CN100529097C - 利用来自酵母的胆固醇酯酶进行的对映纯中间体的酶促合成 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备可用于合成有价值的药学活性化合物、例如MAOB抑制剂的对映纯中间体的方法以及式(I)和(II)的新中间体，其中R21、R22、R23和R24如说明书和权利要求书中所定义。

Description

利用来自酵母的胆固醇酯酶进行的对映纯中间体的酶促合成
本发明涉及一种制备可用于合成有价值的药学活性化合物的对映纯(enantiopure)中间体的方法，并涉及这些新中间体。
如Paytask，Peter L.等(XP002308874)和EP 393607所述，现有技术公开了芳基-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸，但是未公开其酶促制备方法。
另外，WO91/00362公开了利用猪肝胆固醇酯酶进行的4-芳基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酸的光学拆分法，其报道用微生物胆固醇酯酶获得了较差的结果，从而教导人们不采用来自酵母的胆固醇酯酶。
更具体而言，本发明提供了一种制备式I化合物和/或式II化合物的方法，所述的式I化合物是
其中
R21、R22和R23彼此独立地是氢或卤素；且
R24是氢、甲基或卤素；
所述的式II化合物是
Figure C20048003370000052
其中
R1是(C1-C8)-烷基、(C2-C4)-链烯基或式A的基团
R3(OCH2CH2)n-(A)
其中
R3是氢或(C1-C4)-烷基；且
n是1、2或3；
并且R21、R22、R23和R24具有上文所定义的含义，
该方法包括使式III化合物与来自酵母的胆固醇酯酶接触，
Figure C20048003370000071
其中
R1、R21、R22、R23和R24具有上文所定义的含义。
在本文所给出的结构式中，楔形键
Figure C20048003370000072
表示取代基位于纸平面之上。
在本文所给出的结构式中，虚线键
Figure C20048003370000073
表示取代基位于纸平面之下。
本文所用的术语“烷基”表示含有1至8个碳原子的直链或支链的烃残基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、戊基、己基、庚基、辛基，包括它们的各种异构体。优选地，术语“烷基”表示含有1至5个碳原子的直链或支链的烃残基，其可以是未被取代的或者被一个或一个以上取代基取代。取代基的实例包括羟基、(C1-C4)-烷氧基、(C3-C6)-环烷基、芳基和卤素原子。被取代的烷基的实例包括3-羟基丁基、4-甲氧基丁基、3-乙氧基丙基、3-环己基丙基、苄基、2-苯基乙基、2-氟乙基、2-氯乙基、2，2-二氯乙基、3-溴丙基或2，2，2-三氟乙基等。链烯基的实例包括乙烯基、烯丙基、异丙烯基、丁烯基以及丁烯基的异构体，例如1-或2-丁烯基。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
卤素的实例包括氟、氯和溴。
胆固醇酯酶(EC 3.1.1.13)是一族具有广泛特异性的酶，其也被称为胆甾醇酯酶；胆固醇基酯合酶；三萜烯醇(triterpenol)酯酶；胆固醇基酯酶；胆固醇基酯水解酶；固醇酯水解酶或胆固醇酯水解酶。它们属于还包括酯酶、蛋白酶和脂肪酶的水解酶族。
来自酵母的胆固醇酯酶的实例包括来自假丝酵母属(Candida)、例如来自柱状假丝酵母(Candida cylindracea)的胆固醇酯酶。例如，胆固醇酯酶可以通过对可商购获得的Lipase MY(Meito Sangyo，日本)(其是由柱状假丝酵母获得的)进行纯化来获得。该纯化可以是部分纯化。可商购获得的来自酵母的胆固醇酯酶的实例有Roche Applied Science，Industrial Products，Enzyme Projects，Sandhofer Str.116，D-68305 Mannheim，德国提供的订货号为例如10129046103(固体制剂)、0393916或0396800(液体制剂)的来自柱状假丝酵母的胆固醇酯酶。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了这样一种方法，其中来自酵母的胆固醇酯酶是柱状假丝酵母的胆固醇酯酶。
来自酵母的胆固醇酯酶可以以可溶性形式或者以被固定的形式被使用。如何固定酶的各种选择是本领域技术人员已知的。
酶促反应可以在水性系统或在水性-有机系统中进行。
底物、即式III化合物可以例如以混悬液形式被应用。其浓度可以为0.5-20％总浓度(w/w)，或者2-10％。式III化合物可以根据已知方法用任选地被取代的氨基苯酚由衣康酸来制备。
在一个实施方案中，本发明提供了这样一种方法，其中在式III中，R21、R22、R23和R24彼此独立地是氢或氟。在另一个实施方案中，本发明提供了这样一种方法，其中在式IH中，R21、R22、R23和R24是氢。在另一个实施方案中，本发明提供了这样一种方法，其中在式III中，R1是甲基或乙基。
在一个实施方案中，本发明提供了一种制备(S)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸和(R)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸酯的方法，其包括使(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸酯与来自酵母的胆固醇酯酶接触。
可以使用已知可用于生物化学转化的常见缓冲液如磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液等。缓冲液浓度可以为不超过1M，或者为约3mM至约250mM。
所述酶促反应可以在存在有机助溶剂(co-solvent)的情况下进行。所述有机助溶剂可以是水可混溶性的或水不可混溶性的助溶剂。当存在水可混溶性有机助溶剂时，其总浓度可以为不超过30％或不超过25％。水不可混溶性有机助溶剂可以以任何比例、以总浓度被使用。
有机助溶剂的实例包括技术上常见的溶剂如醚类(例如四氢呋喃、二噁烷或叔丁基甲基醚(TBME))、低级醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇)、酯类(例如乙酸乙酯)、极性非质子溶剂(例如二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺或丙酮)和链烷烃(例如庚烷)或环烷烃(例如环己烷或甲基环己烷)。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了这样一种方法，其中酶促反应在存在有机助溶剂的情况下进行，所述的有机助溶剂选自水不可混溶性助溶剂，例如TBME、庚烷；环己烷和甲基环己烷。在另一个实施方案中，本发明提供了这样一种方法，其中酶促反应在存在环己烷或甲基环己烷的情况下进行。
所述酶促反应可以在存在水溶性添加剂的情况下进行，例如在存在盐、多元醇、聚乙二醇或其衍生物的情况下进行。添加剂可对酶具有活化、选择性触发或稳定作用。
盐的实例包括氯化钠或氯化钾，也可以是其它添加剂例如LiSCN、Na2SO4和Mg2SO4。特别地，水性缓冲液可含有已知是酶活化剂的镁离子。盐可以以不超过1M或不超过0.5M的浓度存在。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了这样一种方法，其中酶促反应在存在镁盐的情况下进行。
多元醇的实例包括甘油和糖。多元醇可以以不超过水相40％(w/v)的浓度存在。
任选地为单-或二甲基醚形式的聚乙二醇(PEG)可以以不超过50％(w/v)或以5％至25％的浓度被使用。例如，可以使用任选地为单-或二甲基醚形式的4kD至6kD的聚乙二醇。
在加入酶后，可以将反应混合物的pH维持在所选择的pH-值下，例如所述酶促反应可以在pH 3.5至pH 10.0或pH 4.0至pH 8.0或pH 5.5至pH 7.0的pH下进行。用本领域技术人员已知的方法维持恒定的pH值，例如控制性地加入碱例如氢氧化钠或氢氧化钾或碳酸氢钠或碳酸氢钾的水溶液或者选择具有足够缓冲容量的缓冲液。
所述酶促反应可以在4℃至45℃的温度下或在15℃至35℃的温度下或在26℃至32℃的温度下进行。
反应终止后，可以通过萃取将式I化合物和式II化合物分离出来。
例如，可以通过用适宜的有机溶剂例如二氯甲烷萃取反应混合物来对式II化合物进行常规后处理。将溶液浓缩后，式II化合物可析出结晶，从而可以容易地增加其光学纯度。
残留在水相中的对映体形式的(antipodal)式I化合物可以通过随后在更低pH值下对水相进行萃取来分离。这通常可以通过对保留的水相进行酸化和将所形成的沉淀滤出或者通过用适宜的有机溶剂例如乙酸乙酯进行萃取来实现。将溶液浓缩后，式I化合物可析出结晶，从而可以增加其光学纯度。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种制备式I化合物和/或式II化合物的方法，其包括
(a)使式III化合物与来自酵母的胆固醇酯酶接触，和
(b)通过在不同pH下进行萃取分离所得的式I化合物和所得的式II化合物。
如果水溶性添加剂与式I或式II的化合物一起被共萃取出来，则可能需要进行另外的萃取步骤以将各反应产物与添加剂分离开。或者，可以使用吸附树脂或离子交换树脂。对所用特定萃取方案进行选择在本领域技术人员的技能范围内并且取决于添加剂、例如PEG添加剂的具体性质。例如，可以通过用例如二氯甲烷进行萃取(通过与保留的式II化合物一起共萃取)将聚乙烯与式I化合物分离开，随后可以用乙酸乙酯通过溶剂改变或通过研磨/消化(聚乙烯在这些条件下不溶)将聚乙烯与保留的式II化合物的级分分离开。
可以将由本发明的方法获得的化合物、即式I化合物和式II化合物在羧酸或酯官能度上进行本领域技术人员已知的衍生化反应，生成例如化合物如甲酰胺、N-取代的甲酰胺、N，N-二取代的甲酰胺、甲脒、N-羟基-甲脒、羧酸羟酰胺、羧酸酰肼、腈、醛、酮、异氰酸酯、异硫氰酸酯、氨基甲酸酯、脲、N-取代的脲、N，N-二取代的脲、伯，仲和叔胺、N-酰胺、胍、氨基甲基-、羟基甲基衍生物以及酯衍生物。
这类化合物的实例包括式IVa或式IVb化合物
其中R21、R22、R23和R24具有式I、II和III中所定义的含义，并且
R是CN、CHO、CH2R4、C(O)R5、C(O)NHR6、C(NH)NH2、NHR7或C(O)OR8；
R4是OH或NH2；
R5是(C1-C6)-烷基；
R6是H、OH、NH2或(C1-C6)-烷基；
R7是H或C(NH)NH2；且
R8是(C1-C6)-烷基。
式IVa和IVb的化合物是新化合物并且也形成了本发明的实施方案。
为了使两种对映体中的一种重结晶，可以用碱例如醇化物或1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)进行式II化合物的外消旋化，和在酯化后，进行式I化合物的外消旋化。
由本发明的方法获得的化合物、即式I化合物和式II化合物以及式IVa和IVb的化合物是有价值的构造块，可用于合成化学、农业学和药学工业中有用的产品，例如可用于合成药学活性化合物，例如可用于治疗疾病如帕金森病、阿尔茨海默病或其它中枢神经系统疾病的单胺氧化酶抑制剂。
例如，可以使(S)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸与醇、优选甲醇或乙醇进行反应，从而在酸催化下得到相应的(S)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸酯。该酯可以用未被取代的或被取代的选自苄基卤化物的苄基衍生物、甲苯磺酸酯、甲烷磺酸酯(甲磺酸酯)或三氟甲烷磺酸酯(三氟甲磺酸酯)通过Williamson-醚合成而被烷基化。所用的碱可以是碳酸盐，如碳酸钠、碳酸钾或碳酸铯。溶剂的实例有低级酮如丙酮或2-丁酮。该反应可以在20℃至回流温度下进行。另一种供选择的烷基化方法是Mitsunobu-偶联：使任选地被取代的苄型醇与苯酚在惰性溶剂例如乙醚或四氢呋喃中、使用偶氮二甲酸二烷基酯、在存在膦类例如三丁基-或三苯基-膦的情况下进行反应。酯官能团的水解可以用本身已知的方法进行，如在酸性条件下水解，例如在使用盐酸的酸性条件下水解，或在碱性条件下水解，例如使用氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾水解，用醇和水的混合物作为溶剂。然后，可以将所得的酸经由形成相应的异氰酸酯来进行从碳原子到氮原子的亲核迁移，如例如通过Hofmann或Curtius重排来进行迁移。随后用水性酸处理该异氰酸酯，直接得到相应的胺。用适宜的醇处理该异氰酸酯中间体，得到氨基甲酸酯形式的被保护的氨基衍生物。对于该异氰酸酯的处理，选择可产生用作胺保护基的典型氨基甲酸酯的醇，所述的胺保护基例如叔丁氧基羰基、苄氧基羰基或芴基甲氧基羰基。用于裂解成胺的方法在文献中是众所周知的。可以用标准操作方法进一步转化成N-酰胺，如例如通过与活化的酰基衍生物、例如酰卤或酸酐进行反应或者通过使用例如碳二亚胺作为缩合剂的酸的缩合反应来进行转化，从而得到化合物如(S)-N-{1-[4-(3-氟-苄基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-基}-乙酰胺(实施例10)。
可以将(R)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸酯通过上文所述的Williamson-醚合成或Mitsunobu-偶联用未被取代的或被取代的苄基衍生物进行烷基化。酯官能团的水解可以用本身已知的方法进行，如在酸性条件下水解，例如在使用盐酸的酸性条件下水解，或在碱性条件下水解，例如使用氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾水解，用醇和水的混合物作为溶剂。然后，可以用标准操作方法将所得的酸转化成相应的酰胺。对于与伯胺或仲胺的反应而言，可以使用缩合试剂，如碳二亚胺例如二环己基碳二亚胺或苯并三唑衍生物例如O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU)，从而得到化合物如(R)-1-[4-(4-氟-苄基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲基酰胺(实施例9)。
在实施例中，使用了以下缩写：ISN-MS：离子喷雾负质谱；EI-MS：电子碰撞质谱；NMR：核磁共振光谱；IR：红外光谱；HPLC：高效液相色谱法；min：分钟；RT：室温；HBTU：O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐；TBME：叔丁基甲基醚；HV：高真空
实施例1：(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯的制备
a)将2.355mol 4-氨基苯酚和2.32mol衣康酸的混合物逐渐加热：在60℃下，该粉末开始变粘，在110-120℃下，其变成液体并且颜色变成深棕色，同时剩余的固体物质也溶解。在沸腾下开始该放热反应并且温度升至150℃。在1-2小时内将沙质产物放置冷却至RT。将所得的粗品(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸不经进一步纯化或表征直接用于下一步。
b)将粗品(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸溶解于5000ml甲醇、24ml浓硫酸和400ml 2，2-二甲氧基丙烷的混合物中并将其在回流下搅拌2小时。通过蒸馏使反应溶液的体积降至一半，然后将其转移到一个20L的容器中。在40℃下进行搅拌的同时，加入2500ml水/冰(1∶1)混合物。立即开始结晶，然后，在过滤漏斗上收集细小的白色结晶。共计用2000ml冷水对其进行洗涤直至滤液为中性。将该产物减压干燥，得到980g(理论值的84％，2步)(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯，为白色固体；MS：m/e＝234(M+H)+。
用与实施例1b)中所述方法相似的方式，通过使粗品(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸与乙醇反应，得到(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸乙酯，为白色固体；MS：m/e＝248(M-H)+。
实施例2：(R)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯和(S)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸的制备
a)在适度搅拌下，将213.5mmol(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯(98％HPLC)混悬于500ml环己烷中。加入2.0L 3mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0，含有0.1M氯化钠和50mM硫酸镁)，将所得的乳液/混悬液重新调节至pH 6.0并将温度设定为30℃。通过加入201mg来自柱状假丝酵母的胆固醇酯酶(Roche Applied Science，Industrial Products，EnzymeProjects，Sandhofer Str.116，D-68305 Mannheim，德国，订货号为10129046103，下文被称为：酶)来开始水解并通过在适度搅拌下控制性加入0.1N NaOH溶液(pH-恒定)而将pH恒定保持在6.0。在共消耗1016ml滴定剂(一整夜；转化率为48.6％)后，用3.5L和2×2.5L二氯甲烷(开始时为浑浊相)、然后用3.5L乙酸乙酯(被弃去的有机相)萃取反应混合物。将合并的二氯甲烷相用硫酸钠干燥、蒸发并在HV下干燥，得到22.5g(95.6mmol；44.8％)(R)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯，为白色晶体。分析：HPLC：＞99％。对映体过量：96.3％(Chiralpak AD，250×4.6mm；70％己烷+10％0.1％TFA的己烷溶液+20％乙醇；1ml/min；DAD：sig＝210.8nm，ref＝360.1nm；应用的样品：0.5μl 2mg/ml 1％TFA的EtOH溶液)。[δ]D＝-27.7°(c＝1.02；EtOH)。EI-MS：m/e＝235.1(M；67)，122.0(100)。1H-NMR(400MHz；CDCl3)：2.89(ddd，2H，-CHaHb-)，3.37(m，1H，-CHCOO)，3.78(s，3H，COOCH3)，4.03(ddd，2H，C(O)NCHaHb)，6.08(s，1H，Ph-OH)，6.77，7.30(AA’XX’，2x2H，C6H4)。
b)用32％盐酸将二氯甲烷和乙酸乙酯萃取后剩余的水层的pH设定为2.2，用3×3.5L乙酸乙酯进行萃取。将合并的有机层用硫酸钠干燥、蒸发并在HV下干燥，得到21.9g(99.0mmol；46.4％)(S)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸，为白色固体。分析：HPLC：＞99％。对映体过量：99.1％(方法见上)。[δ]D＝25.4°(c＝1.05；EtOH)。EI-MS：m/e＝221.1(M；57)，122.0(100)。1H-NMR(400MHz；MeOD)：2.83(dd，2H，-CHaHb-)，3.39(m，1H，-CHCOO)，4.05(ddd，2H，C(O)NCHaHb)，6.79，7.31(AA’XX’，2x2H，C6H4)。
实施例3：在存在各种有机助溶剂的情况下进行的对映选择性水解
a)在搅拌下，向2.13mmol(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯(98％)在5ml TBME中的混悬液中加入2ml 50mM硫酸镁和20ml 3mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0，含有0.1M氯化钠和0.02％叠氮化钠)。通过加入10mg酶来开始反应并通过控制性加入0.1N NaOH而将pH维持在6.0。在消耗10.4ml(转化率49.9％；45小时)后，用3×50ml二氯甲烷萃取反应混合物，将合并的有机相蒸发并进行对映体过量测定。将水性酸化至pH 2，用3×50ml乙酸乙酯萃取，将合并的有机相蒸发并进行对映体过量(ee)-测定。b)在适度搅拌下，向4.25mmol(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯(含有大约2％各外消旋酸)在10ml有机溶剂(见下表)中的混悬液中加入39ml 3mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0，含有50mM氯化镁和0.1M氯化钠)并将其温度设定为28℃。通过加入6.5mg溶解于1.0ml去离子水中的酶来开始反应并通过控制性加入0.1N NaOH来将其pH维持在6.0。在大约50％转化后，与实施例3a相似地对反应混合物进行后处理。
表：在存在各种有机助溶剂的情况下进行的对映选择性水解
  溶剂  转化率<sup>a</sup>(％)   时间(小时)  酸的％ee<sup>b</sup>  酯的％ee<sup>b</sup>
  TBME  49.9   45  99.4  98.7
  环己烷  48.4   12  96.6  98.5
  甲基环己烷  48.4   12  97.1  99.0
a：根据所消耗的滴定剂的量获得(相对于100％纯物质计算得到)
b：其测定如实施例2所述
实施例4：在存在各种添加剂的情况下进行的对映选择性水解
在适度搅拌下，向4.25mmol(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯(含有大约2％各外消旋酸)在10ml环己烷中的混悬液中加入添加剂(见下表)在3mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0，含有50mM氯化镁和0.1M氯化钠)(下表给出的量)中的溶液，并将温度设定为28℃。通过加入6.5mg溶解于1.0ml去离子水中的酶来开始反应并通过控制性加入0.1N NaOH而将pH维持在6.0。在大约50％转化后，与实施例3a)相似地对反应混合物进行后处理。
表：在存在各种添加剂的情况下进行的对映选择性水解
  添加剂(量)  缓冲液(ml)  转化率<sup>a</sup>(％)   时间(小时)  酸的％ee<sup>b</sup>  酯的％ee<sup>b</sup>
  D-葡萄糖(2.0g)  39  48.4   10  91.1  98.5
  蔗糖(2.0g)  39  47.4   14  96.0  98.3
  蔗糖(8.0.g)  39  48.0   14  96.2  98.5
  聚乙二醇200(2ml)  36  50.6   7  94.2  98.9
  聚乙二醇200(8ml)  31  48.1   12  98.0  99.5
a：根据所消耗的滴定剂的量获得(相对于100％纯物质计算得到)
b：其测定如实施例2所述
实施例5：在存在各种盐添加剂的情况下进行的对映选择性水解
在适度搅拌下，向4.25mmol(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯(含有大约2％各外消旋酸)在10ml环己烷中的混悬液中分别加入39ml 3mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0，含有一种或两种中性盐)(见下表)并将温度设定为28℃。通过加入6.5mg溶解于1.0ml去离子水中的酶来开始反应并通过控制性加入0.1N NaOH而将pH维持在6.0。在大约50％转化后，与实施例3a)相似地对反应混合物进行后处理。
表：在存在各种盐添加剂的情况下进行的对映选择性水解
  添加的盐组分  转化率<sup>a</sup>(％)   时间(小时)   酸的％ee<sup>b</sup>   酯的％ee<sup>b</sup>
  50mM MgCl<sub>2</sub>，0.1M NaCl  48.4   12   96.6   98.5
  50mM MgCl<sub>2</sub>  49.0   10   96.1   98.6
  100mM MgSO<sub>4</sub>  47.9   9   94.5   97.6
a：根据所消耗的滴定剂的量获得(相对于100％纯物质计算得到)
b：其测定如实施例2所述
实施例6：在各种条件下进行的对映选择性水解
在适度搅拌下，向(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯(其量见下表；含有大约2％各外消旋酸)在有机溶剂(见下表)中的混悬液中加入含有添加剂(见下表)的缓冲水溶液，将温度设定为28℃。通过加入溶解于1.0ml去离子水中的酶(其量见下表)来开始反应并通过控制性加入0.1NNaOH而将pH维持在6.0。在大约50％转化后，与实施例3a)相似地对反应混合物进行后处理。
表：在各种条件下进行的对映选择性水解
  底物(g)   酶(mg)   溶剂   缓冲液   添加剂  转化率<sup>a</sup>(％)   时间(小时)   酸的％ee<sup>b</sup>   酯的％ee<sup>b</sup>
  2.0   6.5   CH   PPB<sup>1</sup>   PG(8ml)   47.6<sup>c</sup>   44   96.8   97.8
  2.5   6.5   CH   PPB<sup>2</sup>   PG(8ml)   49.6   31   94.0   96.5
  2.0   13   CH   MgAc<sub>2</sub>(23ml)   PG(16ml)   51.2   40   94.4   ＞99
  2.0   6.5   MCH   MgAc<sub>2</sub>(35ml)   PG(4ml)   约50   51   94.0   97.4
  4.0   10   MCH   MgAc<sub>2</sub>(23ml)   PG(16ml)   48.1   118   93.1   97.2
  2.0   13   MCH   MgAc<sub>2</sub>(31ml)   PGM(8g)   49.5   23   94.1   93.6
  2.5   8.3   MCH   MgAc<sub>2</sub>(35ml)   PGM(4g)   46.3   20   95.2   94.1
  2.5   8.3   MCH   MgAc<sub>2</sub>(37ml)   PGM(2g)   47.1   15   94.7   94.8
  3.0   10   MCH   MgAc<sub>2</sub>(37ml)   PGM(2g)   46.9   28   95.7   94.6
a：根据所消耗的滴定剂的量获得(相对于100％纯物质计算得到)
b：其测定如实施例2所述
c：用0.1N NaOH溶液作为滴定剂
所用的缩写：CH：环己烷(10ml)；MCH：甲基环己烷(10ml)；PPB1：50mMMgCl2，0.1M NaCl，pH 6.0的3mM磷酸钾缓冲液(31ml)；PPB2：100mMMgCl2，0.1M NaCl，pH 6.0的3mM磷酸钾缓冲液(31ml)；MgAc2：100mM二醋酸镁pH 6.0；PG：聚乙二醇200；PGM：聚乙二醇5000单甲醚
实施例7：用不同酯进行的对映选择性水解
在适度搅拌下，向4.01mmol(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸乙酯在10ml环己烷中的混悬液中加入39ml 3mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0，含有50mM氯化镁)并将温度设定为28℃。通过加入6.5mg溶解于1.0ml去离子水中的酶来开始反应并通过控制性加入0.1N NaOH而将pH维持在6.0。反应完全后，与实施例3a)相似地对反应混合物进行后处理。
表：用不同酯进行的对映选择性水解
  酯  转化率<sup>a</sup>(％)   时间(小时)  酸的％ee<sup>b</sup>  酯的％ee<sup>b</sup>
  乙酯  50.2   5.1  97.8  97.0
a：根据所消耗的滴定剂的量获得(相对于100％纯物质计算得到)
b：其测定如实施例2所述
实施例8：(R)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯和(S)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸的制备
a)(R)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯的制备：在适度搅拌下，将106.3mmol(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯(98.2％HPLC；含有0.2％外消旋酸)混悬于100ml甲基环己烷中。将20.00g聚乙二醇单甲醚5000溶解于380ml pH 6.0的0.1M醋酸镁中(搅拌0.5小时；体积为大约398ml)，将该溶液倒入上述混悬液。将所得的乳液/混悬液重新调至pH 6.0并将温度设定为28℃。通过加入83mg酶来开始反应并通过在适度搅拌下控制性加入1.0N NaOH-溶液(pH-恒定)而将pH恒定保持在6.0。17.2小时和共消耗49.64ml滴定剂(转化率47.5％)后，通过加入500ml二氯甲烷来终止反应。用4×500ml二氯甲烷(开始时为浑浊相)、随后用500ml乙酸乙酯(被弃去的有机相)萃取反应混合物。将合并的二氯甲烷相用硫酸钠干燥并进行蒸发。将残余物在400ml乙酸乙酯中研磨一整夜以除去不溶性PEG。将混悬液过滤，蒸发滤液，将残余物用二氯甲烷重结晶，得到11.27g(47.9mmol；45.1％)(R)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯，为白色晶体。分析：HPLC：99.4％(A226nm)。对映体过量：97.8％(方法见实施例2)。[δ]D＝-29.1°(c＝1.04；EtOH)。ISN-MS：m/e＝294.2(M+OAc；70)，234.0(M-H；100)。IR(Nujol)：3292，2923，2854，1742，1662，1615，1269，1221，1029，832cm-1。1H-NMR(400MHz；CDCl3)：2.89(ddd，2H，-CHaHb-)，3.48(m，1H，-CHCOO)，3.78(s，3H，COOCH3)，4.03(ddd，2H，C(O)NCHaHb)，5.59(s，1H，Ph-OH)，6.78，7.33(AA’XX’，2x2H，C6H4)
b)(S)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸的制备：用25％硫酸将水相的pH调至2.0并用4×500ml乙酸乙酯对其进行萃取。将合并的有机相用硫酸钠干燥、蒸发，将残余物用TBME重结晶，得到10.49g(47.4mmol；44.6％)(S)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸，为白色固体。分析：HPLC：99.9％(A226nm)。对映体过量：98.2％(方法见上；保留时间：(R)-酸：12.44min，(S)-酸：16.25min)。[δ]D＝+25.0°(c＝1.01；EtOH)。ISN-MS：m/e＝220.1(M-H；100)。IR(Nujol)：3419，2925，2854，2600，1702，1628，1613，1519，1277，1211，1130，837cm-1。1H-NMR(400MHz；DMSO)：2.67(ddd，2H，-CHaHb-)，3.31(m，1H，-CHCOO)，3.92(ddd，2H，C(O)NCHaHb)，6.74，7.38(AA’XX’，2x2H，C6H4)。NMR表明该产物含有约2％PEG。
实施例9：(R)-1-[4-(4-氟-苄基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲基酰胺的制备
a)在0℃下，将4.3mmol 4-氟-苄醇和4.7mmol三苯膦在7ml四氢呋喃中的溶液滴加到4.7mmol(R)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯[实施例2a)或8a)]和4.7mmol偶氮二甲酸二异丙酯在11ml四氢呋喃中的溶液中。使该混合物升温至RT并将其继续搅拌18小时。加入2g硅胶后，将反应混合物减压蒸发。将所得物质在硅胶上进行色谱处理，首先用庚烷和乙酸乙酯的2∶1混合物、然后用庚烷和乙酸乙酯的1∶1混合物作为洗脱剂，得到(R)-1-[4-(4-氟-苄基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯，为白色固体；MS：m/e＝344(M+H)+。
b)将3.7mmol(R)-1-[4-(4-氟-苄基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯在77ml二噁烷中的溶液用8.64ml盐酸(37％)处理。将该混合物在封闭的烧瓶中于52℃下加热18小时。将该溶液减压蒸发，得到微黄色固体形式的粗品酸。将粗品酸在-5℃下用10ml乙酸乙酯研磨。在过滤漏斗上收集固体，然后将其在高真空下干燥，得到(R)-1-[4-(4-氟-苄氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸，为白色固体；MS：m/e＝330(M+H)+。
c)将被冷却至0℃的1.82mmol(R)-1-[4-(4-氟-苄基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸在37ml N，N-二甲基甲酰胺中的溶液连续用2.0mmol三乙胺、1.82mmol HBTU、2.2mmol盐酸甲胺和2.0mmol三乙胺进行处理。除去冰浴，继续在RT下进行搅拌。30min后停止反应，将该橙色的溶液减压蒸发。将所得的残余物用1ml乙酸乙酯研磨，滤出白色固体产物，其后将其溶解于二氯甲烷中并将溶液用水洗涤三次。将有机相用硫酸钠干燥，然后减压蒸发，得到409mg(理论值的66％)(R)-1-[4-(4-氟-苄基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲基酰胺，为白色固体。MS：m/e＝343(M+H)+；对映体过量＞99.5％。
实施例10：(S)-N-{1-[4-(3-氟-苄基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-基}-乙酰胺的制备
a)在氮气气氛、0℃下，将110.6mmol 3-氟-苄醇和108.8mmol三苯膦在150ml四氢呋喃中的溶液在50min内滴加到100.5mmol(S)-1-(4-羟基-苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯和100.5mmol偶氮二甲酸二异丙酯在200ml四氢呋喃中的溶液中。使该混合物升温至RT，继续搅拌18小时。将该混合物减压蒸发。将固体残余物在400ml乙醚中研磨，得到主要由产物和氧化三苯膦组成的白色固体。过滤后，将固体物质用100ml冷甲醇研磨，得到白色固体形式的(S)-1-[4-(3-氟-苄基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯[MS：m/e＝344(M+H)+]以及痕量的三苯膦和氢化偶氮二甲酸二异丙酯(diisopropyl hydrazodicarboxylate)。
b)将74.6mmol(S)-1-[4-(3-氟-苄基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯在650ml二噁烷中的溶液用175ml盐酸(37％)处理。将该混合物在封闭的烧瓶中于50℃下加热18小时。将该溶液减压蒸发，得到黄色固体形式的粗品。将粗品酸在0℃下用50ml乙酸乙酯进行研磨。在过滤漏斗上收集固体，然后在高真空下干燥，得到(S)-1-[4-(3-氟-苄基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸，为微黄色固体；MS：m/e＝330(M+H)+。
c)将61mmol(S)-1-[4-(3-氟-苄基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸在300ml二噁烷中的溶液用61mmol N-甲基吗啉处理。其后，将该反应混合物冷却至-8℃并加入61mmol氯甲酸异丁酯。搅拌5min后，加入121mmol叠氮化钠在40ml水中的溶液，同时使温度升至0℃。在0℃下搅拌70min后，将混悬液用
Figure C20048003370000211
过滤。将滤液用700ml甲苯稀释并转移到一个分液漏斗中。分离出有机层，然后用250ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次，用200ml饱和氯化钠溶液洗涤两次。其后，将有机层用硫酸钠干燥，加入400ml甲苯后，蒸发掉溶剂和残余的异丁醇，最后至约350ml的体积。将该溶液逐渐加热至80℃并将其在该温度下保持70min。冷却后，将异氰酸酯中间体的溶液浓缩至约300ml并将其滴加到25.4ml盐酸(37％)在100ml二噁烷中的溶液中，同时加热至45℃。最后，在完全加入后，使温度升高至60℃达1小时，盐酸盐已经开始沉淀。将该混合物冷却至0℃并在过滤漏斗上收集所形成的固体物质。用叔丁基甲基醚洗涤后，将产物在高真空下干燥。得到盐酸(S)-4-氨基-1-[4-(3-氟-苄基氧基)-苯基]-吡咯烷-2-酮，为白色固体。MS：m/e＝301(M+H)+。
d)将11.3mmol盐酸(S)-4-氨基-1-[4-(3-氟-苄基氧基)-苯基]-吡咯烷-2-酮在86ml二氯甲烷中的混悬液用23.8mmol三乙胺进行处理并冷却至0℃。向该溶液中加入12.5mmol乙酰氯并在0℃下继续搅拌15min。关于后处理，将反应混合物用100ml水萃取两次。将有机层分离出来，用硫酸钠干燥并减压蒸发。将粗产物在100ml甲苯中进行研磨，然后在过滤漏斗上收集固体。在第二步中，将产物在200ml叔丁基甲基醚中于RT下进行研磨。再次在过滤漏斗上收集固体产物并将其在高真空下干燥。得到(S)-N-{1-[4-(3-氟-苄基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-基}-乙酰胺，为白色固体。MS：m/e＝343(M+H)+；对映体过量：＞99.5％。
实施例11：(S)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸的制备
在搅拌下，将8.00g聚乙二醇6000溶解于150mL pH 6.0的100mM醋酸镁缓冲液中，将该溶液加入到进行着搅拌的10.00g(42.51mmol)(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯(99.7％)在40mL甲基环己烷中的混悬液中。将该混合物加热至28℃并用2M NaOH将pH重新调节至6.0。通过加入33.2mg柱状假丝酵母胆固醇酯酶(16.88kU/g)来开始反应并通过在搅拌下控制性加入1.0M NaOH溶液而将pH维持在6.0。在共计消耗20.35mL(20.35mmol)1.0M氢氧化钠溶液后(17.1小时后；转化率47.9％)，用垂熔玻璃漏斗对反应混合物进行过滤。滤液自动分离成水相和有机相。将水相用2×200ml乙酸乙酯洗涤以除去未裂解的酯。用25％的硫酸将水相的pH调至4.0并将其真空浓缩至约80ml的体积(浴温为60℃)。将该溶液冷却至1℃(形成白色沉淀/晶体)，用25％的硫酸将pH调至1.5。将沉淀/晶体在1℃下搅拌一整夜，用玻璃垂熔漏斗滤出(用最少量的水洗涤)并在高真空下干燥一整夜(RT，6×10-2mbar)，得到4.32g(19.53mmol；45.9％)(S)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸。分析：HPLC(A226nm面积)：99.3％，0.7％酯。98.9％ee。该产物含有5.3％水(根据Karl Fischer测定法测得)和2.1％(w/w)PEG(根据NMR测得)。

Claims (25)

1.一种制备式I化合物和/或式II化合物的方法，
所述的式I化合物是
Figure C2004800337000002C1
其中
R21、R22和R23彼此独立地是氢或卤素；且
R24是氢、甲基或卤素；
所述的式II化合物是
Figure C2004800337000002C2
其中
R1是C1-C8-烷基；
并且R21、R22、R23和R24具有上文所定义的含义，
该方法包括使式III化合物与来自酵母的胆固醇酯酶接触，
Figure C2004800337000002C3
其中
R1、R21、R22、R23和R24具有上文所定义的含义。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的来自酵母的胆固醇酯酶是来自柱状假丝酵母(Candida cylindracea)的胆固醇酯酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的来自酵母的胆固醇酯酶是由Roche Applied Science，Industrial Products，Enzyme Projects，Sandhofer Str.116，D-68305 Mannheim，德国提供的、订货号为10129046103、0393916或0396800的可商购获得的胆固醇酯酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中式III化合物以0.5至20％总浓度w/w的浓度被应用。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在式III中，R21、R22、R23和R24彼此独立地是氢或氟。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在式III中，R21、R22、R23和R24是氢。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在式III中，R1是甲基或乙基。
8.一种制备(S)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸和(R)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸酯的方法，其包括使(RS)-1-(4-羟基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸酯与来自酵母的胆固醇酯酶接触。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应在存在3mM至1M的缓冲液的情况下进行。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的缓冲液是磷酸钾缓冲液或二醋酸镁。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应在存在有机助溶剂的情况下进行。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的助溶剂是叔丁基甲基醚、环己烷或甲基环己烷。
13.根据权利要求1所述的方法，该方法在存在添加剂的情况下进行，所述添加剂选自镁盐、多元醇和聚乙二醇。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述的聚乙二醇是单-或二甲基醚形式的聚乙二醇。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述的盐以不超过1M的浓度存在。
16.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述的多元醇以不超过水相40％w/v的浓度存在。
17.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述的聚乙二醇选自分子量为4kD至6kD的聚乙二醇。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的聚乙二醇是单-或二甲基醚形式的聚乙二醇。
19.根据权利要求13或14所述的方法，其中聚乙二醇的浓度为不超过50％v/v。
20.根据权利要求1所述的方法，其中反应是在pH 3.5至pH 10的pH下进行的。
21.根据权利要求1所述的方法，其中反应是在4℃至45℃的温度下进行的。
22.一种制备权利要求1中的式I化合物和/或权利要求1中的式II化合物的方法，其包括
(a)使权利要求1中的式III化合物与来自酵母的胆固醇酯酶接触，和
(b)通过在不同pH下进行萃取分离所得的式I化合物和式II化合物。
23.权利要求1中的式I化合物。
24.权利要求1中的式II化合物。
25.式IVa或式IVb的化合物，
Figure C2004800337000004C1
其中R21、R22、R23和R24具有权利要求1中的式I、II和III中所定义的含义，并且
R是C(O)NHR6或C(O)OR8；
R4是OH或NH2；
R5是C1-C6-烷基；
R6是H、OH、NH2或C1-C6-烷基；
R7是H或C(NH)NH2；且
R8是C1-C6-烷基。
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