CN100469893C - 糖基转移产物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
提供一种苯酚衍生物糖苷的制备方法。该方法包括在酶存在下使糖和苯酚衍生物反应,形成苯酚衍生物糖苷的步骤,该酶选自新支链淀粉酶、环麦芽糖糊精酶、麦芽α-淀粉酶和具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶。
Description
技术领域
本发明涉及使用新支链淀粉酶(neopullulanase)、环麦芽糖糊精酶(cyclomaltodextrinase)、麦芽α-淀粉酶(maltogenic α-amylase)或具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶制备苯酚衍生物糖苷的方法。
背景技术
苯酚衍生物糖苷不仅一直作为色素、甜味剂、镇痛剂、抗氧化剂等使用,还作为发挥优良美白效果的化妆品的配合成分使用。已知通过将苯酚衍生物糖基化,与糖基化以前相比,改善了稳定性、味道质量和吸收性。
本案申请人已经提供了使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X-23株生产的糖化型α-淀粉酶(日本专利号第2662667号、日本专利号第2805273号)制备多元酚糖苷的方法。
已知不具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶能将多元酚糖基化(日本特公平7-36758号以及J.Ferment.Bioeng.,78:31(1994))。但是,通过以前公知的不具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶,将多元酚的一种即氢醌糖基化时(日本特公平7-36758号),生成的糖苷是氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷和氢醌-O-α-D-麦芽糖苷2种。生成的这些物质的重量分别为110mg和51mg。因而,采用以前的方法,由于生成多种氢醌糖苷的混合物,因此存在为了纯化目的产物而耗费成本的问题。
已知来源于枯草芽孢杆菌的糖化型淀粉酶中存在具有环糊精合成能力的淀粉酶(J.Ferment.Bioeng.,81:26(1996))。但是,完全不知道来源于枯草芽孢杆菌的糖化型淀粉酶中存在的具有环糊精合成能力的淀粉酶能将苯酚衍生物糖基化。
对于新支链淀粉酶、环麦芽糖糊精酶和麦芽α-淀粉酶,也完全不知道能将糖转移到多元酚上生成糖苷。
作为迄今为止已知的其他糖基化方法,有使用环糊精葡聚糖转移酶的糖基化方法(日本特开平3-7593号)那样将糖转移至分子中含有糖的多元酚化合物的糖质部分的糖基化方法。但是,采用该方法,不能将糖有效转移至分子中不含糖的多元酚化合物中。具有各种生理活性的苯酚衍生物内分子中不含糖的化合物也较多,期望改善这种苯酚衍生物的稳定性和吸收性。
在多种生成糖苷的酶反应中,在酶反应结束后作为副产物得到的麦芽低聚糖完全没有有效用途。因此,期望一种能够得到有用的副产物的苯酚衍生物糖基化方法。
以前,使用阳离子交换树脂的配体交换色谱法一直用于糖的分离,例如葡萄糖和果糖的分离。在用于纯化糖苷的色谱法中,一般使用疏水性吸附树脂。
发明公开
本发明人发现以前在工业上几乎不利用的酶,即新支链淀粉酶、环麦芽糖糊精酶、麦芽α-淀粉酶以及具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶具有苯酚衍生物糖苷合成能力,基于此完成了本发明。
本发明人发现使用具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶时,反应结束后,作为糖苷生成1种苯酚衍生物糖苷。如果使用具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶将氢醌糖基化,则生成的氢醌糖苷为氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷1种。由于产物为1种,因此,纯化糖苷的方法与以前的方法相比容易,能够廉价地供给高纯度的糖苷。
本发明人还发现使用新支链淀粉酶、环麦芽糖糊精酶或麦芽α-淀粉酶时,反应结束后生成苯酚衍生物糖苷和异麦芽低聚糖。
本发明人还发现,通过将儿茶素类、咖啡酸、曲酸、氢醌、儿茶酚类化合物、间苯二酚类化合物、原儿茶酸、没食子酸、香草醛、黄豆苷原、染料木黄酮、α-间羟苯甲酸、间苯三酚等苯酚衍生物糖基化,阳离子交换树脂或阳离子交换树脂上结合的钙、铅、锌、钠等金属或氢与苯酚衍生物糖苷的相互作用以及与苯酚衍生物的相互作用不同。本发明人还发现通过将上述苯酚衍生物糖基化,阴离子交换树脂的部分或全部与苯酚衍生物糖苷间的疏水性相互作用以及阴离子交换树脂的部分或全部与苯酚衍生物的相互作用不同。本发明人基于这些发现,获得了下述纯化方法,即通过用使用阳离子交换树脂或阴离子交换树脂的柱色谱法处理进行了糖基化反应的酶反应产物,能够1步纯化糖苷的纯化方法。
使用新支链淀粉酶、环麦芽糖糊精酶或麦芽α-淀粉酶,生成苯酚衍生物的糖苷时,同时由作为供体加入的基质生成大量异麦芽低聚糖。异麦芽低聚糖作为使有益的肠内细菌增殖的双歧乳杆菌生长因子受到瞩目。因此,采用本发明的方法,能够得到苯酚衍生物糖苷,并同时得到异麦芽低聚糖这种有用的副产物。
本发明方法的特征在于,不管作为糖的受体发挥作用的分子含不含糖残基,通过上述酶的作用,都能使糖转移到该分子的羟基上。即使受体分子中含有糖残基时,也可以使糖转移至糖残基以外的羟基上。这与以前的方法中使用的酶完全不同。
本发明的方法是苯酚衍生物糖苷的制备方法,该方法包括在酶存在下使糖和苯酚衍生物反应,形成苯酚衍生物糖苷的步骤,该酶选自新支链淀粉酶、环麦芽糖糊精酶、麦芽α-淀粉酶和具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶。
在1种实施方式中,上述酶为新支链淀粉酶,该新支链淀粉酶能够来源于选自普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、假单孢菌属(Pseudomonas)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、Bacillus thermoamyloliquefaciens和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的细菌。
在1种实施方式中,上述酶为环麦芽糖糊精酶,该环麦芽糖糊精酶能够来源于选自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、嗜热芽孢杆菌(Bacillus thermophilus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulanc)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、嗜碱芽孢杆菌(AlkalophilicBacillus)和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)的细菌。
在1种实施方式中,上述酶为麦芽α-淀粉酶,该麦芽α-淀粉酶能够来源于选自普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、假单孢菌属(Pseudomonas)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、Bacillus thermoamyloliquefaciens和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的细菌。
在1种实施方式中,上述酶为具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶,该具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶能够来源于选自枯草芽孢杆菌(Bacillu ssubtilis)、牛链球菌(Streptococcus boyis)、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)、早期链霉菌(Streptomyces praecox)、德列马根霉(Rhizopus delemar)、德列马曲霉(Aspergillus delemar)和黑曲霉(Aspergillus niger)的细菌。
在1种实施方式中,上述苯酚衍生物可以选自黄酮类化合物、异黄酮类化合物、黄酮醇类化合物、黄烷酮类化合物、黄烷酮醇类化合物、儿茶素类化合物、2-次苯甲基苯并呋喃酮类化合物、查耳酮类化合物、二氢查耳酮类化合物、曲酸、二甲氧基苯酚、对乙酰氨基酚、香草醛、氢醌、表棓儿茶素、棓酸表儿茶酯、花青素类化合物、花色素苷类化合物、咖啡酸、儿茶酚、间苯二酚、原儿茶酸、没食子酸、间羟苯甲酸和间苯三酚。
在1种实施方式中,上述糖可以选自麦芽低聚糖、糊精、直链淀粉、支链淀粉、天然淀粉、淀粉分解物和化工淀粉。
在1种实施方式中,本发明的方法还可以包括使用离子交换树脂对上述酶反应产物进行分级的步骤。
在1种实施方式中,本发明的方法还可以包括使用离子交换树脂将上述酶反应产物至少分级为含有副产物的级分、含有未反应的苯酚衍生物的级分以及含有苯酚衍生物糖苷的级分的步骤。
发明的最佳实施方式
以下,详细说明本发明。
本发明的方法是苯酚衍生物糖苷的制备方法。
本说明书中,“苯酚衍生物糖苷”是指苯酚衍生物部分与糖部分通过糖苷键结合得到的物质。苯酚衍生物糖苷可以是氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷、咖啡酸-O-α-D-吡喃葡糖苷、3,4-二甲氧基苯酚-O-α-D-吡喃葡糖苷、儿茶素-O-α-D-吡喃葡糖苷等一吡喃葡糖苷,也可以是上述一吡喃葡糖苷进一步结合糖部分得到的二吡喃葡糖苷、三吡喃葡糖苷等。
本发明的方法包括使糖和苯酚衍生物在酶的存在下进行反应,形成苯酚衍生物糖苷的步骤。
(1)糖:
本发明中使用的“糖”是指具有通式Cn(H2O)m的化合物。糖根据构成要素即糖单元的个数分成单糖、低聚糖和多糖。本发明中,优选低聚糖和多糖。因此,上述通式中的n优选为12以上,m优选为11以上。
单糖为D-葡萄糖。
所谓低聚糖,在本说明书中是指2~10个单糖脱水缩合生成的物质中至少具有1个α-1,4键的物质。低聚糖优选具有3~9个糖单元,更优选具有4~8个糖单元,进一步优选具有5~7个糖单元。作为具有α-1,4键的低聚糖的实例,可以例举麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、麦芽八糖、麦芽九糖、麦芽十糖等麦芽低聚糖。低聚糖可以是直链状的低聚糖,也可以是支链状的低聚糖。低聚糖可以在其分子内具有环状部分。
所谓多糖,在本说明书中是指11个以上的单糖脱水缩合生成的物质中至少具有1个α-1,4键的化合物。作为多糖的实例,可以例举糊精、直链淀粉、支链淀粉和淀粉。优选糊精。
糊精是指用化学方法或酶方法将淀粉低分子化得到的物质。作为糊精的实例,可以例举英国胶(British gum)、黄糊精、白糊精、PINE-DEX(松谷化学工业株式会社)、SUNDECK(三和淀粉株式会社)、Tetrup(林原商事株式会社)。
直链淀粉是指通过α-1,4键连接的葡萄糖单元构成的直链分子。直链淀粉包含在天然淀粉中。
支链淀粉是指在通过α-1,4键结合的葡萄糖单元上通过α-1,6键连接葡萄糖单元得到的支链状分子。支链淀粉包含在天然淀粉中。作为支链淀粉,例如可以使用由支链淀粉100%构成的糯玉米淀粉。
淀粉是直链淀粉和支链淀粉的混合物。作为淀粉,只要是通常市售的淀粉,任何一种淀粉均可使用。淀粉中含有的直链淀粉和支链淀粉的比例根据植物的种类而不同。糯米、糯玉米等含有的淀粉几乎均为支链淀粉。淀粉可以分为天然淀粉、淀粉分解物和化工淀粉。
天然淀粉根据原料分为薯类淀粉和谷类淀粉。作为薯类淀粉的实例,可以例举马铃薯淀粉、木薯淀粉、甘薯淀粉、葛淀粉和蕨淀粉等。作为谷类淀粉的实例,可以例举玉米淀粉、小麦淀粉和米淀粉等。
化工淀粉是对天然淀粉实施水解、酯化或α化等处理,使之具有更易于利用的性质得到的淀粉。能够得到以各种组合具有糊化开始温度、糊的粘度、糊的透明度、老化稳定性等的广泛种类的化工淀粉。化工淀粉的种类有多种。作为实例,例如通过在淀粉的糊化温度以下浸渍于酸中,淀粉分子断裂,但淀粉粒子未破坏的淀粉。
淀粉分解物是对淀粉实施酶处理或水解等处理得到的与处理前相比分子量少的低聚物或聚合物。作为淀粉分解物的实例,可以例举淀粉脱支分解物和淀粉部分水解物。
淀粉脱支分解物通过使脱支酶作用于淀粉而得到。通过对脱支酶的作用时间进行各种改变,能够得到以任意程度将支链部分(即,α-1,6-糖苷键)切断的淀粉脱支分解物。
淀粉部分水解物是指通过盐酸、醋酸、草酸、硫酸、硝酸等酸的作用将淀粉部分分解得到的分解物。淀粉部分水解物根据分解的淀粉种类,得到的分子的分子量分布可以不同。淀粉部分水解物可以是各种长度的糖链的混合物。
(2)苯酚衍生物:
本发明中使用的“苯酚衍生物”是指含有苯酚骨架(即苯环)或类黄酮骨架的化合物中,具有结合在苯酚骨架或类黄酮骨架上的羟基的化合物、苯酚和曲酸。作为苯酚衍生物的实例,可以例举单一的苯酚骨架或类黄酮骨架上具有1个酚性羟基的化合物,以及单一的苯酚骨架或类黄酮骨架上具有2个以上酚性羟基的化合物。以下,为了方便,在本说明书中将在单一的苯酚骨架或类黄酮骨架上具有1个酚性羟基的化合物称为单酚类(mono-phenol type)化合物,将在单一的苯酚骨架或类黄酮骨架上具有2个以上酚性羟基的化合物称为多酚类(poly-phenol type)化合物。
将单一的苯酚骨架或类黄酮骨架上具有2个酚性羟基的化合物称为二酚化合物。
具有酚性羟基的苯酚衍生物糖苷包括在苯酚衍生物中。
作为单一的苯酚骨架或类黄酮骨架上具有1个酚性羟基的单酚类化合物,可以例举苯酚、曲酸、二甲氧基苯酚、对乙酰氨基酚、香草醛和黄豆苷原。
作为单酚化合物的实例还可以例举单酚类类黄酮类化合物。作为单酚类类黄酮类化合物的实例,可以例举单酚类黄酮类化合物、单酚类异黄酮类化合物、单酚类黄酮醇类化合物、单酚类黄烷酮类化合物、单酚类黄烷酮醇类化合物、单酚类儿茶素类化合物、单酚类2-次苯甲基苯并呋喃酮类化合物、单酚类查耳酮类化合物和单酚类二氢查耳酮类化合物。
作为二甲氧基苯酚的实例,可以例举2,3-二甲氧基苯酚、2,4-二甲氧基苯酚、2,5-二甲氧基苯酚、2,6-二甲氧基苯酚、3,4-二甲氧基苯酚和3,5-二甲氧基苯酚。优选3,4-二甲氧基苯酚和3,5-二甲氧基苯酚。
作为单一的苯酚骨架或类黄酮骨架上具有2个以上酚性羟基的多酚类化合物,可以例举氢醌、表棓儿茶素、棓酸表儿茶酯、花青素类化合物、花色素苷类化合物、咖啡酸、儿茶酚、间苯二酚、原儿茶酸、没食子酸、染料木黄酮、β-间羟苯甲酸和间苯三酚。
作为二酚化合物的实例,还可以例举二酚类类黄酮类化合物。作为二酚类类黄酮类化合物的实例,可以例举二酚类黄酮类化合物、二酚类异黄酮类化合物、二酚类黄酮醇类化合物、二酚类黄烷酮类化合物、二酚类黄烷酮醇类化合物、二酚类儿茶素类化合物、二酚类2-次苯甲基苯并呋喃酮类化合物、二酚类查耳酮类化合物和二酚类二氢查耳酮类化合物。
作为间羟苯甲酸,可以例举α-间羟苯甲酸、β-间羟苯甲酸和γ-间羟苯甲酸。在本发明中,优选β-间羟苯甲酸。
本发明的方法中优选氢醌、儿茶素类化合物、表棓儿茶素、棓酸表儿茶酯、3,4-二甲氧基苯酚、3,5-二甲氧基苯酚、对乙酰氨基酚,更优选氢醌。
苯酚衍生物可以由天然物分离,也可以对天然化合物进行修饰获得(即半合成),也可以新合成。苯酚衍生物结构越复杂,越优选由天然物提取或半合成。
苯酚衍生物的分离方法、半合成方法以及合成方法在该领域是公知的,可以按照公知的方法进行。
(3)酶:
本发明的方法中使用的酶选自新支链淀粉酶、环麦芽糖糊精酶、麦芽α-淀粉酶以及具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶。
本发明中使用的酶只要能够检测出将苯酚衍生物糖基化的活性,不一定必须是纯化的酶。即使是未纯化的细菌培养物或纯化阶段的粗酶,也可以用于本发明的制备方法。这些酶可以按照本领域公知的方法由细菌的培养液生成。这些酶也可以是市售的酶。
新支链淀粉酶是指主要水解茁酶多糖(pullulan)的α-1,4-糖苷键的酶,即主要具有生成潘糖(panose)的能力的酶。该酶可以进一步进行糖基转移反应。
作为新支链淀粉酶的实例,可以例举来源于选自普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)、多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)、假单孢菌属(Pseudomonas)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformin)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、Bacillusthermoamyloliquefaciens和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的细菌的新支链淀粉酶。
特别优选的新支链淀粉酶的实例中包括来源于嗜热脂肪芽孢杆菌TRS40(微工研菌保藏第9609号)的新支链淀粉酶(Journal ofBacteriology,170卷,第1554页,1988年)、来源于普通高温放线菌的α-淀粉酶(Agricultural and Biological Chemistry,42卷,第1681页,1978年)以及来源于普通高温放线菌的新支链淀粉酶型α-淀粉酶(Biosci.Biotechnol.Biochem.57卷,第395页,1993年)、嗜热脂肪芽孢杆菌KP1064的茁酶多糖(pullulan)水解酶(Applied Microbiology and Biotechnology,21卷,第20页,1985年)、多形拟杆菌95-1的新支链淀粉酶(Journal ofBacteriology,173卷,第2926页,1991年)以及来源于多粘芽孢杆菌的新支链淀粉酶(Applied Biochemistry and Biotechnology,68卷,第113页,1997年)、来源于地衣芽孢杆菌的淀粉酶(J.Biol.Chem.,267卷,22108页,1992年)、来源于芽孢杆菌属KSM-1876的新支链淀粉酶(Biosci.Biotechnol.Biochem.,56卷,514页,1992年)等。
新支链淀粉酶特征在于,对于直链淀粉的反应性与对支链淀粉的反应性相比显著高。如果使新支链淀粉酶和淀粉反应,则淀粉中的直链淀粉主要分解成麦芽糖。认为由于在麦芽糖等二糖以上的糖存在下新支链淀粉酶引起的支链淀粉的水解受到抑制,因此结果对直链淀粉的反应性进一步高于对支链淀粉的反应性。新支链淀粉酶未必对支链淀粉完全没有作用,也可以在某种程度上分解支链淀粉减小分子量。因此,即使以大部分或实质上全部由支链淀粉构成的淀粉作为基质,也能够得到由新支链淀粉酶产生的特有的分子量降低的产物。
新支链淀粉酶可以按照公知的方法,例如日本专利第1853673号或日本专利第1985401号等进行制备。
作为环麦芽糖糊精酶是指分解具有麦芽三糖以上聚合度的麦芽低聚糖以及环糊精类,但几乎不分解支链淀粉、糖原、潘糖和异潘糖的酶。环麦芽糖糊精酶记载于特开平5-68486号公报中。在特开平7-289280号公报中,将环麦芽糖糊精酶定义为具有下述基质特异性,即对环糊精的水解速度或亲和性大于多糖类或与环糊精聚合度相同的直链状低聚糖。在Appl.Microbiol.Biotechnol.(1993)39:197-203(1993)中记载了下述内容,即与淀粉、支链淀粉相比环麦芽糖糊精酶迅速分解环糊精(CD);由于不能由淀粉制备CD,因此与CGTase不同;以及在氨基酸序列的一维结构中与新支链淀粉酶类似。
作为环麦芽糖糊精酶的实例,可以例举来源于选自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜热芽孢杆菌(Bacillusthermophilus,Thermus thermophilus)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulanc)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、嗜碱芽孢杆菌(Alkalophillic Bacillus)和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)的细菌的环麦芽糖糊精酶。
作为优选的环麦芽糖糊精酶的实例,包括来源于球形芽孢杆菌的环麦芽糖糊精酶(Appl.Microbiol.Biotechnol.39:197-203(1993),以下称为BSCDase)以及来源于嗜碱芽孢杆菌属A2-5a株的环麦芽糖糊精酶(保藏号FERM-P-13846,Bioscience Biotech.Biochem.,58(3),517-520(1994),以下称为A2-5a CDase)。
麦芽α-淀粉酶是指以内切型作用于葡聚糖,产生α端基异构麦芽糖的酶。关于麦芽α-淀粉酶在J.Biol.Chem.267(31)22108-22114,1992中记载了下述内容,即切断α-1,4-糖苷键(但是不能切断α-1,6-糖苷键之后的α-1,4-糖苷键);具有转移活性;分解环糊精;以及在氨基酸序列的一维结构中与新支链淀粉酶类似。
作为麦芽α-淀粉酶的实例,可以例举来源于选自普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)、多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)、假单孢菌属(Pseudomonas)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformin)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、Bacillusthermoamyloliquefaciens、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)以及芽孢杆菌属的细菌的麦芽α-淀粉酶。
优选的麦芽α-淀粉酶中包括来源于地衣芽孢杆菌的麦芽α-淀粉酶(称为BLMA)。
新支链淀粉酶、环麦芽糖糊精酶、麦芽α-淀粉酶均包含在α-淀粉酶族中。α-淀粉酶族通过含有的酶的结构的类似性以及催化机理的类似性进行定义。也就是说,该α-淀粉酶族被定义为具有以下特性:
1、作用于α-糖苷键;
2、水解α-糖苷键,生成α-端基异构的葡萄糖或麦芽低聚糖,或者通过糖基转移反应形成新的α-糖苷反应;
3、在一维结构上,存在各种酶共同的4个保守区域。而且,该保守区域内存在所有催化部位以及多个基质结合部位;
4、作为催化部位具有与高淀粉酶A的Asp206、Glu230和Asp297相对应的Asp、Glu和Asp残基。
如上所述,已知α-淀粉酶族包括的酶根据氨基酸序列的一维结构的比较,具有4个同源性高的区域,即保守区域。这里所说的α-淀粉酶族的酶中的保守区域是指Journal of Bioscience andBioenginieering第87卷,557-565页(1999年)的图1所示的区域1、2、3和4(称为保守区域1、2、3和4)。保守区域1~4存在于具有下述结构的A结构域中,所述结构为具有β链和α螺旋的8个重复单位的结构(称为(β/α)8-桶结构)。在α-淀粉酶族的一些酶中,保守区域1由距N末端侧约第120个氨基酸位置开始(例如,α-淀粉酶(起源于Aspergillus oryzae))。但是,在α-淀粉酶族中,也存在保守区域1由距N末端侧约第240个氨基酸位置(优选239~242的氨基酸位置)开始的酶。上述酶的氨基酸序号由其成熟形态的N末端开始。本发明中使用的新支链淀粉酶、环麦芽糖糊精酶和麦芽α-淀粉酶可以具有后者的氨基酸序列的特征。这种酶也可以在A结构域之前进一步具有由100个以上的氨基酸构成的其他结构域(N结构域)。
本发明中使用的新支链淀粉酶、环麦芽糖糊精酶和麦芽α-淀粉酶包括由N末端侧起依次含有α淀粉酶族酶的保守区域1、2、3和4的氨基酸序列。本发明使用的新支链淀粉酶、环麦芽糖糊精酶和麦芽α-淀粉酶中,α-淀粉酶族的酶中的保守区域1可以在距N末端第239~242个氨基酸位置或者与该位置实质上同等的位置开始。“实质上同等的位置”可以是在N末端侧或C末端侧由标记的位置(即第239~242)起移动1~10个氨基酸的位置,优选1~5个氨基酸,更优选1~3个氨基酸,进一步优选1~2个氨基酸,再进一步优选1个氨基酸。最优选在本直链淀粉特异性酶中,保守区域1由距N末端第239~242个位置开始。
具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶是指在反应的初期阶段,合成聚合度6以上的环糊精,最终产生葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的α-淀粉酶。
作为具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶的实例,可以例举来源于选自IFO14140株代表的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)、早期链霉菌(Streptomyces praecox)、德列马根霉(Rhizopus delemar)和黑曲霉(Aspergillus niger)的细菌的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶。
作为产生具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶的枯草芽孢杆菌的实例,可以例举IFO14140株(可以由Institute For Fermentation,Osaka,Japan(简记为IFO)获得)、Ohaio University,BacillusGenetic Stock Center的芽孢杆菌1A289株、冈田等[Journal ofFermentation Technology Vol.41,No.8,427(1963)]记载的K02株、K05株、K12株和D11株。此次发现冈田等记载的K02株、K05株、K12株和D11株能合成具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶。冈田等记载了获得产生糖化型α-淀粉酶的细菌的来源、筛选方法以及活性测定方法。按照该方法进行一次筛选,可以获得产生糖化型淀粉酶的菌株。对于获得的产生糖化型淀粉酶的菌株,按照西村等在J.Ferment.Bioeng.,71,26(1996)记载的方法进行二次筛选,可以选择出产生具有环糊精合成能力的酶的菌株。关于由枯草芽孢杆菌产生的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶,记载于J.Ferment.Bioeng.,81,26(1996)中。
牛链球菌、吸水链霉菌、早期链霉菌、德列马根霉和黑曲霉等细菌中产生糖化型淀粉酶的细菌由于产生具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶的可能性高,因此产生糖化型淀粉酶的细菌也可以适用。产生糖化型淀粉酶的细菌是否产生具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶,可以按照西村等J.Ferment.Bioeng.,81,26(1996)的方法进行确认。
具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶水解广范围的糖基质,将葡萄糖转移至各种苯酚衍生物上,从而得到多种多样的苯酚衍生物糖苷。
具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶可以按照公知的方法,例如冈田等的方法[Journal of Fermentation Technology Vol.41.,No.8,427(1963)]进行制备。
本发明使用的新支链淀粉酶、环麦芽糖糊精酶、麦芽α-淀粉酶以及具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶可以由采用基因重组方法导入了编码这些酶的基因的微生物产生。例如,对于新支链淀粉酶,可以利用来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的新支链淀粉酶的碱基序列(J.Gen.Microbiol.,第135卷,1521页(1989年))以及氨基酸序列(特开平7-177891号公报;也记载了重组的步骤)。或者,也可以通过使用基于公知序列设计的引物,检索植物或微生物等的DNA文库,获得新的新支链淀粉酶、环麦芽糖糊精酶、麦芽α-淀粉酶或具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶。这种新的酶的利用也包括在本发明的范围内。
本发明中使用的新支链淀粉酶、环麦芽糖糊精酶、麦芽α-淀粉酶和具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶等酶的多肽上添加1~约10个氨基酸残基得到的多肽,由上述酶的多肽缺失1~约10个氨基酸残基得到的多肽,或者在上述酶的多肽中替换1~约10个氨基酸残基得到的多肽也可以显示直链淀粉特异性这种所需的生物学活性。上述添加、缺失或替换的氨基酸残基可以是10个乃至数个至1个。优选上述氨基酸残基数为10个、8个、5个、3个、2个或1个。优选这种缺失、添加或替换的氨基酸残基存在于α-淀粉酶族中的非保守区域。进行替换时,优选替换是保守的替换。保守替换是本领域技术人员众所周知的。
通过由自然界筛选得到这种酶对于本领域技术人员来说也很容易。而且,这种多肽可以采用本领域技术人员公知的基因操作技术制备。
本发明中使用的酶例如可以如下所述进行制备。首先,培养生产本发明中使用的酶的细菌。该细菌也可以是直接生产该酶的细菌。另外,也可以将编码该酶的基因克隆化,用得到的基因使对于酶表达有利的细菌进行性状转化,得到性状转化细菌,将得到的细菌用于本发明的实施。
采用克隆化基因进行的细菌的性状转化可以按照本领域技术人员公知的方法进行。使用克隆化基因的场合,优选将该基因可操作地连接到组成性启动子或诱导性启动子上。“可操作地连接”是指将启动子和基因连接,使之能够通过该启动子调节基因的表达。使用诱导性启动子时,优选在诱导条件下进行培养。各种诱导性启动子是本领域技术人员公知的。
克隆化基因也可以与信号肽连接,使产生的酶分泌到菌体外。信号肽是本领域技术人员公知的。
本领域技术人员为了生产酶可以适当设定细菌培养的条件。适于细菌培养的培养基、适于各种诱导性启动子的诱导条件等是本领域技术人员公知的。
培养适当的时间后,由培养液回收酶。生产的酶分泌到菌体外时,通过离心分离除去细菌,得到上清液。生产的酶不分泌时,通过超声波处理、机械粉碎、化学粉碎等处理将细菌粉碎,得到细菌粉碎液。接着,将细菌粉碎液离心分离,除去细菌的碎片,得到上清液。采用包括硫酸铵沉淀或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水性相互作用层析法、亲和层析法、羟基磷灰石层析法和凝集素层析法在内的众所周知的方法由得到的上清液回收本发明的酶。回收的产物可以根据需要进行纯化。
本发明中使用的酶可以是纯化酶或者粗酶,可以是固定化的酶,也可以是未固定化的酶。反应的形式可以是间歇式,也可以是连续式。作为固定化的方法,可以使用载体结合法(例如共价结合法、离子结合法或物理吸附法)、交联法或载留法(晶格型或微囊型)等本领域技术人员众所周知的方法。
(酶活性测定方法)
酶活性如下所述进行测定。
向40℃下培养的酶液50μl中添加40℃下培养的1.5重量/重量%可溶性淀粉水溶液(可溶性淀粉由Merck公司生产,且通过40mM醋酸-Na缓冲溶液调节至pH5.5)200μl,在40℃下反应10分钟。向该反应产物中添加将0.5N醋酸和0.5N盐酸按5:1混合得到的液体2ml,接着搅拌得到的混合物,使反应停止。采集反应停止后的溶液0.1ml,添加含有0.005%碘和0.05%碘化钾的溶液5ml,接着搅拌得到的混合物。在室温下放置20分钟,通过碘淀粉反应使之显色。接着,测定该溶液在660nm处的吸光度。以得到的吸光度作为C。另外,作为空白配制用蒸馏水代替上述酶液的溶液,进行同样的操作测定吸光度。以得到的吸光度作为B。采用下式由这样得到的C和B得到酶活性A。
A=(B-C)/B×10
其中,酶活性的1单位为B值的10%。
(糖基转移率的测定方法)
糖基转移率如下所述进行测定。
将含有可溶性淀粉或麦芽五糖等供体和作为受体的氢醌、儿茶素等的溶液,以及酶液混合,在40℃下反应16~24小时。用HPLC(使用MERCK公司生产的ODS柱RP-18;使用调节至pH2.5的10%甲醇的洗脱液)分析反应产物。测定HPLC的级分液在280nm处的吸光度,检测糖苷,然后进行定量。求出糖苷的峰面积。作为对照,配制用蒸馏水代替酶液的溶液,进行与上述同样的操作,测定受体的量。求出受体的峰面积。
采用下式计算糖基转移率。
糖基转移率=糖苷的峰面积/对照的受体的峰面积×100
(苯酚衍生物与糖的反应)
在本发明苯酚衍生物糖苷的制备方法中的上述糖和上述苯酚衍生物在酶存在下反应的步骤中,只要是生成苯酚衍生物糖苷的pH、温度等反应条件,可以采用任何一种条件。上述糖和苯酚衍生物的浓度也可以考虑反应条件等进行确定。在开始酶反应的阶段,不一定必须将糊精等糖供体和苯酚衍生物的总量溶解于反应体系的溶剂中。即使是极少的量,只要存在溶解的糊精,就可以使反应开始。例如,即使是一部分糊精未溶解时,通过溶解的糊精使反应开始,随着酶反应的进行,未溶解的糊精也会一点点溶解,不断进行反应。同样,即使是苯酚衍生物的一部分未溶解时,随着酶反应的进行,未溶解的苯酚衍生物也会一点点溶解进行反应。
酶为新支链淀粉酶时,反应体系的pH优选为约4.0至约8.0。从反应速度、效率、酶的稳定性等方面考虑,更优选约5.0至约7.5,进一步优选约5.5至约7.0。温度优选约10℃至约80℃。从反应速度、效率、酶的稳定性等方面考虑,更优选约20℃至约60℃,进一步优选约40℃。反应时间优选约1至100小时,更优选约1至50小时,进一步优选约16小时。苯酚衍生物浓度优选为约0.1重量%至约50重量%,从反应速度、效率、基质溶液的处理难易等方面考虑,更优选约1重量%至约20重量%,进一步优选约1重量%至约5重量%。糖浓度优选为约0.1重量%至约70重量%,从反应速度、效率、基质溶液的处理难易等方面考虑,更优选约1重量%至约20重量%,进一步优选约5重量%~约10重量%。使用的酶的量根据与反应时间、基质浓度的关系决定,通常优选选择使反应在约1小时至约72小时内结束的酶量。使用的酶量优选每1g基质通常为约50~10000单位。
酶为环麦芽糖糊精酶时,反应体系的pH优选为约4.0至约8.0。从反应速度、效率、酶的稳定性等方面考虑,更优选约5.0至约7.5,进一步优选约6.0至约7.0。温度优选约10℃至约80℃。从反应速度、效率、酶的稳定性等方面考虑,更优选约20℃至约60℃,进一步优选约40℃。反应时间优选约1至100小时,更优选约1至50小时,进一步优选约16小时。苯酚衍生物浓度优选为约0.1重量%至约50重量%,从反应速度、效率、基质溶液的处理难易等方面考虑,更优选约1重量%至约20重量%,进一步优选约1重量%至约5重量%。糖浓度优选为约0.1重量%至约70重量%,从反应速度、效率、基质溶液的处理难易等方面考虑,更优选约1重量%至约20重量%,进一步优选约5重量%至约10重量%。使用的酶的量根据与反应时间、基质浓度的关系决定,通常优选选择使反应在约1小时至约72小时内结束的酶量。使用的酶量优选每1g基质通常为约50~10000单位。
酶为麦芽α-淀粉酶时,反应体系的pH优选为约4.0至约8.0。从反应速度、效率、酶的稳定性等方面考虑,更优选约5.0至约7.5,进一步优选约5.5至约7.0。温度优选约10℃至约80℃。从反应速度、效率、酶的稳定性等方面考虑,更优选约20℃至约60℃,进一步优选约40℃。反应时间优选约1至100小时,更优选约1至50小时,进一步优选约16小时。苯酚衍生物浓度优选为约0.1重量%至约50重量%,从反应速度、效率、基质溶液的处理难易等方面考虑,更优选约1重量%至约20重量%,进一步优选约1重量%至约5重量%。糖浓度优选为约0.1重量%至约70重量%,从反应速度、效率、基质溶液的处理难易等方面考虑,更优选约1重量%至约20重量%,进一步优选约5重量%至约10重量%。使用的酶的量根据与反应时间、基质浓度的关系决定,通常优选选择使反应在约1小时至约72小时内结束的酶量。使用的酶量优选每1g基质通常为约50~10000单位。
酶为具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶时,反应时的pH通常为约3.0至约11.0。从反应速度、效率、酶的稳定性等方面考虑,优选约4.0至约7.0,进一步优选约4.0至约6.5。反应温度为约10℃至约80℃,从反应速度、效率、酶的稳定性等方面考虑,优选约30℃至约60℃。反应时间通常为约3至72小时,优选约10至24小时,进一步优选约16小时。苯酚衍生物浓度通常为约1重量%至约40重量%,从反应速度、效率、基质溶液的处理难易等方面考虑,优选约1重量%至约40重量%,进一步优选约5重量%至约20重量%。糖浓度通常为约1重量%至约50重量%,从反应速度、效率、基质溶液的处理难易等方面考虑,进一步优选约10重量%至约50重量%。使用的酶的量根据与反应时间、基质浓度的关系决定,通常优选选择使反应在约10小时至约24小时内结束的酶量。使用的酶量每1g基质通常为约10~10000单位。
(产物的分离和纯化)
通过上述反应得到的苯酚衍生物糖苷可以采用本领域技术人员众所周知的分离方法进行分离和纯化。例如,可以单独或组合利用使用各种溶剂(例如甲醇、乙醇)的分配以及层析法(例如凝胶过滤层析、HPLC)进行纯化。
通过上述反应得到的苯酚衍生物糖苷优选通过使用离子交换树脂的层析法进行纯化。离子交换树脂可以是阳离子交换树脂,也可以是阴离子交换树脂。更优选阳离子交换树脂。这是基于阳离子交换树脂或阳离子交换树脂上结合的钙、铅、锌、钠等金属或氢与苯酚衍生物之间的相互作用或者阴离子交换树脂的一部分或全部与苯酚衍生物糖苷之间的相互作用根据苯酚衍生物的糖基化而改变。推断阴离子交换树脂的一部分或全部与苯酚衍生物糖苷之间的相互作用可能是基于树脂全体与苯酚衍生物糖苷的疏水性相互作用。如果通过使用阳离子交换树脂或阴离子交换树脂的层析法进行纯化,可以将糖苷1步纯化。
阳离子交换树脂只要可以分离苯酚衍生物和苯酚衍生物糖苷,可以使用任意的阳离子交换树脂。作为阳离子交换树脂的实例,可以例举市售的三菱化学社生产的DIAION SK1B、DIAION SK104、DIAIONSK110、DIAION PK208、DIAION PK212、DIAION PK216、DIAION UBK530和DIAION UBK550;以及有机株式会社生产的CR-1310、CR-1320、Amberlite IR120B、Amberlite 200CT和IRC50。
阴离子交换树脂只要可以分离苯酚衍生物和苯酚衍生物糖苷,可以使用任意的阴离子交换树脂。作为阴离子交换树脂的实例,可以例举市售的三菱化学株式会社生产的PA412、WA-30和PA-308;以及有机株式会社生产的IRA96SB、IRA910CT、XT6050RF和IRA900。优选对例如苯乙烯类阴离子交换树脂进行预处理制成C1型、醋酸型、碳酸型或硝酸型进行使用以便难于引起阴离子交换。阴离子交换树脂更优选对苯乙烯类阴离子交换树脂进行预处理使之形成C1型后进行使用。
通过使用阳离子交换树脂或阴离子交换树脂的层析法,能够以分别独立的级分回收苯酚衍生物糖苷、作为副产物的糖(例如异麦芽低聚糖)以及未反应的苯酚衍生物。因此,能够再次有效利用分级得到的这些物质。
在本发明的方法中,根据需要也能够实施连续进行纯化的模拟移动床式柱层析。
(苯酚衍生物糖苷的用途)
按照本发明的方法得到的苯酚衍生物糖苷可以作为苯酚衍生物的替代物用于各种用途。特别是这些苯酚衍生物糖苷可以作为饮食用组合物、食品添加用组合物、输液、粘结用组合物、淀粉的老化防止剂、口腔用组合物、药物、保健品和化妆品使用。在这些用途中,这些苯酚衍生物糖苷能够以适于各种用途的浓度使用。
实施例
(制备例1:环麦芽糖糊精酶的制备)
按照常规方法制备嗜碱芽孢杆菌属A2-5a株(保藏号FERM-P-13864)的染色体。参考公开的嗜碱芽孢杆菌属A2-5a株的环麦芽糖糊精酶基因的碱基序列(DBJ/EMBL/GenBank,AB015670),按照常规方法合成具有下述序列的低聚核苷酸,作为PCR引物使用。PCR引物的序列如下所示:
NP6N-NCO:TGGCCATGGTAAAAGAAGCGATTTA;以及
NP6N-KPN:TTCGGTACCTTAAATCACCTTTATAACACC。
使用制备的染色体和引物,在94℃处理1分钟后,反复进行94℃下0.5分钟、50℃下1分钟以及72℃下2分钟的循环30次。在该条件下进行PCR,扩增环麦芽糖糊精酶的基因片断。
用限制酶NcoI和KpnI切断扩增的基因片断,与预先用这些酶切断的载体pKK388-1(Clontech公司生产)连接,得到重组质粒pNPR63。按照常规方法将该质粒导入大肠杆菌TG-1株(AmershamPharmacia Biotech公司生产),得到具有嗜碱芽孢杆菌属A2-5a株环麦芽糖糊精酶基因的重组TG-1株。
将得到的重组TG-1株0.01g混合到含有50μg/ml氨苄青霉素的L培养基(1.0%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5%NaCl)10ml中,37℃下振荡培养一夜,得到预培养液。
将该预培养液10ml添加到装有1升Terrific培养基(LifeTechnologies Oriental(株)生产,含有50μg/ml的氨苄青霉素)的2升坂口烧瓶中,然后使用振荡培养机在37℃下振荡烧瓶3小时。接着,将振荡培养机的设定温度变更为15℃后,在15℃下振荡烧瓶30分钟。接着,向烧瓶中添加异丙基-β-D-吡喃半乳糖苷(IPGP,和光纯药生产),使最终浓度达到0.1mM,再在15℃下振荡烧瓶20小时。
接着,以10000rpm将产物离心分离10分钟,回收细菌。将得到的细菌悬浊于50ml的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)(以下称为缓冲液ML)中。对该悬浊液进行超声波处理,将细菌粉碎。接着,以10000rpm将产物离心分离10分钟,除去不溶物,得到粗酶液。
向该粗酶液中添加硫酸铵达到70%饱和,使环麦芽糖糊精酶沉淀。将沉淀的环麦芽糖糊精酶悬浊于约20ml的缓冲液ML中。之后,对于缓冲液ML每日更换1次缓冲液,同时将该悬浊液透析3天。
将透析后的悬浊液装入用缓冲液ML平衡过的Q-Sepharose柱(Amersham Pharmacia Biotech生产)中。用含有0.2M NaCl的缓冲液ML洗涤该柱,接着使含有0.4M NaCl的缓冲液ML流过,洗脱环麦芽糖糊精酶。
对于缓冲液ML每日更换1次缓冲液,同时将得到的活性级分透析3天。将透析后的溶液装入用缓冲液ML平衡过的ResourceQ柱(Amersham Pharmacia Biotech生产)中。用含有0.2M NaCl的缓冲液ML洗涤该柱。之后,使缓冲液ML中的NaCl浓度直线上升至0.4M,洗脱环麦芽糖糊精酶。对于缓冲液ML每日更换1次缓冲液,同时将得到的活性级分透析3天,得到纯化环麦芽糖糊精酶液。
(制备例2:麦芽α-淀粉酶的制备)
按照常规方法制备地衣芽孢杆菌ATCC27811株的染色体。参考公开的地衣芽孢杆菌ATCC27811株的麦芽α-淀粉酶基因(也称为BLMA基因)的碱基序列(Kim,I.C.等,J.Biol.Chem.,267,11108-22114(1992)),按照常规方法合成具有下述序列的低聚核苷酸,作为PCR引物使用。PCR引物的序列如下所示:
NP4N-NDE:TGGCATATGATCGAATTAGCAGCGATAC;和
NP4N-ECO:CTTGAATTCTTAACAGAATTTAGACCGC。
使用制备的染色体和引物,在94℃处理1分钟后,反复进行94℃下0.5分钟、50℃下1分钟以及72℃下2分钟的循环30次。在该条件下进行PCR,扩增麦芽α-淀粉酶的基因片断。
用限制酶NdeI和EcoRI切断扩增的基因片断,与预先用这些酶切断的载体pGEX-Nde2连接,得到重组质粒pNPR63。pGEX-Nde2是使用DNA聚合酶将CTGA这四个碱基插入到Terada等在Applied andEnvironmental Microbiology,165:910-915(1999)记载的pGEX-Nde的唯一的XbaI限制酶切断部位得到的质粒。按照常规方法将该质粒导入大肠杆菌TG-1株(Amersham Pharmacia Biotech公司生产),得到地衣芽孢杆菌ATCC27811株的麦芽α-淀粉酶基因重组TG-1株。
将重组TG-1株0.01g混合到含有50μg/ml氨苄青霉素的L培养基10ml中,接着将培养基在37℃下振荡培养一夜,得到预培养液。
将该预培养液10ml添加到装有1升Terrific培养基(LifeTechnologies Oriental(株)生产,含有50μg/ml的氨苄青霉素)的2升坂口烧瓶中,然后在37℃下振荡烧瓶3小时。接着,将振荡培养机的设定温度变更为15℃后,在15℃下振荡烧瓶30分钟。接着,向烧瓶中添加异丙基-β-D-吡喃半乳糖苷(IPGP,和光纯药生产),使最终浓度达到0.1mM,再在15℃下振荡烧瓶20小时。
接着,以10000rpm将产物离心分离10分钟,回收细菌。将得到的细菌悬浊于50ml的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)(以下称为缓冲液ML)中。对该悬浊液进行超声波处理,将细菌粉碎。接着,以10000rpm将产物离心分离15分钟,除去不溶物,得到粗酶液。
向该粗酶液中添加硫酸铵达到70%饱和,使麦芽α-淀粉酶沉淀。将沉淀的麦芽α-淀粉酶悬浊于约20ml的缓冲液ML中,然后对于缓冲液ML每日更换1次缓冲液,同时将该悬浊液透析3天。
将透析后的溶液装入用缓冲液ML平衡过的Q-Sepharose柱(Amersham Pharmacia Biotech生产)中。用含有0.4M NaCl的缓冲液ML洗涤该柱,接着使含有1.0M NaCl的缓冲液ML流过,洗脱麦芽α-淀粉酶。
对于缓冲液ML每日更换1次缓冲液,同时将得到的活性级分透析3天,得到纯化麦芽α-淀粉酶液。
(实施例1:氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将氢醌(和光纯药社生产)和麦芽五糖(盐水港制糖社生产)溶解于20mM醋酸-Na缓冲液(pH5.5)中,得到氢醌10重量%和麦芽五糖20重量%的溶液。向该溶液10ml中添加酶活性60单位的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶液10ml,得到混合物。该酶液是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌IFO14140株制备的。使该混合物在40℃下反应18小时。接着,向该反应产物中加入3倍量的乙酸乙酯,剧烈振荡容器,使酶反应停止。接着,将该反应产物在室温下静置30分钟后,回收水相级分(即下层)。这种操作进行3次,完全除去未反应的氢醌。减压干燥最终得到的水相级分,得到试样。
将试样溶解于10ml的蒸馏水,得到试样溶液。将该试样溶液加入到用蒸馏水平衡过的活性碳柱(和光纯药社生产)中,使糖苷吸附到活性炭柱上。接着,用20%甲醇水溶液200ml洗脱吸附在活性炭柱上的未反应的糖。接着,用100%甲醇300ml洗脱糖苷。将含有糖苷的100%甲醇级分减压干燥后,将残渣再次溶解于蒸馏水中,进行冷冻干燥。通过以上操作,得到白色粉末约250mg。
将该粉末1mg和α-葡糖苷酶(TOYOBO社生产)20单位溶解于磷酸缓冲液(pH7.0),得到溶液。将该溶液在40℃下培养4小时。培养后,将该溶液施于使用ODS柱RP-18(MERCK公司生产)的HPLC上,使用调节至pH2.5的10%甲醇水溶液作为移动相。测定洗脱液的各级分在280nm处的吸光度,检测氢醌糖苷。结果,氢醌一葡糖苷的峰完全消失,重新出现氢醌的峰。由此可知得到的粉末是葡萄糖α结合在氢醌上的糖苷(氢醌一葡糖苷)。
而且,通过NMR(JEOL社生产的JNM-GX270)确认氢醌一葡糖苷的结构,结果与上述相同。
结果可知得到的氢醌一葡糖苷的纯度为96%。
(实施例2:氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将氢醌(和光纯药社生产)和麦芽五糖(盐水港制糖社生产)溶解于20mM醋酸-Na缓冲液(pH5.5)中,得到氢醌10重量%和麦芽五糖40重量%的溶液。向该溶液10ml中添加酶活性60单位的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶液10ml,得到混合物。该酶液是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌IFO14140株制备的。该酶液按照西村等在J.Ferment.Bioeng.,71,26(1996)记载的方法确认具有环糊精合成能力。使该混合物在40℃下反应16小时。
接着,采用Sephadex G-15对该反应产物进行凝胶过滤,得到约800mg的氢醌葡糖苷(纯度90%)。
(实施例3:氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将氢醌(和光纯药社生产)和麦芽五糖(盐水港制糖社生产)溶解于20mM醋酸-Na缓冲液(pH5.5)中,得到氢醌5重量%和麦芽五糖5重量%的溶液。向该溶液10ml中添加酶活性60单位的新支链淀粉酶液10ml,得到混合物。该酶液是按照Journal of Bacteriology,170卷,第1554页,1988年记载的方法,使用嗜热脂肪芽孢杆菌TRS40制备的。使该混合物在40℃下反应,反应开始至3、8和12小时后,分别追加相对于混合物的重量为2%的麦芽五糖和30单位的新支链淀粉酶,合计反应24小时。
接着,采用Sephadex G-15对该反应产物进行凝胶过滤,得到约100mg的氢醌葡糖苷(纯度85%)。
通过凝胶过滤,与含有氢醌葡糖苷的级分不同的级分含有糖质。该含有糖质的级分中含有的糖质约60%为异麦芽低聚糖。
(实施例4:氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将氢醌(和光纯药社生产)和麦芽五糖(盐水港制糖社生产)溶解于20mM醋酸-Na缓冲液(pH5.5)中,得到氢醌5重量%和麦芽五糖50重量%的溶液。向该溶液10ml中添加酶活性10单位的环麦芽糖糊精酶液5ml,得到混合物。该酶液是制备例1得到的来源于嗜碱芽孢杆菌属A2-5a的酶液。使该混合物在40℃下反应16小时。
接着,采用Sephadex G-10对该反应产物进行凝胶过滤,得到约50mg的氢醌葡糖苷(纯度85%)。
通过凝胶过滤,与含有氢醌葡糖苷的级分不同的级分含有糖质。该含有糖质的级分中含有的糖质约50%为异麦芽低聚糖。
(实施例5:氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将氢醌(和光纯药社生产)和麦芽五糖(盐水港制糖社生产)溶解于20mM醋酸-Na缓冲液(pH5.5)中,得到氢醌3重量%和麦芽五糖10重量%的溶液。向该溶液10ml中添加酶活性10单位的麦芽α-淀粉酶液10ml,得到混合物。该酶液是制备例2得到的来源于地衣芽孢杆菌ATCC27811的酶液。每3小时,向该混合物中添加相对于反应物的重量为1%的氢醌、相对于反应物的重量为1%的麦芽五糖以及酶活性10单位的麦芽α-淀粉酶,同时在40℃下合计反应24小时。
接着,采用Sephadex G-15对该反应产物进行凝胶过滤,得到约30mg的氢醌葡糖苷(纯度80%)。
通过凝胶过滤,与含有氢醌葡糖苷的级分不同的级分含有糖质。该含有糖质的级分中含有的糖质约50%为异麦芽低聚糖。
(实施例6:儿茶素-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将儿茶素(Funakoshi公司生产)和麦芽五糖(盐水港制糖社生产)溶解于20mM醋酸-Na缓冲液(pH5.5)中,得到儿茶素2重量%和麦芽五糖10重量%的溶液。向该溶液1ml中添加淀粉酶活性10单位的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶液1ml,得到混合物。该酶液是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌IFO14140株制备的。使该混合物在40℃下反应16小时。
接着,采用HPLC分析该反应产物。HPLC使用ODS柱RP-18,用乙腈/乙酸乙酯/0.05%磷酸=12/2/86洗脱,通过280nm的吸光度检测产物。结果,除了未反应的儿茶素以外,还确认了新的儿茶素糖苷的峰。
接着,向该反应产物2ml中添加酶活性40单位的α-葡糖苷酶(TOYOBO社生产),在40℃下反应6小时。α-葡糖苷酶是水解非还原末端存在的α-D-葡糖苷键的酶。接着,与上述同样采用HPLC分析该反应产物。结果,儿茶素糖苷的峰消失,而且与用α-葡糖苷酶处理前的反应产物相比,未反应的儿茶素的峰增加。由此可以确认儿茶素糖苷是葡萄糖通过α-D-葡糖苷键结合在儿茶素上的化合物。本反应中的糖基转移率为约28%。
采用阳离子交换树脂(三菱化成株式会社生产的DIAION UBK530)以水作为移动相对反应产物进行分级。结果,得到纯化的儿茶素糖苷(5mg)(纯度70%)。
(实施例7:表棓儿茶素-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将表棓儿茶素(Funakoshi公司生产)和麦芽五糖(盐水港制糖社生产)溶解于20mM醋酸-Na缓冲液(pH5.5)中,得到表棓儿茶素2重量%和麦芽五糖10重量%的溶液。向该溶液1ml中添加淀粉酶活性10单位的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶液1ml,搅拌得到混合物。该酶液是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌IFO14140株制备的。使该混合物在40℃下反应16小时。
接着,采用HPLC分析该反应产物。HPLC使用ODS柱RP-18,用乙腈/乙酸乙酯/0.05%磷酸=12/2/86洗脱,通过280nm的吸光度检测产物。结果,除了未反应的表棓儿茶素以外,还确认了新的表棓儿茶素糖苷的峰。
接着,向该反应产物2ml中添加酶活性40单位的α-葡糖苷酶(TOYOBO社生产),在40℃下反应6小时。接着,与上述同样采用HPLC分析该反应产物。结果,表棓儿茶素糖苷的峰消失,而且与用α-葡糖苷酶处理前的反应产物相比,未反应的表棓儿茶素的峰增加。由此可以确认表棓儿茶素糖苷是葡萄糖通过α-D-葡糖苷键结合在表棓儿茶素上的化合物。本反应中的糖基转移率为约20%。
采用阳离子交换树脂(三菱化成株式会社生产的DIAION UBK530)以水作为移动相对反应产物进行分级。结果,得到纯化的表格儿茶素糖苷(7mg)(纯度70%)。
(实施例8:棓酸表儿茶酯-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将棓酸表儿茶酯(Funakoshi公司生产)和麦芽五糖(盐水港制糖社生产)溶解于20mM醋酸-Na缓冲液(pH5.5)中,得到棓酸表儿茶酯2重量%和麦芽五糖10重量%的溶液。向该溶液1ml中添加淀粉酶活性20单位的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶液1ml,搅拌得到混合物。该酶液是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌IFO14140株制备的。使该混合物在40℃下反应16小时。
接着,采用HPLC分析该反应产物。HPLC使用ODS柱RP-18,用乙腈/乙酸乙酯/0.05%磷酸=12/2/86洗脱,通过280nm的吸光度检测产物。结果,除了未反应的棓酸表儿茶酯以外,还确认了新的棓酸表儿茶酯糖苷的峰。
接着,向该反应产物2ml中添加酶活性40单位的α-葡糖苷酶(TOYOBO社生产),在40℃下反应6小时。接着,与上述同样采用HPLC分析该反应产物。结果,棓酸表儿茶酯糖苷的峰消失,而且与用α-葡糖苷酶处理前的反应产物相比,未反应的棓酸表儿茶酯的峰增加。由此可以确认棓酸表儿茶酯糖苷是葡萄糖通过α-D-葡糖苷键结合在棓酸表儿茶酯上的化合物。本反应中的糖基转移率为约20%。
采用阳离子交换树脂(三菱化成株式会社生产的DIAION SK1B)以水作为移动相对反应产物进行分级。结果,得到纯化的棓酸表儿茶酯糖苷(8mg)(纯度70%)。
(实施例9:3,4-二甲氧基苯酚-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将3,4-二甲氧基苯酚(Sigma公司生产)和麦芽五糖(盐水港制糖社生产)溶解于20mM醋酸-Na缓冲液(pH5.5)中,得到3,4-二甲氧基苯酚2重量%和麦芽五糖10重量%的溶液。向该溶液1ml中添加淀粉酶活性15单位的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶液1ml,搅拌得到混合物。该酶液是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌IFO14140株制备的。使该混合物在40℃下反应16小时。
接着,采用HPLC分析该反应产物。HPLC使用ODS柱RP-18,用25%甲醇水溶液洗脱,通过280nm的吸光度检测产物。结果,除了未反应的3,4-二甲氧基苯酚以外,还确认了新的3,4-二甲氧基苯酚糖苷的峰。
接着,向该反应产物2ml中添加酶活性40单位的α-葡糖苷酶(TOYOBO社生产),在40℃下反应4小时。接着,与上述同样采用HPLC分析该反应产物。结果,3,4-二甲氧基苯酚糖苷的峰消失,而且与用α-葡糖苷酶处理前的反应产物相比,未反应的3,4-二甲氧基苯酚的峰增加。由此可以确认3,4-二甲氧基苯酚糖苷是葡萄糖通过α-D-葡糖苷键结合在3,4-二甲氧基苯酚上的化合物。本反应中的糖基转移率为约12%。
采用阳离子交换树脂(三菱化成株式会社生产的DIAION UBK530)以水作为移动相对反应产物进行分级。结果,得到纯化的3,4-二甲氧基苯酚糖苷(2mg)(纯度90%)。
(实施例10:3,5-二甲氧基苯酚-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将3,5-二甲氧基苯酚(Sigma公司生产)和麦芽五糖(盐水港制糖社生产)溶解于20mM醋酸-Na缓冲液(pH5.5)中,得到3,5-二甲氧基苯酚2重量%和麦芽五糖10重量%的溶液。向该溶液1ml中添加淀粉酶活性15单位的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶液1ml,搅拌得到混合物。该酶液是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌IFO14140株制备的。使该混合物在40℃下反应16小时。
接着,采用HPLC分析该反应产物。HPLC使用ODS柱RP-18,用25%甲醇水溶液洗脱,通过280nm的吸光度检测产物。结果,除了未反应的3,5-二甲氧基苯酚以外,还确认了新的3,5-二甲氧基苯酚糖苷的峰。
接着,向该反应产物2ml中添加酶活性40单位的α-葡糖苷酶(TOYOBO社生产),在40℃下反应4小时。接着,与上述同样采用HPLC分析该反应产物。结果,3,5-二甲氧基苯酚糖苷的峰消失,而且与用α-葡糖苷酶处理前的反应产物相比,未反应的3,5-二甲氧基苯酚的峰增加。由此可以确认3,5-二甲氧基苯酚糖苷是葡萄糖通过α-D-葡糖苷键结合在3,5-二甲氧基苯酚上的化合物。本反应中的糖基转移率为约18%。
采用阳离子交换树脂(三菱化成株式会社生产的DIAION UBK530)以水作为移动相对反应产物进行分级。结果,得到纯化的3,5-二甲氧基苯酚糖苷(4mg)(纯度90%)。
(实施例11:对乙酰氨基酚-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将对乙酰氨基酚(Sigma公司生产)和麦芽五糖(盐水港制糖社生产)溶解于20mM醋酸-Na缓冲液(pH5.5)中,得到对乙酰氨基酚2重量%和麦芽五糖10重量%的溶液。向该溶液1ml中添加淀粉酶活性10单位的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶液1ml,搅拌得到混合物。该酶液是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌IFO14140株制备的。使该混合物在40℃下反应16小时。
接着,采用HPLC分析该反应产物。HPLC使用ODS柱RP-18,用25%甲醇水溶液洗脱,通过280nm的吸光度检测产物。结果,除了未反应的对乙酰氨基酚以外,还确认了新的对乙酰氨基酚糖苷的峰。
接着,向该反应产物2ml中添加酶活性40单位的α-葡糖苷酶(TOYOBO社生产),在40℃下反应4小时。α-葡糖苷酶是水解非还原末端存在的α-D-葡糖苷键的酶。接着,与上述同样采用HPLC分析该反应产物。结果,对乙酰氨基酚糖苷的峰消失,而且与用α-葡糖苷酶处理前的反应产物相比,未反应的对乙酰氨基酚的峰增加。由此确认对乙酰氨基酚糖苷是葡萄糖通过α-D-葡糖苷键结合在对乙酰氨基酚上的化合物。本反应中的糖基转移率为约5%。
采用阳离子交换树脂(三菱化成株式会社生产的DIAION UBK530)以水作为移动相对反应产物进行分级。结果,得到纯化的对乙酰氨基酚糖苷(1mg)(纯度85%)。
(实施例12:氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将氢醌(和光纯药社生产)和麦芽五糖(盐水港制糖社生产)溶解于20mM醋酸-Na缓冲液(pH5.5)中,得到氢醌10重量%和麦芽五糖10重量%的溶液。向该溶液10ml中添加酶活性30单位的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶粉末,得到混合物。该粉末是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌IFO14140株制备的。使该混合物在40℃下反应,反应开始至3、9和15小时后,分别追加相对于混合液重量为1g的麦芽五糖和30单位的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶,合计反应19小时。
接着,采用Sephadex G-25对该反应产物进行凝胶过滤,得到约600mg的氢醌一葡糖苷(纯度96%)。
(实施例13:氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将氢醌(和光纯药社生产)和淀粉分解物(松谷化学工业株式会社生产的PINE-DEX1)溶解于水中,得到氢醌15重量%和淀粉分解物40重量%的溶液。向该溶液10ml中添加酶活性30单位的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶粉末,搅拌得到混合物。该粉末是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌IFO14140株制备的。使该混合物在40℃下反应20小时。
接着,采用三菱化成株式会社生产的DIAION UBK530以水作为移动相对该反应产物进行分级,得到含有氢醌一葡糖苷的级分。使该级分进一步通过DIAION PA308,进行脱色。结果,得到约1g的氢醌一葡糖苷(纯度95%)。
(实施例14:氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷的大规模制备)
将氢醌(和光纯药社生产)和淀粉分解物(松谷化学工业株式会社生产,PINE-DEX 100)溶解于水中,得到氢醌15重量%和淀粉分解物40重量%的溶液。向该溶液10升中添加酶活性30000单位的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶粉末,搅拌得到混合物。该酶液是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌IFO14140株制备的。使该混合物在40℃下反应20小时。
接着,采用三菱化成株式会社生产的DIAION UBK530通过以水作为移动相的模拟移动层柱层析法对该反应产物连续进行分级,得到含有氢醌一葡糖苷的级分。使该级分进一步通过DIAION PA308,进行脱色。结果,得到约1kg的氢醌一葡糖苷(纯度98%)。
(实施例15:氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将氢醌(和光纯药社生产)和淀粉分解物(三和淀粉株式会社生产,SUNDECK 70)溶解于水中,得到氢醌15重量%和淀粉分解物40重量%的溶液。向该溶液10ml中添加酶活性30单位的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶粉末,搅拌得到混合物。该粉末是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌IFO14140株制备的。使该混合物在40℃下反应20小时。
接着,采用Amberlite 1310Na(有机株式会社)以水作为移动相对该反应产物进行分级。结果,得到约1g的氢醌一葡糖苷(纯度96%)。
(实施例16:氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷的大规模制备)
将氢醌(和光纯药社生产)和淀粉分解物(松谷化学工业株式会社生产,MAX 1000EX)溶解于水中,得到氢醌15重量%和淀粉分解物40重量%的溶液。向该溶液10升中添加酶活性30000单位的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶粉末,搅拌得到混合物。该酶液是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌IFO14140株制备的。使该混合物在40℃下反应20小时。
接着,采用Amberlite 1310Na(有机株式会社)通过以水作为移动相的模拟移动层柱层析法对该反应产物连续进行分级,得到含有氢醌一葡糖苷的级分。结果,得到约1kg的氢醌一葡糖苷(纯度94%)。
(实施例17:氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将氢醌(和光纯药社生产)和麦芽五糖(盐水港制糖社生产)溶解于20mM醋酸-Na缓冲液(pH5.5)中,得到氢醌5重量%和麦芽五糖50重量%的溶液。向该溶液10ml中添加酶活性20单位的环麦芽糖糊精酶液5ml,搅拌得到混合物。该酶液是制备例1得到的来源于嗜碱芽孢杆菌属A2-5a的酶液。使该混合物在40℃下反应16小时。
接着,采用Amberlite 1310Na(有机株式会社)通过以水作为移动相的柱层析法对该反应产物进行分级。结果,得到约75mg的氢醌葡糖苷(纯度80%)。
柱层析中,与含有氢醌葡糖苷的级分不同的级分含有糖质。该含有糖质的级分中含有的糖质约50%为异麦芽低聚糖。
(实施例18:氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将氢醌(和光纯药社生产)和麦芽五糖(盐水港制糖社生产)溶解于20mM醋酸-Na缓冲液(pH5.5)中,得到氢醌3重量%和麦芽五糖10重量%的溶液。向该溶液10ml中添加酶活性10单位的麦芽α-淀粉酶液10ml,搅拌得到混合物。该酶液按照J.Biol.Chem.267(31)22108-22114,1992记载的方法,使用以保藏号FERM P-13717保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所的E.coli制备。该E.coli具有来源于普通高温放线菌R-47株的麦芽α-淀粉酶的基因,表达该麦芽α-淀粉酶。每3小时添加相对于该混合物重量为2%的氢醌、相对于混合物的重量为4%的麦芽五糖以及酶活性10单位的麦芽α-淀粉酶,同时在40℃下合计反应24小时。
接着,采用Amberlite 1310Na(有机株式会社)通过以水作为移动相的柱层析法对该反应产物进行分级。结果,得到约30mg的氢醌葡糖苷(纯度96%)。
通过柱层析,得到下述级分,该级分与含有氢醌葡糖苷的级分不同的级分含有糖质。该含有糖质的级分中含有的糖质约50%为异麦芽低聚糖。
(实施例19:氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将氢醌(和光纯药社生产)和淀粉分解物(松谷化学工业株式会社生产的MAX 1000EX)溶解于水中,得到氢醌20重量%和淀粉分解物50重量%的溶液。向该溶液10升中添加酶活性50000单位的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶粉末,搅拌得到混合物。该粉末是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌IFO14140株制备的。使该混合物在40℃下反应20小时。
接着,采用经HCl平衡后制成C1型的三菱化成株式会社生产的DIAION WA-30以水作为移动相对该反应产物进行柱层析,进行分级,得到含有氢醌一葡糖苷的级分。结果,得到约1.2kg的氢醌一葡糖苷(纯度96%)。
(实施例20:氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷的制备)
将氢醌(和光纯药社生产)和淀粉分解物(松谷化学工业株式会社生产的MAX 1000EX)溶解于水中,得到氢醌20重量%和淀粉分解物50重量%的溶液。向该溶液10升中添加酶活性50000单位的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶粉末,搅拌得到混合物。该粉末是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌IFO14140株制备的。使该混合物在40℃下反应20小时。
接着,采用经HCl平衡后制成C1型的三菱化成株式会社生产的DIAION PA-412以水作为移动相对该反应产物进行柱层析,进行分级,得到含有氢醌一葡糖苷的级分。结果,得到约1.0kg的氢醌一葡糖苷(纯度95%)。
(实施例21:使用枯草芽孢杆菌K02株制备氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷)
除使用上述冈田等记载的来源于枯草芽孢杆菌K02株的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶液代替来源于枯草芽孢杆菌IFO14140株的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶液以外,与实施例1同样进行反应。该酶液是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌K02株制备的。
向该反应液中添加α-葡糖苷酶(TOYOBO公司生产)20单位,在40℃下培养4小时。培养后,将该溶液施于使用ODS柱RP-18(MERCK公司生产)的HPLC上,使用调节至pH2.5的20%甲醇水溶液作为移动相。作为对照,将未用α-葡糖苷酶处理的溶液施于HPLC上。测定洗脱液的各级分在280nm处的吸光度,检测氢醌糖苷。结果,用α-葡糖苷酶处理的场合,与未处理的溶液相比,氢醌一葡糖苷的峰完全消失,氢醌的峰增加。由此可知使用K02株时也生成了氢醌糖苷。
另外,基于HPLC的洗脱时间以及被α-葡糖苷酶分解这一事实,可以得知该糖苷是葡萄糖α结合在氢醌上的糖苷。
(实施例22:使用枯草芽孢杆菌K05株制备氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷)
除使用上述冈田等记载的来源于枯草芽孢杆菌K05株的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶液(采用上述冈田等的方法制备)代替来源于枯草芽孢杆菌IFO14140株的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶液以外,与实施例1同样进行反应。该酶液是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌K05株制备的。
向该反应液中添加α-葡糖苷酶(TOYOBO公司生产)20单位,在40℃下培养4小时。培养后,将该溶液施于使用ODS柱RP-18(MERCK公司生产)的HPLC上,使用调节至pH2.5的20%甲醇水溶液作为移动相。作为对照,将未用α-葡糖苷酶处理的溶液施于HPLC上。测定洗脱液的各级分在280nm处的吸光度,检测氢醌糖苷。结果,用α-葡糖苷酶处理的场合,与未处理的溶液相比,氢醌一葡糖苷的峰完全消失,氢醌的峰增加。由此可知使用K05株时也生成了氢醌糖苷。
(实施例23:使用枯草芽孢杆菌K12株制备氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷)
除使用上述冈田等记载的来源于枯草芽孢杆菌K12株的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶液(采用上述冈田等的方法制备)代替来源于枯草芽孢杆菌IFO14140株的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶液以外,与实施例1同样进行反应。该酶液是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌K12株制备的。
向该反应液中添加α-葡糖苷酶(TOYOBO公司生产)20单位,在40℃下培养4小时。培养后,将该溶液施于使用ODS柱RP-18(MERCK公司生产)的HPLC上,使用调节至pH2.5的20%甲醇水溶液作为移动相。作为对照,将未用α-葡糖苷酶处理的溶液施于HPLC上。测定洗脱液的各级分在280nm处的吸光度,检测氢醌糖苷。结果,用α-葡糖苷酶处理的场合,与未处理的溶液相比,氢醌一葡糖苷的峰完全消失,氢醌的峰增加。由此可知使用K12株时也生成了氢醌糖苷。
(实施例24:使用枯草芽孢杆菌D11株制备氢醌-O-α-D-吡喃葡糖苷)
除使用上述冈田等记载的来源于枯草芽孢杆菌D11株的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶液(采用上述冈田等的方法制备)代替来源于枯草芽孢杆菌IFO14140株的具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶液以外,与实施例1同样进行反应。该酶液是按照上述冈田等记载的方法使用枯草芽孢杆菌D11株制备的。
向该反应液中添加α-葡糖苷酶(TOYOBO公司生产)20单位,在40℃下培养4小时。培养后,将该溶液施于使用ODS柱RP-18(MERCK公司生产)的HPLC上,使用调节至pH2.5的20%甲醇水溶液作为移动相。作为对照,将未用α-葡糖苷酶处理的溶液施于HPLC上。测定洗脱液的各级分在280nm处的吸光度,检测氢醌糖苷。结果,用α-葡糖苷酶处理的场合,与未处理的溶液相比,氢醌一葡糖苷的峰完全消失,氢醌的峰增加。由此可知使用D11株时也生成了氢醌糖苷。
工业实用性
按照本发明,提供苯酚衍生物糖苷的制备方法。本发明中,新支链淀粉酶、环麦芽糖糊精酶、麦芽α-淀粉酶以及具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶对于氢醌、儿茶素、表棓儿茶素等苯酚衍生物进行利用α结合的糖基转移。
使新支链淀粉酶、环麦芽糖糊精酶、麦芽α-淀粉酶作用时,在得到糖苷的同时还可以得到异麦芽低聚糖。
Claims (12)
1、一种苯酚衍生物糖苷的制备方法,该方法包括在酶存在下使糖和苯酚衍生物反应,形成苯酚衍生物糖苷的步骤,该酶是具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶.
2、如权利要求1所述的方法,上述具有环糊精合成能力的糖化型淀粉酶来源于选自枯草芽孢杆菌、牛链球菌、吸水链霉菌、早期链霉菌、德列马根霉、德列马曲霉和黑曲霉的细菌.
3、如权利要求1所述的方法,上述苯酚衍生物可以选自黄酮类化合物、异黄酮类化合物、黄酮醇类化合物、黄烷酮类化合物、黄烷酮醇类化合物、儿茶素类化合物、2-次苯甲基苯并呋喃酮类化合物、查耳酮类化合物、二氢查耳酮类化合物、曲酸、二甲氧基苯酚、对乙酰氨基酚、香草醛、氢醌、表棓儿茶素、棓酸表儿茶酯、花青素类化合物、花色素苷类化合物、咖啡酸、儿茶酚、间苯二酚、原儿茶酸、没食子酸、间羟苯甲酸和间苯三酚.
4、如权利要求1所述的方法,上述糖选自麦芽低聚糖、糊精、直链淀粉、支链淀粉、天然淀粉、淀粉分解物和化工淀粉.
5、如权利要求1所述的方法,进一步包括使用离子交换树脂对上述酶反应产物进行分级的步骤。
6、如权利要求1所述的方法,进一步包括使用离子交换树脂将上述酶反应产物至少分级为含有副产物的级分、含有未反应的苯酚衍生物的级分以及含有苯酚衍生物糖苷的级分的步骤.
7、一种苯酚衍生物糖苷的制备方法,该方法包括在酶存在下使糖和苯酚衍生物反应,形成苯酚衍生物糖苷的步骤,该酶是新支链淀粉酶.
8、如权利要求7所述的方法,上述新支链淀粉酶来源于选自普通高温放线菌、多形拟杆菌、假单孢菌属、多粘芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、Bacillus thermoamyloliquefaciens和嗜热栖热菌的细菌.
9、一种苯酚衍生物糖苷的制备方法,该方法包括在酶存在下使糖和苯酚衍生物反应,形成苯酚衍生物糖苷的步骤,该酶是环麦芽糖糊精酶.
10、如权利要求9所述的方法,上述环麦芽糖糊精酶来源于选自嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、黄杆菌属、嗜碱芽孢杆菌和球形芽孢杆菌的细菌。
11、一种苯酚衍生物糖苷的制备方法,该方法包括在酶存在下使糖和苯酚衍生物反应,形成苯酚衍生物糖苷的步骤,该酶是麦芽α-淀粉酶.
12、如权利要求11所述的方法,上述酶为麦芽α-淀粉酶,该麦芽α-淀粉酶来源于选自普通高温放线菌、多形拟杆菌、假单孢菌属、多粘芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、Bacillusthermoamyloliquefaciens和嗜热栖热菌的细菌。
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