CN100467121C

CN100467121C - 一种柱层析用Ni2+螯合亲和型超大孔晶胶介质及其制备方法

Info

Publication number: CN100467121C
Application number: CNB2006101554823A
Authority: CN
Inventors: 贠军贤; 姚克俭; 沈绍传
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2006-12-26
Filing date: 2006-12-26
Publication date: 2009-03-11
Anticipated expiration: 2026-12-26
Also published as: CN101007265A

Abstract

本发明涉及一种柱层析用金属离子螯合亲和型超大孔连续床晶胶介质及其制备方法。所述的晶胶介质为柱状或圆盘状，内表面固载有Ni²⁺亲和配基，孔隙率50～98%，孔径范围5～500μm，所述的晶胶介质直径或当量直径大于等于10mm。晶胶介质可直接置于层析柱内进行层析操作，连通性好，可在高流速范围内操作；晶胶介质的吸附分离性能良好，吸附容量较大，分离效率高，洗脱和再生容易。适于常规发酵物、生化药物、基因工程下游目标物等的大规模分离纯化，应用领域广阔。晶胶介质的制备单体材料易得，工艺简单迅速，成本低，规模化生产十分容易。

Description

一种柱层析用Ni2+螯合亲和型超大孔晶胶介质及其制备方法

(一)技术领域

本发明涉及生物分离与医药技术领域，涉及一种柱层析用金属离子螯合亲和型超大孔连续床晶胶介质及其制备方法。

(二)背景技术

超大孔连续床层析分离方法是一种新型生物层析分离技术。超大孔连续床的介质称为晶胶介质，其孔径达数十到数百微米，能够使发酵液中的微生物细胞或细胞碎片直接通过。因此，对于发酵液、培养液、裂解液等复杂料液流体，可以不经过离心、沉淀、过滤等前处理，利用该技术可直接从这些原料液中提取和分离生物大分子目标物物质。超大孔连续床层析分离方法集成了扩张床和固定床的优点，既具有扩张床集成化的优点，集离心、过滤、浓缩和层析分离等几个步骤为一体，同时又具有固定床理论塔板数高的优点，并可实现与扩张床可比拟的高速处理，其成本较低，在发酵物、重组蛋白、酶、基因治疗用质粒DNA、抗体、微生物细胞、特殊目标细胞等重要生物物质的分离提取和纯化方面有广阔的应用前景。

金属离子螯合亲和型晶胶介质是超大孔连续床晶胶介质中的重要类型之一，已被证明在生物大分子的吸附和层析分离领域十分有效。欧洲于2002年曾开发成功了螯合Cu²⁺的丙烯酰胺基超大孔连续床晶胶介质，但其吸附容量较低(对牛血清蛋白BSA或溶菌酶的吸附容量在0.1～0.2mg/mL床层)。而目前尚没有柱层析用Ni²⁺螯合亲和型超大孔连续床晶胶介质。因此，需要发展Ni²⁺螯合亲和型晶胶介质及其相关制备技术。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种柱层析用Ni²⁺螯合亲和型晶胶介质及其制备方法，用于生物分离。

本发明采用的技术方案如下：

一种柱层析用Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质，所述的晶胶介质为柱状或圆盘状，内表面固载有Ni²⁺亲和配基，孔隙率50～98％，孔径范围5～500μm，所述的晶胶介质直径或当量直径大于等于10mm。

进一步，所述的晶胶介质有较小的理论塔板高度和较大的吸附容量，当流速在0.1～10cm/min时，晶胶的床层等板高度小于0.2cm，吸附容量以BSA为例，为2～6mg BSA/ml晶胶介质。

本发明还提供了一种制备上述Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质的方法，包括以下步骤：

1)将床层骨架聚合物单体、交联剂以及配基材料以1:0.01～0.8:0.01～0.8的质量配比制备成总质量体积浓度2～15％的水溶液，加入有引发或加速作用的催化剂后将反应液置于-80～0℃冷却系统中结晶并进行聚合反应，后升温使晶体形成超大孔隙，得到所述的超大孔晶胶介质基质，所述的配基材料为含有环氧基功能基团的可聚合单体，可与床层骨架聚合单体共聚，所述的床层骨架聚合物单体:催化剂的质量比为1:0.01～0.3；

2)将超大孔晶胶介质基质在活化剂、螯合剂的作用下于10～90℃与含Ni²⁺的溶液进行螯合反应，即得到所述的Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质，所述的超大孔晶胶介质基质:活化剂:螯合剂:Ni²⁺的比为1:0.02～4.5:0.25～4.5:0.5～45(L/mol/mol/mol)，所述的活化剂为硼氢化物、碱或弱酸的金属盐的一种或多种的混合物，所述的螯合剂为下列之一：亚氨基二乙酸(IDA)、三羧甲基乙二胺(TED)或乙二胺(EDT)。

进一步，步骤1)中所述的床层骨架聚合物单体为含有氨基或酰胺基的可聚合单体，优选为下列之一或一种以上混合物：丙烯酰胺(AAm)、N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)，更优选丙烯酰胺(AAm)或N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)。

所述的交联剂为下列之一：N，N＇-亚甲基双丙烯酰胺(MBAAm)或N，N＇-双烯丙酰基乙二胺，优选MBAAm；

所述的配基材料可选烯丙基缩水甘油醚(AGE)或乙二醇二缩水甘油醚，优选为AGE。

所述的催化剂针对不同的聚合物单体进行选择，常为相应聚合反应的引发剂或是加速剂。针对上述具体使用的床层骨架聚合物单体、交联剂和配基材料，催化剂可选用过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)的任意比例混合物或三乙醇胺，优选过硫酸铵和四甲基乙二胺任意比例混合物。

步骤1)中所述的冷却系统优选可程序控温的恒温冷却系统，在冷却时既可以在某一个温度进行冷却，也可以采取程序升降温的方法进行冷却。

步骤2)中，所述的含Ni²⁺的溶液可选择Ni²⁺的可溶性盐溶液，如氯化镍、硫酸镍或硝酸镍的水溶液，溶液浓度在0.01～5M为宜。

所述的活化剂优选硼氢化钠、硼氢化钾、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、醋酸钾、醋酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾，活化剂配制为溶液，浓度在0.01～5M为宜。

所述的螯合剂为能提供共用电子对并螯合金属离子的有机化合物，如亚氨基二乙酸(IDA)、三羧甲基乙二胺(TED)、乙二胺(EDT)等，优选为IDA。

步骤2)的反应时间为0.5～48h。

具体的，所述的Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质的制备方法，按照以下步骤进行：

1)将床层骨架聚合物单体丙烯酰胺或N，N-二甲基丙烯酰胺、交联剂N，N＇-亚甲基双丙烯酰胺以及配基材料烯丙基缩水甘油醚以1:0.01～0.8:0.01～0.5的质量配比制备成总质量体积浓度2～15％的水溶液，加入催化剂过硫酸铵和四甲基乙二胺的任意比例混合物后将反应液置于-80～0℃冷却系统中结晶并进行聚合反应5～48小时，然后升至室温使晶体形成超大孔隙，得到所述的超大孔晶胶介质基质，所述的催化剂的质量为床层骨架聚合物单体质量的0.01～0.3倍；

2)将超大孔晶胶介质基质在活化剂、螯合剂的作用下10～90℃与Ni²⁺的可溶性盐溶液进行螯合反应0.5～48h，即得到所述的Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质，所述的超大孔晶胶介质基质:活化剂:螯合剂:Ni²⁺的可溶性盐的比为1:0.02～4.5:0.25～4.5:0.5～45(L/mol/mol/mol)，所述的活化剂为氢氧化钠或碳酸钠，所述的螯合剂为亚氨基二乙酸。

本发明所述的Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质容易再生，具体可使用0.5～1M的EDTA和0.5～1M的NaCl溶液再生。

本发明与现有技术相比，其有益效果体现在：

1)晶胶介质为柱状或圆盘状，晶胶直径或当量直径在10mm以上，可直接置于层析柱内进行层析操作。晶胶介质的孔隙率和孔径大，孔隙率50～98％，孔径范围5～500μm，连通性好，可在高流速范围内操作；以水为例，当水流速1cm/min时，柱压降梯度小于0.05atm/cm；流速在0.2～10cm/min范围内，介质的结构基本不变。

2)晶胶介质的吸附分离性能良好，流速在0.1～10cm/min范围内，晶胶床柱等板高度小于0.2cm，吸附容量较大，以BSA为例，吸附容量可达2～6mg BSA/mL介质，分离效率高，洗脱和再生容易。

3)晶胶介质可方便地再生，重复使用次数达20次以上。

4)适于常规发酵物、生化药物、基因工程下游目标物等的大规模分离纯化，应用领域广阔。

5)制备单体材料易得，工艺简单迅速，成本低，规模化生产十分容易。

(四)具体实施方式：

以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1

将1.5g AAm单体，0.09g交联剂MBAAm和0.09g乙二醇二缩水甘油醚溶于15mL去离子水中，搅拌均匀后，迅速加入10mg TEMED和20mg APS，将所得混合液装入内径16mm、长200mm的玻璃层析柱内，置于可程序控温的恒温冷却系统中，由0℃下降到-40℃，然后恒温，进行冷却结晶致孔聚合。24小时后，升温至室温，得到晶胶介质基质。

在25℃下，用0.4倍基质体积的0.05M Na₂CO₃溶液、5倍基质体积的0.05M IDA溶液分别对所得基质进行活化反应24h，然后用2倍基质体积的0.5M NiSO₄溶液进行螯合反应，即得到Ni²⁺螯合亲和型晶胶介质。其孔隙率59％，SEM显示其孔径范围5～80μm；水流速1cm/min时，柱压降梯度0.047atm/cm；流速在0.1～10cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.08cm；吸附容量3mg BSA/mL介质，以1M EDTA和0.5M NaCl再生，重复使用30次以上。

实施例2

将2g DMAAm单体，0.6g交联剂N，N＇-双烯丙酰基乙二胺和0.5g配基材料乙二醇二缩水甘油醚溶于50ml去离子水中，搅拌均匀后，迅速加入20mg TEMED和50mg APS，将所得混合液装入内径26mm、长200mm的层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却系统中，进行冷却结晶致孔。温度变化历程为：(A)降温：由0℃下降到-70℃；(B)升温：升温至-10℃；(C)恒温：恒温5小时；(D)降温：由-10℃重新降温至-20℃；(E)恒温：恒温16小时；(F)升温：升温至室温，得到晶胶介质基质。

用15倍基质体积的0.15M NaHB溶液对所得基质进行活化，然后将所得基质与3倍基质体积的1.5M TED溶液在60℃下进行循环反应5h，最后与5倍基质体积的2M NiCl₂溶液螯合反应，即得到Ni²⁺螯合亲和型晶胶介质。其孔隙率89％，孔径范围50～450μm；水流速1cm/min时，柱压降梯度0.007atm/cm；流速在0.2～10cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.16cm；吸附容量2.1mgBSA/mL介质，以0.5M EDTA和0.5M NaCl再生，可重复使用25次以上。

实施例3

将0.76g DMAEMA单体，0.38g交联剂MBAAm和0.5g配基材料AGE和乙二醇二缩水甘油醚的混合物(质量比1：0.5)溶于12ml去离子水中，搅拌均匀后，迅速加入45mg TEMED和50mg APS，将所得混合液装入内径10mm、长200mm的玻璃层析柱内，在可程序控温的恒温冷却系统中降温到-25℃，进行冷却结晶致孔。然后，在室温下融化晶体，得到晶胶介质基质。

将所得介质基质与4.5倍基质体积的1M NaOH溶液在40℃下反应后，再与3倍基质体积的0.5M EDT溶液在55℃下循环反应6h，最后与9倍基质体积的5M NiCl₂溶液螯合反应，即得到Ni²⁺螯合亲和型晶胶介质。其孔隙率73％，孔径范围5～120μm；水流速1cm/min时，柱压降梯度0.043atm/cm；流速在0.1～15cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.06cm；吸附容量5.9mg BSA/mL介质，以1M EDTA和1M NaCl再生，可重复使用40次以上。

实施例4

将3.2g AAm单体，0.36g交联剂MBAAm和0.04g配基材料AGE溶于60ml去离子水中，搅拌均匀后，迅速加入30mg TEMED和12mgAPS，将所得混合液装入内径26mm、长200mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却系统中降温到-40℃；进行冷却结晶致孔。然后，在室温下融化晶体，得到晶胶介质基质。

将基质与1倍基质体积的0.5M NaOH溶液在80℃下反应后，再与3倍基质体积的1M IDA溶液在30℃下循环反应6h，最后与1倍基质体积的0.5M NiCl₂溶液螯合反应，即得到Ni²⁺螯合亲和型晶胶介质。其孔隙率91％，孔径范围50～400μm；水流速1cm/min时，柱压降梯度0.009atm/cm；流速在0.1～10cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.2cm；吸附容量3.4mg BSA/mL介质，以0.5M EDTA和0.5M NaCl再生，可重复使用30次以上。

实施例5

将0.19g DMAEMA单体，0.09g交联剂MBAAm和0.15g配基材料AGE溶于20ml去离子水中，搅拌均匀后，迅速加入22mg TEMED和29mg APS，将所得混合液装入内径16mm、长200mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却系统中降温到-15℃，进行冷却结晶致孔。然后，融化得到超大孔连续床晶胶基质。

将基质与3倍基质体积的0.02M Na₂CO₃溶液在40℃下反应后，再与0.5倍基质体积的2M TED溶液在60℃下循环反应10h，再与10倍基质体积的0.05M Ni(NO₃)₂溶液螯合反应，即得到Ni²⁺螯合亲和型晶胶介质。其孔隙率87％，孔径范围30～220μm；水流速1cm/min时，柱压降梯度0.048atm/cm；流速在0.1～15cm/min范围内，介质的结构基本不变，晶胶床柱内等板高度0.09cm；吸附容量5.2mg BSA/mL介质，以0.5M EDTA和0.5M NaCl再生，可重复使用30次以上。

Claims

1.一种柱层析用Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质，其特征在于所述的晶胶介质为柱状或圆盘状，内表面固载有Ni²⁺亲和配基，孔隙率50～98％，孔径范围5～500μm，所述的晶胶介质直径或当量直径大于等于10mm。

2.如权利要求1所述的Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质，其特征在于所述的晶胶介质的吸附容量为2～6mg BSA/ml晶胶介质。

3.如权利要求1所述的Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质的制备方法，包括以下步骤:

1)将床层骨架聚合物单体、交联剂以及配基材料以1:0.01～0.8:0.01～0.8的质量配比制备成总质量体积浓度2～15％的水溶液，加入有引发或加速作用的催化剂后将反应液置于-80～0℃冷却系统中结晶并进行聚合反应，后升温使晶体形成超大孔隙，得到所述的超大孔晶胶介质基质，所述的配基材料为含有环氧基功能基团且可与床层骨架单体聚合的单体，所述的床层骨架聚合物单体:催化剂的质量比为1:0.01～0.3；

2)将超大孔晶胶介质基质在活化剂、螯合剂的作用下于10～90℃与含Ni²⁺的溶液进行螯合反应，即得到所述的Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质，所述的超大孔晶胶介质基质:活化剂:螯合剂:Ni²⁺的比为1:0.02～4.5:0.25～4.5:0.5～45(L/mol/mol/mol)，所述的活化剂为硼氢化物、碱或弱酸的金属盐的一种或多种的混合物，所述的螯合剂为下列之一:亚氨基二乙酸、三羧甲基乙二胺或乙二胺。

4.如权利要求3所述的Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的床层骨架聚合物单体为含有氨基或酰胺基的可聚合单体。

5.如权利要求4所述的Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的床层骨架聚合物单体为下列之一或一种以上混合物:丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯。

6.如权利要求3所述的Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的步骤1)中所述的交联剂为下列之一:N，N′-亚甲基双丙烯酰胺或N，N′-双烯丙酰基乙二胺。

7.如权利要求3所述的Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的配基材料为烯丙基缩水甘油醚或乙二醇二缩水甘油醚。

8.如权利要求3所述的Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的催化剂为过硫酸铵和四甲基乙二胺的任意比例混合物或三乙醇胺。

9.如权利要求3所述的Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的方法按照以下步骤进行:

1)将床层骨架聚合物单体丙烯酰胺或N，N-二甲基丙烯酰胺、交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺以及配基材料烯丙基缩水甘油醚以1:0.01～0.8:0.01～0.5的质量配比制备成总质量体积浓度2～15％的水溶液，加入催化剂过硫酸铵和四甲基乙二胺的任意比例混合物后将反应液置于-80～0℃冷却系统中结晶并进行聚合反应5～48小时，升至室温使晶体形成超大孔隙，得到所述的超大孔晶胶介质基质，所述的催化剂的质量为床层骨架聚合物单体质量的0.01～0.3倍；

2)将超大孔晶胶介质基质在活化剂、螯合剂的作用下10～90℃与Ni²⁺的可溶性盐溶液进行螯合反应0.5～48h，即得到所述的Ni²⁺螯合亲和型超大孔晶胶介质，所述的超大孔晶胶介质基质:活化剂:螯合剂:Ni²⁺的可溶性盐的比为1:0.02～4.5:0.25～4.5:0.5～45(L/mol/mol/mol)，所述的活化剂为氢氧化钠或碳酸钠，所述的螯合剂为亚氨基二乙酸，所述的Ni²⁺的可溶性盐溶液为氯化镍、硫酸镍或硝酸镍的水溶液。