CN100488561C

CN100488561C - 一种干扰素长效注射微球制剂的制备方法

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Publication number: CN100488561C
Application number: CNB2004100667740A
Authority: CN
Inventors: 钟延强; 吴诚; 鲁莹; 尹东锋
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2004-09-29
Filing date: 2004-09-29
Publication date: 2009-05-20
Anticipated expiration: 2024-09-29
Also published as: CN1634570A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是一种干扰素(IFN)的长效注射微球制剂的制备方法。本发明中的IFN微球由干扰素、生物可降解基质和添加剂组成。本发明的制备方法其优点在于，提高了干扰素在制备工艺和释放过程中的稳定性，方法简便，易于操作，重现性好。所制备的缓释微球可在体外缓释达4周以上，释放符合近似零级模式。

Description

一种干扰素长效注射微球制剂的制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是一种干扰素(interferon，IFN)长效注射微球制剂的制备方法。

背景技术

干扰素是正常机体细胞产生的一种具有抗病毒、抗肿瘤和调节机体免疫功能的蛋白质。在临床上对于许多恶性肿瘤和病毒性疾病疗效确切。为使干扰素在体内血药浓度平稳，减少病人的用药次数，提高干扰素的治疗效果，往往使用生物可降解聚合物作为基质制备成长效剂型以控制药物释放。例如将蛋白质类药物制成微球制剂。

复乳法是制备IFN微球制剂的方法之一，文献报道(Sanchez A，

M，Gonzalez L，et al.Biodegradable micro-and nanoparticles as long-term deliveryvehicles for interferon-alpha.Eur J Pharm Sci，2003，18：221)用该方法制备了IFN-α微球，制备方法如下：

一、配方与配比

主要成分含量(w/v)

IFN-α 0.01％

聚乳酸—羟基乙酸嵌段共聚物(PLGA) 89.99％

人血清白蛋白(HSA) 1％

伯洛沙姆188(F-68) 9％

二、操作步骤

1 制备油相

将生物可降解基质材料按处方量溶于有机溶剂二氯甲烷，即成油相。

2 制备内水相

将IFN-α和HSA和F-68溶液按处方量混匀，即成内水相。

3 制备初乳

将上述内水相加入油相混合超声即成初乳。

4 制备微球

初乳在海藻酸钠溶液中分散制备复乳，复乳经溶剂挥发、固化形成微球。该微球制备工艺较简单，体外释药可维持一个月左右。然而由于所使用的保护剂HSA分子量大，在微球中所占比例大，导致微球载药量低，药物在微球中所占的质量百分比仅为0.01％左右。且若用血制品人血白蛋白有可能造成病毒性疾病的传染。

US6379701B1中提到了另一种制备IFN微球制剂的方法，称作低温喷雾提取法。具体制备方法如下：

一、配方及配比

优选处方为：

主要成分质量

锌离子稳定化的干扰素(锌离子、干扰素摩尔比为2：1) 40mg

PLGA 410mg

碳酸氢钠 10mg

碳酸锌 50mg

二、操作步骤

1 制备IFN-α-Zn²⁺复合物

将IFN-α溶于pH7.2的碳酸氢钠缓冲液，加适量醋酸锌(ZnAc)溶液，使IFN-α和Zn²⁺在溶液中的摩尔比为1：2，再加入适量醋酸(HAc)溶液将溶液pH调为7.1，即形成IFN-α-Zn²⁺复合物。

2 制备IFN-α-Zn²⁺复合物微粉

将上述含IFN-α-Zn²⁺复合物的溶液经低温喷雾干燥法制成微粉。

3 制备IFN-α微球

将PLGA按处方量溶于有机溶剂二氯甲烷，加入处方量上述微粉形成混悬液，再用喷雾冷冻提取法在液氮中分散形成微球，然后在-80℃低温冰箱中用无水乙醇缓慢萃取有机溶剂使微球固化，萃取过程约需3天。该微球体内释药可维持一个星期左右。

本方法制备工艺复杂，制备时间长，需专门设备，行两次喷雾。但将锌离子和IFN-α制备成复合物后，不仅提高了IFN-α的稳定性，而且提高了微球制剂的载药量。

发明内容

本发明提供一种制备工艺简单、载药量大、释药平稳且持续时间长的IFN长效注射微球制剂及其制备方法，其可在体外持续释药达4周以上。

本发明的制备方法如下：

一、配方与配比

主要成分含量

锌离子稳定化的干扰素(锌离子、干扰素摩尔比为2：1) 1～50mg

PLGA 50～500mg

释放调节剂(碳酸锌或伯洛沙姆188) 0～50mg

二、操作步骤

1.制备油相

将生物可降解基质材料溶于有机溶剂，即成油相。

所说的生物可降解基质材料为聚乳酸—羟基乙酸嵌段共聚物PLGA，其中乳酸(LA)和羟基乙酸(GA)的比例为1：1，平均分子量为5000～70000道尔顿，特异性粘度为0.1～0.6dl/g。

所说的有机溶剂选自二氯甲烷或乙腈。

2.制备IFN和锌离子复合物微粉

IFN原液经超滤脱盐后换用10mM pH7.2的NaHCO₃缓冲液，在其中加2mMZnAc，调节Zn²⁺和IFN的摩尔比为2：1，并使IFN终浓度为1mg/ml左右，用1％HAc调pH至7.1，即可产生Zn²⁺和IFN复合物沉淀。再加入10倍量PEG6000，溶解混匀后冷冻干燥，得冻干粉。冻干粉用有机溶剂二氯甲烷或乙腈溶解，离心去上清，重复三次以去除PEG6000，即得IFN和锌离子复合物微粉。

3.制备IFN微球

将IFN和锌离子复合物微粉加入油相，涡旋或超声分散后，逐滴加入连续相棉子油或水中，搅拌乳化。

当选用棉子油为连续相时，使用的乳化剂为0.1％～2％的卵磷脂，室温搅拌2～6小时，然后加入适量石油醚200～1000rpm继续搅拌10～40分钟，使微球固化，再离心，石油醚洗涤，冷冻干燥即得本发明微球。

当选用水溶液为连续相时，使用的乳化剂为0.5％～5％聚乙烯醇(PVA)，以600～1800rpm高速搅拌乳化1～5分钟，得新生微球，再加5～10倍体积量蒸馏水稀释，以300～600rpm继续搅拌使有机溶剂挥发并固化微球，离心，蒸馏水洗涤，冷冻干燥即得本发明微球。

还可在微球处方中加入释放调节剂碳酸锌和伯洛沙姆188(0～10％)，调节微球中IFN的释放速度。

本发明的IFN长效注射微球外观圆整，粒径均匀，混悬性好，包封率大于85％以上，经体外释放实验，缓释达4周以上，释放符合近似零级模式。

附图说明

图1为实施例1制备的IFN微球体外累积释放～时间曲线图。

图2为实施例2制备的IFN微球体外累积释放～时间曲线图。

图3为实施例3制备的IFN微球体外累积释放～时间曲线图。

图4为实施例4制备的IFN微球体外累积释放～时间曲线图。

具体实施方式

实施例1：以乙腈为连续相制备IFN微球制剂

(1)Zn²⁺和IFN-α-2b复合物的制备

IFN-α-2b(0.5mg/ml，上海万兴生物制药有限公司，批号20030401，下同)原液2ml经超滤脱盐后换用10Mm pH7.2的NaHCO₃缓冲液800μl配成溶液，加2mM ZnAc 52μl，使Zn²⁺和IFN-α-2b摩尔比为2：1，IFN-α-2b终浓度为1mg/ml左右，用1％HAc调pH为7.1，立即产生Zn²⁺和IFN-α-2b复合物沉淀。

(2)制备Zn²⁺和IFN-α-2b复合物微粉

在上述Zn²⁺和IFN-α-2b复合物的溶液中加入10mg PEG6000，溶解混匀后冷冻干燥，得冻干粉。冻干粉用有机溶剂乙腈溶解，离心去上清，重复三次以去除PEG6000，即得Zn²⁺和IFN-α-2b复合物微粉。

(3)微球的制备

PLGA(LA：GA＝50：50，特异性粘度为0.19dl/g，美国BirminghamPolymers公司)100mg溶于500μl乙腈溶液中成油相，将IFN-α-2b与Zn²⁺复合物的微粉加入油相中水浴按常规超声混悬，加入30ml棉子油(含0.05％卵磷脂作为乳化剂，w/v)中，600rpm搅拌乳化2小时，然后加入轻质石油醚(沸点60-90℃)，继续搅拌15分钟使微球固化完全，离心、石油醚洗涤、冷冻干燥即得本发明微球。

实施例2：以棉子油为连续相碳酸锌为释放调节剂制备IFN微球制剂

Zn²⁺和IFN-α-2b复合物微粉的制备方法同实施例1(1)、(2)两步，并将碳酸锌经气流粉碎控制粒径小于5μm，得碳酸锌微粉。

PLGA(RG503H，PLA:PGA＝50:50，德国Boehringer Ingelheim公司)50mg溶于500μl的乙腈溶液中成油相，将上述Zn²⁺和IFN-α-2b复合物微粉和碳酸锌微粉各1mg加入油相中水浴按常规超声混悬，混悬液加入30ml棉子油(含0.05％卵磷脂作为乳化剂，w/v)中，600rpm搅拌乳化2小时，然后加入轻质石油醚(沸点60-90℃)，继续搅拌15分钟使微球固化完全，离心、石油醚洗涤、冷冻干燥即得本发明微球。

实施例3：以棉子油为连续相伯洛沙姆188(F-68)为释放调节剂制备IFN微球制剂

Zn²⁺和IFN-α-2b复合物的制备方法同实施例1(1)，在含复合物的溶液中加入7.5mg(或15mg)F-68溶解混匀后冷冻干燥得冻干粉。

PLGA(RG503H，PLA:PGA＝50:50，德国Boehringer Ingelheim公司)41.5mg(或34mg)溶于500μl的乙腈溶液中成油相，将上述冻干粉加到油相中水浴超声混悬，使处方中F-68的含量分别为15％(或30％)。混悬液加到30ml棉子油(含0.05％卵磷脂作为乳化剂，w/v)中，600rpm搅拌乳化2小时，然后加入轻质石油醚(沸点60-90℃)，继续搅拌15分钟使微球固化完全，离心、石油醚洗涤、冷冻干燥即得本发明微球。

实施例4：以水为连续相制备IFN微球制剂

Zn²⁺和IFN-α-2b复合物的制备方法同实施例1(1)，在含复合物的溶液中加入10mgPEG6000，溶解混匀后冷冻干燥，得冻干粉。冻干粉用有机溶剂二氯甲烷1ml溶解，离心去上清，重复三次以去除PEG6000，即得Zn²⁺和IFN-α-2b复合物微粉。

PLGA(LA：GA＝50：50，特异性粘度为0.19dl/g，美国Birmingham Polymers公司)100mg溶于300μl二氯甲烷溶液中成油相，将Zn²⁺和IFN-α-2b复合物微粉加入油相中水浴超声混悬，加到20ml 3％PVA水溶液中，1000rpm搅拌2分钟，并将其立即用约200ml蒸馏水稀释，400rpm搅拌4小时，离心收集微球，蒸馏水洗涤，冷冻干燥即得本发明微球。

微球的体外释放试验：

称取含药微球10～30mg置10ml离心管中，加入1.5ml10mM pH7.4缓冲液(含0.02％叠氮钠作为抑菌剂，0.02％F-68润湿剂)作为释放介质，置于恒温水浴摇床中，在100rpm振荡速度、37℃±0.5℃温度条件下进行微球的体外释放度测定。分别在2小时、1天、2天取出离心管，于2000rpm离心10分钟，取上清用BCA法(Pierce公司BCA蛋白测定试剂盒，按说明书操作)测定上清中IFN的含量，沉淀中再加等量新的释放介质，按同法每隔3～4天取样检测一次。

以取样天数为横坐标，以相应的IFN累积释放百分比为纵坐标制作药物释放曲线，上述四个实施例制备的微球制剂释放曲线分别见图1～4。由图可见所制备的IFN缓释微球制剂可在体外释药4周以上。

本发明干扰素长效注射微球制剂制备工艺简单，重现性好，微球载药量大，释药平稳且持续时间长.

Claims

1.一种干扰素长效注射微球制剂的制备方法，配方与配比如下：

锌离子稳定化的干扰素 1～50mg

PLGA 50～500mg

释放调节剂碳酸锌或伯洛沙姆188 0～50mg

具体操作步骤为：

(1)制备油相

将生物可降解基质材料溶于有机溶剂，即成油相，所说的生物可降解基质材料为聚乳酸—羟基乙酸嵌段共聚物PLGA，其乳酸LA和羟基乙酸GA的比例为1:1，平均分子量为5000～70000道尔顿，特异性粘度为0.1～0.6dl/g，所说的有机溶剂选自二氯甲烷或乙腈；

(2)制备IFN和锌离子复合物微粉

IFN原液经超滤脱盐后换用10mM pH7.2的NaHCO₃缓冲液，在其中加2mMZnAc，调节Zn²⁺和IFN的摩尔比为2：1，并使IFN终浓度为1mg/ml左右，用1％HAc调pH至7.1，即可产生Zn²⁺和IFN复合物沉淀，再加入10倍量PEG6000，溶解混匀后冷冻干燥，得冻干粉；冻干粉用有机溶剂二氯甲烷或乙腈溶解，离心去上清，以去除PEG6000，即得IFN和锌离子复合物微粉；

(3)制备IFN微球

将IFN和锌离子复合物微粉加入油相，涡旋或超声分散后，逐滴加入连续相棉子油或水中，搅拌乳化；当选用棉子油为连续相时，油相中加入释放调节剂，使用的乳化剂为0.1％～2％的卵磷脂，室温搅拌2～6小时，然后加入适量石油醚200～1000rpm继续搅拌10～40分钟，使微球固化，再离心，石油醚洗涤，冷冻干燥即得微球；当选用水溶液为连续相时，使用的乳化剂为0.5％～5％聚乙烯醇PVA，以600～1800rpm高速搅拌乳化1～5分钟，得新生微球，再加5～10倍体积量蒸馏水稀释，以300～600rpm继续搅拌使有机溶剂挥发并固化微球，离心，蒸馏水洗涤，冷冻干燥即得微球。