CN100484557C - 一种治疗心肌缺血、改善微循环的中药复方制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种临床上用于治疗心肌缺血、改善微循环的中药复方制剂及其制备方法。该中药复方制剂是由西洋参和麦冬配伍的中药制成，该制剂中主要含有西洋参二醇组皂苷、拟人参皂苷F₁₁、麦冬甾体类皂苷以及麦冬黄酮，其中西洋参二醇组皂苷总计不得低于14.848mg，西洋参三醇组皂苷总计不多于8.016mg，其可制成包括注射液、大容量注射液，冻干粉针等剂型，给药途径为静脉注射。

Description

一种治疗心肌缺血、改善微循环的中药复方制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体说涉及一种临床上用于治疗心肌缺血、改善微循环的中药复方制剂及其制备方法。该中药复方制剂是由西洋参和麦冬配伍的中药制成，该制剂中含有西洋参二醇组皂苷、拟人参皂苷F₁₁、麦冬甾体类皂苷以及麦冬黄酮，其可制成包括注射液、大容量注射液，冻干粉针等剂型，给药途径为静脉注射。

背景技术

心血管类疾病是一种常见的多发性疾病，该类疾病严重地影响病人的身心健康及日常生活。现有的治疗药物有参麦注射液，参麦注射液由人参、麦冬组成，有益气固脱、养阴生津之效，广泛应用于气阴两虚型休克、冠心病、病毒性心肌炎、慢性肺心病、粒细胞减少症。但随着临床应用的扩展，参麦注射液不断有不良反应的报道，其不良反应综述如下：

(1)诱发心动过速：临床报道多例静脉注射参麦注射液后引起心动过速的病例，王氏(王红燕，林雁.静滴参麦注射液出现不良反应2例[J].中国中药杂志，2002，27(7)：558.)认为与方中主药红参具有增强心肌自律性，提高心肌兴奋性和收缩性并有兴奋中枢神经系统，尤其是兴奋交感神经系统有关，从而诱发心律失常。

(2)诱发心绞痛：张氏(张洪忠，于鹏飞.参麦注射液诱发心绞痛1例[J].临床心血管杂志，1996，12(6)：415.)认为其原因可能源于药物进入快速，强心作用过于明显并使心率增快，从而心肌耗氧量增加、心肌缺氧诱发心绞痛发作。

(3)严重腹胀：周小琳等(周小琳，杨运清.大量参麦注射液致严重腹胀4例[J].国医论坛，1996，11(2)：36.)报道了在给予参麦注射液治疗过程中出现严重腹胀的病例，周氏认为参麦注射液是益气养阴之补剂，大量久用后过于补气使中焦气滞不行而至腹胀满。

(4)过敏性休克：罗康(罗康.参麦注射液致过敏性休克1例[J].广西中医药，1996，19(2)：39.)，吴继萍等(吴继萍，朱丽文.参麦注射液致过敏性休克1例[J].中国医院药学杂志，2000，10(2)：75.)报道了参麦注射液所至过敏性休克的病例，作者认为过敏原可能与红参有关，为其特异体质所致。

(5)皮肤过敏。

可见，参麦注射液引起的不良反应均疑与方中主药红参有关。红参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的栽培品经蒸制后的干燥根，是临床上常用的益气扶正，滋补强壮药。味甘、微苦，性温。红参能提高心肌收缩力，有似强心甙样作用，对中枢神经系统有兴奋作用，故临床特点为益气固脱，大补元气。其强心升压、补气的特性可能是引起上述不良反应的主要原因，这就提示参麦注射液方中主药红参既起主要功效又会引起一些不良反应。

中国专利“一种含西洋参、麦冬有效部位的药物组合物及其制备方法”(申请号200410080241.8)，由该方法提取的西洋参有效部位中人参皂苷含量(以人参皂苷Rg、Rb↓[1]、Re计)为50％-85％，其中控制人参皂苷中人参二醇皂苷(以人参皂苷Rb↓[1]计)为10％-30％，由此可以推断该方法提取的西洋参有效部位中含有大量的20s-原人参三醇组皂苷(PQTS)，20s-原人参三醇组皂苷(PQTS)主要含单体皂苷Rg₁，Re，但经查阅文献发现：西洋参皂苷(PQS)含有的20s-原人参三醇组皂苷(PQTS)是其溶血的主要成分，且难溶于水，而影响PQS制成注射剂，故不适于缺血性心脏病急症治疗(睢大员，于小风，曲绍春等.西洋参20s-原人参二醇组皂苷对犬急性心肌梗死的保护作用[J].中国中药杂志，2001，26(6)：417.)。8种西洋参单体皂苷中，F₂的溶血作用最强，其次为Rg₂，其次为Rg₁；另外5种单体皂苷Rb₁，Rb₂，Rb₃，Rd，拟人参皂苷F₁₁在0.2mg/mL浓度时无溶血作用。有关单体人参皂苷Re和西洋参原人参三醇组皂苷难溶于生理盐水，其溶血作用有待进一步研究(孟勤，孙平，赵俊艳.西洋参皂苷溶血作用的观察[J].中国药学杂志，1996，31(12)：755～756.)。

可见现有技术中记载的治疗心血管类疾病的药物仍存在一定的缺陷，针对此问题，医学工作者仍不断寻找在临床上更有效、无不良反应的的方剂。

发明内容：

本发明的目的就是为了克服现有参麦注射液的缺陷，提供一种用于治疗心肌缺血、改善微循环的药物，其在保留原有参麦注射液功效的同时可以降低毒副作用，从而减少不良反应的发生。

本发明采取特定的工艺从西洋参和麦冬中提取有效部位配伍，从而实现了本发明目的，得到了一种疗效显著，毒副作用小的用于治疗心肌缺血、改善微循环的药物，具体说，由本发明工艺从西洋参提取的有效部位中，20s-原人参三醇组皂苷(PQTS)的含量大大降低，由此降低了毒副作用，本发明从西洋参和麦冬中提取有效部位制得的药物主要包含西洋参二醇组皂苷、拟人参皂苷F₁₁、麦冬甾体类皂苷、麦冬黄酮和一定药用辅料，本发明的药物可以制成注射剂、大容量注射剂和冻干粉针剂，给药途径为静脉注射。

本发明的一个目的就是提供一种治疗心肌缺血、改善微循环的中药复方制剂。

本发明的另一个目的在于提供一种所述中药复方制剂的制备方法。

本发明的目的是通过如下的技术方案来实现：

一种治疗心肌缺血、改善微循环的中药复方制剂，其特征在于每一个制剂单位含有西洋参奥克梯隆型皂苷：pF₁₁ 6.330-7.339mg；西洋参二醇组皂苷：Rb₃4.430-4.869mg，Rd 6.258-6.721mg，Rb₂ 2.271-2.681mg，Rb₁ 0.955-1.008mg，Rc 0.934-1.090mg，其中西洋参二醇组皂苷总计不得低于14.848mg；西洋参三醇组皂苷总计不多于8.016mg；麦冬甾体类总皂苷(以麦冬皂苷D′计)3.214-3.549mg；麦冬总黄酮(以橙皮苷计)0.521-0.589mg，和药用辅料。

本发明中药复方制剂中，优选西洋参三醇组皂苷总计不多于7.8mg。

本发明的中药复方制剂中的药用辅料选自以下的一种或多种：临床上可接受的pH调节剂诸如氢氧化钠、碳酸钠；渗透压调节剂诸如氯化钠；冷冻干燥赋形剂诸如右旋糖酐、甘露醇、山梨醇、果糖、赤藓糖醇或木醇糖；增溶剂羟丙基β环糊精及注射用水。

本发明的治疗心肌缺血、改善微循环的中药复方制剂是通过以下步骤制备而成：

①取西洋参干燥根粉碎成细粒，加乙醇浸泡，滤过，滤液备用，药渣用乙醇回流提取，滤过，药渣再用少量乙醇洗涤，合并浸渍液、提取液和洗涤液，调pH值至中性，减压回收乙醇至无醇味并浓缩，冷藏备用；

②取大孔吸附树脂，装于玻璃柱中，蒸馏水淋洗至无醇味，将步骤①得到的浓缩液调pH值为12-14，取上清液上柱，用丙酮水溶液洗，弃去丙酮洗脱液，再用乙醇解吸附至检测不出人参皂苷Rb₃和pF₁₁，收集、合并洗脱液，调pH值至中性，回收乙醇并浓缩，加入95％乙醇，放置过夜，过滤，备用；

③取脱色树脂，装于玻璃柱中，取上述滤过液上柱脱色，流出液减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至60℃下相对密度为1.20-1.30，60℃下真空干燥，粉碎过100目筛；

④取麦冬粉碎成细粒，加乙醇浸泡，滤过，滤液备用，药渣用乙醇回流提取，滤过，药渣再用少量乙醇洗涤，合并浸渍液、提取液和洗涤液，减压回收乙醇至无醇味并浓缩，滤过，冷藏备用；

⑤取大孔吸附树脂，装于玻璃柱中，蒸馏水淋洗至无醇味，取步骤④得到的滤过液上柱，蒸馏水洗，弃去水洗脱液，再用乙醇解吸附，收集、合并醇洗液，回收乙醇并浓缩，加入95％乙醇，放置过夜，过滤；

⑥取脱色树脂，装于玻璃柱中，取上述滤过液上柱脱色，流出液减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至25℃下相对密度为1.16-1.20，冷冻干燥，密封保存；

⑦按重量比例2.5-3.5:0.5-1.5取上述提取的西洋参有效成分与麦冬的有效成分加适宜的药用辅料制备成本发明的复方中药制剂。

本发明还涉及由上述制备方法得到的一种治疗心肌缺血、改善微循环的中药复方制剂。

优选本发明的治疗心肌缺血、改善微循环的中药复方制剂是通过以下方法制备而成：

①取西洋参干燥根粉碎成细粒，加80％乙醇浸泡48-96小时，滤过，滤液备用，药渣用80％乙醇回流提取三次，提取时间分别为180、180、150分钟，滤过，药渣用少量乙醇洗涤，合并浸渍液、提取液和洗涤液，调pH值至中性，减压回收乙醇至无醇味并浓缩，滤过，冷藏备用；

②取大孔吸附树脂，装于合适柱体积且直径：柱高约为1:16-18的玻璃柱中，蒸馏水淋洗至无醇味。将步骤①得到的浓缩液调pH值为12-14，取上清液上柱，30％丙酮水溶液洗1-3倍柱体积，弃去30％丙酮洗脱液，再用70％乙醇解吸附至检测不出人参皂苷Rb₃和pF₁₁，收集、合并70％乙醇洗脱液，调pH值至中性，回收乙醇并浓缩，加入95％乙醇，放置过夜，过滤，备用；

③取脱色树脂，装于合适柱体积且直径：柱高约为1:6-8玻璃柱中，取上述滤过液上柱脱色，流出液减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至60℃下相对密度为1.20-1.30，60℃下真空干燥，粉碎过100目筛；

④取麦冬粉碎成细粒，加80％乙醇浸泡24-72小时，滤过，滤液备用，药渣用80％乙醇回流提取2-3次，每次1-2小时，滤过，药渣再用少量乙醇洗涤，合并浸渍液、提取液和洗涤液，减压回收乙醇至无醇味并浓缩，滤过，冷藏备用；

⑤取大孔吸附树脂，装于合适柱体积且直径：柱高约为1:16-18的玻璃柱中，蒸馏水淋洗至无醇味。取步骤④得到的滤过液上柱，蒸馏水洗，弃去水洗脱液，再用70％乙醇解吸附，收集、合并醇洗液，回收乙醇并浓缩，加入95％乙醇，放置过夜，过滤；

⑥取脱色树脂，装于合适柱体积且直径：柱高约为1:6-8玻璃柱中，取上述滤过液上柱脱色，流出液减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至25℃下相对密度为1.16-1.20，冷冻干燥，密封保存；

⑦按重量比例2.5-3.5:0.5-1.5取上述提取的西洋参有效成分与麦冬的有效成分加适宜的药用辅料制备成本发明的复方中药制剂。

本发明制备方法中所使用的大孔吸附树脂包括D101、D21、AB-8等型号。所使用的脱色树脂为弱碱性的离子交换树脂，包括ZTC-2，D301.

本发明的复方制剂可以制成各种剂型，包括注射剂、大容量注射剂、冻干粉针剂，给药途经为静脉注射。

本发明的复方制剂可以制成注射剂，其制备方法为：

按重量比例2.5-3.5:0.5-1.5取本发明提取的西洋参有效成分与麦冬的有效成分加注射用水，摇匀，静置冷藏，滤过，按体积加入0.5％的针用活性炭30-40度加热搅拌，待稍冷后过滤脱炭，微孔滤膜过滤，熔封于安瓿中，105℃热压灭菌即得。注射剂的规格为2～10ml，用法：一日一至三次，每次1-3支。

本发明的复方制剂还可以制成大容量注射液，其制备方法为：

按重量比例2.5-3.5:0.5-1.5取本发明提取的西洋参有效成分与麦冬的有效成分加注射用水，摇匀，静置冷藏，滤过，按体积加入0.5％的针用活性炭30-40度加热搅拌，待稍冷后过滤脱炭，微孔滤膜过滤，再加注射用水，微孔滤膜过滤，分装于输液瓶中，105℃热压灭菌即得。该大容量注射剂的规格为100～500ml，用法：一日一至三次，每次1-3瓶。

本发明的复方制剂还可以制成冻干粉针剂，其制备方法为：

按重量比例2.5-3.5:0.5-1.5取本发明提取的西洋参有效成分与麦冬的有效成分加注射用水，摇匀，静置冷藏，滤过，按体积加入0.5％的针用活性炭30-40度加热搅拌，待稍冷后过滤脱炭，加入15％甘露醇溶液，摇匀，先过0.8μm的膜，再过0.45μm膜，再用0.22μm的微孔滤膜滤过除菌。灌封每支3mL，冷冻干燥即得。

冻干条件：真空度750mmHg，预冻温度-50℃，预冻时间2小时；升华温度-30℃，升华时间20小时；第二次升华温度-10℃，升华时间6小时；干燥温度40℃，干燥时间4小时，即得。

本发明所用的西洋参Panax quinquefoliumL.与人参同为五加科植物人参属植物，也是临床上常用的益气扶正，滋补强壮药。因西洋参与红参原植物为同科同属植物，故所含大类化学成分基本相同。其味甘，微苦，性凉，具有补气养阴，清热生津等功能。药理学研究表明西洋参具有抗心律失常及心肌缺血、抗高血压、抗休克、抗氧化及调节血脂代谢等作用，此外还具有升高白细胞，调节免疫的功能。

迄今为止，从原产和引种西洋参各部位中分离鉴定出的人参皂苷母体结构分属三个类型：达玛烷型(Dammarane)，齐墩果烷型(Oleanane)，奥克梯隆醇型(Ocotillol)。达玛烷型皂苷属四环三萜类，其皂苷元有两种，一种为A型，即20(S)-原人参萜二醇[20(S)-protopanaxadiol]；一种为B型，即20(S)-原人参萜三醇[20(S)-protopanaxatriol]。齐墩果烷型皂苷属五环三萜类即C型皂苷。奥克梯隆醇型皂苷pF₁₁为新近在西洋参中发现的一类新型皂苷，是西洋参中的特有成分(李义侠，刘淑芬，王晓霞.假人参皂甙24(R)-F₁₁鉴别人参与西洋参的显著标志[J].中草药.1995，26(10)：540～541.中国药品生物制品检定所.进口药材质量分析研究[M].1988，57～65.)。

由五加科人参属植物西洋参(Panax quinquefolium L.)干燥根分离纯化得到的20s-原人参二醇组皂苷(PQDS)主要含Rb₃，Rd，Rb₂，Rc和Rb₁，以Rb₃和Rd为主。经研究发现：PQDS能明显缩小犬急性心肌梗死范围，降低血清CK，LDH活性，并纠正缺血时FFA代谢紊乱，对抗自由基引发的脂质过氧化反应，增强体内抗氧化酶活性；PQDS能明显减慢HR，使舒张期延长，延长心内膜供血时间；加之可减少LVEDP的升高幅度，降低左室舒张期内压，亦可增加心内膜心肌供血；此外，PQDS还可增加MBF，降低CVR，从而改善缺血区血流供应；PQDS对急性心肌缺血具有明显的保护作用；PQDS明显增加急性心肌梗死犬心肌血流量，降低冠脉血管阻力，改善缺血心肌供血，亦是其抗心肌缺血的重要药理依据。西洋参二醇组皂苷能加强超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化酶的活力并减少质氧化物的生成，表明它对心肌缺血再灌注操作具有保护作用。同时，PQDS与一般皂苷不同，非但没有溶血毒性，且有抗溶血作用(刘玉梅，于倩，李淑英等.西洋参二醇组皂苷注射液的研制及临床研究[J].中国药学杂志，1997，32(10)：619～621.)，并具有较好的水溶性。

奥克梯隆醇型拟人参皂苷(pesudo-ginsenoside)-F₁₁是从西洋参中分离出的一种特征性单体成分，是西洋参皂苷中含量最多的成分之一。经研究发现：pF₁₁对小鼠断头致急性脑缺氧、双侧结扎颈总动脉致缺血造成的缺氧、NaNO₂、KCN所致化学性缺氧均有明显的保护作用，这与西洋参能够调节心脏机能、改善血液流变学的功能是相关的。另pF₁₁ 10mg/kg iv.可使麻醉大鼠BP、LVSP及±dp/dt_max等明显增加，结果初步表明pF₁₁对心血管系统具有外周作用(陈立，杨世杰，陈霞.西洋参皂苷单体pF₁₁对心血管作用的初步观察[J].白求恩医科大学学报，1995，21(1)：20～22.)。

20s-原人参三醇组皂苷(PQTS)主要含单体皂苷Rg₁，Re等；由于西洋参总皂苷(PQS)含有的PQTS是其溶血的主要成分，且难溶于水，从而影响PQS制成注射剂，故不适于缺血性心脏病急症治疗。因此，本发明通过特定的工艺从PQS中最大可能地去除PQTS组分，为制成注射剂创造了条件，并能增强抗心肌缺血作用。

因此，本发明以五加科人参属植物西洋参(Panax quinquefolium L.)干燥根分离纯化得到的20s-原人参二醇组皂苷(PQDS)和拟人参皂苷F₁₁替代红参，在保留原有功效的同时可以降低毒副作用，从而减少不良反应的发生。本发明从西洋参中提取有效组分中：二醇组皂苷总计不少于50.2％；含奥克梯隆醇型皂苷pF₁₁不少于24％，而引起副作用的三醇组皂苷总计不高于25％。这不仅为制成注射剂创造了条件，并能增强抗心肌缺血作用，使之成为治疗急性心肌梗死的新药。

麦冬为百合科沿阶草属植物麦冬Ophiopogon japonicus(Thunb.)Ker-Gaw1.的干燥块根。性微寒，味甘微苦，具有养阴生津，润肺清心之功。近年来麦冬的研究发展很快，国内外学者从麦冬类植物中分得45种皂苷、21种高异黄酮等其它成分。

现代药化及药理研究发现，麦冬主含多种甾体皂苷及β-谷甾醇等成分，能增强垂体肾上腺皮质系统功能，提高肌体适应性。同时有大量研究资料表明，麦冬对心血管系统有显著作用，即麦冬能改善心肌收缩性，增强心脏排血量，降低心脏负荷和心肌耗氧量，并具有明显改善左心室功能和抗休克作用，现代临床研究发现，单味麦冬的水煎剂及注射剂，均对慢性心功能不全，冠心病有明显疗效。

本发明源于现有的参麦注射液(部颁标准第十八分册)，现有的参麦注射液由红参、麦冬组成，有益气固脱、养阴生津之效，广泛应用于气阴两虚型休克、冠心病、病毒性心肌炎、慢性肺心病、粒细胞减少症。但随着临床应用的扩展，不断有诱发心动过速、诱发心绞痛、严重腹胀、过敏性休克、皮肤过敏等不良反应的报道，其不良反应均疑与方中主药红参强心升压、补气的特性有关。本发明旨在在保留原有功效的同时可以降低毒副作用，从而减少不良反应的发生。

本发明的特点是：以西洋参、麦冬为制剂原料药材，在对西洋参、麦冬有效成分理化性质充分研究的基础上，根据每味药本身特性通过特定的工艺分别提取精制，最大限度的保留有效成分，除去有关杂质成分和引起副作用的成分，使本发明制得的药物疗效显著，毒副作用低，为临床上用于治疗心肌缺血、改善微循环提供了新的途经。

具体实施方式

下列实施例是为了进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。

制备实施例1(注射剂)：

①取西洋参干燥根1kg粉碎成细粒，加80％乙醇2L浸泡72小时，滤过，滤液备用，药渣用加80％乙醇8L回流提取三次，提取时间分别为180、180、150分钟，滤过，药渣用少量乙醇洗涤。合并浸渍液、提取液和洗涤液，调pH值至中性，减压回收乙醇至无醇味并浓缩至5L，滤过，冷藏备用。

②取D101大孔吸附树脂(干树脂)6kg，经处理后装于R8×H150cm的玻璃柱中，蒸馏水淋洗至无醇味。上述浓缩液调pH值为13，取上清液上柱，30％丙酮水溶液洗2倍柱体积(约13L)，流速为每分钟100mL。弃去30％丙酮洗脱液，再用约5倍柱体积的70％乙醇解吸附至检测不出人参皂苷Rb₃和pF₁₁，流速为每分钟80mL。收集、合并70％乙醇洗脱液，调pH值至中性，回收乙醇并浓缩至3L，加入95％乙醇9L，放置过夜，过滤，备用。

③取D301脱色树脂3kg，处理后装于R12×H80cm玻璃柱中，树脂厚度约为30cm。取上述滤过液上柱脱色，流出液减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至60℃下相对密度为1.26，60℃下真空干燥，粉碎过100目筛。

④取麦冬1kg粉碎成细粒，加80％乙醇2L浸泡48小时，滤过，滤液备用，药渣用80％乙醇6L回流提取三次，每次1.5小时，滤过，药渣用少量乙醇洗涤。合并浸渍液、提取液和洗涤液，减压回收乙醇至无醇味并浓缩至2L，滤过，冷藏备用。

⑤取D101大孔吸附树脂(干树脂)2kg，经处理后装于R6×H90cm的玻璃柱中，蒸馏水淋洗至无醇味。取上述滤过液上柱，蒸馏水洗2倍量柱体积，流速为每分钟120mL。弃去水洗脱液，再用约7倍柱体积的70％乙醇解吸附，流速为每分钟80mL。收集、合并醇洗液，回收乙醇并浓缩至1.2L，加入95％乙醇3.6L，放置过夜，过滤。

⑥取D301脱色树脂1.5kg，处理后装于R10×H100cm玻璃柱中，树脂厚度约为20cm。取上述滤过液上柱脱色，流出液减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至25℃下相对密度为1.18，冷冻干燥，密封保存。

⑦按一定重量比例(3:1)取本发明提取的注射级原料药西洋参有效成分与麦冬的有效成分40g加水至1000mL，摇匀，静置冷藏24小时，滤过，按体积加入0.5％的针用活性炭30-40度加热搅拌45分钟，待稍冷后过滤脱炭，微孔滤膜过滤，熔封于5mL安瓿中，105℃热压灭菌即得。

按高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VD)测定，每一个制剂单位含有奥克梯隆型皂苷：pF₁₁ 6.884mg；二醇组皂苷：Rb₃ 4.503mg，Rd 6.570mg，Rb₂ 2.271mg，Rb₁ 1.008mg，Rc 1.048mg，其中二醇组皂苷总计不低于15mg；西洋参三醇组皂苷总计不多于7.7mg；麦冬甾体类总皂苷(以麦冬皂苷D′计)3.464mg；麦冬总黄酮(以橙皮苷计)0.559mg。

制备实施例2(大容量注射剂)：

①取西洋参干燥根1kg粉碎成细粒，加80％乙醇2L浸泡72小时，滤过，滤液备用，药渣用加80％乙醇8L回流提取三次，提取时间分别为180、180、150分钟，滤过，药渣用少量乙醇洗涤。合并浸渍液、提取液和洗涤液，调pH值至中性，减压回收乙醇至无醇味并浓缩至5L，滤过，冷藏备用。

②取D21大孔吸附树脂(干树脂)6kg，经处理后装于R8×H150cm的玻璃柱中，蒸馏水淋洗至无醇味。上述浓缩液调pH值为13，取上清液上柱，30％丙酮水溶液洗2倍柱体积(约13L)，流速为每分钟100mL。弃去30％丙酮洗脱液，再用约5倍柱体积的70％乙醇解吸附至检测不出人参皂苷Rb₃和pF₁₁，流速为每分钟80mL。收集、合并70％乙醇洗脱液，调pH值至中性，回收乙醇并浓缩至3L，加入95％乙醇9L，放置过夜，过滤，备用。

③取ZTC-2脱色树脂3kg，处理后装于R12×H80cm玻璃柱中，树脂厚度约为30cm。取上述滤过液上柱脱色，流出液减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至60℃下相对密度为1.26，60℃下真空干燥，粉碎过100目筛。

④取麦冬1kg粉碎成细粒，加80％乙醇2L浸泡48小时，滤过，滤液备用，药渣用80％乙醇6L回流提取三次，每次1.5小时，滤过，药渣用少量乙醇洗涤。合并浸渍液、提取液和洗涤液，减压回收乙醇至无醇味并浓缩至2L，滤过，冷藏备用。

⑤取D21大孔吸附树脂(干树脂)2kg，经处理后装于R6×H90cm的玻璃柱中，蒸馏水淋洗至无醇味。取上述滤过液上柱，蒸馏水洗2倍量柱体积，流速为每分钟120mL。弃去水洗脱液，再用约7倍柱体积的70％乙醇解吸附，流速为每分钟80mL。收集、合并醇洗液，回收乙醇并浓缩至1.2L，加入95％乙醇3.6L，放置过夜，过滤。

⑥取ZTC-2脱色树脂1.5kg，处理后装于R10×H100cm玻璃柱中，树脂厚度约为20cm。取上述滤过液上柱脱色，流出液减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至25℃下相对密度为1.18，冷冻干燥，密封保存。

⑦按一定重量比例(3:1)取本发明提取的注射级原料药西洋参有效成分与麦冬的有效成分40g加水至1000mL，摇匀，静置冷藏24小时，滤过，按体积加入0.5％的针用活性炭30-40度加热搅拌45分钟，待稍冷后过滤脱炭，微孔滤膜过滤，注射用水加至全量20000mL，微孔滤膜过滤，分装于100mL输液瓶中，105℃热压灭菌即得。

按高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VD)测定，每一个制剂单位含有奥克梯隆型皂苷：pF₁₁ 7.021mg；二醇组皂苷：Rb₃ 4.719mg，Rd 6.375mg，Rb₂ 2.382mg，Rb₁ 0.983mg，Rc 0.967mg，其中二醇组皂苷总计不低于15.1mg；西洋参三醇组皂苷总计不多于7.8mg；麦冬甾体类总皂苷(以麦冬皂苷D′计)3.377mg；麦冬总黄酮(以橙皮苷计)0.569mg。

制备实施例3(冻干粉针)：

①取西洋参干燥根1kg粉碎成细粒，加80％乙醇2L浸泡72小时，滤过，滤液备用，药渣用加80％乙醇8L回流提取三次，提取时间分别为180、180、150分钟，滤过，药渣用少量乙醇洗涤。合并浸渍液、提取液和洗涤液，调pH值至中性，减压回收乙醇至无醇味并浓缩至5L，滤过，冷藏备用。

②取AB-8大孔吸附树脂(干树脂)6kg，经处理后装于R8×H150cm的玻璃柱中，蒸馏水淋洗至无醇味。上述浓缩液调pH值为13，取上清液上柱，30％丙酮水溶液洗2倍柱体积(约13L)，流速为每分钟100mL。弃去30％丙酮洗脱液，再用约5倍柱体积的70％乙醇解吸附至检测不出人参皂苷Rb₃和pF₁₁，流速为每分钟80mL。收集、合并70％乙醇洗脱液，调pH值至中性，回收乙醇并浓缩至3L，加入95％乙醇9L，放置过夜，过滤，备用。

③取ZTC-2脱色树脂3kg，处理后装于R12×H80cm玻璃柱中，树脂厚度约为30cm。取上述滤过液上柱脱色，流出液减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至60℃下相对密度为1.26，60℃下真空干燥，粉碎过100目筛。

④取麦冬1kg粉碎成细粒，加80％乙醇2L浸泡48小时，滤过，滤液备用，药渣用80％乙醇6L回流提取三次，每次1.5小时，滤过，药渣用少量乙醇洗涤。合并浸渍液、提取液和洗涤液，减压回收乙醇至无醇味并浓缩至2L，滤过，冷藏备用。

⑤取AB-8大孔吸附树脂(干树脂)2kg，经处理后装于R6×H90cm的玻璃柱中，蒸馏水淋洗至无醇味。取上述滤过液上柱，蒸馏水洗2倍量柱体积，流速为每分钟120mL。弃去水洗脱液，再用约7倍柱体积的70％乙醇解吸附，流速为每分钟80mL。收集、合并醇洗液，回收乙醇并浓缩至1.2L，加入95％乙醇3.6L，放置过夜，过滤。

⑥取ZTC-2脱色树脂1.5kg，处理后装于R10×H100cm玻璃柱中，树脂厚度约为20cm。取上述滤过液上柱脱色，流出液减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至25℃下相对密度为1.18，冷冻干燥，密封保存。

⑦按一定重量比例(3:1)取本发明提取的注射级原料药西洋参有效成分与麦冬的有效成分40g加水至750mL，摇匀，静置冷藏24小时，滤过，按体积加入0.5％的针用活性炭30-40度加热搅拌45分钟，待稍冷后过滤脱炭，加入250mL 15％甘露醇溶液，摇匀，先过0.8μm的膜，再过0.45μm膜，再用0.22μm的微孔滤膜滤过除菌。灌封每支3mL，冷冻干燥即得。

冻干条件：真空度750mmHg，预冻温度-50℃，预冻时间2小时；升华温度-30℃，升华时间20小时；第二次升华温度-10℃，升华时间6小时；干燥温度40℃，干燥时间4小时，即得。

按高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VD)测定，每一个制剂单位含有奥克梯隆型皂苷：pF₁₁ 6.874mg；二醇组皂苷：Rb₃ 4.695mg，Rd 6.619mg，Rb₂ 2.533mg，Rb₁ 0.996mg，Rc 1.068mg，其中二醇组皂苷总计不低于15.2mg；西洋参三醇组皂苷总计不多于7.9mg；麦冬甾体类总皂苷(以麦冬皂苷D′计)3.502mg；麦冬总黄酮(以橙皮苷计)0.581mg。

药效学实施例

实施例1(盐酸异丙肾上腺素注射液(ISO)诱发的大鼠急性心肌缺血实验)：

1 药品与试剂

(1)本发明实施例1的注射液(洋参麦冬注射液)

配制方法：给药前以5％葡萄糖注射液配制所需浓度溶液

(2)复方丹参注射液：上海中西制药有限公司

                   批号：0410004

用量：成人静脉滴注，一次10～16ml，用5％葡萄糖注射液100～500ml稀释后应用，一日1次

(3)盐酸异丙肾上腺素注射液(Iso)：上海禾丰制药有限公司

                                批号：4E20001

(4)5％葡萄糖注射液：沈阳志鹰制药厂

                    批号：05030701

(5)20％乌拉坦：氨基甲酸乙酯中国医药(集团)上海化学试剂公司

               批号：F 20020802 化学纯CP

临用前以0.9％生理盐水配制

2 实验动物

Wistar大白鼠         体重(180～220g)雌雄各半

实验动物由沈阳药科大学实验动物中心提供

合格证号：SCXK(辽)2003-008

3 实验仪器

(1)RM6240CD型多道生理信号采集系统成都仪器制造厂

(2)JA1003电子天平上海精科公司天平仪器厂

(3)JY8001电子天平上海精科公司天平仪器厂

4 实验方法

将60只大鼠(180～220g，雌雄兼用)随机分成六组，每组10只，雌雄各半。分别为模型对照组；洋参麦冬注射液低、中、高剂量组(给药剂量按临床剂量折算分别为8.4mg/kg，16.8mg/kg，33.6mg/kg)；灌胃给药组(16.8mg/kg)；阳性对照组(复方丹参注射液16.8mg/kg)。受试药物及阳性对照组均用5％葡萄糖配制成所需浓度，给药容积为10ml/kg，腹腔连续给药七天，末次给药后60min受试动物用乌拉坦腹腔注射麻醉(1.2g/kg)，背位固定，用RM6240CD型多道生理信号采集系统针型电极与大鼠四肢相连记录心电图。皮下注射盐酸异丙肾上腺素注射液，诱发大鼠急性心肌缺血，剂量为2mg/kg，给药容积为4ml/kg。观察给药后5′、10′、20′、30′心电图中ST段偏移基线的高度。以偏移均值为衡量心肌损伤的观察指标，进行统计与显著性测定。

5 统计学处理方法

实验数据用平均值x±标准差(SD)表示，组间资料统计用组间T检验。计数资料统计用X²检验。

6 结果与讨论

结果如表1所示，洋参麦冬注射液高、中剂量静脉给药可明显降低异丙肾上腺素皮下注射引起心肌代谢加强所致心肌缺血时ST段的偏移，与模型组比较有显著差异(P<0.05，P<0.01＝。低剂量的抑制作用与模型组比较不明显。阳性药复方丹参注射液亦有作用。

表1：洋参麦冬注射液对Iso诱发大鼠心肌缺血ST段偏移程度的影响(x±SD)

与对照组比较，*P<0.05      **P<0.01

T波的形成是心室负极化过程中产生的电极变化，Lepeschkin认为，心内、外膜肌层温度差变化影响心室的复极作用。即横断心肌温度梯度学说。正常心肌外膜下肌层温度高于心内膜下肌层0.5-1.0℃，形成正向T波，反之则T波倒置，横断心肌温度梯度越大，T波振幅就越高。增加冠脉流量则横断心肌温度梯度减小，所以正常横断心肌温度的增减借助于心肌血流和冠脉血流量调节散热的增减。按照这种解释可以推测，大剂量垂体后叶素由于收缩冠脉小动脉和毛细血管，显著减少冠脉血流量，降低心肌散热过程，特别是心外膜下肌层的散热，增加心内、外膜下肌层温度差，故T波显著增加。

Pit所致大鼠急性心肌缺血法是研究抗心肌缺血药物的一个重要而经典的动物模型。有文献^[14]指出：静脉注射Pit后20S左右即可引起T波的显著升高。由本文实验结果可看出洋参麦冬注射液对Pit所致大鼠心电图变化有明显的抑制作用。提示洋参麦冬注射液对Pit所致大鼠心肌缺血损伤具有一定保护作用。

实施例2(抗心肌缺氧作用——小鼠气管夹闭心电消失时间的测定)：

1 药品与试剂

(1)本发明实施例1的注射液(洋参麦冬注射液)

配制方法：给药前以5％葡萄糖注射液配制所需浓度溶液

(2)复方丹参注射液：上海中西制药有限公司

                   批号：0410004

用量：成人静脉滴注，一次10～16ml，用5％葡萄糖注射液100～500ml稀释后应用，一日1次

(3)5％葡萄糖注射液：沈阳志鹰制药厂

                    批号：05030701

(4)20％乌拉坦：氨基甲酸乙酯中国医药(集团)上海化学试剂公司

               批号：F 20020802  化学纯CP

临用前以0.9％生理盐水配制

2 实验动物

昆明种小白鼠          体重(18～22g)雌雄各半

实验动物由沈阳药科大学实验动物中心提供

合格证号：SCXK(辽)2003-008

3 实验仪器

(1)RM6240CD型多道生理信号采集系统成都仪器制造厂

(2)JA1003电子天平上海精科公司天平仪器厂

(3)JY8001电子天平上海精科公司天平仪器厂

4 实验方法

将60只受试小鼠(18～22g，雌雄兼用)随机分成6组，每组10只，雌雄各半。第一组为模型组，尾静脉注射0.9％生理盐水；第二、三、四组为洋参麦冬注射液低、中、高剂量组，给药剂量按临床剂量折算分别为12mg/kg、24mg/kg、48mg/kg；第五组为洋参麦冬注射液灌胃给药组，剂量为24mg/kg；第六组为复方丹参注射液静脉注射组，给药剂量同中剂量组。各组给药容积均为0.2ml/10g。尾静脉连续给药7天，每天一次，于末次给药后60min按文献方法将受试小鼠用乌拉坦(1.2g/kg)腹腔注射麻醉，翻正反射消失后，背位固定，颈前部手术暴露并游离气管，用RM6240CD型多道生理信号采集系统针型电极与小鼠四肢相连，采集正常心电图，用小动脉夹夹闭小鼠气管，记录每组每只小鼠夹闭气管至心电消失的时间。

5 统计学处理方法

实验数据用平均值x±标准差(SD)表示，组间资料统计用组间T检验。计数资料统计用X²检验。

6 结果与讨论

结果如表2所示，洋参麦冬注射液高、中剂量静脉给药对夹闭小鼠气管其心电消失时间有明显的延长作用，与模型组比较有显著差异，P<0.05，P<0.01。低剂量小鼠对心电消失时间的延长作用与模型组比较不明显。阳性药复方丹参注射液亦有作用。

表2：洋参麦冬注射液静脉给药对小鼠气管夹闭心电消失时间的影响(x±SD)

与对照组比较，*P<0.05     **P<0.01

心肌缺血时主要表现为心肌缺血缺氧。在抗心肌缺氧药的药理初筛实验中，一般采用小鼠耐缺氧实验法，但有文献报道，小鼠耐缺氧试验虽然简便易行，但这种整体动物耐缺氧实验所得结果不仅反映心肌而且包括全身组织对缺氧的反应。尤其是脑组织对缺氧特别敏感。有实验表明，凡能影响中枢神经系统的药物都能影响小鼠在缺氧情况下的存活时间。另有报道大鼠、小鼠的耐缺氧存活时间与心肌耗氧量无平行关系，因此认为整体动物耐缺氧实验不能准确代表心肌耐缺氧情况。因此，本文考察了洋参麦冬注射液对小鼠气管夹闭心电消失时间的影响，试验结果显示，它能有效延长上述状况下小鼠的心电消失及存活时间。

实施例3(氯仿诱发小鼠心室纤颤实验和氯化钡诱发大鼠心律失常实验)：

1 药品与试剂

(1)本发明实施例1的注射液(洋参麦冬注射液)

配制方法：给药前以5％葡萄糖注射液配制所需浓度溶液

(2)复方丹参注射液：上海中西制药有限公司

                   批号：0410004

用量：成人静脉滴注，一次10～16ml，用5％葡萄糖注射液100～500ml稀释后应用，一日1次

(3)5％葡萄糖注射液：沈阳志鹰制药厂

                    批号：05030701

(4)20％乌拉坦：氨基甲酸乙酯中国医药(集团)上海化学试剂公司

               批号：F 20020802  化学纯CP

临用前以0.9％生理盐水配制

(5)三氯甲烷(氯仿)：沈阳市东兴试剂厂

                   批号：20021121

(6)盐酸异丙肾上腺素注射液(Iso)：上海禾丰制药有限公司

                                批号：4E20001

(7)10％水合氯醛：水合三氯乙醛河北高碑店市春光试剂厂

                 批号：950316  化学纯CP

临用前以0.9％生理盐水配制

2 实验动物

(1)Wistar大白鼠           体重(180～220g)雌雄各半

(2)昆明种小白鼠           体重(18～22g)雌雄各半

实验动物由沈阳药科大学实验动物中心提供

合格证号：SCXK(辽)2003-008

3 实验仪器

(1)RM6240CD型多道生理信号采集系统成都仪器制造厂

(2)JA1003电子天平上海精科公司天平仪器厂

(3)JY8001电子天平上海精科公司天平仪器厂

4 实验方法

4.1 氯仿诱发小鼠心室纤颤实验

受试动物分组，给药方式，剂量同小鼠气管夹闭实验。受试动物连续给药七天，末次给药后60min将小鼠放置在倒置的400ml烧杯中，内放有含3ml氯仿的棉球，以后每换1只再添加0.5ml氯仿，至小鼠呼吸停止，立即取出，开胸肉眼观察发生心室纤颤的发生率，用X²检验判断其显著性。

4.2 氯化钡诱发大鼠心律失常实验

受试动物分组，给药方式，剂量同实施例1。受试动物连续给药七天，末次给药后60min受试动物用水合氯醛腹腔注射麻醉，背位固定，用RM6240CD型多道生理信号采集系统针型电极与大鼠四肢相连记录心电图。

5 统计学处理方法

实验数据用平均值x±标准差(SD)表示，组间资料统计用组间T检验。计数资料统计用X²检验。

6 结果与讨论

6.1 氯仿诱发小鼠心室纤颤实验

结果如表3所示，洋参麦冬注射液高、中剂量静脉给药对氯仿诱发小鼠室颤的发生率有明显的抑制作用，与模型组比较有显著差异，(P<0.05，P<0.01)。低剂量的抑制作用与模型组比较不明显。

表3：洋参麦冬注射液静脉给药对小鼠心室纤颤发生率的影响(x±SD)

经X²检验，给药组与模型组比较，*P<0.05    **P<0.01

6.2 氯化钡诱发大鼠心律失常实验

结果如表5所示，洋参麦冬注射液高、中剂量静脉给药对氯化钡引起的心律不齐维持时间有缩短作用，与模型组比较有显著差异，(P<0.05，P<0.01)。低剂量的抑制作用与模型组比较不明显。

表5：洋参麦冬注射液对氯化钡诱发大鼠心律失常的保护作用(x±SD)

给药组与模型组比较，*P<0.05      **P<0.01

心肌缺血时，由于心脏缺血缺氧，心肌代谢紊乱，后期往往发生严重的心律失常，这是因为心肌的损伤只是心脏冲动的产生和传导受阻，继而诱发心律失常。

一定剂量的氯仿可提高心肌的自律性导致室性早搏、室性心动过速、甚至室颤。据报道氯仿诱发的心律失常可能与其敏化心脏对内源儿茶酚胺的作用有关；氯化钡和氯化钙相似能通过慢通道而内流，增加心律，而诱发心律失常。实验表明洋参麦冬注射液能对抗氯仿、氯化钡诱发的心律失常，延长心律失常开始时间，缩短心律失常维持时间。

Claims (8)

1.一种治疗心肌缺血、改善微循环的中药复方制剂，其特征在于每一个制剂单位含有西洋参奥克梯隆型皂苷、西洋参二醇组皂苷、西洋参三醇组皂苷、麦冬甾体类总皂苷、麦冬总黄酮和药用辅料，其中所述的西洋参二醇组皂苷含有Rb₃，Rd，Rb₂，Rb₁和Rc；西洋参二醇组皂苷总计不得低于14.848mg，西洋参三醇组皂苷总计不多于8.016mg。

2.根据权利要求1所述的中药复方制剂，其特征在于每一个制剂单位含有西洋参奥克梯隆型皂苷pF₁₁ 6.330-7.339mg，西洋参二醇组皂苷Rb₃ 4.430-4.869mg，Rd 6.258-6.721mg，Rb₂ 2.271-2.681mg，Rb₁ 0.955-1.008mg，Rc0.934-1.090mg，其中西洋参二醇组皂苷总计不得低于14.848mg，西洋参三醇组皂苷总计不多于8.016mg，以麦冬皂苷D′计，麦冬甾体类总皂苷3.214-3.549mg，以橙皮苷计，麦冬总黄酮0.521-0.589mg，和药用辅料。

3.根据权利要求2所述的中药复方制剂，其中所述西洋参三醇组皂苷总计不多于7.8mg。

4.根据权利要求2或3所述的中药复方制剂，其中所述的药用辅料选自以下的一种或多种：氢氧化钠、碳酸钠、氯化钠、右旋糖酐、甘露醇、山梨醇、果糖、赤藓糖醇、木醇糖、羟丙基β环糊精及注射用水。

5.根据权利要求4所述的中药复方制剂，其被制成注射剂。

6.权利要求1或2所述的中药复方制剂的制备方法，其步骤为：

①取西洋参干燥根粉碎成细粒，加80％乙醇浸泡，滤过，滤液备用，药渣用80％乙醇回流提取，滤过，药渣再用少量乙醇洗涤，合并浸渍液、提取液和洗涤液，调pH值至中性，减压回收乙醇至无醇味并浓缩，冷藏备用；

②取大孔吸附树脂，装于玻璃柱中，蒸馏水淋洗至无醇味，将步骤①得到的浓缩液调pH值为12-14，取上清液上柱，用30％丙酮水溶液洗，弃去丙酮洗脱液，再用70％乙醇解吸附至检测不出人参皂苷Rb₃和pF₁₁，收集、合并洗脱液，调pH值至中性，回收乙醇并浓缩，加入95％乙醇，放置过夜，过滤，备用；

③取脱色树脂，装于玻璃柱中，取上述步骤②的滤过液上柱脱色，流出液减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至60℃下相对密度为1.20-1.30，60℃下真空干燥，粉碎过100目筛；

④取麦冬粉碎成细粒，加80％乙醇浸泡，滤过，滤液备用，药渣用80％乙醇回流提取，滤过，药渣再用少量乙醇洗涤，合并浸渍液、提取液和洗涤液，减压回收乙醇至无醇味并浓缩，滤过，冷藏备用；

⑤取大孔吸附树脂，装于玻璃柱中，蒸馏水淋洗至无醇味，取步骤④得到的滤过液上柱，蒸馏水洗，弃去水洗脱液，再用70％乙醇解吸附，收集、合并醇洗液，回收乙醇并浓缩，加入95％乙醇，放置过夜，过滤；

⑥取脱色树脂，装于玻璃柱中，取上述步骤⑤滤过液上柱脱色，流出液减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至25℃下相对密度为1.16-1.20，冷冻干燥，密封保存；

⑦按重量比例2.5-3.5:0.5-1.5取上述提取的西洋参有效成分与麦冬的有效成分加适宜的药用辅料制备成本发明的复方中药制剂。

7.权利要求6所述的中药复方制剂的制备方法，其步骤为：

①取西洋参干燥根粉碎成细粒，加80％乙醇浸泡48-96小时，滤过，滤液备用，药渣用80％乙醇回流提取三次，提取时间分别为180、180、150分钟，滤过，药渣用少量乙醇洗涤，合并浸渍液、提取液和洗涤液，调pH值至中性，减压回收乙醇至无醇味并浓缩，滤过，冷藏备用；

②取大孔吸附树脂，装于合适柱体积且直径:柱高为1:16-18的玻璃柱中，蒸馏水淋洗至无醇味，将步骤①得到的浓缩液调pH值为12-14，取上清液上柱，30％丙酮水溶液洗1-3倍柱体积，弃去30％丙酮洗脱液，再用70％乙醇解吸附至检测不出人参皂苷Rb₃和pF₁₁，收集、合并70％乙醇洗脱液，调pH值至中性，回收乙醇并浓缩，加入95％乙醇，放置过夜，过滤，备用；

③取脱色树脂，装于合适柱体积且直径:柱高为1:6-8玻璃柱中，取上述步骤②滤过液上柱脱色，流出液减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至60℃下相对密度为1.20-1.30，60℃下真空干燥，粉碎过100目筛；

④取麦冬粉碎成细粒，加80％乙醇浸泡24-72小时，滤过，滤液备用，药渣用80％乙醇回流提取2-3次，每次1-2小时，滤过，药渣再用少量乙醇洗涤，合并浸渍液、提取液和洗涤液，减压回收乙醇至无醇味并浓缩，滤过，冷藏备用；

⑤取大孔吸附树脂，装于合适柱体积且直径:柱高为1:16-18的玻璃柱中，蒸馏水淋洗至无醇味。取步骤④得到的滤过液上柱，蒸馏水洗，弃去水洗脱液，再用70％乙醇解吸附，收集、合并醇洗液，回收乙醇并浓缩，加入95％乙醇，放置过夜，过滤；

⑥取脱色树脂，装于合适柱体积且直径:柱高为1:6-8玻璃柱中，取上述步骤⑤滤过液上柱脱色，流出液减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至25℃下相对密度为1.16-1.20，冷冻干燥，密封保存；

⑦按重量比例2.5-3.5:0.5-1.5取上述提取的西洋参有效成分与麦冬的有效成分加适宜的药用辅料制备成本发明的复方中药制剂。

8.权利要求6或7所述的中药复方制剂的制备方法，其中大孔吸附树脂为D101、D21或AB-8型号的大孔吸附树脂，所使用的脱色树脂为ZTC-2或D301。