CN100413590C

CN100413590C - 一种阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质及其制备方法

Info

Publication number: CN100413590C
Application number: CNB2006100524318A
Authority: CN
Inventors: 姚克俭; 贠军贤; 沈绍传
Original assignee: Big East Sunshine Science & Technology Development Co Ltd Of Worker In Zhejiang; Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Big East Sunshine Science & Technology Development Co Ltd Of Worker In Zhejiang; Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2006-07-12
Filing date: 2006-07-12
Publication date: 2008-08-27
Anticipated expiration: 2026-07-12
Also published as: CN1903438A

Abstract

本发明涉及一种阳离子交换型超大孔连续床晶胶分离介质及其制备方法。所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质内有磺酸基-SO₃-功能基团，所述的晶胶介质孔径为5～300μm，孔隙率55～98%。制备时将床层骨架聚合物单体和交联剂的水溶液，加入催化剂后置于冷却系统中结晶并进行聚合反应，后升温使晶体融化形成超大孔隙，得到超大孔连续床晶胶介质基质；再将可与晶胶介质基质发生接枝反应的带有磺酸基的单体在0～100℃，催化剂的作用下固载在晶胶介质基质内即得目标产物。所述的晶胶介质连通性好、分离性能良好、吸附容量大；可方便地再生，重复使用可达15次以上。

Description

一种阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质及其制备方法

(一)技术领域

本发明属于生物分离与医药技术领域，涉及一种阳离子交换型超大孔连续床晶胶分离介质及其制备方法。

(二)背景技术

超大孔连续床晶胶介质层析分离方法是近几年出现的一种新型生物层析分离技术，可在高流速下实现从复杂料液系统(如发酵液、培养液等)中直接提取和分离目标物。目标物吸附过程中主要利用了对流传递，传质阻力小，吸附分离迅速。该方法集成了扩张床和固定床的优点，既具有扩张床集成化的优点，集离心、过滤、浓缩和层析分离等几个步骤为一体，同时又具有固定床理论塔板数高的优点。与传统的固定床和常规连续床不同，超大孔连续床的介质即晶胶介质是在结晶致孔条件下制备的，其骨架和孔隙结构与常规聚合反应所得的凝胶结构不同，该晶胶介质在水溶液中具有良好的连通性、弹性和复原能力，在较大的流速变动范围内晶胶床柱的理论塔板数基本不变，床层也不变形，床内有许多尺寸达数十至数百微米的超大孔隙，可使原料液中的微生物细胞、细胞碎片等固相顺利通过，并可实现与扩张床可比拟的高速处理，其成本较低，在发酵物、重组蛋白、酶、基因治疗用质粒DNA、抗体、微生物细胞、特殊目标细胞等重要生物物质的分离提取和纯化方面有广阔应用前景。

晶胶介质的制备和功能基团的固载方法是超大孔连续床技术的关键和核心。国外对超大孔连续床技术的研究始于2002年，主要欧洲的研究小组，已经开发成功了带羧基的阳离子交换型、带胺基的阴离子交换型、Cu²⁺亲和型等晶胶介质，并用于质粒DNA、重组蛋白包涵体、尿激酶、细菌内毒素、目的细胞、病毒颗粒等的分离和纯化，但大多数晶胶的吸附容量很低。将吸附量大的纳米粒嵌于晶胶中，以纳米粒为吸附位点，得到内嵌纳米颗粒的超大孔连续床晶胶介质，可提高吸附容量(200510060269.X)。通过接枝聚合反应，在介质孔隙内表面固载功能基团，也可提高介质吸附容量。

磺酸基(-SO₃-)是阳离子交换生物分离介质中常用的功能基团，常见的如甲基磺酸基(-CH₂-SO₃-)、乙基磺酸基(-CH₂-CH₂-SO₃-)、丙基磺酸基(-CH₂-CH₂-CH₂-SO₃-)等等。这些功能基团已被证明在生物大分子的吸附和层析分离方面十分有效，对目标生物大分子的吸附容量较大，洗脱方便。因此，在生物大分子和药物分子的分离纯化领域得到了广泛应用。但是，目前尚没有带磺酸基功能基团的阳离子交换型晶胶介质。因此，开发该介质及其相关的功能基团的固载技术，具有十分重要的意义。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种带有磺酸基功能基团的阳离子交换型超大孔连续床晶胶分离介质。

本发明采用的技术方案如下：

一种阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质，所述的晶胶介质内有磺酸基-SO₃-功能基团，所述的晶胶介质孔径为5～300μm。孔隙率55～98％。

其中所述的磺酸基-SO₃-功能基团是由晶胶介质基质与可与晶胶介质基质发生接枝反应的带有磺酸基的单体反应形成聚合物中带有的基团。

进一步，所述的带有磺酸基的单体为下列之一或其任意组合：烯丙氧基-2-羟基丙磺酸盐、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、甲基丙烯磺酸钠或苯乙烯磺酸钠。

所述的晶胶介质有较小的理论塔板高度和较大的吸附容量，当流速在0.1～10cm/min时，晶胶床柱等板高度小于0.2cm，吸附容量大于18mg溶菌酶/g晶胶介质。

本发明还提供了一种如上所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的制备方法，包括如下步骤：

(1)将床层骨架聚合物单体和交联剂制备成总质量体积浓度2～15％的水溶液，加入A催化剂后将反应液置于冷却系统中结晶并进行聚合反应，后升温使晶体形成超大孔隙，得到所述的超大孔连续床晶胶介质基质；

(2)将可与晶胶介质基质发生接枝反应的带有磺酸基的单体在0～100℃，B催化剂的作用下通过接枝反应固载在晶胶介质基质内，即固载在晶胶孔隙内表面，即得到所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质。

步骤(1)中所述的床层骨架聚合物单体为含有氨基或酰胺基的可聚合单体，优选为下列之一或一种以上混合物：丙烯酰胺(AAm)、N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)，更优选丙烯酰胺(AAm)或N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)。

所述的交联剂优选为下列之一：N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBAAm)、N，N′-双烯丙酰基乙二胺，优选为MBAAm。

所述的A催化剂要针对不同的聚合物单体进行选择，常为相应聚合反应的引发剂或是加速剂，针对本发明所具体使用的床层骨架聚合物单体和交联剂，A催化剂可选用如下物质，如过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)的任意比例混合物、三乙醇胺，优选为过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)的混合物。

上述制备方法中，所述的聚合物单体∶交联剂∶A催化剂的质量比为1∶0.01～0.5∶0.01～0.2，聚合物单体占反应液的质量体积百分比为2～10％；

在步骤(1)反应结束后，可进行如下处理：用水或甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等有机溶剂的水溶液清洗，以除去未反应的聚合物单体和交联剂，得到晶胶介质基质。

再进一步，制备方法的步骤(2)中所述的带有磺酸基的单体使用时先配成浓度为0.01～5M的溶液，所述的带有磺酸基的单体溶液的用量为所述的晶胶介质基质体积的0.05～10倍。

更进一步，所述的带有磺酸基的单体可与基质发生接枝反应，可选含有碳碳双键带有磺酸基的单体，优选下列之一或任意组合：3-烯丙氧基-2-羟基丙磺酸盐、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)、甲基丙烯磺酸钠、苯乙烯磺酸钠，更优选3-烯丙氧基-2-羟基丙磺酸钠(AHPSS)和2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)。所述的碳碳双键可与晶胶介质基质中的酰胺键(-CONH₂-)在B催化剂的作用下进行接枝反应，从而将磺酸基团固载于晶胶介质基质内。

针对不同的带有磺酸基的单体，接枝反应所需的B催化剂也有所不同，针对本反应优选的上述带有磺酸基的单体，B催化剂可选自下列之一或其任意比例的混合物：Zn、Cu、Ni、Ag金属的高价离子的溶液，所述的离子的溶液浓度为0.005～2M，用量为晶胶介质基质体积的0.2～5倍。

所述的步骤(1)中，反应液在-60～0℃范围内冷却结晶，优选程序控温冷却系统的温度变化历程为：

(A)降温：由0℃下降到-30～-10℃；

(B)恒温：恒温5～24小时；

(C)升温：升温至室温。

用本发明提供的方法制备的晶胶介质，具有如下特性：

1)晶胶介质的物理性能：孔隙率55～98％，孔径范围5～300μm，连通性好。以水为例，当水流速1cm/min时，柱压降梯度小于0.05atm/cm；流速在0.2～10cm/min范围内，介质的结构基本不变。

2)晶胶介质的吸附分离性能：流速在0.1～10cm/min范围内，晶胶床柱等板高度小于0.2cm，分离性能良好，以溶菌酶为例，吸附容量大于18mg溶菌酶/g介质。

3)晶胶介质的寿命：可方便地再生，重复使用次数达15次以上。

本发明所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质及其制备具有如下优点：

1)晶胶介质超大孔隙尺寸较均匀，传质阻力小，连通性好，可在高流速范围内操作；

2)对生物大分子的吸附容量大，分离效率高，洗脱很容易，再生方便；

3)应用领域广阔：允许微生物细胞或细胞碎片顺利通过，可在高流速下从含有微生物细胞、细胞碎片等的发酵液、培养液、裂解液等复杂料液系统中直接分离目标物，适于基因工程下游目标物、常规发酵物、生化药物等的大规模分离提取和纯化。

4)单体材料易得，工艺简单迅速，成本低，规模化生产十分容易；

(四)具体实施方式：

以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1

将1.4g AAm单体，0.07g交联剂MBAAm溶于15ml去离子水中，搅拌均匀后，迅速加入10mg TEMED和21mg APS，将所得混合液装入内径16mm、长200mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却系统中，进行冷却结晶致孔。温度变化历程为：

(A)降温：由0℃下降到-30℃；

(B)恒温：恒温23小时；

(C)升温：升温至室温。

然后，在室温下融化晶体，得到超大孔连续床晶胶介质基质。将基质与150ml浓度0.01M的AHPSS单体溶液在0.01M 3价Zn、Cu离子的溶液催化作用下进行接枝聚合反应10h，得到固载磺酸基功能基团的阳离子交换型晶胶介质。其孔隙率56％，SEM显示其孔径范围5～50μm；水流速1cm/min时，柱压降梯度0.049atm/cm；流速在0.1～15cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.09cm；吸附容量18mg溶菌酶/g介质，以1～2M NaCl和0.2～0.5M NaOH再生，可重复使用25次以上。

实施例2

将1.8g DMAAm单体，0.42g交联剂N，N′-双烯丙酰基乙二胺溶于60ml去离子水中，搅拌均匀后，迅速加入33mg TEMED和59mg APS，将所得混合液装入内径26mm、长200mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却系统中，进行冷却结晶致孔。温度变化历程为：

(A)降温：由0℃下降到-55℃；

(B)升温：升温至-5℃；

(C)恒温：恒温3小、时；

(D)降温：由-5℃重新降温至-11℃；

(E)恒温：恒温10小时；

(F)升温：升温至室温。

然后，在室温下融化晶体，形成超大孔隙，得到超大孔连续床晶胶介质基质。将基质与60ml 2.6M的AHPSS和1.9M AMPS的单体溶液(2∶1)单体溶液在1.8M 2价Ag离子的溶液催化作用下进行接枝聚合反应时间5h，得到固载磺酸基功能基团的阳离子交换型晶胶介质。其孔隙率88％，孔径范围50～230μm；水流速1cm/min时，柱压降梯度0.01atm/cm；流速在0.2～10cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.1cm；吸附容量43mg溶菌酶/g介质，以1～2MNaCl和0.2～0.5M NaOH再生，重复使用18次以上。

实施例3

将0.7g DMAEMA单体，0.35g交联剂MBAAm溶于10ml去离子水中，搅拌均匀后，迅速加入58mg TEMED和43mg APS，将所得混合液装入内径10mm、长200mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却系统中，进行冷却结晶致孔。温度变化历程为：

(A)降温：由0℃下降到-19℃；

(B)恒温：恒温6小时；

(C)升温：升温至室温。

然后，在室温下融化晶体，得到超大孔连续床晶胶介质基质。将基质与3ml 0.8M的AMPS和0.8M的AHPSS单体溶液(按体积比1∶1)在0.5M 2价Ag、Ni离子的溶液催化作用下进行接枝聚合反应时间24h，得到固载磺酸基功能基团的阳离子交换型晶胶介质。其孔隙率77％，孔径范围5～120μm；水流速1cm/min时，柱压降梯度0.036atm/cm；流速在0.1～14cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.07cm；吸附容量28mg溶菌酶/g介质，以1～2M NaCl和0.2～0.5M NaOH再生，重复使用20次以上。

实施例4

将3g AAm单体，0.3g交联剂MBAAm溶于50ml去离子水中，搅拌均匀后，迅速加入28mg TEMED和17mg APS，将所得混合液装入内径26mm、长200mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却系统中，进行冷却结晶致孔。温度变化历程为：

(A)降温：由0℃下降到-28℃；

(B)恒温：恒温19小时；

(C)升温：升温至室温。

然后，在室温下融化晶体，得到超大孔连续床晶胶介质基质。将基质与0.25ml浓度5M的AMPS单体溶液在1M的3价Cu、Zn离子的溶液催化作用下进行接枝聚合反应时间18h，得到固载磺酸基功能基团的阳离子交换型晶胶介质。其孔隙率93％，孔径范围15～150μm；水流速1cm/min时，柱压降梯度0.021atm/cm；流速在0.1～10cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.18cm；吸附容量33mg溶菌酶/g介质，以1～2M NaCl和0.2～0.5M NaOH再生，可重复使用27次以上。

实施例5

将0.4g DMAEMA单体，0.08g交联剂MBAAm溶于23ml去离子水中，搅拌均匀后，迅速加入20mg TEMED和29mg APS，将所得混合液装入内径16mm、长200mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却系统中，进行冷却结晶致孔。温度变化历程为：

(A)降温：由0℃下降到-17℃；

(B)恒温：恒温38小时；

(C)升温：升温至室温。

然后，在室温下融化晶体，得到超大孔连续床晶胶介质基质。将基质与120ml浓度0.5M的AHPSS单体溶液在1.2M 3价Cu离子的溶液催化作用下进行接枝聚合反应时间6h，得到固载磺酸基功能基团的阳离子交换型晶胶介质。其孔隙率97％，孔径范围60～280μm；水流速1cm/min时，柱压降梯度0.01atm/cm；流速在0.1～10cm/min范围内，介质的结构基本不变，晶胶床柱内等板高度0.13cm；吸附容量21mg溶菌酶/g介质，以1～2M NaCl和0.2～0.5M NaOH再生，可重复使用15次以上。

Claims

1. 一种阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质，其特征在于所述的晶胶介质内有磺酸基-SO₃-功能基团，所述的晶胶介质孔径为5～300μm，孔隙率55～98％。

2. 如权利要求1所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质，其特征在于所述的磺酸基-SO₃-功能基团是由晶胶介质基质与可与晶胶介质基质发生接枝反应的带有磺酸基的单体反应形成聚合物中带有的基团。

3. 如权利要求2所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质，其特征在于所述的带有磺酸基的单体为下列之一或其任意组合：烯丙氧基-2-羟基丙磺酸盐、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、甲基丙烯磺酸钠或苯乙烯磺酸钠。

4. 一种如权利要求1所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的制备方法，包括如下步骤：

(1)将床层骨架聚合物单体和交联剂制备成总质量体积浓度2～15％的水溶液，加入A催化剂后将反应液置于冷却系统中结晶并进行聚合反应，后升温使晶体形成超大孔隙，得到所述的超大孔连续床晶胶介质基质；所述的A催化剂为下列之一：过硫酸铵和四甲基乙二胺、三乙醇胺；

(2)将可与晶胶介质基质发生接枝反应的带有磺酸基的单体在0～100℃，B催化剂的作用下，通过接枝反应固载在晶胶介质基质内，即得到所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质，所述的B催化剂为下列之一或一种以上的金属的高价离子的溶液：Zn、Cu、Ni、Ag。

5. 如权利要求4所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的带有磺酸基的单体先配成溶液，浓度为0.01～5M，所述的带有磺酸基的单体溶液的用量为所述的晶胶介质基质体积的0.05～10倍。

6. 如权利要求4～5之一所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的带有磺酸基的单体为下列之一或其任意组合：3-烯丙氧基-2-羟基丙磺酸盐、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、甲基丙烯磺酸钠、苯乙烯磺酸钠。

7. 如权利要求6所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于作为B催化剂的金属的高价离子的溶液浓度为0.005～2M，离子的溶液的用量为晶胶介质基质体积的0.2～5倍。

8. 如权利要求4或5所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的床层骨架聚合物单体为含有氨基或酰胺基的可聚合单体。

9. 如权利要求8所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的床层骨架聚合物单体为下列之一或一种以上混合物：丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯；所述的交联剂为下列之一：N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、N，N′-双烯丙酰基乙二胺。

10. 如权利要求9所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的聚合物单体：交联剂：A催化剂的质量比为1∶0.01～0.5∶0.01～0.2。

11. 如权利要求4所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)反应液在-60～0℃范围内冷却结晶。