KR20210015871A - 민감성 피부를 치료하기 위한 추출물 및 이를 포함하는 피부과학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구체적으로 피부의 신경원성 염증에 대한 표적화된 작용에 의해 민감한 피부 및/또는 반응 내성이 없는 피부를 보호하고/거나 치료하는데 사용될 수 있는 새로운 박테리아 추출물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 박테리아 추출물을 활성 성분으로서 포함하는 미용적 또는 피부과학적 조성물에 관한 것이다.

Description

민감성 피부를 치료하기 위한 추출물 및 이를 포함하는 피부과학적 조성물

본 발명은 명확하게 피부 신경원성 염증에 대한 표적화된 작용을 통하여 민감한 피부 및/또는 반응 내성이 없는 피부의 보호 및/또는 치료에 유용할 수 있는 새로운 박테리아 추출물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 박테리아 추출물을 활성 성분으로서 포함하는 미용적 또는 피부과학적 조성물에 관한 것이다.

표피는 피부의 환경 및 유해물에 대한 보호 장벽으로서 작용하는 다층상화된 상피이다. 이의 많은 생리학적 기능 중에서, 표피는 미생물에 의한 신체 침입에 대한 생물학적, 물리적 및 화학적 장벽의 기능을 갖는다. 이러한 표피의 물리적 장벽 성질은 명확하게 이의 구조와 연관되어 있다. 예를 들면, 표피는 통상적으로, 소위 여러 층의 다면성 세포로 구성되는 가시층인 표피의 배아층을 구성하는 각질형성세포 (keratinocyte)의 기저층 그리고 최종적으로 각질세포 (corneocyte)로 불리는 최종 분화 단계의 각질형성세포로 구성되어 각질층 (또는 스트라툼 코르늄 (stratum corneum))으로 불리는 상층 세트로 구분된다. 표피의 화학적 장벽 성질은 구체적으로, 표피 표면으로부터 많은 항미생물성 펩티드의 방출에 의존한다. 표피의 세포성 구조 구성화의 기능부전 또는 표피의 화학적 장벽 기능의 결함은 피부 염증 상태를 유발할 수 있다.

염증은 다음과 같은 공격 유형에 대한 신체의 정상적인 면역 방어 반응이다: 감염, 열, 기계, 화학, 병변 또는 알레르기. 이것은 다음과 같은 네 가지를 특징으로 한다: 발진, 열, 부종 및 통증. 급성 피부 염증은 유해 제제에 대한 단기 지속하는 (수일 또는 수주), 종종 갑자기 발병하는 즉각적인 반응이고, 강한 부종을 특징으로 한다. 급성 염증은 자발적으로 또는 치료 받고 완치된다. 만성화는 염증이 자발적으로 완치되지 않거나, 수개월 또는 수년 동안 지속되거나, 악화될 때 일어난다. 염증 반응은 다수의 연속적인 단계가 관여하는 역동적인 과정이다: 혈관 (혈관 확장), 백혈구 유출 및 면역 세포 화학주성 및 최종적으로 청소. 백혈구 유출은 혈관벽의 활발한 통과 그리고 병변 부위에서 순환하는 면역 세포, 림프구, 호중구 및 단핵구의 축적을 말한다. 호중구는 화학주성에 의해 다른 염증성 세포를 유인하고, 항미생물성 물질 및 프로테아제를 분비함으로써 상처받은 부위를 제거하는 기능을 갖는다. 단핵구는 화학주성에 따라 이동하고, 손상된 영역을 청소하는 대식구로 분화한다. 이들은 성장인자, 염증성 사이토카인 예컨대 IL-1, 명확하게 IL-1β, TNFα, 프로테아제, 프로스타글란딘 및 염증을 유지하고/거나 증폭시키는 TNF를 분비한다. 청소는 혈관 단계로 이어지며, 백혈구 유출을 동반하고 일시적이다. 이것은 괴사 조직 및 병원체가 제거되는 과정이다.

피부 신경성 염증 (cutaneous neurogenic inflammation)은 신경 말단에 의한 일차 염증 과정의 유도 및/또는 증폭으로서 정의되고, 따라서 이것은 물질 P와 같은 신경펩티드를 분비하는 표피내 신경 섬유의 활성화에 의해 유도되는 피부 염증이다. 구체적으로, 피부 신경성 염증은 민감성 피부, 반응 내성이 없는 피부 및 소양 염증성 피부병에 관여한다. 소양증은 스크래치가 필요한 불쾌한 감각으로서 정의된다. 최근에, 가려움을 감지하는 특이적인 수용체인, 소양감 수용체 (소양증 수용체 (nocireceptor))에 대해 언급되기 시작하였지만, 통증 수용체 패밀리와 이들의 구별은 여전히 논쟁되고 있다. 이러한 소양증 수용체는 표피내 Ao-섬유, 특히 C-섬유를 사용한다. 이들은 신경펩티드로 물질 P, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP) 및 혈관활성 장 펩티드 (VIP)를 분비한다. 최근에, 소양증의 유도에서 프로테아제 (트립신, 카텝신 G, 트롬빈 등)의 역할이 분명하게 확립되었다. 실제로, 프로테아제 활성화된 수용체 2 (PAR-2)가 소양증 활성화에 대한 두 번째 주요한 경로로서 정의되었다 (Misery et al., Nat. Rev. Neurol. 10, 408-416, 2014).

피부내 신경 섬유는 피부 세포 및 림프계와 면역계의 내분비 세포와 직접 또는 간접적으로 상호작용한다. 이러한 소통이 신경-면역-피부-내분비 시스템을 정의하게 한다. 이러한 시스템은 기능하기 위하여 상이한 특성의 분자, 신경전달물질, 사이토카인 및 성장인자로 구성되는 공통의 언어를 요구한다. 이들 분자는 피부 세포, 체류성 및 채용된 면역 세포 그리고 표피내 신경 말단에 의해 합성되어 방출된다. 표피 및 진피 세포는 신경전달물질, 효소, 뉴트로핀, 사이토카인, 케모카인 및 성장인자도 역시 생산할 수 있다. 이러한 매개인자는 피부 신경 분포 및 염증 반응을 조절한다. 염증 과정에서, 수송되거나 피부에 구성적으로 존재하는 면역 세포는 감각 신경 말단 및 피부 세포에 의해 분비되는 이들 매개인자의 작용에 의해 활성화될 수 있다. 이러한 과정은 사이토카인 및 신경전달물질의 제 2의 방출을 유도하고, 이는 염증의 증폭 루프를 생성한다.

새로운 개념이 최근에 나와서, 각질형성 세포도 역시 피부 신경성 염증에서 주요한 작용인자인 점을 시사하고 있다.

또한, 신경펩티드에 의해 생성되는 피부 신경성 염증은 민감성 피부의 반응 및 내성이 없는 피부에도 관여한다. 민감성 피부의 언급은 각 사람의 피부의 민감성 수준을 반영한다. 임의의 연령에서 민감성 피부를 갖는 것이 가능하지만, 이것은 아동 및 노인에서 매우 보편적이다. 아기 피부는 어른 피부의 약 5분의 1 두께이고, 따라서 화학적, 물리적 및 미생물적 손상, 뿐만 아니라 UV 선에 대해 극도로 민감해진다. 어른 피부의 장벽 기능은 연령에 따라, 대사 과정이 느려지면서 점진적으로 약화된다. 피부가 노화되면서, 점차로 지질이 부족해지고, 이로 인해 비누와 같은 알칼리성 물질에 더 쉽게 과민해진다.

피부가 매우 낮은 민감성 한계치를 가지며, 즉 피부가 가장 약한 외부 공격에 과반응할 때, 이것을 내성이 없는 피부 또는 반응 내성이 없는 피부라고 말한다. 내성이 없는 피부는 외부 공격에 대해 더 취약하고, 매일의 불편감 및 높은 과민성을 특징으로 한다. 다소간 현저한 일부 징후가 이를 인식하는 것을 가능하게 한다. 예를 들면, 내성이 없는 얼굴 피부는 적색이고, 따끔거린다. 이는 열감 또는 소양감을 유발시킨다. 또한, 이것은 화상 감지를 야기할 수 있다. 내성이 없는 피부는 일반적으로 알레르기성이라서, 구체적으로 미용 관리 제품의 성분에 대해 민감하다.

사실상 민감성 피부는 핀과 바늘, 과열, 자통 및 소양감에 민감한 경향이 있고, 때로 발진이 동반된다. 이들 불편감은 정상 피부에서는 과민성을 촉발하지 않을 자극에 반응하여 악화된 방식으로 나타난다. 이러한 피부의 과민성은 내성 한계치의 감소로 인해 유발된다. 피부가 더 민감할수록 내성 한계치는 더 낮아지며, 내성 한계치가 가장 낮을 때, 이것을 내성이 없는 피부라고 지칭한다. 이러한 과민성은 다양한 요인에 의해 설명될 수 있다:

- 특정 비누, 가정용 세제 또는 오염과 같은 화학적 자극물과 접촉할 때 발생하는 염증 반응. 따라서 한계치를 초과하는 이들 물질이 민감성 또는 내성이 없는 피부를 유발하고;

- 표피 장벽 기능의 변경. 이러한 현상이 다음으로 피부의 탈수, 특히 잠재적인 자극물의 침투를 촉진하고;

- 스트레스와 같은 심리학적 요인;

- 호르몬 요인;

- 태양광, 온도 변화 (추위/더위), 바람, 에어콘, 열기, 경수와 같은 물리적 요인.

피부는 표면 수지질 필름으로 불리는 보호 필름으로 둘러싸여 있다. 이러한 필름은 최외곽 장벽으로, 가장 연약하고, 가장 많이 교란되고, 피부 건강을 가장 대표하는 장벽이며, 이는 주로 피지샘으로부터 분비되는 지방 물질 및 가시 세포의 각질화 과정 동안 세포 분해로부터 나온 지질, 뿐만 아니라 땀, 글리세롤, 우레아, 천연 피부 보습인자, 염분, 피부 미생물총의 대사물 등과 같은 친수성 화합물로 구성된다. 이러한 표면 필름은 많이 노출되고, 환경 스트레스, 위생 습관 및 피부 컨디션에 대해 민감하다. 특히 가장 민감한 피부의 경우, 이러한 장벽 기능을 보존하고, 심지어 개선하는 것이 중요하다. 또한, 피부 장벽이 약화된, 내성이 없는 피부를 갖는 인구 집단은 생리-유사 수지질 제제, 구체적으로 연화제 및 생리학적 보습제로의 관리가 필요한 한편, 계면활성제 또는 보존제와 같은 표면 수지질 필름을 분해할 수 있는 물질과 피부가 접촉하지 못하도록 피하는 것도 중요하다.

민감성 또는 내성이 없는 피부는 비-알레르기 메커니즘이고, 특이적 알레르기원의 인식이 없는 염증 반응이 관여한다.

피부 과민성의 병리생리학적 메커니즘이 명백하게 밝혀져 있지 않지만, 이에 기여할 수 있는 두 가지 유형의 인자로 식별하려는 경향이 있다. 한편으로, 수분 손실을 통한 피부 장벽의 변경 및 각질세포간 지질의 변경이 있다. 피부는 외부 자극물 및 자극에 대해 더욱 민감해지고, 심지어 최소의 과민성도 염증성 사이토카인 및 아라키돈산 연쇄반응으로부터 화합물의 방출을 유도한다. 다른 한편으로, 신경학적 장애가 피부의 민감성 및 반응성을 부여할 수 있다. 표피 세포에 도달하는 신경 섬유는 외부 자극의 영향 하에 신경성 염증, 즉 피부 신경성 염증을 유발시키는 신경전달물질 (예컨대, 물질 P)을 생산한다.

따라서, 염증 성분이 신경성 염증인 내성이 없는 피부인 민감성 피부를 치료하고, 예방하고, 보호할 수 있는 조성물이 필요하다.

본 발명의 목적은 이러한 필요를 충족시키는 것이고, 달리 말하면 피부 신경성 염증을 감소시키거나 억제함으로써, 민감성 피부의 또는 내성이 없는 피부의 병태를 보호하고/거나, 개선시키는 조성물을 제안하는 것이다.

우선, 본 출원인은 지표수로부터 단리된 박테리아 균주 (또는 박테리아) LMB64로부터 유래한 박테리아 추출물의 조직 재생 및 피부 병변의 완치에서 유익한 성질을 입증하였다. 본 박테리아는 본 출원인에 의해 국제특허출원 제 WO 2012/085182호에 기술되었다. 보다 구체적으로, S0, E0 및 ES0로서 알려진 추출물이 기재되어 예시되었으며, 각각은 염기성 pH에서 수시간 동안 배양액을 배양한 이후에 바이오매스로부터 분리된 배양 상청액, 용해된 세포 바이오매스 및 이의 상청액으로 구성된다. 분획 E0 및 ES0이 시험되었으며, 이러한 추출물 E0 및 ES0은 사이토카인 및 성숙한 란게르한스 세포를 유도할뿐만 아니라 (E0의 경우), TLR2/TLR4/TLR5 수용체를 활성화하고, PAR를 길항하며, 항미생물성 펩티드를 유도하는 (ES0의 경우) 능력을 갖는 것으로 확인되었다. 이들 결과는 소양증, 건성, 습진 또는 아토피성 피부염과 같은 염증 질환의 치료에서 본 추출물의 용도를 고려할 수 잇도록 만든다.

놀랍게도, 본 발명자는 구체적으로 새로운 박테리아 추출물의 피부 신경성 염증을 예방하고/거나 치료하는 효능을 보여주었다.

실제로, 본 발명자는 본 박테리아 추출물이 물질 P에 의해 유도되는 IL-1β및 TNF-α의 각질형성세포에 의한 방출에 미치는 억제 효과를 갖는 것을 입증하였다.

제 1 구현예에 따르면, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 박테리아 추출물 및 피부 신경성 염증의 예방 및/또는 치료에서 이의 용도이다.

구체적으로, 피부 신경성 염증의 예방 및/또는 치료는 민감성 피부 또는 내성이 없는 피부의 보호 및/또는 치료를 포함하거나, 이들로 구성된다.

구체적으로, 피부 신경성 염증의 예방 및/또는 치료는 민감성 피부의 보호 및/또는 치료를 포함하거나, 이들로 구성된다.

구체적으로, 피부 신경성 염증의 예방 및/또는 치료는 내성이 없는 피부의 보호 및/또는 치료를 포함하거나, 이들로 구성된다.

박테리아 LMB64는 베타프로테오박테리아 (Betaproteobacteria) 과, 나이세리아세애 (Neisseriaceae) 아과에 속하는 것으로서 특성화되어 정의되었으며, 아마도 아직 정의되지 않은 새로운 속이다. 16S 리보좀 RNA (rRNA)를 코딩하는 유전자의 서열 분석으로 본 박테리아를 이와 95%의 서열 유사성을 공유하는 크로모박테리움 (Chromobacterium), 팔루디모나스 (Paludimonas), 루텔리아 (Lutelia) 및 글루벤카니아 (Glubenkania) 속에 근접하게 위치시키는 것이 가능하였다. 본 비-병원성, 그램 음성 박테리아는 지표수로부터 단리되었다. 보다 구체적으로, 박테리아 LMB64는 막대 모양으로 약 2.3 μm ± 0.3 μm의 길이 및 약 1.0 μm ± 0.1 μm의 너비 갖는다. 본 박테리아의 구체적인 특징은 극성 편모의 존재이다.

16S rRNA를 코딩하는 유전자는 거의 완벽하게 서열 결정되었다 (1,487 bp, 서열번호 1의 서열에 상응함). 박테리아 LMB64는 10,948 bp의 원형 플라스미드를 갖는다. 본 플라스미드는 완전히 서열 결정되었고, 서열은 서열번호 2에 나타낸다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 박테리아 추출물이 유래한 박테리아는 서열번호 2의 서열, 또는 서열번호 2의 서열과 적어도 80%의 동일성, 유리하게는 서열번호 2의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%, 더욱 바람직하게 적어도 98%의 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함하는 적어도 하나의 플라스미드를 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 박테리아 추출물이 유래한 박테리아는 베타프로테오박테리아 과, 네이세리아세애 아과에 속하는 비-병원성 그램 음성 박테리아이고, 상기 박테리아는 서열번호 1의 서열, 또는 서열번호 1의 서열과 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%의 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함하는 16S rRNA를 포함하고, 상기 박테리아는 서열번호 2의 서열, 또는 서열번호 2의 서열과 적어도 80%의 동일성, 유리하게는 서열번호 2의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%, 더욱 바람직하게 적어도 98%의 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함하는 적어도 하나의 플라스미드를 포함한다.

예로서, 이러한 박테리아는 본 출원인을 대신하여 국립 미생물 배양물 수집 기관 (CNCM)에 2010년 4월 8일자로 수탁번호 제 I-4290호 하에 기탁되었던 균주 LMB64로 대표된다.

본 박테리아의 비-필라멘트 특성인 황이 없는 배지 상의 성장 특징과 조합하여 이러한 유전형 정보를 갖고 있기 때문에, 당업자라면 본 발명에 따른 박테리아 추출물이 획득되는 또 다른 박테리아를 발견/동정하는 것이 전혀 어렵지 않다. 유전형으로는 약간 상이할 수 있지만 박테리아 추출물과 관련하여 본 발명의 표현형 판정기준을 충족하는, 또 다른 이러한 박테리아의 동정은 본 출원에 포함된 정보를 기초로 하여 극복할 수 있고, 당업자의 일반 지식과 조합한 국제특허출원 제 WO 2012/085182호에 포함되는 선별 방법에 따라 수행될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 두 개의 핵산 서열 사이의 "동일성 백분율"은 최상의 정렬 이후에 획득되는, 비교될 두 개의 서열 사이에 일치하는 뉴클레오티드의 백분율을 말한다 (최적의 정렬, 이러한 백분율은 순수하게 통계적이고, 두 개 서열 사이의 차이는 무작위적으로 이들 전체 길이에 걸쳐 분포함). 두 개의 핵산 서열 사이의 서열 비교는 통상적으로 이들을 최적으로 정렬시킨 이후에 이들 서열을 비교함으로써 수행되고, 이는 분절 또는 "비교창"에 의해 시행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 수작업에 덧붙여, 스미스 및 워터맨의 로칼 상동성 알고리즘에 의해 (Smith and Waterman (1981) Ad. App. Math. 2: 482), 니들만 및 운쉬의 로칼 상동성 알고리즘에 의해 (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443), 피어슨 및 립만의 유사도 검색 방법 (Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444)을 사용하여, 이러한 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어 (위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지에서 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, 또는 BLAST N 또는 BLAST P 비교 소프트웨어)를 사용하여 달성될 수 있다.

두 개의 서열 사이의 동일성 백분율은 비교될 핵산 서열이 이들 두 개 서열 사이의 최적의 정렬을 위한 기준 서열과 관련하여 첨가 또는 결실을 포함할 수 있는 이들 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된다. 동일성 백분율은 뉴클레오티드가 두 개의 서열 사이에 일치하는 위치의 수를 결정하고, 이러한 일치하는 위치의 수를 비교창에서 총 위치의 수로 나누고, 이들 두 개 서열 사이의 동일성 백분율을 획득하도록 결과에 100을 곱함으로써 계산된다.

예를 들면, BLAST 프로그램, 구체적으로 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 상에서 사용가능한 "BLAST 2 서열"을 사용할 수 있고 (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250), 디폴트 매개변수도 사용한다 (구체적으로, 매개변수의 경우 "오픈 갭 감점": 5 및 "연장 갭 감점": 2; 예를 들면, 선택된 매트릭스가 프로그램에 의해 제시된 매트릭스 "BLOSUM 62"임). 비교될 두 개의 서열 사이의 동일성 백분율은 프로그램에 의해 직접 계산된다. 다른 프로그램 예컨대 "ALIGN" 또는 "메가라인" (DNASTAR)를 사용하는 것도 가능하다.

본 발명에 따른 박테리아, 구체적으로 박테리아 LMB64는 서열번호 2 또는 상기 서열번호 2의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함하는 적어도 하나의 플라스미드를 포함한다. 상기 박테리아, 구체적으로 박테리아 LMB64의 다른 특징은 하기 실시예에서 상술될 것이다.

일반적으로, 용어 "본 발명에 따른 박테리아 추출물"은 발효 배지로부터 박테리아 세포의 단리, 구체적으로 냉동-해동에 의한 이들의 용해, 수용성 용매에 재현탁 및 액체 분획의 회수 이후에 획득되는, 세포질 성분, 가용성 세포내 세포 화합물, 가용성 막 화합물/분자, 가용성 막통과 화합물/분자, 가용성 세포질 주변 화합물/분자 및 가용성 편모 화합물/분자, 구체적으로 단백질을 포함하는, 박테리아의 세포질에 존재하는 가용성 화합물을 포함하는 세트를 설명하는데 사용된다.

용어 표현 "가용성 막 화합물/분자, 가용성 막통과 화합물/분자, 가용성 세포질 주변 화합물/분자 및 가용성 편모 화합물/분자"는 세포질 또는 세포질 주변 공간, 막 또는 막통과 공간 또는 편모에 포함되는 단백질 및 기타 가용성 화합물을 말하고, 이는 본 발명에 따른 박테리아의 용해에 의해 방출된다. 이들 단백질 및 화합물은 본 발명에 따른 방법에 의해 획득되며, 달리 말하면 발효 배지로부터의 박테리아의 세포 덩어리의 단리 이후에, 예를 들면 냉동-해동에 의해 용해된 박테리아의 세포 덩어리에 대해 수행되는 액체/고체 분리에 이어지는 액체 상의 회수에 의한다. 이들 가용성 세포질, 막, 세포질 주변 및/또는 편모 세포내 단백질 또는 화합물은 용해에 의해 방출되고 물 또는 수용성 용매에 가용성인, 예를 들면 리보좀, 세포성 대사와 관련된 효소, 지질다당류, 당, 지질단백질, 막 및 세포질을 포함한다.

박테리아는 이분법에 의해 증식하고, 이는 각 박테리아가 성장한 다음 세포막에 의해 형성된 격벽을 분할시킴으로써 분리된 두 개의 딸 세포로 분열되는 것을 의미한다. 세포 분열 동안, DNA는 자신 및 다른 구성성분을 복제한다. 다양한 합성 및 분해의 효소계가 세포 분열에 참여한다.

박테리아 성장은 박테리아의 모든 구성성분의 순서화된 증가이다. 이것은 박테리아의 수에서 증가를 가져온다. 성장 동안, 배양 배지는 영양분이 고갈되고, 박테리아에 의해 배양 배지로 분비되어 배출되며, 이러한 배지에 뿐만 아니라 대사성 부산물에서 가용화되는 생체분자가 농축된다.

용어 표현 "배양 배지"는 적어도 박테리아 성장 및 증식에 필요한 영양분을 포함하는 임의의 배지를 말한다. 박테리아는 액체, 고체 또는 반-액체 배지에서 성장할 수 있다. 바람직하게, 배양 배지는 성장 및 바이오매스의 회수를 허용하고, 본 발명에 따른 박테리아 추출물의 생산을 허용하는 액체 배지이다.

적절한 배양 배지는 박테리아 성장 및 증식을 촉진하는 영양분을 포함한다. 일반적으로, 적합한 성장 배지는 물, 탄소원, 질소원 및 염을 포함할 수 있다.

"발효 배지" 또는 성장 및 발달 종료 시의 박테리아를 포함하는 배양 배지에 해당하는 박테리아 배양물이 언급될 수 있다.

실제로, 본 발명에 따른 박테리아 추출물, 구체적으로 박테리아 LMB64의 추출물은 본 발명에 따른 박테리아의 성장, 발달 및 증식을 허용하는 배지에서 상기 박테리아의 배양 그리고 이들의 액체 상으로부터 분리, 예를 들면 원심분리 이후에 펠렛 또는 바이오매스의 형태로 세포의 회수로부터 획득될 수 있다. 이러한 바이오매스는 세포막 및 세포벽을 투과화하고 분해하도록, 예를 들면 냉동-해동에 의한 처리에 착수된다. 본 발명에 따른 추출물은 염기성 완충액으로 처리된, 구체적으로 해동된 바이오매스를 수집한 다음, 예를 들면 원심분리에 의해 혼합물의 고체/액체 분리를 수행함으로써 획득될 수 있다. 이에 따라 본 발명에 따른 추출물을 나타내는 수용성 상이 획득된다.

바이오매스는 발효 배지로부터 임의의 액체/고체 분리의 수단에 의해 회수될 수 있다. 따라서, 보다 구체적으로, 당업자에게 공지된 기법을 사용하여 주로 세포 전체, 표면 단백질을 포함하는 세포 잔해물 및/또는 박테리아의 세포질 주변 공간에 위치하는 단백질을 포함하는 세포성 바이오매스를 배양 배지로부터의 잔류 용질 및 박테리아에 의해 배출되어 발효 배지에 가용화된 생체분자를 포함하는 액체 분획으로부터 단리하는 것이 가능하다.

예시로서, 액체/고체 분리는 원심분리법, 침전법, 여과법, 한외여과법, 고정법 (settling)으로부터 선택되는 기법에 의해 수행될 수 있다.

바람직하게, 액체/고체 분리는 한편으로는 세포 및 세포 잔해물을 포함하는 고체 상, 즉 바이오매스 펠렛 그리고 다른 한편으로는 발효 과정 동안 배출된 가용성 분자 및 박테리아에 의해 소모되지 않은 배양 배지의 잔류 화합물을 포함하는 액체 상, 즉 상청액을 분리하기 위하여 박테리아 배양물을 포함하는 발효 배지를 원심분리함으로써 수행된다.

고체 상, 즉 획득된 바이오매스, 구체적으로 원심분리 펠렛으로 세포막을 파열시키는 단계, 예를 들면 냉동에 이어진 해동 단계에 착수한다.

냉동은 물을 고체화하고, 세포내 및 세포막간 결정을 형성하여 세포막을 적어도 부분적으로 파열시키는 임의의 마이너스 온도에서 수행될 수 있다.

구체적으로, 냉동은 -10℃, 또는 -20℃, 또는 -30℃, -40℃, -50℃, -60℃또는 약 -80℃의 온도에서 수행될 수 있다. 바람직하게, 냉동은 약 -20℃에서 시행된다.

냉동 시간 및 속도 자체가 중요하지는 않다. 냉동 시간은 온도에 의존할 수 있고, 예를 들면 1시간 내지 수시간의 기간이 적절하다. 또한, 냉동된 고체 상은 수일, 수주 또는 수개월, 심지어 필요하지 않은 경우 보관될 수 있다.

냉동 또는 해동의 비율도 역시 중요하지 않으며, 박테리아 세포벽 및 세포막을 변경시키는 조건을 찾을 수 있다.

용어 "해동"은 얼음 결정이 녹는 포지티브 온도로 회복시키는 것을 의미한다.

또한, 이러한 세포벽 및 세포막의 투과화 및 파열 단계는 예를 들면 세제, 무질서 유발제, 유리 비드와 같은 화학적, 초음파 또는 기계적 수단에 의해 수행될 수 있다.

이 단계는 결과적으로 이러한 용해된 또는 손상된 세포의 고체 상에 존재하는 가용성 세포질성 세포내 화합물의 방출을 허용한다.

다음으로 이러한 고체 상에 수용성 용매의 형태로 액체 상을 첨가하여 용해된 또는 손상된 세포를 재현탁시키고, 상기 용매에 용해된 세포질 가용성 화합물을 추출한다.

수용성 용매는 바람직하게 완충액, 구체적으로 염기성 완충액이다. 바람직하게, 이 염기성 완충액은 트리스 완충액 또는 아르기닌 완충액 또는 트리스-아르기닌 완충액이다. 바람직하게, 이것은 아르기닌 완충액이다. 아르기닌 농도는 0.1 내지 1 M, 구체적으로 0.3 내지 0.5 M 범위에 포함될 수 있다. 트리스 농도는 1 내지 100 mM 범위에 포함되고, 구체적으로 20 mM일 수 있다. 염기성 완충액의 pH는 8 내지 12, 바람직하게는 9 내지 11 범위일 수 있다.

이 재현탁 단계는 용해된 또는 손상된 세포의 바이오매스에 포함된 세포질 가용성 화합물의 추출을 허용한다.

마지막으로, 액체/고체 분리는 가용성 세포질 세포내 화합물을 포함하는 액체 수용성 상, 구체적으로 완충된 액체 수용성 상을 회수하도록 수행된다.

따라서 이 획득된 액체 상은 본 발명에 따른 추출물이다.

재현탁 단계를 위한 고체 상/액체 상 비율은 1 내지 10% w/v 범위에 포함될 수 있다.

염기성 완충액의 사용은 외부 막을 더욱 더 투과가능하게 만들고, 세포질 주변 공간부터 액체 배지까지 분자의 확산을 촉진하는 것을 가능하게 한다. 또한, 염기성 완충액의 사용은 화합물, 구체적으로 가용성 단백질을 안정화하고, 이들이 오랜 보관 기간 동안 응집하지 않고, 프로테아제의 작용에 의해 분해되지 않도록 막는 것을 가능하게 한다.

하나 이상의 여과 단계가 추출물을 정화하고, 정제된 본 발명에 따른 추출물을 생성하도록 수행될 수 있다.

여과는 액체 상 또는 완충된 액체 상을 정화시키는 임의의 적절한 수단에 의해 수행될 수 있다. 여과에 의한 이러한 정화는 두 번째 액체/고체 분리 단계에서 제거되지 않았을 현탁된 입자를 제거하도록 허용하고, 정제된 투명한 본 발명의 박테리아 추출물을 생산하는 것을 목표로 한다.

여과는 임의의 여과, 한외여과 또는 투과여과 수단에 의해 수행될 수 있다.

유리하게, 여과는 0.4 μm, 바람직하게 0.2 μm의 컷오프를 갖는 필터 또는 필터 카트리지 상의 여과에 의해 수행된다. 이러한 경우에, 박테리아 추출물은 박테리아 추출물에 존재하는 화합물이 0.2 μm 이하의 크기를 갖는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 정전기적으로 하전되지 않은 필터 또는 프리필터가 추출물 활성의 전부 또는 일부를 책임지는 생체분자의 임의의 흡수를 피하는데 사용될 수 있다.

상이한 단계가 실시예에서 더 자세하게 설명될 것이다. 본 상세한 설명과 관련하여 당업자에게 자명하게 여겨지는 방법, 배지 또는 단계 순서의 임의의 변형이 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로서 고려되어야 할 것으로 이해해야 한다.

일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 본 발명에 따른 박테리아 추출물을 제조하는 방법으로서,

a) 적합한 배지에서 본 발명에 따른 박테리아, 구체적으로 LMB64의 배양으로 박테리아 배양물을 획득하는 단계;

b) 상기 배양물의 액체/고체 분리 및 상기 액체 상의 제거 단계;

c) 상기 고체 상의 세포 용해 단계;

d) 바람직하게는 완충된, 수용성 액체 상에 상기 용해된 고체 상의 재현탁 단계;

e) 액체/고체 분리 및 상기 액체 상의 회수 단계; 및

f) 상기 액체 상의 조건부 여과 단계:

를 포함하는 방법으로 구성된다.

바람직한 구현예에서, 단계 c)의 고체 상의 세포 용해는 냉동에 이어진 해동에 의해 수행된다.

상세한 구현예에 따르면, 상기 박테리아는 서열번호 1의 서열, 또는 서열번호 1의 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함하는 16S rRNA를 포함하는, 베타프로테오박테리아 과, 네이세리아세애 아과에 속하는 비-병원성 그램 음성 박테리아이고, 보다 구체적으로는 박테리아 LMB64이다.

바람직하게, 상기 박테리아는 서열번호 2의 서열, 또는 서열번호 2의 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함하는 적어도 하나의 플라스미드를 포함한다.

일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기에 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 방법에 의해 획득되거나, 획득가능한 박테리아 추출물에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 피부 신경성 염증의 예방, 치료, 예방 및 치료에 사용되는 본 발명에 따른 박테리아 추출물, 구체적으로 본 발명에 따른 방법에 의해 획득되거나, 획득가능한 박테리아 추출물에 관한 것이다.

유리하게, 피부 신경성 염증은 민감성 피부 및/또는 내성이 없는 피부를 포함한다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 피부 신경성 염증의 예방, 치료, 예방 및 치료에 사용되는, 본 발명에 따른 박테리아 추출물 중 적어도 하나를 적어도 하나의 미용적으로 또는 피부과학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 미용적 또는 피부과학적 조성물에 관한 것이다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 민감성 또는 내성이 없는 피부의 보호 및/또는 치료에 사용되는, 본 발명에 따른 박테리아 추출물 중 적어도 하나를 적어도 하나의 미용적으로 또는 피부과학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 미용적 또는 피부과학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 피부 신경성 염증의 예방, 치료, 예방 및 치료를 목적으로 하는 의약 산물의 제조를 위한, 본 발명에 따른 박테리아 추출물 중 적어도 하나를 적어도 하나의 미용적으로 또는 피부과학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 미용적 또는 피부과학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 피부 신경성 염증을 예방하고/거나 치료하는 방법으로서, 본 발명에 따른 박테리아 추출물 중 적어도 하나를 적어도 하나의 미용적으로 또는 피부과학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 미용적 또는 피부과학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개인에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

유리하게, 피부 신경성 염증은 민감성 피부 및/또는 내성이 없는 피부를 포함한다. 본 발명에서, "미용적으로 또는 피부과학적으로 허용가능한"은 미용적 또는 피부과학적 조성물의 제조에 유용하고, 일반적으로 안전하고, 비-독성이고, 생물학적으로 또는 어떤 경우도 비-바람직하지 않으며, 명확하게 국소적 적용에 의해 미용적 또는 피부과학적 사용에 허용가능한 것을 의미한다.

상세한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 국소적 적용에 적합한 형태이다.

본 발명에 따른 미용적 또는 피부과학적 조성물은 활성 성분의 성질 및 접근성을 개선하기 위하여 구체적으로 피부 침투를 허용하는 부형제와 함께, 일반적으로 국소적 투여를 위해 알려져 있는 형태, 즉 구체적으로 로션, 폼, 젤, 분산제, 유화제, 스프레이, 세럼, 마스크 또는 크림, 젤리, 구체적으로 미셀 젤리일 수 있다.

이들 조성물은 일반적으로 본 발명에 따른 박테리아 추출물 중의 화합물에 추가하여, 생리학적으로 허용가능한 매질, 일반적으로 수계 또는 용매계, 예를 들면 알코올, 에테르 또는 글리콜을 포함한다. 이들은 또한 계면활성제, 복합화제, 보존제, 안정화제, 유화제, 증점제, 젤화제, 습윤제, 연화제, 미량 원소, 정유, 향료, 염료, 도말화제, 화학 또는 미네랄 필터, 보습제, 열수 등을 포함할 수 있다.

유리하게, 본 발명에 따른 조성물은 본 발명에 따른 박테리아 추출물을 조성물의 총 중량을 기준으로 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 3 중량% 포함할 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 하루 종일 편안하게 유지되는 보호작용을 제공한다. 구체적으로, 이것은 민감성 피부 및 반응성 피부, 명확하게 아기 피부에 적용될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 조성물은 민감성 피부를 예방하고/거나, 보호하고/거나, 치료하는데 사용된다.

일반적으로, 민감성 피부는 구체적인 피부의 반응성에 의해 정의된다. 이러한 피부 반응성은 고전적으로, 개인이 다양한 기원을 갖을 수 있는 촉발 요소 접촉에 반응하는 불편감 징후의 소견에 의해 발현된다. 이것은 민감성 피부의 표면에 화장품의 적용, 식품 섭취, 급격한 온도 변화에 대한 노출, 공기 오염 및/또는 자외선 또는 적외선이 관여할 수 있다. 또한, 연령 및 피부 유형과 관련된 요인도 들 수 있다. 따라서, 민감성 피부는 정상 피부보다 더 건조 또는 지성 피부 중에서 더욱 보편적이다. 본 발명의 관점에서, 민감성 피부는 과민성 및 내성이 없는 피부를 포괄한다.

이러한 조성물은 당업자에게 잘 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명은 이의 범주를 한정하지 않고 설명하는 하기 실시예를 해석하여 더 잘 이해될 것이다.

실시예 1: 박테리아 LMB64의 배양

예로서, 바람직한 배양 배지는 염화암모늄, 마그네슘 설페이트 및 효모 추출물을 포함한다. 또한, 국제특허출원 제 WO 2012/085182호 등에서 확인된 바와 같이, 다른 유사한 배지가 사용될 수 있음이 언급되어야 하고, 따라서 본 상세한 설명의 필수적인 부분으로서 고려되어야 한다. 당업자에 의한 임의의 적응도 역시 본 발명의 일부로서 고려되어야 한다.

배양 방법의 예가 하기에 기술된다. 본원에서는 이러한 실시예가 단지 설명적인 것이고, 제한하는 것으로 고려되지 않아야 함을 상기해야 한다.

균주 LMB64는 세 가지 단계, 즉 먼저 접종, 회분식으로 사전 배양 (사전 발효) 및 마지막으로 급식 회분식으로의 배양 (포도당의 첨가)으로 성장한다.

접종 단계: WCB LMB64의 튜브를 1000 mL의 멸균 배지를 포함하는 얼렌메이어 플라스크를 접종하는데 사용하였다. 다음으로 얼렌메이어 플라스크를 진탕 배양기에 진탕하면서 나두었다. 배양액의 세포 밀도가 충분할 때, 배양이 중단되었다. 다음으로 세포를 사전 발효기로 이동시킬 때까지 냉각하였다.

사전 배양: 사전 배양기를 다음으로 약 16 L의 배지로 채우고, 완전히 멸균한다.

탱크의 멸균화에 이어진 블록 첨가 이후에 두 개의 위성 바이알을 사전 발효기에 연결한다:

- 멸균 50% 포도당 용액을 포함하는 바이알. 이 용액 (포도당 회분 사전 배양)을 20 g/L의 초기 포도당 농도에 도달하도록 바로 배양 배지로 전달한다.

- 상기 접종 단계에서 기술된 접종물을 포함하는 얼렌메이어 플라스크는 사전 발효기에서 접종된다.

사전 배양을 시작한 다음, 자동적으로 조절된다. 예로서, 다음의 매개변수가 언급될 수 있다: 온도, 교반 속도, 압력, 공기 유속 또는 pO₂.

세포 성장이 620 nm에서 광학 밀도의 측정에 의해 모니터링된다. 사전 배양은 충분한 밀도에 도달할 때 냉각에 의해 중단된다.

배양: 발효기를 다음으로 pH 7.0으로 조정된 127 L의 배지로 채우고, 완전히 멸균한다. 세 개의 위성 바이알이 사용된다:

- 멸균 포도당 용액을 포함하는 바이알. 이 용액을 20 g/L의 초기 포도당 농도에 도달하도록 바로 배양 배지로 전달한다.

- 거품 제거제 병. 이 거품 제거제는 탱크에서 거품 수준을 조절하도록 배양 과정 동안 자동적으로 첨가될 것이다.

- 급식 포도당 병. 이 용액은 세포 성장을 지원하도록 배양 과정 동안 첨가될 것이다.

배양을 시작한 다음, 자동적으로 조절된다. 예로서, 다음의 매개변수가 또한 언급될 수 있다: 온도, pH, 교반, 압력, 공기 유속, pO₂.

배지에 처음 존재하는 포도당의 소모 이후에 (pO₂ 상승), 급식 포도당 용액의 첨가가 촉발되어, 고밀도의 세포 성장을 허용한다. 발효는 총 포도당의 소모 이후에 중단된다. 이 단계에서, 발효는 자동적으로 냉각되어야 한다. 배양 과정 내내, 세포 성장을 620 nm에서 광학 밀도의 측정에 의해 모니터링한다. 배양 종료 시 획득된 건조 바이오매스 (g/L)의 양을 중량 방법을 사용하여 결정한다.

실시예 2: 본 발명에 따른 분획의 추출

하기 실시예는 바람직한 구현예의 설명으로서 주어지지만, 제한하는 것으로 고려되지 않아야 한다.

본 발명에 따른 박테리아 추출물은 일반적으로 상청액을 제거하고, 바이오매스, 즉 세포, 표면 단백질, 세포질 주변 공간에 위치하는 단백질 및 박테리아의 세포내 단백질 (냉동 단계로 인한 존재)을 유지하기 위하여, 배양 단계의 결과를 원심분리한 이후에 획득된다. 원심분리 단계의 경우, 발효기부터 원심분리기까지 이동 라인이 무균화된다. 다음으로 발효는 원심분리기에서 연속적인 원심분리에 의해 분리되어야 한다. 원심분리는 10900 ± 1000 rpm의 통 속도로 150 L/시간 (± 30 L/시간)에서 수행된다. 세포가 일회용 백에 수집된다. 상청액은 한외 파스퇴르화 과정 동안 제거된다. 이러한 원심분리 단계가 -20℃에서 적어도 1시간 동안 펠렛을 냉동하는 단계로 이어진다.

110 리터의 트리스 아르기닌 추출 완충액이 발효기에 넣어 멸균된다. 실온에서 이전에 해동된 세포가 연동 펌프를 통해 발효기로 전달된다. 필요한 접촉 시간은 1 내지 7시간 범위에 포함된다. 일회용 백에 첨가한 이후 트리스 및 아르기닌의 목표 농도는 약 0.3 M L-아르기닌 및 20 mM 트리스이다.

다음으로 발효는 원심분리기에서 연속적인 원심분리에 의해 분리되어야 한다. 원심분리는 10900 ± 1000 rpm의 통 속도로 100 L/시간 (± 30 L/시간)에서 수행된다. 부분적인 고정이 유출물의 혼탁도에 따라 자동적으로 20% 혼탁도의 설정 지점에서 개시된다. 일련의 총 고정 작업이 분리될 부피의 절반에서 수동적으로 촉발된다. 상청액이 일회용 백에 수집된다. 세포는 한외 파스퇴르화 과정 동안 제거된다.

두 번의 여과 단계가 상청액을 정화하고, 본 발명에 따른 무균 박테리아 추출물을 유도하기 위하여 라인 상에서 수행된다. 여과는 여과/분배 시스템에 의해 조절된다. 일회용 깊이 필터 카트리지는 이의 필터 하우징에 배치된다. 여과 매니폴드는 여과 단계의 안전성을 보장하도록 이들의 압력 게이지를 장착하고 있다. 사전 여과 모듈을 대략 92 L ± 5 L의 정제수로 세척하고, 여과될 산물의 백을 연결하여 진탕시킨다. 마지막으로, 0.2 μm 30" PES 여과 카트리지가 여과 시스템의 나머지 부분에 연결된다. 여과는 연동 펌프를 사용하여 240 L/시간 ± 10 L의 초기 유속으로 수행된다. 필터 상류의 압력이 1.2 바에 도달할 때, 여과 유속은 감소된다. 여과된 산물의 전부가 400 L 일회용 백이 장착된 용기에 무균으로 수집된다. 여과된 산물의 백은 저울 팬 위에서 중량이 측정되고, 분배 시까지 +5℃에서 보관된다. 사용 후, 멸균 필터는 해체되고, 특성 테스트에 의해 검사된다.

실시예 3: 피부 신경성 염증에 미치는 본 발명에 따른 박테리아 추출물의 효과

본 연구의 목적은 피부 염증에서 본 발명에 따른 박테리아 추출물의 조정 특성을 평가하는 것이다. 해당 목적으로, 물질 P에 의해 활성화되는, 인간 표피 각질형성세포에 의한 종양 괴사인자-알파 (TNF-α) 및 인터루킨-1 베타 (IL-1β)의 생산 및 방출의 측정을 기반으로 하는 시험관내 실험적 접근법이 피부 신경성 염증의 시험관내 모델로서 제안된다.

연구는 정상 인간 표피 각질형성세포에서 수행되고, 이들 세포가 신생아 포피로부터 획득된다. 이들 세포는 통상적인 연구실 절차를 사용하여 무-혈청 배지에서 배양된다. 피부 신경성 염증의 마커가 테스트될 화합물 (본 발명에 따른 박테리아 추출물 및 기준 산물)의 부재 시 (대조군 조건) 또는 존재 시 배양되고, 선택적으로 물질 P에 노출된 이들 각질형성세포에 대해 결정된다. 각질형성세포를 물질 P에 의해 유도된 스트레스 3시간 이전에 및 이어지는 24시간 동안 처리한다. 전염증성 사이토카인 (TNF-α 및 IL-1β)의 수준이 물질 P (0.5 μM)의 첨가에 의한 염증성 스트레스의 유도 이후 24시간째 정량된다. 동시에, 선택적 NK-1R 저해제인 화합물 CP96345이 기준 산물로서 1 μM 농도에서 세험된다. 각 실험 조건이 은 두 명의 상이한 각질형성세포 공여자에 대해 시행된다.

TNF-α 및 IL-1β 생산을 배양 배지에서 측정하고, 효소-결합된 면역흡착 검정법 (ELISA)에 의해 정량한다. 통계적 분석 (* p < 0.05; ** p < 0.01 또는 *** p < 0.001)은 데이타가 정상도 테스트를 통과하지 못하기 때문에 비-매개변수 테스트 및 이어지는 포스트-혹 테스트로서 던 다수 비교를 사용하여 저해 백분율에 대해 결정된다.

IL-1β 방출 (pg/mg 총 단백질)에 대한 결과는 하기 표 1에 요약되어 있다.

물질 P에 대한 각질형성세포의 노출은 IL-1β의 실질적이고 통계적으로 유의한 방출을 유도한다. 1 μM CP96345로의 처리는 IL-1β 생산을 강하게 감소시킨다 (91%, p < 0.05). 이러한 결과는 NK-1R 저해제의 사용이 본 테스트를 입증하는 것을 매우 확신하게 한다. 본 발명에 따른 화합물로의 각질형성세포의 처리는 물질 P에 의해 유도된 IL-1β 방출을 농도 의존적으로 억제한다. 테스트된 첫 번째 농도 (1.64 μg/mL 단백질)가 유의성에 도달하지 못한 반면, 이러한 IL-1β 방출은 여전히 80%까지 감소시킨다. 5.45 μg/mL 및 16.36 μg/mL (μL/mL 단백질)의 농도에서는, 이러한 저해가 통계적으로 유의하다 (각각 93% 및 96% 저해, p < 0.05 및 p < 0.01).

TNF-α 방출 (pg/mg 총 단백질)에 대한 결과는 하기 표 2에 요약되어 있다.

물질 P에 대한 각질형성세포의 노출은 TNF-α의 실질적이고 통계적으로 유의한 방출을 유도한다. 1 μM CP96345로의 처리는 TNF-α 생산을 강하게 감소시킨다 (90%, p < 0.05). 이러한 결과는 또한 NK-1R 저해제의 사용이 본 테스트를 입증하는 것을 매우 확신하게 한다. 본 발명에 따른 화합물로 각질형성세포의 처리는 물질 P에 의해 유도된 TNF-α 방출을 농도 의존적으로 억제시킨다. 본 발명에 따른 박테리아 추출물의 테스트된 가장 낮은 농도가 TNF-α 방출을 60%까지 감소시킨다. 이러한 저해는 유의성 한계치에 도달하지 못하지만, 입증된 농도 반응 효과는 본 발명에 따른 박테리아 추출물이 본 테스트에 대하여 매우 활성이 있음을 보여준다. 16.36 μg/mL 단백질의 농도에서, 이러한 저해가 통계적으로 유의하다 (77% 저해, p < 0.01).

따라서, 본 발명자는 본 발명에 따른 박테리아 추출물이 물질 P를 통해 생산되는 사이토카인의 생산을 유의하게 억제할 수 있는 것을 입증하고, 따라서 본 발명에 따른 박테리아 추출물은 피부 신경성 염증의 치료에 효과적이다.

실시예 4: 정상 인간 표피 각질형성세포의 모델에서 선천성 면역의 유전자 발현 프로파일에 미치는 본 발명에 따른 박테리아 추출물의 효과

피부의 장벽 기능은 또한 미생물에 대한 방어를 포함한다. 표피는 선천적인 숙주 반응에서 활발한 역할을 담당한다. 피부 항미생물 시스템은 무엇보다도 특정 표면 지질 및 특정 성분 단백질의 존재를 기초로 한다. 이들 단백질은 항미생물 활성을 갖는다. 더우기, 표피 표면의 산성화는 피부 항미생물 방어 없이도 중요한 역할을 담당한다. 따라서, 피부는 물리적 장벽으로서 뿐만 아니라, 화학적 장벽으로서도 작용한다. 또한, 유도가능한 항미생물성 펩티드의 분비를 기초로 하는 선천성 면역의 적응성 구성요소도 존재한다. 후자는 표피 및 염증 세포에 침범하여, 세포 증식 및 사이토카인 생산에 영향을 미침으로써 염증의 매개인자로서 중요한 역할을 담당한다. 이들의 작용 방식은 세포내 대사를 간섭하기 위하여, 감염성 미생물의 원형질막을 파열하거나, 미생물에 진입하는 것으로 구성된다. 피부에서 가장 많이 연구된 항미생물성 펩티드는 β-디펜신 및 카테리시딘이다. 인간 β-디펜신은 인간 표피에서 발견된 항미생물성 펩티드의 주요 부류이고, 이들 중 네 개는 피부에서 HBD 1 내지 4로 확인되었다. 이들이 동일한 패밀리에 속하지만, 이들은 상이한 경로에 의해 조절된다. 인간 β-디펜신 2 (hBD2)는 4 kDa 헤파린 결합 펩티드이고, 주요 피부 항미생물성 펩티드 중 하나이다. hBD2 펩티드의 발현은 염증 상태를 반영하는 사이토카인 (IL-1α, IL-2β 및 TNF-α)의 분비에 의해 또는 박테리아 또는 곰팡이와의 접촉에 의해 유도가능하다.

본 연구의 목적은 정상 인간 표피 각질형성세포의 유전자 발현에 미치는 본 발명에 따른 박테리아 추출물의 효과를 선천성 면역과 관련된 두 개의 유전자에 대한 RT-PCR 기법에 의해 평가하는 것이다.

연구는 세 명의 공여자로부터의 정상 인간 표피 각질형성세포에서 수행된다. 이들 세포가 통상적인 연구실 절차를 사용하여 표피 성장인자 (EGF), 뇌하수체 추출물 (PE) 및 젠타마이신이 보충된 표준 배지에서 배양된다.

본 발명에 따른 박테리아 추출물은 3개의 농도, 0.4, 2 및 10 μg/mL (μg/mL 단백질)에서 시험된다.

이와 동시에, 염화칼슘 1.5 mM이 기준 산물로서 시험된다.

각질형성세포를 24-웰 플레이트에 접종하고(웰 당 50,000개 세포), 배양 배지에서 24시간 동안 배양한다. 다음으로 배지를 본 발명에 따른 박테리아 추출물 또는 염화칼슘 (기준 산물)을 포함하거나, 포함하지 않는 (대조군 조건, DMSO) 테스트 배지로 교체하고, 세포를 이러한 조건 하에 48시간 동안 배양한다. 이 배양 기간의 종료 시, 세포를 완충된 용액으로 세척하고, -80℃의 온도에서 바로 냉동한다.

마커의 발현을 각 조건 하의 세포로부터 추출된 총 RNA에 대해 RT-PCR 방법에 의해 분석한다. 총 RNA를 공급자의 지침에 따라 트리퓨어 단리® 시약을 사용하여 각 시료에서 추출한다. RNA의 정량 및 품질을 모세관 전기영동법에 의해 평가한다. cDNA를 올리고(dT) 및 전사인자 역전사효소의 존재 시 총 RNA의 역전사에 의해 합성한다. 다음으로 CDNA의 양이 중합효소 연쇄반응 (PCR) 단계 이전에 조정된다.

PCR은 공급자의 데이타에 따라 라이트사이클러® 시스템 (로슈사)을 사용하여 수행된다.

데이타는 마이크로소프트 엑셀 소프트웨어에 의해 분석된다.

증폭된 DNA 내로 형광 도입을 PCR 순환 과정 동안 계속적으로 측정한다. 이것은 각 마커에 대한 상대 발현 값의 형광 강도 및 PCR 순환의 횟수 간의 그래프 예시를 생성한다.

본 연구에 사용된 PCR 기법은 두 가지 기준 유전자 (RPL13A 및 TBP)를 포함하고, 이들이 구성적으로 발현되어 이론적으로 안정하기 때문에, 이들 유전자를 데이타 정상화에 사용한다. 결론적으로, 표적 유전자의 발현 수준을 모든 조건의 경우에 이들 두 가지 기준 마커의 평균 발현 수준과 비교한다.

매개변수 RQ (상대 정량화)가 상대 발현/100으로서 정의된다. 모든 결과를 반복 팩터로 표현하고, 이는 유전자가 RQ > 1이면 과다발현되고 또는 RQ < 1이면 과소발현되는 반복 횟수를 나타낸다. 하기 표 3은 처리 대 대조군 조건의 효과를 분류한다.

통계적 분석은 쌍을 이루지 않는 스튜던트 테스트에 의해 군집간 비교에 의해 수행된다.

결과

양성 대조군으로서 1.5 mM 염화칼슘을 사용한 정상 인간 표피 각질형성세포의 처리는 선천성 면역으로 표적화된 유전자의 강한 발현을 유도하고, 이러한 결과가 실험 조건을 입증한다 (도 4).

하기 표 5는 시험된 세 개의 농도에서 본 발명에 따른 박테리아 추출물의 효과를 요약하고 있다.

본 발명자는 본 발명에 따른 박테리아 추출물의 시험된 농도 모두가 HBD2 및 S100A7 유전자의 발현을 농도 의존적 방식으로 유도하는 것을 입증하고 있다.

본 발명에 따른 박테리아 추출물은 항미생물성 펩티드의 유도를 증가시키는 능력을 갖는다. 선천성 면역을 자극함으로써, 항미생물성 펩티드는 피부 방어를 유도하고, 피부 장벽을 보호하도록 돕는다.

이러한 결과 모두, 즉 피부 장벽을 보호하는 작용과 조합된 피부 신경성 염증의 감소는 본 발명에 따른 박테리아 추출물이 진실로 민감성 및/또는 내성이 없는 피부에 작용하는 것을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> PIERRE FABRE DERMO-COSMETIQUE <120> Nouvelle utilisation extrait bact?ien AV13 <130> B376032PCTD38412 <150> FR1854794 <151> 2018-06-01 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1487 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Nouvelle bact?ie LMB64, classe des beta-proteobacteria, issue d'une nappe phr?tique <400> 1 agtttgatca tggctcagat tgaacgcggg cggcatgctt tacacatgca agtcgaacgg 60 cagcacgggc ttcggcctgg tggcgagtgg cgaacgggtg agtaatgcgt cggaacgcgc 120 cgagtagtgg gggataacgc agcgaaagct gtgctaatac cgcatacgta ctgaggtaga 180 aagtggggga ccttcgggcc tcacgctatt cgagcggccg acgtctgatt agctagttgg 240 tggggtaaag gcccaccaag gcgacgatca gtagcgggtc tgagaggatg atccgccaca 300 ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat tttggacaat 360 gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gtctgaagaa ggccttcggg ttgtaaagga 420 cttttgtccg ggagcaaagc ctgcttgtta ataccgagtg gggatgagag taccggaaga 480 ataagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc aagcgttaat 540 cggaattact gggcgtaaag cgtgcgcagg cggttgtgca agtctgatgt gaaagccccg 600 ggctcaacct gggaacggca ttggagactg cacggctaga gtgcgtcaga ggggggtaga 660 attccacgtg tagcagtgaa atgcgtagag atgtggagga ataccgatgg cgaaggcagc 720 cccctgggat gacactgacg ctcatgcacg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 780 cctggtagtc cacgccctaa acgatgtcaa ttagctgttg ggggtttgaa tccttggtag 840 cgaagctaac gcgtgaaatt gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaag 900 gaattgacgg ggacccgcac aagcggtgga tgatgtggat taattcgatg caacgcgaaa 960 aaccttacct gctcttgaca tgtaccgaag cctgaagaga tttgggtgtg cccgaaaggg 1020 agcggtaaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080 tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcattag ttgccatcat ttggttgggc actctaatga 1140 gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttatg 1200 agcagggctt cacacgtcat acaatggtcg gtacagaggg tcgccaagcc gcgaggtgga 1260 gccaatctca gaaagccgat cgtagtccgg atcgcactct gcaactcgag tgcgtgaagt 1320 cggaatcgct agtaatcgca gatcagcatg ctgcggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac 1380 acaccgcccg tcacaccatg ggagtggggg ataccagaag tgggtaggct aaccgcaagg 1440 gaggccgctt accacggtat gcttcatgac tggggtgaag tcgtaac 1487 <210> 2 <211> 10948 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Nouvelle bact?ie LMB64, classe des beta-proteobacteria, issue d'une nappe phr?tique <400> 2 gggcgcagca ccatcgccca ggccaaaagc cacccgtgcc gattcggcgg cctgttgctc 60 gcgctcaatg cgctgcgcct ggtcggccaa gtcggcggct tgctgctcgg ccttgcccgc 120 cagggtgtca cgctcgcggg tcagttccgc cacctgctcg gctagggcat cgcgctcggc 180 ctcgatcacc tcaccagcgg ccgccagctc ggcggcttcg ctctgcgcct ggaccaagcg 240 gccctcgacc tcggcgcggg cctgggcggc tgcgcgctcg atctcggcgg caatggcggc 300 ggtcaatgcc tggggcagtt ccggcgcagc agcagcggcc accggccggg cctctcgcca 360 ggcagttaga tgcttgtgaa cggtattcgg gctgccggtg cccaaacgct cgcggatcgc 420 gcggatagtc ggctgctgcc cttcgccgac cagcgcatca gcggcggcgg cgaacgggtg 480 gcccgtgcag aggcccgcgt cgagcagatc gagcagcagg ccgccaaggc ggcacaggcc 540 cacgaagaag cccgcgccgc cgccacgcag gaagcccggc aagtgcaagc cgaacgcgac 600 gaagcccgca aggtggccgc cgaggcgcgc gagcagaccg cgcgcctggc tgggcaactc 660 gaagccctca ccgcgaagga gcgaaaagcc gatgaaagac cgtgaccaca acgaagcgat 720 ggccggcatg tttcaggccg acccccgatt tgccgccgac tatctgcgcc aggtgttggc 780 cgatggcgag cctaccgacg tgcgcgccgg cttgcggcaa atggcggatg tgctgcgcgt 840 cagtcaggcc gccgcgccga ccgattctgc gccttcggcg ggcctctttg accgggccgg 900 cgtgcgctac gaagtggcgt gcgatgtgat cggggcgttg attgcccatt acgccgaaat 960 catgggacgg gaacgcgagc aggcgcagcc gaatgaggcg gttttgcgcg tggccggagc 1020 catgaaggcg gcgctggccg gggagcggga tgatctcgat ccgcgcgata gcgccggcat 1080 cgaggcggcg atttcgcgct atgcgccact ggcgcgccgg ctgtatggcc aggctgaaaa 1140 cgaccacgcc cgccaggaac agcgtcgcgc cgatttcgac caggtgcatg cttcgctggc 1200 cttggagggg ctggccatga gcgcggacga tttggcggtt caggcgctgc tgatccgggg 1260 cgacattacc cacgatgagg cggtgcagtg ctaccgcatc ctgcatcgcc atgcgcggta 1320 aaaccgactg gccgcccgag gtggccggtg tgctgggttt gctcgaatcg cagccgccag 1380 aggcggcgat gctggtgggc tgttttctgg cggcggtagc ccatcccgat catgcggccg 1440 aattggcgat gttcgacaaa ttgccgccag cggcccggat ggtcgtcggg cgatttttcc 1500 tcgtttttct ggcgggcggc ctggacgatg ccgggcgcga aaaactgcat tcgcacatgc 1560 aggcatggtt tgtccgtcag cgccgttttc ggtgaatggc ttgcctcatc cactagggcc 1620 gggcaagggg tgaacagcgg gcgatgctgg cttgcgggac gaccccgcac ccccggaaaa 1680 cttgtcacac accacgcaac tcccgttgct tcgctaaaag ccttgtgccg caaggctttt 1740 agcgaggcga caccgaagac acatcgcggc gacaccgaaa gggccgaacc ggcctaaaac 1800 ccttgctgcg caaggagaac agccgcgctt tcgcgcgcga aagtgcttca aatgcctgtc 1860 ggcatcagca gggtatggat cggcacgccg aaggcgttgg cgatgcgctc caggttgtcc 1920 aaggagatgt ttctgacttg gcgctcgcag tgcgcaacga aggtgcgatg taggccgcac 1980 tcaaaggcga gcgcttcttg tgaccagcct ctttcccggc gtaatcggat catgttggcc 2040 gcgagcacgg cccgcgcgga atgcgcggtt ggtgcgggag gttgagcggc gggagacatg 2100 caaaccagtc tcctgatatg ccgcttttac gtcagccgtg tttaagtcac aatatggttt 2160 tctcatagag aaagacggcg tgacgatggg cagaaaaaca gcaatcaggc gagggggtgc 2220 cgtgttggcc agcctgttga tttgcgcaat tgaaccggtc ggcgcggcct ccctggtcgg 2280 cggtcaaacc gatgattccg tgtgcgacct gggcagcgcg ccacagaacg cccggaagct 2340 gtcggcagcg ggcgacttca tccgcgcgca gtgcaaaaac ggtcaaatgt tggtgggttc 2400 cggcatcgtg cctgccggcg ggtttgactc ggaagtggtg cgcctggcgc gcaccttctg 2460 ccgcatggcg gacattcaga ctcggcgcac gcagggcaac atggccggcc tcgtcatgga 2520 gatcgacgag gtacggtgca tcatcgggaa gttgccgaca tgagaaaagc gatgttggct 2580 ggctttctgg ccgttgtggt ggccaacgtg gttgccgctg agggcggtgc gcccttgcgc 2640 ggcggtgttt gcatcggacc gttccgtggc gctgattccg tcgtgcactg cgagcacatc 2700 ggcaaggtga cgatccgcca gatttacgaa aagggctttc gggtcgttca catgcaggac 2760 gacaagaaca cagccagcta cgttgtgctg gttatcgagg agcaggcgcg atgagggcga 2820 aagcgtggcg gatgctgttt gccgggcggc gctgggtgct ctggcttccc gtgccggcgt 2880 cggtatggct ggcactgccc gaatggcagc acattcccgc catgttgttg ggcggcctga 2940 tcgtgtggat tcccttctgg ctcgcgtggt ggctcagtga tggcttcgcg ggcatgtcca 3000 ggtggccagg aaccggcgca cctgcggtat ctggcggggt gaacccgcac accggcaagc 3060 catgcacggt gtatcaccag ccgtggggag ataccttcgt gggtggagac tgattatttg 3120 attgaggaac gatgacaagg gccagcaaca agctggccct tgtcgttttc tggactgttt 3180 tacccacaac atccgctctg ctgctgaatt ggcggacatg gcaccgagcc gaacgaacag 3240 aacacgcagc aatcccccgg cttggggcgc agcagcgtat ggcaggccgg gcactcgtag 3300 tagaactggc aggcgtccgt gggcatggtt tcctgctgtg cgtggccgca gtgcgggcag 3360 gtcagcacgg attcgagaat gacggcgctc atcgtggcgt tacctctgca cggtggacgg 3420 atagcctgcg ttcgtcgttg ccgaggtcaa cgcttccggc ttggccttgt cggcgtcata 3480 ggtgacggtg gccgttttct tgtcgaaatc gaccttgacg gcgctcacac cgggcacttt 3540 ctccagcgac ttcttgactg tgatcgggca tagctcgcag gtcatgttct gaacggccag 3600 cgtgacggtt ttcggggtgg cggccagcac ggcgagcggc acggcagcca gcagagcaat 3660 cagcagtttg cgcatgggag tctcctttca atagaacagc ggggcgaacc acggcacggc 3720 caacagggca agcaacagca cagtgacgat ccagaacgtc aggcgctgcc gctggcgtgt 3780 gcgcggatca gcgcatggcg tgccgggcgt gcagacctgc ggcaccagat agagcttgcg 3840 gaaggccagt ccgagaaaga gcagcgtcat gccgatgaaa aagggccggt acggctccat 3900 cgcggtcagg ctgccaaccc atgagccacc aatgccaagc accagcagga caagcggccc 3960 gacacagcac accgacgcgc cgatggcggt cagtacgctc acgatcaacg agcttttttc 4020 agtgagtcgt gccatgtcgc tttccttgta cctgtttgcc caagtgttac tctaaatccc 4080 gtacctaagt acggagtcaa gggggtgtga tgggaacaga actgaccatc ggcaagctgg 4140 ctgacgctgc cggggtgaat atcgagacga ttcgctacta ccagcggcgc ggcctgctgg 4200 atgagccgcc taaaccgcca ggggggcatc ggcgctatgc gcctgagcag gcaaaacgtg 4260 tgcgatttat caagcgggca caggcgcttg gtttcacgct ggacgaggta ggcgcgctac 4320 tgaccctgga tgcggcctgc gcctgcggtg agacgcgagc gctggctgtg cgcaagctgg 4380 gtctgatcga gcagaagatg gctgacctcg cggccatgcg gcaggcgctg ggtggattgg 4440 tgcagcagtg tgatgcgggc gacggtggag ccagctgtcc catcatcgac gtgctggcag 4500 gtaattagat gtgttcaaaa aatggtggtt ttctggacac atgccggttt gccctgtcct 4560 gagttgtcct gatgcgttaa agtgttcatt tattcgttca gctttcaatg tggcggaact 4620 gttcatgaat caacgcatcg gctatgcccg cgtttcgacc gacgaccaaa acctagacct 4680 gcaacgggac gcactccggc aggctggatg ctcaaccatt tacgaggaag cagccagcgg 4740 aaagagcgca gcaaggcccg agcttgagca gtgtcggaag gctctccggc ccggcgacac 4800 gcttgtggtg tggcggcttg atcgccttgg gcgcagcctg cccgacctgg tgcagatcgt 4860 ggctgatctt gaacagcgcg gcgtgcattt cgagagcctg accgagaaga tcgagacggg 4920 gagcgcagcg ggtaagctgc aattccatgt tttcgctgca ctcgccgagt tcgagcgcgg 4980 cctgatccgg gagcgaaccc gggcagggct ggatgcagct cgcgcccgtg gccgatccgg 5040 tggacgcaaa ccgaagctgg acgccaagca gatacgccac attaaggcgc tactacgtga 5100 cccgaatacc tgtgttgctg aactcgcccg tgactacggc gtgtcgagaa caactatcta 5160 taaacactgc ggtgtggttc tgccgcgtac agccgatgaa ggggcaatat gacaaaaaag 5220 acaacagcat tcgatgtatt cgagaaatgc gtccaagcag ttcaggctgg tgaactgatc 5280 gaatccgttt ctgcgaagga caaggaattc catttccaga actggtttca gaagcgcctc 5340 cagagcctgt cgatgcactt cgaggggtcg ggtcgcaaca cctacccgga cttctgcttg 5400 gtagagcaca ccgagggcta cgagatcaag ggtttggcat ggcctggccg cgagcgcgac 5460 tacgactcga acagccaagt gccgactggc tatcacaacg gccgtcaaat cttctacgtg 5520 ttcgggcgct accccgcaga cctgtctggc tatgccgatc agggcaacgg ccgcaggcag 5580 tacccggtgg ttgacctcgt ggtctgccac ggcgacttcc tcaacgccga tcacaactac 5640 gtccataaga acaagagcgt aaagggcttt ggcacctacg gcgacatcat gatccgcgac 5700 cggaagatgt acgtcgcgcc gacgccattt gcgctgaccg aaggcaccac tggcctgatg 5760 actttgatcc tgccggagaa cttcggcacc gatgaccgtt accaggtggt cggtaacctc 5820 actcgcgtcg aggcggaaac gctggtggtt ggctacaact ttgacctgcg cacgaacgag 5880 ctgagcgcag agcgcgtgcc caatcccaac gcaggcaccc agcaccgatt cgtggcctac 5940 cggctcaagg atcaagcgag caagcctgtc tccatgactg gcacccaggt gcagcccgac 6000 gagaacaacc tgccggacga cgaatgaaca ccatcaccga caagatcggg ttcgcttacc 6060 cggttgcagc gaccgcgctg gagtgcgact tcccgctggt cgaaatcagc cagatcgccg 6120 agcaggaaag ttggcgaaag gagatcaaca ggccgatcta ccacatccac aagtggtggg 6180 cgaccagact tgggtcggtg tttcgtggca ttacccttgg tgctttgagt cagcctggta 6240 ctgacctctg ggcgcagttc tacaaaacgc acgacctggc cggtaaggta gtgctcgatc 6300 ccttcatggg cagtggcacg acgcttggcg aggccgtcaa gctgggtgcc aaggccatcg 6360 gctgcgacat caacccagtc agtaccttcc tcgtacgtca ggcgttcacg ccggcgtccg 6420 aggcagagct gcgtgccgct ttcgagcggc tggaacgtga cgtggcaccg gagattcggc 6480 gctactacca gacgcgcgat cctaagacgg gcgagctgat tcaggtcttg tactacttct 6540 gggtcaagac ggtgacgacg cccgagggcg aggtaatccc cttgctgtcg cgctacgtgt 6600 tttcacaaga cgcctacccg aagaagaagc cgcgagcgca gatcgtgtgc cctggctgct 6660 ggagtgtgct ggaggatcgc tacgatgcga ctgacctgca ctgccagcac tgcggccacc 6720 agttcaatcc gcaggaaggc ccggccgctg gtcagtacgt caaaaccaag ggcggtcacc 6780 gttaccgcat caaggaacta ctgccaaagg acggtacgcc gccctctcat cgaatgtacg 6840 cgatgatggc cttgcgagcg gatggatcga aggtctatct gccggtgcgg aatgaggact 6900 tggccctcta cgaggaagcc caagaacgcc ttgctacaga ggcactgccg ctgccgaaaa 6960 cctctgttcg acctggccac aacaccgacc aggcgcgcgg ctacaactac acccaatggc 7020 gcgacttctt caatgcgcgc caactgctgt gccttggcct gctgctgcgg gaaatcctga 7080 ccatcgacga cctggcagtg caagagcaga tgctgtgctt gttctccagc accttggagt 7140 tcaacaacct gttttgcagc ttcaagggtg agggaacagg ggccgtgcgg catatgttct 7200 cgaaccacat cctcaagcca gagcgcaccc cgctggagaa ctccgtgtgg ggcactggca 7260 agagcagcgg tacgtttagc acgttgttcg agtctcgcct gctacgtgcg aagcgctacc 7320 tcgatgagcc gttcgagatc gcgttcgagc atgaccagga cggtaaccgc gcaggctcgc 7380 gcaagacggt ggctagccat ccgatccgcg cccgtcgcgt cgaaacctgg ccggaattgg 7440 aggccgcaga tcatggcctg ctgatcctca acggtgacag ctcgaagctg ccggtgcccg 7500 ctggttcggt ggatgccgtg gtgactgatc cgccctactt cgacttcgtt cattactcgg 7560 agttgagcga cttctttttt gcttggctca cccctgtgct gcgccagcgc tatccgtgga 7620 tggcccgcga ggactcgtct gaccaagggg aggtgcagca caaagaccct cgtgtgttcg 7680 cccgtcagct tgcgtcggtg ttcacggagg cgtgccgcgt gcttaaggac gatggagtgt 7740 tggcgttcag cttccaccac tcgcgtgccg agggctgggc ggccatctat gaagcgatca 7800 acaaggcggg cctggccgta gttgcggctc accctgtcca tgccgagctg cgcgcggcaa 7860 gtcccaagac tgcggccaaa gacccgatca gccttgatgc gattctggtg tgtcgcaaaa 7920 aggcgtttgc cctgcaccag tcgcctgcta tccaggatgt ccgccaggct gttgatgcgc 7980 tggcatcacg gctgcaagct gctggccttc gcatctcggc gggtgaccgc ttcgtgatcg 8040 gcgcagcgca aaccttgatt gcacgcgctg ctgatgacat gggcttcgac gagatcaagg 8100 ttgatcttga ggcaattcgg ctggccgtgg ggccaagggc tgcaacatca aaggctgcga 8160 gtgcgtggga tgacgatgtg cccttctgat tggctgcacg gccttgtcgg cgcatgcgtt 8220 ttgatggcag ccgctgcacg caagccgcgt ccctccgcgt aaagttcatt tatacgcaaa 8280 tacgtatttg cgtgatacaa taacgccata ttaatggagg tgcgtaaatg cggactattg 8340 ttgtggctag ccaaaaaggt ggcgtcggca agacaacgat tgcaggtcac ttgggtgtca 8400 tggccgagca gagcaaagag gggccagtgg cgctgatcga cacagaccca caaggctcgc 8460 tcgcgtcctg gtggaatgag cgaaccaatg aggcaccgct gtttgcacgg gtggaaatcg 8520 gcaagctgac cgagcacctt caggcattgt ccaagggtgg catcaagctg gccatcatcg 8580 acaccccgcc ctctgttacg gaaatgattc agcaggtgct ccgcaccgcc gacttggtac 8640 tgatccccac caggccgagt ccgcatgact tgcgcgcggt cggatctacc gtcgaactgg 8700 tggagaacgc aggcaagcga atgatcttcg tcatcaatgg ggcggcacct cgcgcgcgga 8760 tcgcgggtga ggctgccgtg gcgctttcgc agcatggcac ggttgccccc gtgacgctgt 8820 accagcgcac cgacttcgcc agctcgatga tcgacggccg caccgtccag gaaatcgacc 8880 ccaaggggcg gtcggccgaa gaaatcgggc agttgtggaa atacgtatct acacaactgc 8940 gtaaaatttg atataatacg tacatgcgta ttaatggaga tacgtaaatg gctaaaactg 9000 catctttgac tgccggcctg gtggccaaga aaggggaggc gtcccctgct acggttgtcg 9060 cggcacccca ggttcaacct atcgaagtga aggcatcggc gactggcggc ggccgggatt 9120 actacaaggc gttgaccgtc aagttggatc gtgaccgcta cgagagtctg aaaagcatgg 9180 gcgtgaagct ggacaagaag agccaggaaa tctttgtcga ggccctggat ttgtggatga 9240 agtcggccgc tggccagcaa cacgcctaag aggcccctat gcgttcagtg cgctctgccg 9300 tcgaactcgc caaggagttg gccgaaaaag ccaaggcccg ccgcctagcg gcggaaaaga 9360 acgagctggg acttgaaggc ccggcgcagg gcaacgccgg caccactccc agcccggtga 9420 aggttgcggc cgaagtggtg ggcgagcagc cggcacgacg caagggagcg ccgaaagggc 9480 cgcgtggcct gatgccggtg catcatccaa accgcgattt cttcttgtgc gatctgtttg 9540 actacgccct aaaggatgac ggcgtgagca tggaggcccc catcttcacc ttggcaacca 9600 ggccggacac ctctgtttgg cattgggaaa gcaaggatgg gacacgcgcc atcaccgtca 9660 cgccaagcgt gaaggggagg gccacgcagt ttgataagga tttacttatt tacgtagtta 9720 gccagatgac cgaggctatc aatcgcggtc ggcctgatgc gaacaatcga accgtgcgct 9780 ttcgcgtcta tgactacttg gtctcaacca acaagccgac tggcggcaag gagtaccagc 9840 gactggagga tgccctagac aggctgcggg gtacatcgat caagacgaac atcaagacgg 9900 gtggccagcg tgtgaaggaa ggcttcggca tcgtcgatag ctggacgatc atcgagaagg 9960 cccccgacga tgaccgcatg attgccgtcg aggtcacgct ctccaagtgg cttttcaatg 10020 cagtgcaggc ccacgaggtt ctgaccatca acccggacta tttccggctg cgtaagccaa 10080 ttgagcgccg tttgtacgag ctggccagga agcactgtgg cgaccaggcc ttttttgtga 10140 ttgggctgga actgttgcag gacaagtgcg gcagcaagtc ggcactgttc gagttccgcc 10200 gtgccttgcg cgagatcatc aaggccgaca ccttgccaga ctaccgcatg acgcttgatg 10260 acgagaaaga ccaggtgatt ttctacaccc gcgacacgaa gaagctagcg gcgtctaccg 10320 ctctggcccg gcgcttccag tgacgcccaa agtattgacg gtcaatactt cgttatttca 10380 cccatgcggt gttaccgctg cgtgttggac gttcccttga cctagcggcc gaggcagggc 10440 tttcgcgctt tgcattgagc caccaagtgc gtctcgctcc ttcgagcatc aagccctaac 10500 gcgtttcatg tcactttcgc gcacgaaagt cgaggcaaga ggcttgatcg tgtctatcgt 10560 tacatcaccc atgcctgtgg atggacacgt tacatcaccc atgttttctg tggatgggca 10620 cgttacatca cccatacctc acttcgttac atcgcccatg cagcgatttg tggaagcctt 10680 gagcagcaag gctttacgag cgttatccac agccgtaaca cgcgcgcgcg attttttaac 10740 tttataaatc tttaacgcgg ttgcggacaa agcccgcgcc gcctcttggg ggctacgccc 10800 ccgccggctc ctacgggccg caagcggccc tccgcccgcg cttcgcgctc cctcccggca 10860 tccccgaggg gtttcgcttc gctgcacccc tcgcgcttcg cgctcacccg catatcgagg 10920 cccccaaagg gggccggatg gtgccccc 10948

Claims (11)

1. 베타프로테오박테리아 (Betaproteobacteria) 과, 네이세리아세애 (Neisseriaceae) 아과에 속하는 비-병원성 그램 음성 박테리아의 박테리아 추출물로서, 서열번호 1의 서열을 포함하는 16S rDNA 및 서열번호 1의 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함하고, 상기 박테리아 추출물은
   a) 적합한 배지에서 상기 박테리아의 배양으로 박테리아 배양물을 획득하는 단계;
   b) 상기 배양물의 액체/고체 분리 및 상기 액체 상의 제거 단계;
   c) 상기 고체 상의 세포 용해 단계;
   d) 바람직하게 완충된, 수용성 액체 상에 상기 용해된 고체 상의 재현탁 단계;
   e) 액체/고체 분리 및 상기 액체 상의 회수 단계; 및
   f) 상기 액체 상의 조건부 여과 단계:
   를 포함하는 방법에 의해 획득되는, 박테리아 추출물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 재현탁 단계 d)의 상기 수용성 액체 상은 완충액, 구체적으로 염기성 완충액인 것을 특징으로 하는, 박테리아 추출물.
3. 제 2항에 있어서,
   상기 염기성 완충액은 트리스 완충액, 아르기닌 완충액 또는 트리스-아르기닌 완충액으로부터 선택되는, 박테리아 추출물.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 박테리아는 서열번호 2의 서열 또는 서열번호 2의 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함하는 적어도 하나의 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 박테리아 추출물.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 박테리아는 CNCM에 2010년 4월 8일자로 수탁번호 제 I-4290호 하에 기탁된 LMB64인 것을 특징으로 하는, 박테리아 추출물.
6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
   피부 신경성 염증의 예방 및/또는 치료에 사용되는, 박테리아 추출물.
7. 제 6항에 있어서,
   상기 피부 신경성 염증은 민감성 피부 및/또는 내성이 없는 피부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 박테리아 추출물.
8. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 추출물 및 적어도 하나의 미용적으로 또는 피부과학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 미용적 또는 피부과학적 조성물.
9. 제 8항에 있어서,
   상기 미용적 또는 피부과학적 조성물은 국소적 적용에 적합한 것을 특징으로 하는, 미용적 또는 피부과학적 조성물.
10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서,
    피부 신경성 염증의 예방, 치료, 예방 및 치료에 사용되는, 미용적 또는 피부과학적 조성물.
11. 제 10항에 있어서,
    상기 피부 신경성 염증은 민감성 피부 및/또는 내성이 없는 피부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 미용적 또는 피부과학적 조성물.