstellung prozessbedingt anfallenden Verunreinigung, einem Farbstoff, einem Pestizid, einem biologischen oder chemischen Kampfstoff, einem Desinfektionsmittel, einem Antibiotikum, einem Protein, einem Peptid, einem Toxin, einem Hormon, einem Zytokin, einem Immunmodulator, einem pharmazeutischen Wirkstoff und/oder einer biologisch aktiven Substanz und deren Metaboliten oder primären Abbauprodukten.
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Zahlreiche Produkte biotechnologischer Herstellung müssen für ihre Verwendung in biologischen oder biochemischen Assays zu diagnostischen Zwecken oder zu therapeutischen Zwecken von begleitenden Verunreinigungen befreit werden. Ebenso muss beispielsweise Wasser vor seiner Verwendung als Trinkwasser gereinigt oder Grundwasser von Schadstoffen befreit werden. Einige der etablierten Reinigungsverfahren umfassen einen affinitätschromatographischen Schritt. Das beschriebene Trägermaterial weist die eingangs als nachteilig benannten Eigenschaften konventioneller Trägermaterialien nicht auf und ist deshalb für solche Reinigungsschritte gut geeignet.
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Die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen können beliebig miteinander kombiniert werden.
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Den beschriebenen Ausführungsformen ist die Verwendung eines gesinterten, porösen Materials, beispielsweise einem Glas, das üblicherweise als Glasfritte zur Filtration eingesetzt wird, gemeinsam. Im Unterschied zur üblichen Verwendung von Glasfritten, z.B. in einer Nutsche, werden große Rohlinge hier z.B. mittels Diamanthohlbohrer nach Bedarf zugeschnitten. Der Zuschnitt kann alternativ auch mittels Fräsen, oder beispielsweise durch Wasserstrahlschneiden erfolgen. Das jeweils bevorzugte Trennverfahren ist ausgewählt in Abhängigkeit von der Art der Fritte, sodass der Zuschnitt beispielsweise auch mittels Laser erfolgen kann. Der dann typischerweise zylindrisch zugeschnittene Monolith wird in einem Mantel oder einem Rohr, z.B. in einer Metallhülse, angeordnet, abgedichtet und das Rohr beidseitig mit Fluidanschlüssen versehen. Diese Vorgehensweise bewahrt die räumlich homogene Porenverteilung und ermöglicht die Vermeidung von Randeffekten.
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Gemäß typischen Ausführungsformen zeichnen sich die bevorzugten Fritten typischerweise durch ein Aspektverhältnis größer 0,5 und insbesondere größer 1 aus. Das heißt, dass die Höhe des Monolithen (der Säule), gemessen entlang einer zentralen Rotationsachse typischerweise mindestens halb so groß oder größer als der Durchmesser des Monolithen (der Säule) ist. Insofern unterscheidet sich der Monolith deutlich von einer wie auch immer gearteten Membran.
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Die beiliegenden Zeichnungen veranschaulichen Ausführungsformen und dienen zusammen mit der Beschreibung der Erläuterung der Prinzipien der Erfindung. Die Elemente der Zeichnungen sind relativ zueinander und nicht notwendigerweise maßstabsgetreu.
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1 zeigt elektronenmikroskopische Aufnahmen verschiedener Fritten.
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2 zeigt oben eine Glasfritte kreiszylindrischer Form vor dem Einsatz in eine Metallhülse. Im unteren Teilbild ist die Fritte in ein Edelstahlrohr eingepasst und mit Silikonkleber fluidisch dichtend eingeklebt.
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3 illustriert das Druckverhalten zweier Chromatographiesäulen umfassend Monolithe aus Glasfritten (VitraPOR 4 und VitraPOR 5). VitraPOR® ist eine Handelsmarke der ROBU® Glasfilter-Geräte GmbH, Hattert, Deutschland. Bei den Materialien handelt es sich um Borosilikatgläser. Es können jedoch auch beliebige andere Glasfritten als Trägermaterial für die Affinitätschromatographie verwendet werden.
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4 zeigt ein Chromatogramm zur Charakterisierung der dynamischen Bindungskapazität von IgG an einem Protein-A-VitraPOR 5 Monolithen.
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5 zeigt eine Kalibrierkurve einer monolithischen Protein A Säule (VitraPOR 4) für Kaninchen IgG.
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6 zeigt die Affinitätsextraktion von Kaninchen-IgG aus verschiedenen Proben.
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Insbesondere zeigt 1 verschiedene Fritten, die als monolithische Trägermaterialien eingesetzt werden können. Oben ist die rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer Titanfritte gezeigt. Das mittlere Bild zeigt die Aufnahme einer Glasfritte (VitraPOR 4) mit einer mittleren Porengröße von 10 - 16 µm. Das untere Bild zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer Glasfritte (VitraPOR 5) mit einer mittleren Porengröße von 1 - 1,6 µm.
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Hierbei wird unter einer Fritte bzw. unter einem Monolithen ein gesintertes poröses Material verstanden, das von einem Netzwerk großer, miteinander verbundener Poren und Kanäle durchzogen ist.
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2 zeigt Teilschritte der Herstellung einer Chromatographiesäule, umfassend eine monolithische Glasfritte. Im oberen Bild ist eine kreiszylindrische Glasfritte (VitraPOR 5) gezeigt. Diese Fritte kann beispielsweise mit Silikonkautschuk beschichtet werden und dann in ein passendes Rohr eingeklebt werden. Ein in eine Edelstahlhülse eingeklebter Monolith ist im unteren Bild gezeigt. Als Kleber diente ein RTV Silikonkleber. Ebenso können andere vergleichbare Kleber oder Harze verwendet werden.
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Im oberen Diagramm der 3 ist der Volumenstrom über eine monolithische Säule in Abhängigkeit von Druck und Zeit dargestellt, im unteren Diagramm ist die beim jeweiligen Volumenstrom erzeugte Druckdifferenz (Rückdruck) gezeigt. Die verwendete Säule wies bei einem Innendurchmesser von 8 mm eine Länge von 15 mm auf.
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4 zeigt ein Chromatogramm zur Charakterisierung der dynamischen Bindungskapazität von IgG an einem Protein-A VitraPOR 5 Monolithen. Nach Aktivierung der Glasmatrix, beispielsweise mit Piranhasäure, wurden die Silanolgruppen mit GLYMO (3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilan, 1% in Toluol) für 1 Stunde bei Raumtemperatur modifiziert. Danach wurde Protein A während 7 Tagen bei 4°C kovalent verankert. Die Konzentration des Protein A betrug 2 g/L in 100 mM PBS, pH 7.4. Danach wurde der so erhaltene Protein-A-Monolith mit PBS bis zum Erreichen einer stabilen Basislinie gespült. Andere dem Fachmann bekannte Methoden der Aktivierung und/oder Ligandenkopplung sind ebenso möglich. Beispielsweise kann eine Metallfritte zunächst oxidiert werden und der interessierende Ligand an der Oxidschicht der Metallfritte verankert werden. Ebenso kann die Fritte als Träger einer Umkehrphase dienen und beispielsweise für die Flash-Chromatographie genutzt werden.
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Zur Ermittlung der dynamischen Bindungskapazität DBC10% der wie beschrieben erhaltenen Protein A - Säule wurden jeweils 10 ml einer (Kaninchen-)IgG Probe unterschiedlicher Konzentration (147,9 µg/ml; 434,4 µg/ml und 458,5 µg/ml) in PBS (100 mM Phosphat, 137 mM NaCl; pH 7,4) auf eine VitraPOR 5 Säule (15 mm lang und Innendurchmesser 8 mm) aufgetragen und die Elution des Materials bei 280 nm verfolgt. Nach dem Wiedererreichen der Basislinie wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung, deren pH-Wert mit Phosphorsäure auf pH 2,2 eingestellt worden war, eluiert. Die Absorption des Eluats wurde bei 280 nm gemessen.
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Gemäß der Formel DBC10% = t10% of Amax·Q·c wurde die dynamische Bindungskapazität der monolithischen Protein A Säule ermittelt. Hierbei ist t10% of Amax - diejenige Zeit, bei der 10% der maximalen Absorption erreicht sind; Q - ist die Flußrate (ml/min) und c - die Proteinkonzentration (µg/ml). Aus dem Kurvenverlauf ergibt sich eine mittlere dynamische Bindungskapazität von DBC10%~ 3100 µg IgG.
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5 zeigt eine Kalibrierkurve für Kaninchen-IgG einer monolithischen Protein A Säule (VitraPOR 4). Der lineare Korrelationskoeffizient (R-Quadrat) der Eichgeraden betrug 0,99662.
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6 illustriert die Selektivität der erhaltenen Affinitätssäule für Kaninchen-IgG. Die mit einer Retentionszeit von 0,6 min eluierte Probe entspricht ungebundenem Protein (überwiegend BSA), die bei 4,8 min eluierte Probe ist reines Kaninchen IgG.
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Das Wesen der vorstehend beschriebenen Erfindung kann unter den folgenden Aspekten zusammengefasst werden:
- 1. Poröser Glas-Monolith für die Chromatographie oder Extraktion;
- 2. Anwendung in der Affinitätschromatographie, auch automatisiert;
- 3. Anwendung für die Festphasenextraktion, auch automatisiert;
- 4. Anwendung für die klassische Chromatographie;
- 5. Ggf. kann Glas auch durch andere sinterbare Materialien ersetzt werden, wie Keramiken, Metallgranulate, Kunststoffe oder Metalloxide.
- 6. Trägermaterial für Anwendungen aller Art, z.B. Analyse oder präparative Aufreinigung von Antikörpern und anderen Proteinen.
- 7. Mehrere Säulen (Monolithe) können ggf. gestapelt und/oder miteinander kombiniert werden.
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Wenngleich hierin spezifische Ausführungsformen dargestellt und beschrieben worden sind, liegt es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, die gezeigten Ausführungsformen geeignet zu modifizieren, ohne vom Schutzbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Die nachfolgenden Ansprüche stellen einen ersten, nicht bindenden Versuch dar, die Erfindung allgemein zu definieren.
