CN100528890C - 能维护生理活性的从动物组织中提取神经节苷脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从动物组织中提取神经节苷脂的方法。从生物质中提取有用物质，维护其原有生理活性至关重要。本方法采用丙酮、四氢呋喃、甲醇、氯仿及其他极性溶剂，在含Na2HPO4，NaH2PO4，或柠檬酸等的缓冲溶液维持一定酸度的条件下，从动物组织中萃取神经节苷脂，整个过程使用离子交换水(无重金属)，处理温度保持在35℃以下，以免除或减少其生理活性的损失。所得产品为神经节苷脂粗制品，除神经节苷脂外还含有一些其他的糖脂，具有保健功能。
Description
技术领域
本发明属生物提取技术领域，具体涉及一种从动物组织中提取神经节苷脂的方法。
技术背景
神经节苷脂是一组含有唾液酸(N-乙酰神经氨酸)为特征的紧密相关的鞘糖脂，由亲水性的含唾液酸的寡糖链和疏水性的神经酰氨组成(图1)。按分子中唾液酸的数目可将其分为GM(单唾液酸神经节苷脂)，GD(双唾液酸神经节苷脂)和GT(三唾液酸神经节苷脂)；按GM的糖基数目又可分为含4个糖基的GM1，3个糖基的GM2及2个糖基的GM3。自1935年Klenk首先发现以来，至今已分离鉴定出70余种。GM1是哺乳类神经节苷脂的主要种类。
神经节苷脂是生物膜的重要组成部分，是细胞表面负电荷的主要来源之一。GM1已被证实对细胞-细胞识别、跨膜信息传导粘附有影响，而且通过调控由多肽生长因子调控增殖和促成熟过程而调节细胞生长[1]。体外实验研究发现，神经节苷脂与神经细胞膜结合后能明显增加神经生长因子功能，促进神经再生[2]。外源性GM1能通过血脑屏障，聚集在神经损伤区，与损伤神经组织、细胞具有高度亲和力，通过稳定膜的结构和功能发生作用[3]。在临床中，GM1用于治疗中枢神经损伤对神经有明显的保护作用，促进神经功能恢复[4]。由于其重要性，已开展了许多提取制备的研究，但鲜有涉及保护其生理活性的问题。
发明内容
本发明的目的在于提出一种从动物组织中提取神经节苷脂的方法。该方法可以有效地保护提取物的生理活性，从而使神经节苷脂粗制品的保健作用得到保障。
本发明提出的从动物组织中提取神经节苷脂的方法，具体步骤如下：
(1)用冷丙酮抽提动物组织，冷丙酮温度为-5～4℃，用量为生物组织体积的1-4倍，抽提温度为0～15℃，抽提时间为5分钟～24小时；
(2)混合抽提，经冷丙酮抽提后的提取物用由去离子水和电解质配制的缓冲溶液及有机溶剂组成的萃取体系，再进行抽提；
(3)冷冻预分离，将步骤2所得抽提液置-15℃～-25℃下冷冻，使其析出固体并与液体分离；较佳的冷冻温度为-17℃～-18℃；
(4)减压、蒸馏，将步骤(3)所得固体在常温下化成液体，在30℃～37℃下减压蒸馏，得浓缩液；较佳的减压蒸馏温度为35℃～36℃；
(5)沉淀，对步骤(4)所得浓缩液加入冷丙酮使其析出白色固体，冷丙酮温度为-5～4℃，用量为溶液体积的4-6倍；
(6)分离干燥，分离白色固体，置-17℃以下，真空干燥，得神经节苷脂粗制品。
本发明方法中，所述动物组织可以为猪脑、牛脑、羊脑等。
本发明方法中，所述混合抽提用的溶剂为去离子水，特别为脱除重金属的水；所述电解质可以为磷酸、磷酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐；所述有机溶剂可以为四氢呋喃、乙醚、甲醇或氯仿等；萃取体系的pH值为6.3-7，最佳的pH值为6.5-6.8。
动物组织，特别是动物脑中含有大量胆固醇和脂肪酸甘油脂，大量摄入对人体健康有害。动物组织中还含有各种酶，由于酶对生物分子中特定化学键的专一断裂作用，使得生物提取物的活性受到破坏。本方法采用溶剂处理的方法预先除去胆固醇及简单脂肪酸脂等有害物质，同时破坏酶的活性，以保护产品的活性。
动物组织中的神经节苷脂可能通过亲水部分(羧基)和疏水的神经酰氨端分别以离子键和非极性键与组织中的其他组分复杂地结合。单一的有机溶剂或水均难以破坏结合键。本方法采用水和有机溶剂的混合体系作为萃取剂，并加入适量电解质(磷酸、磷酸盐、柠檬酸及柠檬酸盐等)以促进离子键的离解，提高萃取效率。
生物提取物的生理活性对提取条件和环境(如温度，酸碱度等)十分敏感，重金属也会使其失去活性。本方法采用pH缓冲体系，使萃取体系的接近生物组织的原有pH值(如保持在6.5-6.8)；浓缩回收的温度低于37℃；采用脱除重金属的去离子水，以保护提取物的生理活性。
浓缩回收环节也是提取物容易失活的一步，浓缩温度过高或时间过长都可能使活性降低。本方法将提取液置于-25℃以下冷冻，使含有神经节苷脂的水结冰析出，与有机溶剂粗分离。再将水相减压浓缩至一定体积，加入丙酮，使神经节苷脂析出，在-17℃以下真空干燥。这样极大地缩短了在减压回收的时间，进一步保障产品的活性。同时，也减少了减压蒸馏时易产生泡沫冲出的问题。
附图说明
图1为神经节苷脂分子结构。
具体实施方式
实施例1
将100克猪脑在冰水中洗净，用去离子水淋洗后用粉碎机搅成浆状，加入预冷至4℃的丙酮200ml萃取，用布氏漏斗过滤，滤饼再用同量丙酮处理一次并抽干。所得滤饼加入50ml磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，搅匀，再加200ml冷四氢呋喃萃取，布氏漏斗抽滤。残渣用同样方法在处理一次。合并滤液，置-17℃冰箱内冷冻析出冰晶固体(A)，分离除去液相部分(B)。将(A)在35℃下减压蒸馏，浓缩至80ml，加入400ml冷丙酮，在冰箱中静止过夜，过滤得白色固体，在-17℃下真空干燥后得7～9g粗制品。
实施例2
猪脑4只在冰水中洗净，用去离子水淋洗后用粉碎机搅成浆状，加入预冷至-5℃的丙酮250ml萃取，过滤，共2次(400ml丙酮)。残渣中加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液50ml，搅匀，再加250ml冷四氢呋喃萃取、过滤，并重复此过程一次，得滤液600ml。滤液入-20℃冰箱冷冻至析出全部冰晶，取出冰块在30℃下减压蒸馏，从约400ml浓缩至约80ml。再加入320ml1℃的冷丙酮，使析出固体，分离固体物，置-17℃真空干燥得白色固体产物。
参考文献
[1]Heidinger V，Hicks D，Sahel J，et al.Peptide growth factors but not ganglioside protectagainst excitotoxicity in rat retinal neurons in vitro[J].Brain reseach，1997，767(2)：279.
[2]Ledee R W.Biology of ganglioside：neuritogenic and neuronotropic properties.J NeurosciRes，1984，12：147
[3]Karpiak SE，Mahadik SP.Reduction of cerebral edema with GM1 ganglioside.J NeurosciRes，1984，12：485
[4]杨礼庆，王欢，王海义，张云歧，付勤，杨军，安春厚.GM-1治疗急性脊髓损伤.中国脊柱脊髓杂志，1999，(2)
Claims (4)
1、一种能维护提取物生理活性的从动物组织中提取神经节苷脂的方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)用冷丙酮抽提动物脑组织，冷丙酮温度为-5～4℃，用量为动物脑组织体积的1-4倍，抽提温度为0～15℃，抽提时间为5分钟～24小时；这里，动物为猪，羊或牛；
(2)混合抽提，经冷丙酮抽提后的提取物用由去离子水和电解质配制的缓冲溶液及有机溶剂组成的萃取体系，再进行抽提；其中，所用的去离子水为脱除重金属的水；所用电解质为磷酸、磷酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐；所用有机溶剂为四氢呋喃、乙醚、甲醇或氯仿；萃取体系的pH值为6.3-7；
(3)冷冻预分离，将步骤2所得抽提液置-15℃～-25℃下冷冻，使其析出固体并与液体分离；
(4)减压、蒸馏，将步骤(3)所得固体在常温下化成液体，在30℃～37℃下减压蒸馏，得浓缩液；
(5)沉淀，对步骤(4)所得浓缩液加入冷丙酮使其析出白色固体，冷丙酮温度为-5～4℃，用量为溶液体积的4-6倍；
(6)分离干燥，分离白色固体，置-17℃以下，真空干燥，得神经节苷脂粗制品。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中冷冻温度为-17℃～-18℃。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于减压蒸馏温度为35℃～36℃。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述萃取体系的pH值为6.5-6.8。
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