KR100870784B1 - 효모로부터 유래한 콜레스테롤에스터라제에 의한엔안티오퓨어 중간체의 효소적 합성 - Google Patents

효모로부터 유래한 콜레스테롤에스터라제에 의한엔안티오퓨어 중간체의 효소적 합성 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유용한 약학 활성 화합물, 예를 들어 MAOB 저해제의 합성에 유용한 엔안티오퓨어 중간체의 제조방법 및 하기 화학식 I 및 II의 신규한 중간체에 관한 것이다:
화학식 I
Figure 112006018559963-pct00018
화학식 II
Figure 112006018559963-pct00019
상기 식에서,
R21, R22, R23 및 R24는 명세서 및 청구의 범위에서 정의된 바와 같다.

Description

효모로부터 유래한 콜레스테롤에스터라제에 의한 엔안티오퓨어 중간체의 효소적 합성{ENZYMATIC SYNTHESIS OF ENANTIOPURE INTERMEDIATES BY MEANS OF CHOLESTEROLESTERASE FROM YEASTS}
본 발명은 유용한 약학 활성 화합물의 합성에서 유용한 엔안티오퓨어(enantiopure) 중간체의 제조방법 및 신규한 중간체에 관한 것이다.
보다 구체적으로 본 발명은 하기 화학식 III의 화합물을 효모로부터 유래하는 콜레스터라제와 접촉시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 I의 화합물 및/또는 하기 화학식 II의 화합물의 제조방법을 제공한다:
Figure 112006018559963-pct00001
[상기 식에서,
R21, R22 및 R23은 서로 독립적으로 수소 또는 할로겐이고;
R24는 수소, 메틸 또는 할로겐이다]
Figure 112006018559963-pct00002
[상기 식에서,
R1은 (C1-C8)-알킬, (C2-C4)-알케닐 또는 하기 화학식 A의 기이고
R21, R22, R23 및 R24는 상기에서 정의된 바와 같은 의미를 갖는다]
R3(OCH2CH2)n-
[상기 식에서,
R3은 수소 또는 (C1-C4)-알킬이고;
n은 1, 2 또는 3이다]
Figure 112006018559963-pct00003
[상기 식에서,
R1, R21, R22, R23 및 R24는 상기에서 정의된 바와 같은 의미를 갖는다]
본원에서 제시된 구조 화학식에서, 쐐기모양의 결합(
Figure 112006018559963-pct00004
)은 치환체가 지면의 위쪽인 것을 나타낸다.
본원에서 제시된 구조 화학식에서, 점선 결합(
Figure 112006018559963-pct00005
)은 치환체가 지면의 아래쪽인 것을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "알킬"은 탄소원자 1 내지 8을 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기를 나타내고, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, 아이소-뷰틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸 및 이들의 상이한 이성질체를 포함한다. 바람직하게, 용어 "알킬"은 비치환되거나 또는 하나 이상의 치환체에 의해 치환될 수 있는 탄소원자수 1 내지 5를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기를 나타낸다. 치환체의 예로는 하이드록시, (C1-C4)-알콕시, (C3-C6)-사이클로알킬, 아릴 및 할로겐 원자를 포함한다. 치환된 알킬의 예로는 3-하이드록시뷰틸, 4-메톡시뷰틸, 3-에톡시프로필, 3-시아노헥실프로필, 벤질, 2-페닐에틸, 2-플루오로에틸, 2-클로로에틸, 2,2-다이클로로에틸, 3-브로모프로필 또는 2,2,2-트라이플루오로에틸 등을 포함한다. 알케닐의 예로는 비닐, 알릴, 아이소프로페닐, 뷰테닐 및 뷰테닐의 이성질체, 예를 들어 1- 또는 2-뷰테닐을 포함한다. 사이클로알킬의 예로는 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실을 포함한다.
할로겐의 예로는 불소, 염소 및 브롬을 포함한다.
콜레스터라제(EC 3.1.1.13)은 또한 콜레스톨 에스터라제; 콜레스테릴 에스터 합성효소; 트라이터페놀 에스터라제; 콜레스테릴 에스터라제; 콜레스테릴 에스터 하이드롤라제; 스테롤 에스터 하이드롤라제 또는 콜레스테롤 에스터 하이드롤라제로 불리는 광범위한 특이성의 효소 군이다. 이들은 또한 에스터라제, 프로테아제 및 리파제를 포함하는 하이드롤라제의 군에 속한다.
효모로부터 유래하는 콜레스터라제의 예로는 칸디다(Candida) 속, 예를 들어 칸디다 사일린드라시아(cylindracea)로부터 유래하는 콜레스터라제를 포함한다. 예를 들어, 콜레스터라제는 칸디다 사일린드라시아로부터 수득된, 시판되는 리파제 MY(메이토 산교(Meito Sangyo), 일본)를 정제하여 수득될 수 있다. 정제는 부분적일 수 있다. 효모로부터 유래하는 시판되는 콜레스터라제의 예로는 독일 데-68305 만하임 샌드호퍼 스트라쎄 116 소재의 로슈 어플라이드 사이언스 인더스트리얼 프로덕츠 엔자임 프로젝트(Roche Applied Science, Industrial Products, Enzyme Projects)에 의해 제공된 주문번호 10129046103(고체 제형), 0393916 또는 0396800(액체 제형)으로 시판되는 콜레스터라제이다.
따라서, 하나의 실시태양에서 본 발명은 효모로부터 유래하는 콜레스터라제가 칸디다 사일린드라시아의 콜레스터라제인 제조방법을 제공한다.
효모로부터 유래하는 콜레스터라제는 가용성 형태 또는 고정된 형태로 사용될 수 있다. 효소를 고정하는 다양한 선택이 당업자에게 공지되어 있다.
효소 반응은 수성 또는 수성-유기 시스템에서 발생할 수 있다.
기질, 즉 화학식 III의 화합물을 예를 들어 현탁액으로서 적용할 수 있다. 농도는 0.5 내지 20% 전체 농도(w/w) 또는 2 내지 10% 범위일 수 있다. 화학식 III의 화합물을 이타콘산과 선택적으로 치환된 아미노페놀로부터 공지된 방법에 따라서 제조할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 화학식 III에서 R21, R22, R23 및 R24가 서로 독립적으로 수소 또는 불소인 방법을 제공한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 화학식 III에서 R21, R22, R23 및 R24가 수소인 방법을 제공한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 화학식 IIII에서 R1이 메틸 또는 에틸인 방법을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 (RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 에스터를 효모로부터 유래하는 콜레스터라제와 접촉시키는 단계를 포함하는 (S)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 및 (R)-1-(4-하이드록시-페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 에스터의 제조방법을 제공한다.
인산 완충액 또는 아세테이트 완충액 등과 같은 생화학적 전환을 위해 사용하는 것으로 공지된 통상적인 완충 용액을 사용할 수 있다. 완충액 농도는 1M 이하의 범위 또는 약 3mM 내지 약 250mM의 범위일 수 있다.
효소 반응을 유기 공-용매의 존재하에 수행할 수 있다. 유기 공-용매는 수혼화성 또는 수-비혼화성 공-용매일 수 있다. 유기 수혼화성 공-용매가 존재할 때, 그의 전체적인 농도는 30% 이하 또는 25% 이하일 수 있다. 유기 수-비혼화성 공-용매를 임의의 비율로 전체적인 농도에서 사용할 수 있다.
유기 공-용매의 예로는 기술적으로 통상적인 용매, 예컨대 에터(예를 들어, 테트라하이드로퓨란, 다이옥세인 또는 3급-뷰틸 메틸 에터(TBME)), 저급 알콜(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아이소프로판올, 3급-뷰탄올), 에스터(예를 들어, 에틸 아세테이트), 극성 비양성자성 용매(예를 들어, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸아세트아미드, N,N-다이메틸포름아미드 또는 아세톤) 및 알케인(예를 들어, 헵테인) 또는 사이클로알케인(예를 들어, 사이클로헥세인 또는 메틸사이클로헥세인)을 포함한다.
따라서, 하나의 실시태양에서 본 발명은 효소 반응이 수-비혼화성 공-용매, 예를 들어 TBME, 헵테인; 사이클로헥세인 및 메틸사이클로헥세인으로 구성된 군에서 선택된 유기 공-용매의 존재하에서 수행하는 반응에 관한 것이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 사이클로헥세인 또는 메틸사이클로헥세인의 존재하에 수행하는 반응을 제공한다.
효소 반응을 수용성 첨가제의 존재하에, 예를 들어 염, 폴리올, 폴리에틸렌 글라이콜 또는 그의 유도체의 존재하에 수행할 수 있다. 첨가제는 효소를 활성화시키거나, 선택적으로 자극하거나 또는 안정화시킬 수 있다.
염의 예로는 염화 나트륨 또는 염화 칼륨 및 기타 첨가제, 예를 들어 LiSCN, Na2SO4 및 Mg2S04를 포함한다. 구체적으로, 수성 완충액은 효소의 공지된 활성제인 마그네슘 이온을 함유할 수 있다. 염은 1M 이하 또는 0.5M 이하 범위의 농도로 존재할 수 있다.
따라서, 하나의 실시태양에서 본 발명은 효소 반응이 마그네슘 염의 존재하에 수행되는 방법을 제공한다.
폴리올의 예로는 글리세롤 및 당을 포함한다. 폴리올은 수성 상의 40%(w/v) 이하 농도로 존재할 수 있다.
폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 선택적으로 모노메틸 또는 다이메틸 에터를 50%(v/v) 또는 5% 내지 25% 범위로 사용할 수 있다. 예를 들어, 4kD 내지 6kD 범위의 PEG, 선택적으로 모노메틸 또는 다이메틸 에터로서 사용할 수 있다.
효소를 첨가한 후, 반응 혼합물의 pH를 선택된 pH-값에서 유지할 수 있고, 예를 들어 효소 반응을 pH 3.5 내지 pH 10.0 또는 pH 4.0 내지 pH 8.0 범위에서 수행할 수 있다. 일정한 pH 값은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 염기(예를 들어 수산화 나트륨 또는 수산화 칼륨 또는 중탄산)의 조절된 첨가 또는 충분한 완충 성능을 갖는 완충액의 선택에 의해 유지된다.
효소 반응을 4℃ 내지 45℃ 범위의 온도 또는 15℃ 내지 35℃ 범위의 온도 또는 26℃ 내지 32℃ 범위의 온도에서 수행할 수 있다.
반응의 종료한 후, 화학식 I의 화합물 및 화학식 II의 화합물을 추출에 의해 분리할 수 있다.
예를 들어, 화학식 II의 화합물은 반응 혼합물을 적합한 유기 용매, 예를 들어 다이클로로메테인으로 추출하여 통상적으로 후처리할 수 있다. 용액의 농축시 화학식 II의 화합물이 결정화되고 이에 의해, 그의 광학 순도를 용이하게 증가시킬 수 있다.
수성 상에 남아있는 화학식 I의 안티포드 화합물을 보다 낮은 pH 값에서 수성 상의 후속적인 추출에 의해 단리할 수 있다. 이는 유지된 수성 상을 산성화시키고 형성된 침전물을 여거하고 적합한 유기 용매, 예를 들어 에틸 아세테이트로 추출하여 달성될 수 있다. 용액의 농축시 화학식 I의 화합물이 결정화되고 이에 의해 그의 광학 순도를 증가시킬 수 있다.
따라서, 하나의 실시태양에서 본 발명은
(a) 화학식 III의 화합물을 효모로부터 유래하는 콜레스터라제와 접촉시키는 단계 및
(b) 생성된 화학식 I의 화합물 및 화학식 II의 화합물을 상이한 pH에서의 추출에 의해 분리하는 단계
를 포함하는 화학식 I의 화합물 및/또는 화학식 II의 화합물의 제조방법을 제공한다.
수용성 첨가제가 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물과 함께 공-추출되는 경우, 첨가제로부터 각각의 반응 생성물을 분리하기 위한 추가의 추출 단계가 필요할 수 있다. 다르게는, 흡수제 수지 또는 이온 교환 수지를 사용할 수 있다. 적용되는 특정 추출 방식의 선택은 당업자에게 공지되어있고, 첨가제, 예를 들어 PEG 첨가제의 특정 성질에 의존한다. 예를 들어, 폴리에틸렌을 예를 들어 다이클로로메테인(잔류하는 화학식 II의 화합물과 공-추출에 의해서)을 이용한 추출에 의해 화학식 I의 화합물로부터 분리할 수 있고, 이후에 용매를 변화시키거나 또는 저작/분해에 의해 에틸 아세테이트(폴리에틸렌은 이들 조건하에서 불용성임)를 이용하여 화학식 II의 화합물의 보유된 분획으로부터 분리할 수 있다.
본 발명의 방법으로부터 생성된 화합물, 즉 화학식 I의 화합물 및 화학식 II의 화합물은 당업자에게 공지된 카복실산 또는 에스터 작용기에서 유도 반응을 겪을 수 있고 예를 들어 카복사미드, N-치환된 카복사미드, N,N-이치환된 카복사미드, 카복사미딘, N-하이드록시-카복사미딘, 카복실산 하이드록사미드, 카복실산 하이드라지드, 카보나이트릴, 카브알데하이드, 케톤, 아이소시아네이트, 아이소티오시아네이트, 카바메이트, 유레아, N-치환된 유레아, N,N-이치환된 유레아, 1급, 2급 및 3급 아민, N-아미드, 구아니딘, 아미노메틸-, 하이드록시메틸 유도체 및 에스터 유도체와 같은 화합물을 생성한다.
이러한 화합물의 예로는 하기 화학식 IVa 또는 하기 화학식 IVb의 화합물을 포함한다:
Figure 112006018559963-pct00006
Figure 112006018559963-pct00007
상기 식에서,
R21, R22, R23 및 R24가 화학식 I, II 및 III에 대해 정의된 바와 같은 의미를 갖고;
R은 CN, CHO, CH2R4, C(O)R5, C(O)NHR6, C(NH)NH2, NHR7 또는 C(O)OR8이고;
R4가 OH 또는 NH2이고;
R5가 (C1-C6)-알킬이고;
R6이 H, OH, NH2 또는 (C1-C6)-알킬이고;
R7이 H 또는 C(NH)NH2이고;
R8이 (C1-C6)-알킬이다.
화학식 IVa 및 IVb의 화합물은 신규하고 또한 본 발명의 실시태양을 형성한다.
2개의 거울상이성질체중 하나의 재환형화를 위해서, 화학식 II의 화합물 및 에스터화 후의 화학식 I의 화합물을 염기, 예를 들어 알콜레이트 또는 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU)과 같은 염기를 사용하여 라세미화시킬 수 있다.
본 발명의 방법으로부터 생성된 화합물, 즉 화학식 I의 화합물 및 화학식 III의 화합물 및 화학식 IVa 및 화학식 IVb의 화합물은 중요한 구성 블록이고 화학, 농학 및 약학 산업에서 유용한 생성물의 합성에, 예를 들어 약학적으로 활성인 화합물, 예를 들어 파킨슨 질병, 알츠하이머 질병 또는 중추 신경계의 기타 질병과 같은 질병의 치료에 유용한 모노아미노옥시다제 저해제의 합성에 사용될 수 있다.
예를 들어, (S)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산을 알콜, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올과 반응시켜 산성 촉매화하에서 상응하는 (S)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 에스터를 수득할 수 있다. 에스터를 벤질성 할라이드, 토실레이트, 메테인 설포네이트(메실레이트) 또는 트라이플루오로메테인 설포네이트(트라이플레이트)로부터 선택된 비치환되거나 또는 치환된 벤질 유도체를 사용하여 윌리암슨(Williamson)-에터 합성에 의해 알킬화할 수 있다. 사용되는 염기는 나트륨, 칼륨 또는 세슘 카보네이트와 같은 카보네이트일 수 있다. 용매의 예로는 아세톤 또는 2-뷰탄온과 같은 저급 케톤이 있다. 반응을 20℃ 내지 환류 온도의 범위에서 수행할 수 있다. 다른 알킬화 방법은 미츠노부 커플링(Mitsunobu-coupling)이다: 선택적으로 치환된 벤질성 알콜을 불활성 용매, 예를 들어 다이에틸 에터 또는 테트라하이드로퓨란중의 페놀과 포스핀, 예를 들어 트라이뷰틸- 또는 트라이페닐 포스핀의 존재하에 다이알킬-아조-다이카복실레이트를 사용하여 반응시킬 수 있다. 에스터 작용기의 가수분해는 용매로서 알콜과 물의 혼합물 중에서 산성 조건(예를 들어 염산)하에서, 또는 염기성 조건(예를 들어 리튬, 수산화 나트륨 또는 수산화 칼륨)하에서, 가수분해와 같은 그자체로 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 이어서, 생성된 산을 예컨대 호프만(Hofmann) 또는 커티우스(Curtius) 재배열에 의해 상응하는 아이소시아네이트의 형성에 의해 탄소로부터 질소 원자로 친핵체를 이동시킬 수 있다. 후속적으로 수성 산으로 아이소시아네이트를 처리하여 상응하는 아민을 직접적으로 수득한다. 중간체 아이소시아네이트를 적합한 알콜로 처리하여 카바메이트의 형성시 보호된 아미노 유도체를 수득한다. 아이소시아네이트의 처리에 대해서, 알콜은 아민 보호 기로서 사용되는 전형적인 카바메이트, 예를 들어 3급-뷰톡시카보닐, 벤질옥시카보닐 또는 플루오렌일-메톡시카보닐를 수득하도록 선택된다. 아민으로 절단하기 위한 방법은 문헌에 공지되어 있다. N-아미드로의 추가의 전환은 표준 과정에 의해서, 예컨대 활성화된 아실 유도체, 예를 들어 아실 할로게나이드 또는 무수화물과의 반응에 의해서 또는 예를 들어 축합 시약으로서 카보다이이미드를 사용하는 산의 축합 반응에 의해서 수행될 수 있고, 따라서 (S)-N-{1-[4-(3-플루오로-벤질옥시)-페닐]-5-옥소-피롤리딘-3-일}-아세트아미드(실시예 10)와 같은 화합물을 생성할 수 있다.
(R)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 에스터를 상기에서 기술된 바와 같이 윌리암슨-에스터 합성 또는 미츠노부-커플링에 의해서 비치환되거나 또는 치환된 벤질 유도체로 알킬화시킬 수 있다. 에스터 작용기의 가수분해를 산성 조건(예를 들어 염산)하, 또는 염기성 조건(리튬, 수산화 나트륨 또는 수산화 칼륨)하에서, 예를 들어 용매로서 알콜 및 물의 혼합물중에서 그자체가 공지된 방법에 의해서 수행할 수 있다. 이어서, 생성된 산을 표준 과정에 의해 상응하는 아미드로 전환시킬 수 있다. 1급 또는 2급 아민과 반응에 대해서, 카보다이이미드와 같은 축합 시약, 예를 들어 다이사이클로헥실-카보다이이미드 또는 벤조트라이아졸 유도체, 예를 들어 O-(벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄-헥사플루오로포스페이트(HBTU)를 적용하여 (R)-1-[4-(4-플루오로-벤질옥시)-페닐]-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸아미드(실시예 9)와 같은 화합물을 수득할 수 있다.
실시예에서 다음 약어를 사용한다: ISN-MS: 이온 분사 음성 질량 분광계; EI-MS: 전자 충격 질량 분광계; NMR: 핵 자기 공명 분광계; IR: 적외선 분광계; HPLC: 고 압력 액체 크로마토그래피; HBTU: O-(벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄-헥사플루오로포스페이트; TBME: 3급-뷰틸메틸에터; HV: 고진공.
실시예 1
(RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터의 제조
(a) 4-아미노페놀 2.355mol 및 이타콘산 2.32mol의 혼합물을 조금씩 가열하였다: 60℃에서 분말이 점성이 되기 시작하고, 110 내지 120℃에서 액체가 되고 색상이 짙은 갈색으로 변하면서 고체 물질의 나머지 또한 용해되었다. 발열 반응을 비등하에서 시작하고 온도는 150℃로 상승하였다. 1 내지 2시간내에 실온까지 냉각되도록 모래 생성물을 방치하였다. 수득된 조질의 (RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산을 추가의 정제 및 특성 규명 없이 다음 단계를 수행하였다.
(b) 조질의 (RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산을 메탄올 5000㎖ 및 진한 황산 24㎖ 및 2,2-다이메톡시프로페인 400㎖의 혼합물중에 용해시키고 환류하에서 2시간동안 교반하였다. 반응 용액을 증류하여 부피가 절반으로 감소된 후 20ℓ들이 용기로 옮겼다. 40℃에서 교반하에서, 물/얼음(1:1) 2500㎖의 혼합물을 첨가하였다. 즉시 결정화가 시작되었고, 그 결과 미세한 백색의 결정을 여과 깔대기 상에서 수집하였다. 여과물이 중성이 될 때까지 이들을 냉수 총 2000㎖로 세척하였다. 생성물을 감압하에서 건조하여 (RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터 980g(이론치 84%, 2단계)을 백색의 고체로서 수득하였다; MS: m/e = 234(m+ H)+.
실시예 1b에서 기술된 것과 유사한 방식으로, 조질의 (RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산과 에탄올과의 반응에 의해 (RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 에틸 에스터를 백색의 고체로서 수득하였다; MS: m/e = 248(M-H)+.
실시예 2
(R)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터 및 (S)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산의 제조
(a) (RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터(98% HPLC) 213.5mmol을 적당한 교반하에서 사이클로헥세인 500㎖중에 현탁시켰다. 0.1M 염화 나트륨 및 50mM 황산 마그네슘을 함유하는 pH 6.0의 3mM 인산 칼륨 완충액 2.0ℓ를 첨가하고 생성된 유화액/현탁액을 pH 6.0으로 재조정하고 온도를 30℃로 설정하였다. 칸디다 사일린드라시아(독일 데-68305 만하임 샌드호퍼 스트라쎄 116 인더스트리얼 프로덕츠 엔자임 프로젝트 소재의 로슈 어플라이드 사이언스, 주문 번호 10129046103, 이후에서: 효소)에서 나온 콜레스터라제 201mg을 첨가하여 가수분해를 시작하고 적당한 교반하에서 0.1N NaOH 용액(pH-고정)을 조절하여 첨가함에 의해 pH를 6.0으로 일정하게 유지하였다. 적정화제 1016㎖를 모두 소비한 후(밤새도록, 전환율 48.6%) 반응 혼합물을 다이클로로메테인(시작시 탁한 상) 3.5ℓ 및 2 x 2.5ℓ 이어서 에틸 아세테이트(폐기되는 유기 상) 3.5ℓ로 추출하였다. 합한 다이클로로메테인 상을 황산 나트륨 상에서 건조하고, 증발시키고 HV하에서 건조하여 (R)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터 22.5g(95.6mmol; 44.8%)를 백색 결정으로서 수득하였다. 분석치: HPLC: 99% 초과. 거울상이성질체 과량: 96.3%(키랄팩 AD, 250 x 4.6mm; 70% 헥세인 + 헥세인중 0.1% TFA 10% + 20% 에탄올; 1㎖/분; DAD: sig = 210.8nm, ref = 360.1nm; 시료 적용: EtOH중 1% TFA 1㎖당 2mg, 0.5㎕). [δ]D = -27.70(c=1.02; EtOH). EI-MS: m/e = 235.1(M; 67), 122.0(100). 1H-NMR(400MHz ;CDCl3): 2.89(ddd, 2H, -CHaHb-), 3.37(m, 1H, -CHCOO), 3.78(s, 3H, COOCH3), 4.03(ddd, 2H, C(O)NCHaHb), 6.08(s, 1H, Ph-OH), 6.77, 7.30(AA'XX', 2x2H, C6H4).
(b) 다이클로로메테인 및 에틸 아세테이트로 추출한 후 방치시킨 수성 층을 32% 염산으로 pH 2.2로 조정하고 에틸 아세테이트 3 x 3.5ℓ로 추출하였다. 합한 유기 층을 황산 나트륨 상에서 건조하고, 증발시키고 HV하에서 건조하여 (S)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 21.9g(99.0mmol; 46.4%)을 백색의 고체로서 수득하였다. 분석치: HPLC: 99% 초과. 거울상이성질체성 초과량: 99.1%(방법은 상기를 참조하시오). [δ]D = 25.40o(c=1.05; EtOH). EI-MS: m/e = 221.1(M; 57), 122.0(100). 1H-NMR(400MHz; MeOD): 2.83(dd, 2H, -CHaHb-), 3.39(m, 1H, -CHCOO), 4.05(ddd, 2H, C(O)NCHaHb), 6.79, 7.31(AA'XX', 2x2H, C6H4).
실시예 3
다양한 유기 공-용매의 존재하에 거울상이성질체 선택적인 가수분해
(a) TBME 5㎖중 (RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터(98%) 2.13mmol의 현탁액에 50mM 황산 마그네슘 2㎖, 및 0.1M 염화 나트륨 및 0.02% 나트륨 아자이드를 함유하는 pH 6.0의 3mM 인산 칼륨 완충액 20㎖를 교반하에서 첨가하였다. 효소 10mg을 첨가하여 반응을 시작하고 0.1N NaOH를 조절하여 첨가함에 의해 pH를 6.0으로 유지하였다. 10.4㎖를 소비한 후(전환율 49.9%; 45시간), 반응 혼합물을 다이클로로메테인 3 x 50㎖로 추출하고 합한 유기 상을 증발시키고 ee-측정을 수행하였다. 수성 상을 pH 2로 산성화시키고, 에틸 아세테이트 3 x 50㎖로 추출하고, 합한 유기 상을 증발시키고 ee-측정을 수행하였다.
(b) 유기 용매(표 1 참조) 10㎖중 (RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터(약 2% 각각의 라세미 산을 함유함) 4.25mmol의 현탁액에 50mM 염화 마그네슘 및 0.1M 염화 나트륨을 함유하는 pH 6.0의 3mM 인산 칼륨 완충액 39㎖를 적당한 교반하에서 첨가하고 온도를 28℃로 설정하였다. 탈이온수 1.0㎖에 용해된 효소 6.5mg를 첨가하여 반응을 시작하고 0.1N NaOH를 조절하여 첨가함에 의해 pH를 6.0으로 유지하였다. 전환율 약 50%가 된 후, 반응 혼합물을 실시예 3a에 유사하게 후처리하였다.
Figure 112006018559963-pct00008
실시예 4
다양한 첨가제의 존재하에 거울상이성질체의 선택적인 가수분해
사이클로헥세인 10㎖중 (RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터(각각의 라세미 산 약 2%를 함유함) 4.25mmol의 현탁액에 50mM 염화 마그네슘 및 0.1M 염화 나트륨(표 2에서 제시된 양)을 함유하는 pH 6.0의 3mM 인산 칼륨 완충액중 첨가제 용액(하기 표 2 참조)을 적당한 교반하에서 첨가하고 온도를 28℃로 설정하였다. 탈이온수 1.0㎖에 용해된 효소 6.5mg를 첨가하여 반응을 시작하고 0.1N NaOH를 조절하여 첨가함에 의해 pH를 6.0으로 유지하였다. 전환율 약 50%가 된 후, 반응 혼합물을 실시예 3a에 유사하게 후처리하였다.
Figure 112007020966813-pct00020
실시예 5
다양한 염 첨가제의 존재하에 거울상이성질체 선택적인 가수분해
사이클로헥세인 10㎖중 (RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터(각각의 라세미 산 약 2%를 함유함) 4.25mmol의 각각의 현탁액에 1개 또는 2개의 중성 염(표 3 참조)을 함유하는 pH 6.0의 3mM 인산 칼륨 완충액 39㎖를 적당한 교반하에서 첨가하고 온도를 28℃로 설정하였다. 탈이온수 1.0㎖에 용해된 효소 6.5mg를 첨가하여 반응을 시작하고 0.1N NaOH를 조절하여 첨가함에 의해 pH를 6.0으로 유지하였다. 전환율 약 50%가 된 후, 반응 혼합물을 실시예 3a에 유사하게 후처리하였다.
Figure 112007020966813-pct00021
실시예 6
다양한 조건에서 거울상이성질체 선택적인 가수분해
유기 용매(표 4 참조)중 (RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터(하기 표 4 참조; 각각의 라세미 산 약 2%를 함유함)의 현탁액에 첨가제와 함께 수성 완충 용액(하기 표 4 참조)를 적당한 교반하에서 첨가하고 온도를 28℃로 설정하였다. 탈이온수 1.0㎖에 용해된 효소(양은 표 4를 참조하시오)를 첨가하여 반응을 시작하고 0.1N NaOH를 조절하여 첨가함에 의해 pH를 6.0으로 유지하였다. 전환율 약 50%가 된 후, 반응 혼합물을 실시예 3a에 유사하게 후처리하였다.
Figure 112007020966813-pct00022
실시예 7
상이한 에스터의 거울상이성질체 선택적인 가수분해
사이클로헥세인 10㎖중 (RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 에틸 에스터 4.01mmol의 현탁액에 50mM 염화 마그네슘을 함유하는 pH 6.0의 3mM 인산 칼륨 완충액 39㎖를 적당한 교반하에서 첨가하고 온도를 28℃로 설정하였다. 탈이온수 1.0㎖에 용해된 효소를 첨가하여 반응을 시작하고 0.1N NaOH를 조절하여 첨가함에 의해 pH를 6.0으로 유지하였다. 반응이 종료된후 반응 혼합물을 실시예 3a와 유사하게 후처리하였다.
Figure 112007020966813-pct00023
실시예 8
(R)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터 및 (S)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산의 제조
(a) (R)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터의 제조: (RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터(98.2% HPLC; 0.2% 라세미 산을 함유함) 106.3mmol을 적당한 교반하에서 메틸사이클로헥세인 100㎖중에 현탁시켰다. 폴리에틸렌 글라이콜 모노메틸 에터 5000 20.00g을 pH 6.0의 0.1M 마그네슘 아세테이트(0.5시간동안 교반함; 약 398㎖ 부피) 380㎖중에 용해시키고 용액을 상기 현탁액에 쏟아부었다. 생성된 유화액/현탁액을 pH 6.0으로 재조정하고 온도를 28℃로 설정하였다. 효소 83mg을 첨가함에 의해 가수분해를 시작하고 적당한 교반하에서 1.0N NaOH-용액(pH-고정)의 조절 첨가에 의해 pH를 6.0으로 일정하게 유지하였다. 17.2시간 및 적정화제(전환율 47.5%) 49.64㎖를 총 소비한 후, 다이클로로메테인 500㎖을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 반응 혼합물을 다이클로로메테인(시작시에 탁한 상) 4 x 500㎖ 및 이후에 에틸 아세테이트 500㎖(폐기된 유기 상)로 추출하였다. 합한 다이클로로메테인 상을 황산 나트륨 상에서 건조하고 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 400㎖에서 밤새도록 분쇄하여 불용성 PEG를 제거하였다. 현탁액을 여과하고, 여과물을 증발시키고 잔류물을 다이클로로메테인으로 재결정화하여 (R)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터 11.27g(47.9mmol; 45.1%)을 백색의 결정으로서 수득하였다. 분석치: HPLC: 99.4%(A226nm). 거울상이성질체 과량: 97.8%(방법은 실시예 2를 참조하시오). [δ]D = -29.1o(c=1.04; EtOH). ISN-MS: m/e = 294.2(M+OAc; 70), 234.0(M-H; 100). IR(누졸(Nujol)): 3292, 2923, 2854, 1742, 1662, 1615, 1269, 1221, 1029, 832cm-1. 1H-NMR(400MHz ;CDCl3): 2.89(ddd, 2H, -CHaHb-), 3.48(m, 1H, -CHCOO), 3.78 (s, 3H, COOCH3), 4.03(ddd, 2H, C(O)NCHaHb), 5.59 (s, 1H, Ph-OH), 6.78, 7.33(AA'XX', 2x2H, C6H4).
(b) (S)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산의 제조: 수성 상을 25% 황산으로 pH 2.0으로 설정하고 에틸 아세테이트 4 x 500㎖로 추출하였다. 합한 유기 상을 황산 나트륨으로 건조하고, 증발시키고 잔류물을 TBME로부터 재결정하여 (S)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 10.49g(47.4mmol; 44.6 %)을 백색의 고체로서 수득하였다. 분석치: HPLC: 99.9%(A226nm). 거울상이성질체 과량: 98.2%(방법은 상기를 참조하시오; 지체 시간: (R)-산: 12.44분, (S)-산: 16.25분). [δ]D = +25.0o(c=1.01; EtOH). ISN-MS: m/e = 220.1(M-H; 100). IR(누졸): 3419, 2925, 2854, 2600, 1702, 1628, 1613, 1519, 1277, 1211, 1130, 837cm-1. 1H-NMR(400MHz; DMSO): 2.67(ddd, 2H, -CHaHb-), 3.31(m, 1H, -CHCOO), 3.92(ddd, 2H, C(O)NCHaHb), 6.74, 7.38(AA'XX', 2x2H, C6H4). NMR에 따라서 생성물은 PEG 약 2%를 함유하였다.
실시예 9
(R)-1-[4-(4-플루오로-벤질옥시)-페닐]-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸아미드
(a) 테트라하이드로퓨란 7㎖중 4-플루오로-벤질알콜 4.3mmol 및 트라이페닐포스핀 4.7mmol의 용액을 0℃에서 테트라하이드로퓨란 11㎖중 (R)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터[실시예 2a 또는 8a] 4.7mmol 및 다이아이소프로필 아조다이카복실레이트 4.7mmol의 용액에 적가하였다. 혼합물을 방치하고 실온으로 가온하고 18시간동안 교반을 지속하였다. 실리카 겔 2g을 첨가한 후 반응 혼합물을 감압하에서 증발시켰다. 수득된 물질을 먼저 용리액으로서 헵테인 및 에틸 아세테이트 2:1 이어서 1:1-혼합물을 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여 (R)-1-[4-(4-플루오로-벤질옥시)-페닐]-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터를 백색의 고체로서 수득하였다; MS: m/e = 344(M+H)+.
(b) 다이옥세인 77㎖중 (R)-1-[4-(4-플루오로-벤질옥시)-페닐]-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터 3.7mmol의 용액을 염산(37%) 8.64㎖로 처리하였다. 혼합물을 폐쇄된 플라스크내에 52℃에서 18시간동안 가열하였다. 용액을 감압하에서 증발시켜 황색을 띄는 고체로서 조질의 산을 수득하였다. 조질의 산을 -5℃에서 에틸 아세테이트 10㎖중에 분쇄하였다. 고체를 여과 깔대기 상에서 수집한 후 고진공하에서 건조하여 (R)-1-[4-(4-플루오로-벤질옥시)-페닐]-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산을 백색의 고체로서 수득하였다; MS: m/e = 330(M+H)+.
(c) 0℃로 냉각된 N,N-다이메틸포름아미드 37㎖중 (R)-1-[4-(4-플루오로-벤질옥시)-페닐]-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 1.82mmol의 용액을 트라이에틸아민 2.0mmol, HBTU 1.82mmol, 메틸아민 하이드로클로라이드 2.2mmol 및 트라이에틸아민 2.0mmol로 연속적으로 처리하였다. 빙냉을 제거하고 교반을 실온에서 지속하였다. 30분 후 반응을 중단시키고 오렌지색으로 착색된 용액을 감압하에서 증발시켰다. 수득된 잔류물을 에틸 아세테이트 1㎖로 분쇄하고, 백색의 고체를 여과한 후 다이클로로메테인중에 용해하고 용액을 물로 3회 세척하였다. 유기 상을 황산 나트륨 상에서 건조한 후 감압하에서 증발시켜 (R)-1-[4-(4-플루오로-벤질옥시)-페닐]-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸아미드 409mg(이론치 66%)을 백색의 고체로서 수득하였다. MS: m/e = 343(M+H)+; 거울상이성질체성 초과량 99.5% 초과.
실시예 10
(S)-N-{1-[4-(3-플루오로-벤질옥시)-페닐]-5-옥소-피롤리딘-3-일}-아세트아미드
(a) 테트라하이드로퓨란 150㎖중 3-플루오로-벤질알콜 110.6mmol 및 트라이페닐포스핀 108.8mmol의 용액을 50분 내에 질소 대기하에 0℃에서 테트라하이드로퓨란 200㎖중 (S)-1-(4-하이드록시-페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터 100.5mmol 및 다이아이소프로필 아조다이카복실레이트 100.5mmol의 용액에 적가하였다. 혼합물을 방치하고 실온으로 가온하고 교반을 18시간동안 지속하였다. 혼합물을 감압하에서 증발시켰다. 고체 잔류물을 에터 400㎖중에 분쇄시켜 생성물 및 트라이페닐포스핀옥사이드로 주로 구성된 백색의 고체를 남겼다. 여과 후, 고체 물질을 차가운 메탄올 100㎖중에 분쇄시켜 (S)-1-[4-(3-플루오로-벤질옥시)-페닐]-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터를 백색의 고체로서[MS: m/e = 344(M+H)+] 트라이페닐포스핀 및 다이아이소프로필히드라조다이카복실레이트의 흔적량과 함께 수득하였다.
(b) 다이옥세인 650㎖중 (S)-1-[4-(3-플루오로-벤질옥시)-페닐]-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터 74.6mmol의 용액을 염산(37%) 175㎖로 처리하였다. 혼합물을 50℃에서 18시간동안 폐쇄된 플라스크에서 가열하였다. 용액을 감압하에서 증발시켜 조질의 산을 황색의 고체로서 수득하였다. 조질의 산을 0℃에서 에틸 아세테이트 50㎖중에 분쇄하였다. 고체를 여과 깔대기 상에서 수집한 후 고진공하에서 건조하여 (S)-1-[4-(3-플루오로-벤질옥시)-페닐]-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산을 황색을 띄는 고체로서 수득하였다; MS: m/e = 330(M+H)+.
(c) 다이옥세인 300㎖중 (S)-1-[4-(3-플루오로-벤질옥시)-페닐]-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 61mmol의 용액을 N-메틸모폴린 61mmol로 처리하였다. 이후에, 반응 혼합물을 -8℃로 냉각하고 아이소뷰틸 클로로포름 61mmol을 첨가하였다. 5분동안 교반한 후, 물 40㎖중 나트륨 아자이드 121mmol의 용액을 첨가할 때 온도가 0℃로 상승하였다. 70분동안 0℃에서 교반한 후, 현탁액을 디칼리트(Dicalite, 등록상표) 상에서 여과하였다. 여과물을 톨루엔 700㎖로 희석하고 분리 깔대기로 옮겼다. 유기 층을 분리한 후, 나트륨 수소카보네이트 포화 용액 250㎖로 2회 및 염화 나트륨 포화 용액 200㎖로 2회 세척하였다. 이후에, 유기 층을 황산 나트륨 상에서 건조하고, 톨루엔 400㎖를 첨가한 후, 용매 및 잔류하는 아이소뷰틸알콜을 마지막에 약 350㎖ 부피로 증발시켰다. 용액을 점차적으로 80℃로 가열하고 이 온도를 70분동안 유지하였다. 냉각한 후, 중간체 아이소시아네이트의 용액을 약 300㎖로 농축하고 45℃로 가열하면서 다이옥세인 100㎖중 염산(37%) 25.4㎖의 용액을 적가하였다. 최종적으로 첨가를 완료한 후, 온도를 1시간동안 60℃로 증가시키고 하이드로클로라이드는 이미 침전을 시작하였다. 혼합물을 0℃로 냉각하고 형성된 고체 물질을 여과 깔대기 상에서 수집하였다. 3급-뷰틸메틸에터로 세척한 후, 생성물을 고진공하에서 건조하였다. (S)-4-아미노-1-[4-(3-플루오로-벤질옥시)-페닐]-피롤리딘-2-온 하이드로클로라이드를 백색의 고체로서 수득하였다. MS: m/e = 301(M+H)+.
(d) 다이클로로메테인 86㎖중 (S)-4-아미노-1-[4-(3-플루오로-벤질옥시)-페닐]-피롤리딘-2-온 하이드로클로라이드 11.3mmol의 현탁액을 트라이에틸아민 23.8mmol으로 처리하고 0℃로 냉각하였다. 이 용액에, 아세틸클로라이드 12.5mmol을 첨가하고 0℃에서 15분동안 교반을 지속하였다. 후처리동안, 반응 혼합물을 물 100㎖로 2회 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 황산 나트륨 상에서 건조하고 감압하에서 증발시켰다. 조질의 생성물을 톨루엔 100㎖중에 분쇄시킨 후, 고체를 여과 깔대기 상에서 수집하였다. 2단계동안, 생성물을 실온에서 3급-뷰틸메틸에터 200㎖중에 분쇄하였다. 반복적으로, 고체 생성물을 여과 깔대기 상에서 수집하고 고진공하에서 건조하였다. (S)-N-{1-[4-(3-플루오로-벤질옥시)-페닐]-5-옥소-피롤리딘-3-일}-아세트아미드를 백색의 고체로서 수득하였다. MS: m/e = 343(M+H)+; 거울상이성질체성 초과량: 99.5% 초과.
실시예 11
(S)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산의 제조
폴리에틸렌글라이콜 6000 8.00g을 교반하에서 pH 6.0의 100mM 마그네슘 아세테이트 완충액 150㎖중에 용해시키고 용액을 메틸사이클로헥세인 40㎖중 (RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 메틸 에스터(99.7%) 10.00g(42.51mmol)의 교반된 현택액에 첨가하였다. 혼합물을 28℃로 가열하고 2M NaOH로 pH를 6.0으로 재조정하였다. 칸디다 사일린드라시아 콜레스터라제(16.88kU/g) 33.2mg를 첨가하여 반응을 시작하고 교반하에서 1.0M NaOH을 조절하여 첨가함에 의해 pH를 6.0으로 유지하였다. 1.0M 수산화 나트륨 용액(17.1시간 후; 전환율 47.9%) 20.35㎖(20.35mmol)를 총 소비한 후, 반응 혼합물을 규화 유리 여과기를 통하여 통과시켰다. 여과물이 수성 상 및 유기 상으로 자연적으로 분리되었다. 수성 상을 에틸 아세테이트 2 x 200㎖로 세척하여 미절단된 에스터를 제거하였다. 수성 상을 25% 황산으로 pH 4.0로 설정하고 진공에서 약 80㎖(욕 60℃)의 부피로 농축하였다. 용액을 1℃로 냉각하고(백색의 침전물/결정의 형성) pH를 25% 황산으로 1.5로 설정하였다. 침전물/결정을 1℃에서 밤새도록 교반하고, 규화 유리 여과기(물의 최소량으로 세척함) 상에서 여거하고 고진공에서(실온, 6 x 10-2mbar) 밤새도록 건조하여 (S)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 4.32g(19.53mmol; 45.9%)을 수득하였다. 분석치: HPLC(구역 A226nm): 99.3%, 0.7% 에스터. 98.9 % ee. 생성물은 5.3% 물(칼 피셔(Karl Fischer) 측정에 따라서) 및 2.1%(w/w) PEG(NMR에 따라서)를 함유하였다.

Claims (25)

  1. 하기 화학식 III의 화합물을 칸디다 사일린드라시아(Candida cylindracea)로부터 유래하는 콜레스터라제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 I의 화합물 및 하기 화학식 II의 화합물중 하나 또는 둘 모두의 제조방법:
    화학식 I
    Figure 112008031184010-pct00024
    화학식 II
    Figure 112008031184010-pct00025
    화학식 III
    Figure 112008031184010-pct00026
    상기 식에서,
    R1은 (C1-C8)-알킬 또는 (C2-C4)-알케닐이고;
    R21, R22 및 R23은 서로 독립적으로 수소 또는 할로겐이고;
    R24는 수소, 메틸 또는 할로겐이다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    화학식 III의 화합물이 총 농도 0.5 내지 20%(w/w) 범위의 농도로 사용되는 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    화학식 III에서 R21, R22, R23 및 R24가 서로 독립적으로 수소 또는 불소인 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    화학식 III에서 R21, R22, R23 및 R24가 수소인 제조방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    화학식 III에서 R1이 메틸 또는 에틸인 제조방법.
  8. (RS)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 에스터를 칸디다 사일린드라시아로부터 유래하는 콜레스터라제와 접촉시키는 단계를 포함하는, (S)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 및 (R)-1-(4-하이드록시페닐)-5-옥소-피롤리딘-3-카복실산 에스터의 제조방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    3mM 내지 1M 범위 농도의 완충액이 사용되는 제조방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    유기 공-용매가 존재하는 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    유기 공-용매가 3급-뷰틸 메틸 에터, 사이클로헥세인 또는 메틸사이클로헥세인인 제조방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    마그네슘 염, 폴리올, 폴리에틸렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜 모노메틸에터 및 폴리에틸렌 글라이콜 다이메틸에터로 구성된 군에서 선택되는 첨가제의 존재하에서 수행되는 제조방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    마그네슘 염이 0 초과 내지 1M 이하의 범위의 농도로 존재하는 제조방법.
  14. 제 12 항에 있어서,
    폴리올이 수성 상의 0 초과 내지 40%(w/v) 이하의 농도로 존재하는 제조방법.
  15. 제 12 항에 있어서,
    폴리에틸렌 글라이콜(PEG)이 4kD 내지 6kD 범위의 분자량을 갖는 PEG에서 선택되는 제조방법.
  16. 제 12 항에 있어서,
    폴리에틸렌 글라이콜의 농도가 0 초과 내지 50%(v/v) 이하의 범위인 제조방법.
  17. 제 1 항에 있어서,
    반응이 3.5 내지 10 범위의 pH에서 수행되는 제조방법.
  18. 제 1 항에 있어서,
    반응이 4℃ 내지 45℃ 범위의 온도에서 수행되는 제조방법.
  19. 제 1 항에 있어서,
    (a) 화학식 III의 화합물을 칸디다 사일린드라시아로부터 유래하는 콜레스터라제와 접촉시키는 단계 및
    (b) 반응 혼합물의 pH에서 다이클로로메테인으로 화학식 II의 화합물을 추출하고 산성 pH에서 에틸 아세테이트로 화학식 I의 화합물을 추출함으로써, 생성된 화학식 I의 화합물과 화학식 II의 화합물을 서로 분리시키는 단계
    를 포함하는, 화학식 I의 화합물 및 화학식 II의 화합물중 하나 또는 둘 모두의 제조방법.
  20. 제 1 항에 정의된 화학식 I의 화합물.
  21. 제 1 항에 정의된 화학식 II의 화합물.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 제 15 항에 있어서,
    PEG가 폴리에틸렌 글라이콜 모노메틸에터 또는 폴리에틸렌 글라이콜 다이메틸에터인 제조방법.
  25. 제 9 항에 있어서,
    완충액이 인산 칼륨 완충액 또는 마그네슘 다이아세테이트인 제조방법.
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