BR112020023771A2 - extrato e composição dermatológica compreendendo o mesmo para o tratamento de peles sensíveis - Google Patents

Abstract

“extrato e composição dermatológica compreendendo o mesmo para o tratamento de peles sensíveis”. a presente invenção refere-se a um novo extrato bacteriano que pode ser útil na proteção e/ou no tratamento de pele sensível e/ou de pele intolerante reativa, especialmente por uma ação direcionada na inflamação neurogênica cutânea. a invenção tem igualmente como objetivo composições cosméticas ou dermatológicas compreendendo tal extrato bacteriano como agente ativo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “EXTRATO E COMPOSIÇÃO DERMATOLÓGICA COMPRE -

ENDENDO O MESMO PARA O TRATAMENTO DE PELES SENSÍVEIS”. Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a um novo extrato bacteriano que pode ser útil na proteção e/ ou no tratamento de pele sensível e/ou de pele intolerante reativa, especia l- mente por uma ação direcionada na inflamação neurogênica cutânea. A invenção tem igualmente como objetivo composi- ções cosméticas ou dermatológicas compreendendo tal e x- trato bacteriano como agente ativo. Estado da Técnica

[002] A epiderme é um epitélio pluriestratificado que exerce uma função barreira de proteção contra seu ambiente e suas agressões. Entre suas múltiplas funções fisiológicas, a epiderme tem a função de constituir uma barre ira ao mes- mo tempo biológica, física e química contra a invasão de mi- cro-organismos no organismo. Esta propriedade de barre ira física da epiderme está especialmente relacionada com sua estrutura. Por conseguinte, a epiderme é convenciona lmente dividida em uma camada basal de queratinóticos constituindo a camada germinativa da epiderme, uma cam ada dita espi- nhosa constituída de várias camadas de células poliédricas e, por fim, um conjunto de camadas super iores denominado camada córnea (ou estrato córneo), con stituída de querati- nócitos no estágio terminal de sua diferenciação denomina- dos corneócitos. As propriedades de barreira qu ímica da epi- derme dependem, particularmente, da liberação na superfície desta última de numerosos peptídios antim icrobianos. Uma disfunção da organização estrutural c elular epidérmica, ou uma falha da função barreira química da ep iderme, pode se traduzir em um estado inflamatório cutâneo.

[003] A inflamação é uma reação de defesa imunológica normal do organismo a uma agressão do tipo: infecci osa, térmica, mecânica, química, lesional ou mesmo alérgica. Ela se caracteriza em quatro pontos que são: manchas verm e- lhas, queimação, edema e dor. A inflamação cutânea aguda é uma resposta imediata a um agente agressor, de curta d u- ração (alguns dias ou semanas), de instalação frequent e- mente bruta e caracterizada por um edema intenso. As i nfla- mações agudas curam-se espontaneamente ou com tr ata- mento. A cronicidade aparece quando a inflamação não se cura espontaneamente, persiste ou se agrava por vários me- ses ou mesmo vários anos. A reação inflamatória é um pro- cesso dinâmico que compreende várias etapas sucess ivas: vascular (vasodilatação), diapedese dos leucócitos e quimio- tactismo das células imunes e, para terminar, desbridamento. A diapedese leucocitária corresponde à passagem ativa pe- las paredes vasculares e ao acúmulo de células imunes cir- culantes, linfócitos, neutrófilos e monócitos no ambiente da lesão. Os neutrófilos têm a função de atrair o utras células inflamatórias por quimiotactismo e limpar o sítio ferido secre- tando substâncias antimicrobianas e proteases. Os monóc i- tos migram por quimiotactismo e se diferenciam em macrófa- gos limpando a zona lesionada. Eles secretam fat ores de crescimento, citocinas inflamatórias, tal como IL-1, especi- almente IL-I, TNF, proteases, prostaglandinas e IFNs per- mitindo a manutenção e/ou a amplificação da infl amação. O desbridamento ocorre depois da fase vascular e ao mesmo tempo em que a diapedese leucocitária. Isto si gnifica a eli- minação dos tecidos necrosados e dos a gentes patogênicos.

[004] Inflamação neurogênica cutânea é definida como a indução e/ou a amplificação de um processo inflamatório primário pelas terminações nervosas e, portanto, significa uma inflamação da pele induzida pela ativação das fibras nervosas intraepidérmicas que secretam neuropeptídios tais como a substância P. A inflamação neurogênica cutânea e stá particularmente envolvida em peles sensíveis, peles int ole- rantes reativas e mesmo em dermatoses inflamatórias pr uri- ginosas. O prurido é definido como uma sensação desagra- dável que provoca a necessidade de se coçar. Recent emente surgiu a notação de pruriceptores, receptores espec íficos que permitem perceber o prurido, mas sua distinção da famí- lia dos receptores nociceptivos ainda está sendo disc utida. Estes pruriceptores usam as fibras intraepidérmicas do tipo Ao e especialmente aquelas do tipo C. Eles secretam neuro- peptídios: a substância P, o peptídio relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) e o peptídio intestinal vasoativo (VIP). Recentemente foi estabelecido o papel das proteases (tripsi- na, catepsina G, trombina etc.) na indução de prurido. Na verdade, seu receptor PAR-2 foi definido como a segunda grande via de ativação de prurido (Misery et al., Nat. Rev. Neurol 10, 408- 416, 2014).

[005] As fibras nervosas intradérmicas interagem dir eta- mente ou indiretamente com as células cutâneas e com as células do sistema endócrino, linfático e imunológico. Estas comunicações levaram à definição de um sistema neuro - imuno-endócrino-cutâneo. Para funcionar, este sistema pre- cisa de uma linguagem comum constituída de moléculas de diferentes naturezas, neurotransmissores, citocinas e fat ores de crescimento. Estas moléculas são sintetizadas e lib eradas pelas células da pele, pelas células imunes residentes e re- crutadas, bem como pelas terminações nervosas intra epi- dérmicas. As células epidérmicas e dérmicas podem igual- mente produzir neurotransmissores, enzimas, neurotr ofinas, citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento. Estes medi- adores regulam a inervação cutânea e a respo sta inflamató- ria. Em caso de inflamação, as células imunes em trâ nsito ou presentes constitutivamente na pele podem ser at ivadas sob a além dissociação desses mediadores secret ados pelas terminações nervosas sensoriais e pelas células da pele. Es- te processo leva a uma segunda onda de liber ação de citoci- nas e neurotransmissores, que geram um ciclo de ampl ifica- ção da inflamação.

[006] Um novo conceito surgiu recentemente, sugerindo que os queratinócitos também são atores importantes da i n- flamação neurogênica cutânea.

[007] A inflamação neurogênica cutânea gerada por ne u- ropeptídios está envolvida na reatividade das peles sens íveis e também das peles intolerantes. A noção de pele se nsível reflete o nível de sensibilidade da pele de cada pess oa. Em- bora seja possível ter uma pele sensível em qualquer idade, isto é extremamente comum nos bebês e nos idosos. A pele dos bebês tem uma espessura que representa cerca de um quinto da espessura da pele dos adultos, e cons equentemen- te ela é extremamente sensível a agressões qu ímicas, físicas e microbianas, bem como aos raios UV. A função de barreira da pele dos adultos, por si só, enfraquece progressivamente com a idade, paralelamente à desaceler ação dos processos metabólicos. O envelhecimento da pele leva pouco a pouco a uma deficiência de lipídios, o que deixa a mesma mais facil- mente irritável por substâncias alcal inos tais como sabonete.

[008] Quando a pele apresenta um limiar de sensibilid ade muito baixo, isto é, ela reage de forma exacerbada à m enor agressão externa, ela será chamada de p ele intolerante, ou ainda pele intolerante reativa. As peles intolerantes são mais vulneráveis às agressões externas e caracterizam -se por um desconforto diário e uma forte irritabilidade. Alguns sinais, mais ou menos acentuados, permitem reconhecer tais p eles. A pele intolerante do rosto fica, por exemplo, vermelha e formiga. Ela repuxa, fica quente ou coça. Ela também pode provocar a sensação de queimação. As peles intolerantes geralmente apresentam um perfil alérgico e são, consequen- temente, particularmente sensíveis aos componentes de pro- dutos cosméticos.

[009] A pele sensível é, de fato, propensa a picadas, s u- peraquecimento, formigamento e coceira, às vezes acomp a- nhada de manchas vermelhas. Estas sensações de desco n- forto aparecem de forma exacerbada como reaç ão a estímu- los que não desencadeariam irritação na pele normal. Esta hipersensibilidade da pele é resultado de uma redução de seu limiar de tolerância. Quanto mais sensível é a pele, mais baixo é seu limiar de tolerância e quando o limiar de tolerân- cia estiver em seu nível mais baixo, este tipo será chamado de pele intolerante. Esta hipe rsensibilidade pode ser expli- cada por diferentes fatores: - uma reação inflamatória que se desenvolve ao contato com substâncias químicas irritant es tais como certos tipos de sabão, detergentes domésticos ou poluição; o limiar de ati-

vação dessas substâncias dando assim origem à pele sensí- vel ou pele intolerante. - uma alteração da função barreira da epiderme. Este fenômeno favorece então a desidratação e pele e principal- mente a penetração de agentes potencialmente irritantes; - fatores psicológicos, como estresse; - fatores hormonais; - fatores físicos tais como sol, mudanças de temperatura (calor / frio), vento, climatiza ção, aquecimento, água dura.

[0010] A pele é coberta por uma película protetora, ch a- mada película hidrolipídica de superfície. Esta película con s- titui a barreira mais externa, assim como a mais frágil, a mais perturbada e mais representativa da saúde da pele; ela é constituída em grande parte de corpos adiposos excret a- dos pelas glândulas sebáceas e lipídios provenientes da d e- gradação de células durante a fase de queratinização das células córneas, bem como de compostos hidrofílicos, tais como a água do suor, glicerol, ureia, fatores naturais de h i- dratação da pele, sais, metabólitos da flora cutânea, etc. E s- ta película de superfície fica muito exposta e é muito sens í- vel aos estresses ambientais, aos hábitos de higiene, e ao estado da pele. É importante preservar, e até mesmo melho- rar, esta função barreira, e ainda mais para as peles mais sensíveis. E, embora se saiba que as populações com peles intolerantes cuja barreira cutânea é fragilidade precisam de cuidados com agentes hidrolipídicos fisiomiméticos, especi- almente agentes emolientes e hidratantes fisiológicos, ta m- bém é importante evitar o contato da pele com qualquer substância passível de degradar a película hidrolipídica de superfície, tal como um agente tensoativo ou um conservan-

te.

[0011] A pele sensível ou intolerante deve-se a um meca- nismo não alérgico e envolve uma reação inflamatória sem identificação de um alérgeno específico.

[0012] Os mecanismos fisiopatológicos da hiper - reatividade cutânea não estão claramente elucidados, mas tende-se a identificar dois tipos de fatores, que podem ser concorrentes. De um lado, ocorre uma alteração da barreira cutânea através da perda de água e da alteração dos lipídios intercorneocitários. A pele fica mais sensível aos irritantes e estímulos externos e a irritação, ainda que mínima, leva à liberação de citocinas inflamatórias e de compostos da cas- cata araquidônica. Do outro lado, um distúrbio neur ológico pode se responsável pela sensibilidade, pela reativ idade da pele. As fibras nervosas que chegam às células da epiderme produzem, sob a influência de estímulos externos, neuro- transmissores (tal como a substância P) que causam uma in- flamação neurogênica, isto é, uma inflamação neurogênica cutânea.

[0013] Faz-se, portanto, necessária uma composição c a- paz de tratar, prevenir, e proteger as peles sensíveis e as peles intolerantes cujo componente inflamatório é uma i nfla- mação neurogênica.

[0014] A presente invenção tem como objeto satisfazer essas necessidades, isto é, propor uma composição que pro- teja e/ou melhore o estado da pele sensível, ou da pela int o- lerante, diminuindo ou inibindo a inflamação neurogênica cu- tânea.

[0015] Pela primeira vez, a requerente demonstrou as propriedades benéficas de um extrato bacteriano derivado de uma cepa bacteriana (ou bactéria) LMB64 isolada a partir de um lençol freático na regeneração de tecidos e na cicatr iza- ção de lesões cutâneos. Esta bactéria foi descrita pela r e- querente no pedido de patente W O2012/085182. Mais part i- cularmente, foram descritos e exemplificados os extratos de- nominados S0, E0 e ESO, respectivamente constitu ídos de um sobrenadante de cultura separado da biomassa, da bio- massa de células lisadas, e do sobrenadante depois de i ncu- bação da cultura a um pH básico durante várias horas. As frações E0 e ESO foram testadas e foi demonstrado que es- tes extratos E0 e ESO tinha capacidade de indução de c ito- cinas e de maturação de células de Langherans (para E0) bem como de ativação de receptores TLR2/TLR4/TLR5, de antagonismo de receptores PARs e de indução de peptídios antimicrobianos (para ESO). Estes resultados permit iram considerar o uso de tais extratos no tratamento de doenças inflamatórias tais como prurido, psoríase, eczema ou ainda dermatite atópica. Sumário da Invenção

[0016] Os inventores revelaram de forma surpreendente a eficácia de um novo extrato bacteriano particular na preven- ção e/ou no tratamento de inflamação neurogênica cutânea.

[0017] De fato, os inventores demonstraram que este e x- trato bacteriano apresenta um efeito inibidor dos queratin óci- tos na liberação de IL-1 e TNF- induzidos pela substância P. Descrição Detalhada

[0018] De acordo com um primeiro modo de realização, a presente invenção tem por objeto um extrato bacteriano de acordo com a invenção assim como o uso do mesmo na pr e-

venção e/ou no tratamento de inflamação neurogênica cut â- nea.

[0019] Particularmente, a prevenção e/ou o tratamento de inflamação neurogênica cutânea compreende, ou consiste em, a proteção e/ou o tratamento da pele sensível ou da p ele intolerante.

[0020] Particularmente, a prevenção e/ou o tratamento de inflamação neurogênica cutânea compreende, ou consi ste em, a proteção e/ou o tratamento da pele sensível.

[0021] Particularmente, a prevenção e/ou o tratamento de inflamação neurogênica cutânea compreende, ou consiste em, a proteção e/ou o tratamento da pele intolerante.

[0022] A bactéria LMB64 foi caracterizada e defin ida como pertencente à classe das Beta-proteobacteria, subfamília das Neisseriaceae, e provavelmente de um novo gênero ainda não definido. A análise da sequênica do gene que codif ica o RNA ribossômico (rRNA) 16S permitiu colocar esta ba ctéria perto dos gêneros Chromobacterium, Paludimonas, L utelia e Glubenkania, com os quais ela compartilha 95% de similari- dade de sequência. Esta bactéria, não patogênica, é uma bactéria Gram-negativa que foi isolado de lenç óis freáticos. Mais particularmente, a bactéria LMB6 4 se apresenta na forma de um bastonete de cerca de 2,3 m ± 0,3 m de com- primento e cerca de 1,0 µm ± 0,1 µm de la rgura. Uma parti- cularidade desta bactéria é a presença de um flagelo polar.

[0023] O gene que codifica o rRNA 16S foi quase tota l- mente sequenciado (1487 pb, correspondendo à sequência SEQ ID NO. 1). A bactéria LMB64 possui um plasmídeo ci r- cular de 10948 pb. Este plasmídeo foi totalmente sequenci a- do e a sequência está representada na sequência SEQ ID

NO. 2.

[0024] De acordo com um outro modo de realização, um a bactéria da qual deriva um extrato bacteriano de acordo com a invenção compreende pelo menos um plasmídeo compr e- endendo a sequência SEQ ID NO. 2, ou qualquer sequência apresentando pelo menos 80% de identidade com a sequê n- cia SEQ ID NO. 2, vantajosamente pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou ainda pelo menos 97% e mais preferivelmente ainda pelo menos 98% de identidade com a sequência SEQ ID NO. 2.

[0025] Ainda, uma bactéria da qual deriva o extrato bact e- riano de acordo com a invenção é uma bactéria Gram- negativa não patogênica pertencente à classe das Betapro- teobacteria, subfamília das Neisseriaceae, a referida bacté- ria compreendendo um rRNA 16S compreendendo a sequê n- cia SEQ ID NO. 1, ou qualquer s equência apresentando pelo menos 80%, ou ainda pelo menos 90%, pelo menos 95%, p e- lo menos 97% de identidade com a s equência SEQ ID NO. 1 e a referida bactéria compreendendo pelo menos um pla smí- deo compreendendo a sequência SEQ ID NO. 2, ou qua lquer sequência apresentando pelo menos 80% de identidade com a sequência SEQ ID NO. 2, vantajosamente pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou ainda pelo m enos 97% e mais preferivelmente ainda pelo menos 98% de ide ntidade com a sequência SEQ ID NO. 2.

[0026] A título de exemplo, tal bactéria é representa pela cepa LMB64 que foi depositada em nome da requerente na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, Paris, em 8 de abril de 2010 sob o número I-4290.

[0027] Em posse dessas informações genotípicas da nat u- reza não filamentosa desta bacté ria, associadas às caracte- rísticas de crescimento em meio não sulfurado, o especiali s- ta na técnica não teria dificuldade de encontrar/identificar uma outra bactéria que permitisse obter um extrato bacter ia- no de acordo com a invenção. A identificação de uma outra bactéria certamente ligeir amente diferente genotipicamente, porém parecida com os cr itérios fenotípicos da invenção no que diz respeito ao extrato bacteriano poderia ser feita após um trabalho de seleção que não é de forma alguma insup e- rável e isto tendo por base as informações contidas no pr e- sente pedido assim como as inform ações contidas no pedido W O2012/085182 associadas ao conhecimento geral do e spe- cialista na técnica.

[0028] Por “percentagem de identidade” entre duas s e- quências de ácidos nucleicos no contexto da presente inven- ção, se entende uma percentagem de nucleotídeos idê nticos entre as duas sequências a serem comparadas, obtida após o melhor alinhamento (alinhamento ótimo, esta perce ntagem sendo puramente estatística e as diferenç as entre as duas sequências estando distribuídas aleatoriamente e em todo o seu comprimento. As comparações de sequências e ntre duas sequências de ácidos nucleicos são tradicionalmente reali- zadas por comparação destas sequências d epois de terem sido alinhados de forma ótim a, a referida comparação po- dendo ser efetuada por segmento ou por “janela de co mpa- ração”. O alinhamento ótimo das sequências para a co mpa- ração pode ser feito manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith et W aterman (1981) [Ad. App. Math. 2: 482 ], por meio do algoritmo de homologia local de

Neddleman et W unsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], pelo método de busca de similaridade de Peason et Lipman (1988) [Proc. Natl . Acad. Sci . USA 85: 2444], por meio de programas de computador que util izam estes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA em W isconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, W I, ou ainda pelos programas de comparação BLAST N ou BLAST P).

[0029] A percentagem de identidade entre duas sequên- cias de ácidos nucleicos é determinada por comparação des- tas duas sequências alinhadas de forma ótima na qual a se- quência de ácidos nucleico a ser comparada pode compre- ender adições ou deleções em relação à sequência de refe- rência para um alinhamento ótimo ent re essas duas sequên- cias. A percentagem de identidade é calculada determ inan- do-se o número de posições idênticas para as quais o n ucle- otídeo é idêntico entre as duas sequências, dividindo -se este número de posições idênticas pelo número total de posições na janela de comparações e multiplicando -se o resultado ob- tido por 100 para obter a percentagem de identidade entre essas duas sequências.

[0030] Por exemplo, seria possível usar o programa BLAST, “BLAST 2 sequences” (Tatusova et al., “Blast 2 s e- quences - a new tool for comparing protein and nucléotide sequences”, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponível no site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, os parâm e- tros usados são aqueles dados por de fault (em particular pa- ra os parâmetros “open gap penaltie”: 5, e “extension gap penaltie”: 2 ; a matriz escolhida sendo, por exemplo, a matriz “BLOSUM 62” proposta pelo programa). A percentagem de identidade entre as duas sequências a serem comparadas é calculada diretamente pelo programa. Também é possível usar outros programas tais como os softwares “ALIGN” ou “Megalign” (DNASTAR).

[0031] Uma bactéria de acordo com a invenção, em part i- cular a bactéria LMB64, compreende pelo menos um plasm í- deo compreendendo a sequência SEQ ID NO. 2, ou qualquer sequência apresentando pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com a referida sequê n- cia SEQ ID NO. 2. Outras características da referida bact é- ria, em particular a bactéria LMB64, serão apresentadas em detalhes mais adiante nos exemplos.

[0032] De modo geral, o termo “extrato bacteriano de acordo com a invenção” é usado para descrever o conjunto que compreende os compostos solúveis presentes no citosol da bactéria, obtidos depois do isolamento das células bact e- rianas do meio de fermentação, sua lise, em particular po r congelamento-descongelamento, ressuspensão em um sol- vente aquoso e recuperação da fração líquida compree nden- do os componentes citosólic os, os compostos intracelulares solúveis das células, os compostos/moléculas me mbranares solúveis, os compostos/molécul as transmembranares solú- veis, os compostos/moléculas periplasmáticos sol úveis assim como os compostos/moléculas flagelares sol úveis, em parti- cular as proteínas.

[0033] Por compostos/moléculas membranares solúveis, compostos/moléculas transmembranares solúveis, compos- tos/moléculas periplasmáticos solúveis assim como compos- tos/moléculas flagelares solúveis, se entende proteínas e ou- tros compostos solúveis contidos no citoplasma, ou no espa-

ço periplasmático, no espaço membranar ou transme mbranar ou no flagelo, e que são liberados pela lise de uma bactéria de acordo com a invenção. Estas proteínas e co mpostos são obtidos pelo processo de acordo com a invenção, ou seja, recuperação da fase líquida subsequente a uma s eparação líquido/sólido realizada na massa celular de bactérias lisa- das, por exemplo, por congelamento -descongelamento, de- pois de isolamento dessa massa cel ular do meio de fermen- tação. Essas proteínas ou compostos intracelulares citosóli- cos, membranares, periplasmát icos e/ou flagelares solúveis compreendem, por exemplo, ribossomas, enzimas associa- das ao metabolismo celular, lipop olissacarídeos, açúcares, lipoproteínas, membranas e periplasmáticas, liberados pela lise e solúveis em água ou em um solvente aquoso.

[0034] As bactérias se multiplicam por fissão binária, o que quer dizer que cada bactéria cresce e depois se divide em duas células-filhas separadas por um septo de divisão formado pela parede celular. Durante a divisão, o DNA se duplica bem como os outros constituintes. Diversos sistemas enzimáticos de síntese e de degradação participam na divi- são celular.

[0035] O crescimento bacteriano é aumento ordenado de todos os componentes da bactéria. Ele resulta no aumento do número de bactérias. Ao longo do crescimento, ocorre, de um lado, um empobrecimento do meio de cultu ra em nutrien- tes e, do outro lado, um enriquecimento em biomoléc ulas se- cretadas e excretadas no meio de cultura pela bactéria e so- lubilizadas neste meio e também em subprodutos do metab o- lismo.

[0036] Pela expressão “meio de cultura”, se entende qua l-

quer meio compreendendo pelo menos os nutrientes nece s- sários para o crescimento e a multiplicação de bactérias. As bactérias podem ser cultivadas em meio líquido, sólido ou semilíquido. De preferência, o meio de cultura é um meio lí- quido que permite o crescimento e a re cuperação da biomas- sa e permite a obtenção de um extrato bacteriano de acordo com a invenção.

[0037] Um meio de cultura adequado contém nutrientes que favorecem o crescimento e a multiplicação de bactérias. De modo geral, um meio de cultura conveniente poderá co m- preender água de uma fonte de carbono, uma fonte de nitr o- gênio e seus sais.

[0038] Pode-se fazer menção ao “meio de fermentação” ou cultura bacteriana que corresponde ao meio de cultura con- tendo bactérias em fim de crescimento e desenvolvimento.

[0039] Na prática, o extrato bacteriano de acordo com a invenção, em particular um extrato da bactéria LMB64, pode ser obtido a partir de uma cultura de uma bactéria de acordo com a invenção em um meio de cultura que possibilita o crescimento, o desenvolvimento e a multiplicação da referida bactéria e a recuperação das células depois de separ ação das mesmas da fase líquida, por exemplo, por centrif ugação, na forma de uma pelota ou bi omassa. Esta biomassa é sub- metida a um tratamento que permite permeabilizar e degra- dar as membranas e paredes celulares - por exemplo, por congelamento-descongelamento. A obtenção do extrato de acordo com a invenção pode ocorrer por recuperação da bi- omassa tratada, em particular descongelada, com um ta mpão básico e em seguida realização de uma separação sóli- do/líquido da mistura, por exemplo, por centrifugação. Ob-

tém-se assim uma fase aquosa representando o extrato de acordo com a invenção.

[0040] A recuperação da biomassa a partir do meio de fermentação pode ser feita por qualquer meio de separação líquido/sólido. Mais particularmente, é, portanto, possível, por meio de técnicas conhecidas pelo especialista na técn i- ca, isolar a biomassa celular contendo majoritariamente c élu- las inteiras, detritos celulares compreendendo proteínas de superfície e/ou proteínas localizadas no espaço periplasmá- tico da bactéria da fração líquida contendo solutos residuais do meio de cultura e biomoléculas excretadas pela bactéria e solubilizadas no meio de fermentação.

[0041] A título de ilustração, a separação líquido/sólido pode ser realizada por uma técnica selecionada dentre: ce n- trifugação, sedimentação, filtração, ultrafiltração, decanta- ção.

[0042] De preferência, a separação líquido/sólido é real i- zada por centrifugação do meio de fermentação contendo a cultura bacteriana para separar, de um lado, a fase sólida, isto é, a pelota de biomassa, contendo células e detritos c e- lulares e, de outro lado, a fase líquida, isto é, o sobrenadan- te compreendendo as moléculas solúveis excretadas durante a fermentação e compostos residuais do meio de cultura n ão consumidos pela bactéria.

[0043] A fase sólida, i.e., a biomassa obtida, em particular a pelota de centrifugação, é submetida a uma etapa que leva à ruptura das membranas das células, por exemplo, cong e- lamento seguido por descongelamento.

[0044] O congelamento pode ser realizado a qualquer temperatura negativa que permita a solidificação da água, a formação de cristais intracelulares e intermembranares e, por conseguinte, a ruptura, pelo menos parcial, das me mbra- nas.

[0045] Em particular, o congelamento pode ser feito a uma temperatura de -10°C, ou -20°C, ou ainda -30°C, de -40°C, de -50°C de -60°C, ou ainda cerca de -80°C. Preferivelmen- te, o congelamento é feito a cerca de -20°C.

[0046] O período e a velocidade de congelamento não são críticos. O período de congelamento pode ser função da temperatura e, por exemplo, um período de uma a várias ho- ras é adequado. A fase sólida congelada também pode ser armazenada por vários dias, semanas ou meses mesmo que não seja necessário.

[0047] A velocidade de congelamento, ou descongelame n- to, também não é crítica e serão usadas condições que pe r- mitam a alteração das paredes e membranas bacterianas.

[0048] Por descongelamento se entende um retorno a uma temperatura positiva que permita fusão dos cristais de gelo.

[0049] Esta etapa de permeabilização e ruptura das par e- des e membranas também pode ser realizada por meio qu í- micos, ultrassônicos ou mecânicos tais como detergentes, agentes caotrópicos, contas de vidro, por exemplo.

[0050] Esta etapa possibilita a liberação de compostos i n- tracelulares citoplasmáticos solúveis e que, portanto, estão presentes nessa fase sólida de células lisadas ou danific a- das.

[0051] A essa fase sólida adiciona-se em seguida uma fa- se líquida na forma de um solvente aquoso para efetuar a ressuspensão das células lisadas ou danificadas e extrair os compostos solúveis citoplasmáticos solúveis no referido so l-

vente.

[0052] O solvente aquoso é de preferência um tampão, em particular um tampão básico. De preferência este tampão bá- sico é tampão Tris ou tampão arginina ou tampão Tris - arginina. De preferência ele é tampão ar ginina. A concentra- ção de arginina pode variar entre 0,1 e 1 M, particularmente de cerca de 0,.3 a 0,5 M. A conce ntração de Tris pode variar entre 1 e 100 mM, particularmente 20 mM. O pH do tampão básico pode variar entre 8 e 12, et de preferência entre 9 e

11.

[0053] Esta etapa de ressuspensão permite extrair os compostos solúveis citoplasmáticos contidos na biomassa de células lisadas ou danificadas.

[0054] Por fim, passa-se à separação líquido/sólido para recuperar uma fase aquosa líquida, em particular uma fase aquosa líquida tamponada, contendo compostos intracelul a- res citoplasmáticos solúveis.

[0055] Esta fase líquida obtida representa, portanto, o e x- trato de acordo com a invenção.

[0056] A relação fase sólida/fase líquida aquosa para a etapa de ressuspensão pode variar entre 1 e 10% p/v.

[0057] O uso de um tampão básico permite permeabilizar ainda mais as membranas externas e favorecer a difusão de moléculas do espaço plasmático para o meio líquido. O uso de um tampão básico permite ainda estabilizar os compo s- tos, em particular as prote ínas solúveis e evitar a agregação dos mesmos por um longo período de armazenamento bem como sua degradação por ação de proteases.

[0058] Uma ou mais etapas de filtração podem ser real i- zadas para clarificar o extrato e obter um extrato de acordo com a invenção, extrato purificado.

[0059] A filtração poderá ser realizada por qualquer meio adequado que permita uma clarificação da fase líquida, ou da fase líquida tamponada. Tal clarificação por filtração per- mite a eliminação de partículas em suspensão que não teri- am sido eliminadas durante a segunda etapa de separação líquido/sólido e visa a obtenção de um extrato bacteriano de acordo com a invenção purificado, lí mpido.

[0060] A filtração pode ser realizad a por qualquer meio de filtração, ultrafiltração ou diafiltração.

[0061] Vantajosamente, a filtração é efetuada por filtração por um filtro ou cartucho de filtro apresentando um corte de 0,4 µm, preferivelmente 0,2 µm. Neste caso, o extrato bact e- riano é caracterizado pelo fato de que os compostos prese n- tes no extrato bacteriano têm um tamanho menor ou igual a 0,2 µm.

[0062] Preferivelmente, é possível usar filtros ou pré- filtros não carregados eletrostaticamente para evitar qual- quer absorção de biomoléculas responsáveis por parte ou por toda a atividade do extrato.

[0063] As diferentes etapas serão desc ritas mais detalha- damente nos exemplos. Deve ficar entendido que qualquer modificação no processo, nos meios, na sequência de et apas que pareça óbvia para o especialista na técnica em r elação ao presente relatório descritivo deverá ser consider ada como estando abrangida pelo escopo da presente invenção.

[0064] De acordo com um modo de realização, o processo de acordo com a invenção consiste em um processo de pr e- paração de um extrato bacteriano de acordo com a inve nção, o referido processo compreendendo as etapas de:

a) cultivar uma bactéria de acordo com a invenção, em particular LMB64, em um meio adequado para obter uma cul- tura bacteriana; b) separação líquido/sólido da referida cultura e elim i- nação da fase líquida; c) lise celular da fase sólida, d) ressuspender a fase sólida lisada em uma fase líqui- da aquosa, de preferência tamponada, e) separação líquido/sólido e recuperação da fase líquida, f) opcionalmente filtrar a fase líquida.

[0065] De acordo com um modo de realização pr eferido, a etapa c) de lise celular da fase sólida é realizada por cong e- lamento seguido por descongelamento.

[0066] De acordo com um modo de realização particular, a bactéria é uma bactéria Gram -negativa não patogênica per- tencente à classe das betaproteobacteria, subfamília das Neisseriaceae, compreendendo um rRNA 16S compreenden- do a sequência SEQ ID NO. 1, ou qualquer sequência apr e- sentando pelo menos 80% de identidade com a sequência SEQ ID NO. 1, mais particula rmente a bactéria é a bactéria LMB64.

[0067] De preferência, a bactéria compreende pelo menos um plasmídeo compreendendo a sequência SEQ ID NO.2, ou qualquer sequência apresentando pelo menos 80% de identi- dade com a sequência SEQ ID NO .2.

[0068] De acordo com um modo de realização, a presente invenção se refere a um extrato bacteriano obtido, ou pass í- vel de ser obtido, por um processo de acordo com a inve nção tal como descrito supra.

[0069] Em um modo de realização, a invenção refere -se a um extrato bacteriano de acordo com a invenção, em part icu- lar um extrato obtido ou passível de ser obtido por um pro- cesso de acordo com a invenção, para uso na prevenção, no tratamento, na prevenção e tratamento de inflamação neuro- gênica cutânea.

[0070] Vantajosamente, inflamação neurogênica cutânea compreende pele sensível e/ou pele intolerante.

[0071] De acordo com um outro modo de realização, a i n- venção refere-se a uma composição cosmética ou de rmato- lógica compreendendo pelo menos um extrato bacteriano de acordo com a invenção, com pelo menos um excipiente cos- meticamente ou dermatologicamente aceitável, p ara uso na prevenção, no tratamento, na prevenção e tratamento de in- flamação neurogênica cutânea.

[0072] De acordo com um outro modo de realização, a i n- venção refere-se a uma composição cosmética ou dermat o- lógica compreendendo pelo menos um extrato bacteriano de acordo com a invenção, com pelo menos um excipiente cos- meticamente ou dermatologicamente aceitável, para uso na proteção e/ou no tratamento de peles sensíveis ou intol eran- tes. Em particular a pele é pele sensível ou intolerante cuja origem é uma inflamação neurogênica cutânea.

[0073] A invenção também diz respeito ao uso de uma composição cosmética ou dermatológica compreendendo pe- lo menos um extrato bacteriano de acordo com a invenção, com pelo menos um excipiente cosmeticamente ou dermat o- logicamente aceitável, para a produção de um medicamento destinado à prevenção, tratamento, prevenção e tratamento de inflamação neurogênica cutânea.

[0074] A invenção também diz respeito a um método de prevenção e/ou tratamento de inflamação neurogênica cut â- nea compreendendo a administração, a um indivíduo com necessidade da mesma, de uma quantidade eficaz de uma composição cosmética ou dermatológica compreendendo pe- lo menos um extrato bacteriano de acordo com a invenção, com pelo menos um excipiente cosmeticamente ou dermat o- logicamente aceitável.

[0075] Vantajosamente, inflamação neurogênica cutânea compreende pele sensível e/ou pele intolerante.

[0076] Na presente invenção, por “cosmeticamente ou dermatologicamente aceitável” se entende aquilo que é útil na preparação de uma composição cosmética ou dermatoló- gica que geralmente é seguro, atóxico e que não é biolog i- camente ou de alguma forma indesejável e que é aceitável para uso cosmético ou dermatológico, especialmente por aplicação tópica.

[0077] De acordo com um modo de realização particul ar, a composição de acordo com a invenção está em uma forma adequada para aplicação tópica.

[0078] As composições cosméticas ou dermatológicas de acordo com a invenção poderão estar em formas que são ge- ralmente conhecidas para administração tópica, isto é, em particular loções, espumas, géis, dispersões, emulsões, sprays, serums, máscaras ou cremes, eleias, em particular eleias micelares, com excipientes que permitem em part icu- lar a penetração na pele para melhorar as propriedades de acessibilidade do princípio ativo. Vantajosamente, será um creme, um creme rico, uma loção, um produto para os olhos, um produto contra UV.

[0079] Estas composições geralmente contêm, além dos compostos de extrato bacteriano de acordo com a invenção, um meio fisiologicamente aceitável, em geral à base de água ou solvente, por exemplo, álcoois, éteres ou glicóis. Elas também podem conter agentes tensoativos, agentes comple- xantes, conservantes, agentes estabilizantes, emuls ificantes, espessantes, gelificantes, umectantes, emolientes, oligoele- mentos, óleos essenciais, perfumes, corantes, age ntes mati- ficantes, filtros químicos ou minerais, agentes hidratantes, águas termais, etc.

[0080] Vantajosamente, as composições de acordo com a presente invenção compreenderão 0,05 a 10% em peso, de preferência 0,1 a 5% em peso, ainda mais preferivelmente 0,5 a 3% em peso do extrato bacteriano de acordo com a i n- venção em relação ao peso total da composição.

[0081] A composição de acordo com a invenção propo rci- ona proteção que permanece confortável ao longo do dia. Ela pode ser em particular aplicada a peles sensíveis, peles rea- tivas, e em particular peles de bebê.

[0082] De preferência, a composição de acordo com a presente invenção é usada para prevenir, proteger e/ou tr a- tar peles sensíveis.

[0083] Em geral, pele sensível é definida por um a reativi- dade particular da pele. Esta reatividade da pele se traduz classicamente pela manifestação de sinais de desconforto em resposta ao contato do indivíduo com um elemento d e- sencadeador que pode ser de diversas origens. Isto pode ser causado pela aplicação de um produto cosmético à s uperfí- cie da pele sensível, ingestão de al imentos, exposição a va- riações bruscas de temperatura, poluição atmosférica e/ou raios ultravioletas ou infravermelhos. Há também fat ores as-

sociados à idade e ao tipo de pele. Assim, a pele sensível é mais comum entre as peles secas ou gordurosas do que en- tre as peles normais. No contexto da presente inve nção, pele sensível cobre pele irritável e pele intolerante.

[0084] Tais composições podem ser produzidas de acordo com processos bastante conhecidos pelo especialista na técnica.

[0085] A invenção será melhor compreendida a partir da leitura dos exemplos abaixo que ilustram a mesma sem limi- tar seu escopo. Exemplo 1: Cultura da bactéria LMB64

[0086] A título de exemplo não limitativo, meios de cultura preferidos contêm cloreto de amônio, sulfato de magnésio e extrato de levedura. Também deve ser observado que, como mostrado no pedido W O2012/085182 e outros documentos, meios similares poderão ser usados e devem, portanto, ser considerados como parte integrante da presente descrição. Toda adaptação feita pelo especialista na técnica também deve ser considerada como parte da invenção.

[0087] Um exemplo de um processo de cultura está de s- crito abaixo. Convém lembrar que este exemplo é apenas ilustrativo e não deve de forma alguma ser considerado como limitativo.

[0088] A cepa LMB64 é cultivada em três etapas, a saber, um primeiro inóculo, uma pré-cultura (ou pré-fermentação) em modo batch e por fim uma cultura em modo fed -batch (adição de glicose).

[0089] Inóculo: um tubo de W CB LMB64 é usado para ino- cular um tubo Erlenmeyer contendo 1000 mL de meio estéril. O tubo Erlenmeyer é em seguida colocado na incubadora agitadora com agitação. Quando a densidade de células no caldo é suficiente, o cultivo é interrompido. As células são então colocadas sob refrigeração até serem transferidas para o pré-fermentador.

[0090] Pré-cultura: o pré-fermentador é em seguida preen- chido com cerca de 16 L de meio e em seguida totalmente esterilizado.

[0091] Dois frascos satélites são conectados ao pré - fermentador depois de esterilização do tanque e em seguida blocos de adição: - um frasco contendo uma solução estéril de glicose a 50%. Esta solução (“glucose batch preculture”) é imediat a- mente transferida para o meio de cultura para atingir a co n- centração inicial de glicose de 20g/L. - o tubo Erlenmeyer contendo o inóculo descrito acima na etapa Inóculo é inoculado no pré-fermentador.

[0092] A pré-cultura é iniciada e então regulada automati- camente. A título de exemplo, pode-se mencionar os seguin- tes parâmetros: temperatura, velocidade de agitação, pres- são, vazão ar ou ainda Po 2 .

[0093] O crescimento das células é monitorado por uma medição da densidade óptica a 620 nm. A pré -cultura é inter- rompida por resfriamento quando atinge uma densidade sufi- ciente.

[0094] Cultura: o fermentador é em seguida preenchido com 127 L de meio ajustado em pH 7,0 e em seguida tota l- mente esterilizado. Três frascos satélites são usados: - um frasco contendo uma solução estéril de glicose. Esta solução é imediatamente transferida para o meio de cul- tura para atingir uma concentração inicial de glicose de

20g/L. - um frasco de antiespumante. Este antiespumante s erá adicionado automaticamente durante a cultura para controlar o nível de espuma no tanque. - um frasco de glicose fedbatch. Esta solução s erá adi- cionada durante a cultura para suportar o crescimento das células.

[0095] A cultura é iniciada e então regulada automatic a- mente. A título de exemplo, pode-se mencionar os seguintes parâmetros: temperatura, pH, agitação, pressão, vazão de ar Po 2 .

[0096] Depois de exaustão da glicose inicialmente prese n- te no meio (aumento em Po2), a adição da solução de glic o- se fedbatch é iniciada e permite o crescimento de células em alta densidade. A fermentação é interrompida depois do con- sumo total da glicose. Neste está gio, o mosto de fermenta- ção é resfriado automaticamente. Durante toda a cultura, o crescimento de células é monitorado por uma medição da densidade óptica a 620 nm. A quantidade de biomassa seca (g/L) obtida no final da cultura é determinada por um método ponderal Exemplo 2: extração da fração de acordo com a invenção

[0097] Abaixo é dado um exemplo a título ilustrativo de um modo de realização preferido, mas que não deve ser consi- derado como limitativo.

[0098] O extrato bacteriano de acordo com a invenção é em geral obtido depois de centrifugação do resultado da eta- pa de cultura para eliminar o sobrenadante e manter a b io- massa, isto é, as células, proteínas de superfície, prote ínas localizadas no espaço periplasmático e proteínas intracelula-

res da bactéria (presença devi da à etapa de congelamento). Para a etapa de centrifugação, a linha de transf erência do fermentador para a centrífuga é esterilizada. O mosto de fermentação é então separado por centrifugação contínua em uma centrífuga. A centrifugação é realizada a 150 L/ h (± 30 L/h) a uma velocidade de rotação do cesto de 10900 ± 1000 rpm. As células são recuperadas em um saco descartável. O sobrenadante é eliminado durante a ultrapasteurização. Esta etapa de centifrugação é acompanhada por uma etapa de congelamento da pelota a -20°C durante pelo menos 1 hora.

[0099] Cento e dez litros de tampão de extração Tris arg i- nina são esterilizados no fermentador. As células previ amen- te descongeladas à temperatura ambiente são transfer idas para o fermentador através de uma bomba peristálti ca. O tempo de contato necessário varia entre 1 e 7 horas. A con- centração alvo de Tris e arginina depois de adicionados ao saco descartável é de cerca de 0,3 M de L -arginina e 20 mM de Tris.

[00100] O mosto de fermentação é em seguida separado por centrifugação contínua em uma centrífuga. A centrifug a- ção é realizada a 100 L/h (± 30 L/h) a uma velocidade de r o- tação do cesto de 10900 ± 1000 rpm. Sedimentação parcial é iniciada automaticamente em função da turbidez do efluente com um ponto fixado em 20% de turbidez. U ma série de ope- rações de sedimentação totais é desencadeada manua lmente na metade do volume a ser separado. O sobrenada nte é re- cuperado em um saco descartável. As células são eliminadas por ultrapasteurização.

[00101] Duas etapas de filtração são realizadas em lin ha, para clarificar o sobrenadante e obter um extrato bacteriano de acordo com a invenção livre de germes. A filtração é co n- trolada por um sistema de filtração/distribuição. O cartucho de filtração em profundidade descartável é colocado na ca ixa de filtração. As tubulações de filtração são equipadas com seus manômetros para garantir a segurança da etapa de fil- tração. O módulo de pré-filtração é enxaguado com cerca de 92L ± 5L de água purificada e o saco de produto a ser filtra- do é conectado com agitação. Po r fim, o cartucho de filtração de 0,2 µm 30” de PES é conectado ao resto do sistema de filtração. A filtração é realizada a uma taxa de fluxo inicial de 240L/h ± 10L graças a uma bomba peristált ica. Quando a pressão a montante dos filtros atinge 1,2 bar, a taxa de fluxo de filtração é reduzida. A totalidade do pr oduto filtrado é re- cuperada de forma estéril em um recipiente equipado com um saco descartável de 400L. O saco de pr oduto filtrado é pesado no prato da balança e então armaz enado a +5°C até ser distribuído. Depois de usado, o filtro de esterilização é desconectado e então verificado por um teste de integridade. Exemplo 3: Efeito do extrato bacteriano de acordo com a invenção em inflamação neurogênica cutânea

[00102] O objetivo deste estudo é avaliar as propr iedades moduladoras do extrato bacteriano de acordo com a inve nção em inflamações cutâneas. Para tanto, uma abordagem expe- rimental in vitro baseada na medição da produção e l ibera- ção de TNF- (fator alfa de necrose tumoral) e de IL -1 (in- terleucina-1 beta) por queratinócitos epidérmicos hum anos, ativados pela substância P, é proposta como modelo in vitro de inflamação neurogênica cutânea. Protocolo

[00103] O estudo é realizado em queratinócitos epidérm icos humanos normais, sendo estas células obtidas do pr epúcio de recém-nascidos. Estas células são cultivadas em um meio sem soro por processos laboratoriais tradicionais. A dosa- gem de marcadores de inflamação neurogênica cut ânea é feita em queratinócitos cultivados em um meio na a usência (condição controle) ou na presença de compostos a serem testados (extrato bacteriano de acordo com a invenção e produto de referência), e expostos ou não à substâ ncia P. Os queratinócitos são tratados por 3 horas antes do estre sse in- duzido pela substância P e durante as 24 horas segui ntes. Os níveis de citocinas pró -inflamatórias (TNF- e IL-1) são quantificados 24 horas depois da indução de estresse infla- matório por adição da substância P (0,5 µM). S imultanea- mente, o composto CP96345, um inibidor seletivo de NK -1R é testado a 1 µM como produto de referência. Cada condi- ção experimental é conduzida em dois doadores diferentes de queratinócitos.

[00104] A produção de TNF- e IL-1 é medida nos meios de incubação e quantificada por ELISA (Enzyme -Linked Immunosorbent Assay). A análise estatística (*p<0,05 ; **p<0,01 ou ***p<0,001) é determinada na percentagem de inibição com a ajuda de um teste não paramétrico porque os dados não passam no teste de normalidade, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn como um pós-teste.

[00105] Os resultados da liberação de IL-1 (pg/mg de pro- teína total) estão resumidos na tabela 1 abaixo: Grupos conc IL-1β (pg/ml) % Inh Stats média SE Cont SP(-) 122,2 11,8 - p<0,001 Cont SP(+) 241,2 18,3

NK-1R inh 1µM 132,5 12,1 91 p<0,05 Composto 1,64µg/ml 143,2 9,2 80 NS de acordo 5,45µg/ml 127,7 8,4 93 p<0,05 com a in- 16,36µg/ml 125,7 10,2 96 p<0,01 venção Conc: concentrações, Inh: inibição, Stats: estatística versus Cont (+) ; E.s.: Desvio padrão médio; Cont: controle (sem produto a ser testado) ; SP ( -): sem substância P ; SP (+): na presença de substância P.

[00106] A exposição de queratinócitos à substâ ncia P induz uma liberação importante e estatisticamente significativa de IL-1. Tratamento CP96345 a 1 µM reduz bastante (91%, P<0,05) a produção de IL-1. Este resultado é muito convi n- cente, o uso do inibidor NK-1R permitiu validar este teste. Tratamento de queratinócitos com o composto de acordo com a invenção permite uma inibição concentração - dependente da liberação de IL-1 induzida pela substância P. Embora a primeira concentração testada (1,64 g/ml de proteínas) não atinja significância, ela ainda em 80% a libe- ração de IL-1. Em concentrações de 5,45 g/ml e 16.36 g/ml (µl/ml de proteína), e esta inibição é esta tisticamente signifi- cativa (93% e 96% de inibição, p<0,05 e p<0,01, respect iva- mente).

[00107] Os resultados da liberação de TNF - (pg/mg de proteína total) estão resumidos na tabela 2 abaixo: Grupos conc TNF-α (pg/ml) % Inh Stats média SE Cont SP(-) 4,1 0,7 - p<0,01 Cont SP(+) 9,9 0,8

NK-1R inh 1µM 4,6 0,9 90 p<0,001 Extrato de 1,64µg/ml 6,1 0,5 63 NS acordo com 5,45µg/ml 5,9 0,6 68 NS a invenção 16,36µg/ml 5,4 0,6 77 p<0,01 Conc: concentrações, Inh: inibição, Stats: estatística versus Cont (+) ; E.s.: Desvio padrão médio; Cont: controle (sem produto a ser testado) ; SP ( -): sem substância P ; SP (+): na presença de substância P.

[00108] A exposição de queratinócitos à substância P induz uma liberação importante e estatisticamente significativa de TNF-. Tratamento com CP96345 a 1 µM reduz bastante (90%, P<0,05) a produção de TNF -. Este resultado também é muito convincente, o uso do inibidor NK-1R permitiu validar este teste. Tratamento de queratinócitos com o extrato ba c- teriano de acordo com a invenção permite uma inibição con- centração-dependente da liberação de TNF- induzida pela substância P. A concentração mais baixa testada do extrato bacteriano de acordo com a invenção inibe a liberação de TNF- em 60%. Embora esta inibição não atinja o limiar de significância, o efeito concentração-resposta observado de- monstra claramente que o extrato bacteriano de acordo com a invenção é muito ativo neste teste.

[00109] A uma concentração de 16,36 g/ml de proteína, e s- ta inibição é estatisticamente significativa (77% de inibição p<0,01).

[00110] Por conseguinte, os inventores demonstraram que um extrato bacteriano de acordo com a invenção é capaz de inibir significativamente a produção de citocinas produzidas via a substância P, este extrato bacteriano de acordo com a invenção sendo, portanto, eficaz no tratamento de inflam a-

ção neurogênica cutânea. Exemplo 4: Efeito do extrato bacteriano de acordo com a invenção no perfil de expressão gênica da imunidade ina- ta em um modelo de queratinóticos epidérmicos humanos normais

[00111] A função barreira da pele também inclui uma def e- sa contra micro-organismos. O epitélio desempenha um p a- pel ativo nas defesas inatas do hospedeiro. Os sist emas an- timicrobianos cutâneos baseiam-se, entre outros, na presen- ça de determinados lipídios de superfície e de determ inas proteínas constitutivas. Estas proteínas possuem ativ idades antimicrobianas. Além disso, a acidificação da supe rfície epidérmica desempenha um papel importante sem a d efesa antimicrobiana cutânea. A pele age a ssim não apenas como uma barreira física, mas também como uma barreira química. Também existe um componente adaptativo da im unidade ina- ta baseado na secreção induzível de peptídios antimicrobia- nos. Estes últimos desempenham um papel impo rtante como mediadores de inflamação afetando as células epitel iais e inflamatórias, influenciando a proliferação celular e a produ- ção de citocinas. Seu modo de ação consiste em ro mper a membrana plasmática de micróbios infecciosos ou penetrar o micro-organismo para interferir no metabolismo i ntracelular. Os peptídios antimicrobianos mais estudados na pele são as -defensinas e as catelicidinas. As -defensinas humanas constituem a principal classe de peptídios antimicrobianos encontrados no epitélio humano e quatro delas f oram identi- ficadas na pele, HBD 1-4. Embora pertençam à mesma famí- lia, elas são reguladas por vias diferentes. A -defensina 2 humana (hBD2), um peptídio de 4kDa que se l iga à heparina é um dos principais peptídios antimicrob ianos cutâneos. A expressão de peptídios hBD2 é induzível seja pela secreção de citocinas (IL-1 e IL-1 e TNF-) refletindo um estado in- flamatório, seja por contato com uma bactéria ou um fungo.

[00112] O objetivo deste estudo é avaliar os efeitos do e x- trato bacteriano de acordo com a invenção na expressão gê- nica de queratinócitos epidérmicos humanos normais por uma técnica de RT -PCR em 2 genes relacionados com im u- nidade inata.

[00113] O estudo é realizado em queratinócitos epidé rmicos humanos normais obtidos de três doadores. Estas cél ulas são usadas em sua terceira passagem. Estas células são cultivadas em meio padrão suplementado com EGF (Epide r- mal Growth factor), PE (Pituitary extract) e gentamicina, de acordo com processos laboratoriais tradicionais.

[00114] O extrato bacteriano de acordo com a invenção é testado em três concentrações, 0,4; 2 e 10 µg/ml (µg/ml de proteínas).

[00115] Simultaneamente, cloreto de cálcio é testado a 1,5 mM como produto de referência.

[00116] Os queratinócitos são semeados em placas de 24 poços (50000 células por poço) e cultivados por 24 horas em um meio de cultura. O meio é então substituído por meio de ensaio contendo ou não (condição controle, DMSO) o extrato bacteriano de acordo com a invenção, ou cloreto de cálcio (produto de referência), as células são incubadas nestas condições por 48 horas. Ao final deste período de incubação, as células são lavadas com uma solução tamponada e imedi- atamente congeladas a uma temper atura de -80°C.

[00117] A expressão de marcadores é anali sada pelo méto-

do de RT-qPCR em RNA total extraído das células em c ada condição. RNA total é extraído em cada amostra usando o reagente Tripure Isolation® de acordo com as instruções do fabricante. A quantidade e a qualidade do RNA são avaliadas por eletroforese capilar. cDNA é sintetizado por tran scrição reversa do RNA total na presença de oligo(dT) e de “Tran s- criptor Reverse Transcriptase”. A quantidade de cDNA é en- tão ajustada antes da etapa de PCR (Polymerase Chain Re- action). A PCR é realizada por meio d o sistema LightCycler® da Roche de acordo com os dados do fabricante.

[00118] Os dados são analisados pelo software Microsoft Excel.

[00119] A incorporação de fluorescência ao DNA amplific a- do é continuamente medida durante os ciclos de PCR. Isto resulta em uma representaç ão gráfica entre a intensidade de fluorescência e o número de ciclos de PCR de um valor de expressão relativa para cada marcador.

[00120] A técnica de PCR usada neste estudo inclui 2 g e- nes de referência (RPL13A e TBP), estes genes sendo us a- dos para normalização dos dados, uma vez que sua expre s- são é constitutiva e, portanto, teoricamente estável. Cons e- quentemente, o nível de expressão dos genes alvo é comp a- rado com a média do nível de expressão desses 2 marcad o- res de referências para todas as condições.

[00121] O parâmetro RQ (relative Quantification) é definido como a expressão relativa/100. Todos os resultados estão expressos em fator de multiplicação, que representa o núme- ro de vezes que o gene é superexpresso se RQ >1 ou i nfra- expresso se RQ<1.

[00122] A tabela 3 abaixo permite classificar os efeitos das condições tratadas vs. controle. Classificação dos efeitos Fator de multiplicação (CF) Forte estimulação CF > 3 Estimulação 3 > CF > 2 Estimulação leve, a ser confir- 2 > CF > 1,5 mada - 1,5 > CF > -1,5 Inibição leve, a ser confirmada -1,5 > CF > -2 Inibição -2 > CF > -3 Forte inibição -3 > CF Sem expressão Número de ciclos > 33

[00123] A análise estatística é realizada por comparação intergrupos por um teste de Student não pareado.

[00124] Resultados

[00125] Tratamento de queratinócitos epidé rmicos humanos normais com 1,5 mM de cloreto de cálcio usado como contro- le positivo induz uma forte expressão dos genes alvo na imunidade inata, este resultado permitindo validar as con- dições experimentais (tabela 4). Cloreto de cálcio (1,5 mM) genes Média Desvio SEM padrão Imunidade inata HBD2 5,8 6,1 3,5 AMP S100A7 4,1 3,8 2,2 Pam: peptídios antimicrobianos

[00125] A tabela 5 resume os efeitos do extrato bacteriano de acordo com a invenção em três concentrações testadas . Extrato bacteriano (0,2µg/ml) genes Média Desvio SEM padrão Imunidade inata HBD2 4,5 3,16 1,83 AMP S100A7 2,1 0,39 0,23 Extrato bacteriano (1,0µg/ml) Imunidade Inata HBD2 21,0 12,29 7,10 AMP S100A7 3,9 1,61 0,93 Extrato bacteriano (5,0µg/ml) Imunidade Inata HBD2 596,4 546,48 315,51 AMP S100A7 10,6 6,56 2,05 Pam: peptídios antimicrobianos

[00126] Os inventores demonstraram que todas as conce n- trações testadas do extrato bacteriano de acordo com a in- venção induzem a expressão dos genes HBD2 e S1 00A7 e de forma concentração-dependente.

[00127] O extrato bacteriano de acordo com a invenção tem capacidade de aumentar a indução de peptídios antimicrobi- anos. Por estimulação da imunidade inata, os peptídios anti- microbianos induzem a defesa cutânea e participam na pro- teção da barreira cutânea.

[00128] Todos estes resultados, isto é, uma diminuição de inflamação neurogênica cutânea combinada a um auxiliar da proteção da barreira cutânea permitem demonstrar que o e x- trato bacteriano de acordo com a invenção atua efetivame nte em peles sensíveis e/ou intolerantes.

Claims (11)

REIVINDICAÇÕES

1. Extrato bacteriano de uma bactéria Gram - negativa não patogênica pertencente à classe das betapr ote- obacteria, subfamília das Neisseriaceae, compreendendo um rRNA 16S compreendo a sequência SEQ ID NO. 1, ou qual- quer sequência apresentando pelo menos 80% de ide ntidade com a sequência SEQ ID NO. 1, caracterizado pelo fato de que é obtido por um processo compreendendo as etapas de: a. cultivar a referida bactéria em um meio adequado pa ra ob- ter uma cultura bacterina; b. separação líquido/sólido da referida cultura e eliminação da fase líquida; c. lise celular da fase sólida, d. ressuspender a fase sólida lisada em uma fase líquida aquosa, preferivelmente tamponada, e. separação líquido/sólido e recuperação da fase líquida, f. opcionalmente filtrar a fase líquida.

2. Extrato bacteriano, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizado pelo fato de que a fase líquida aquosa da etapa de ressuspender d) é um tampão, em particular um tampão básico.

3. Extrato bacteriano, de acordo com a reivindica- ção 2, caracterizado pelo fato de que o tampão básico é s e- lecionado dentre tampão Tris, tampão arginina ou tampão Tris-arginina.

4. Extrato bacteriano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a bactéria compreende pelo menos um plasmídeo compreen- dendo a sequência SEQ ID NO.2, ou qualquer sequência apresentando pelo menos 80% de identidade com a sequên-

cia SEQ ID NO .2.

5. Extrato bacteriano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a bactéria é a bactéria LMB64, depositada na CNCM em 8 de abril 2010 sob o número I-4290.

6. Extrato bacteriano, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que é para uso na prevenção e/ou no tratamento de inflama- ção neurogênica cutânea.

7. Extrato para uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que inflamação neurogênica cu- tânea compreende pele sensível e/ou pele intolerante.

8. Composição cosmética ou dermatológica , carac- terizada pelo fato de que compreende um extrato bacteriano, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e pelo menos um excipiente cosmeticamente ou dermatologi- camente aceitável.

9. Composição cosmética ou dermatológica , de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que é adequada para aplicação tópica.

10. Composição dermatológica , de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que é para uso na prevenção, no tratamento, na prevenção e tratamento de inflamação neurogênica cutânea.

11. Composição para uso, de acordo com a reivin- dicação 10, caracterizada pelo fato de que a inflamação neu- rogênica cutânea compreende pele sensível e/ou pele intol e- rante.