CN101085798B - 一种三磷酸胞苷的晶胶吸附层析分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用超大孔连续床晶胶层析技术(Supermacroporous Cryogel Chromatography，简称晶胶层析)从微生物发酵液中分离三磷酸胞苷(CTP)的方法。所述方法是，首先将微生物发酵液的pH值调为酸性，以一定流速通过阴离子交换型超大孔连续床晶胶介质床柱，进行吸附；然后，用冲洗液冲洗床柱，去除柱内残留的发酵液和杂质，用洗脱液分步洗脱，得到纯度较高的CTP。本发明提供的方法将现有CTP分离工艺中的菌体过滤、乙醇沉淀、阳离子交换、阴离子交换树脂吸附等多个步骤简化为通过晶胶吸附层析一步实现，工艺简单，料液在柱内停留时间短，分离迅速，处理流速高，分离过程成本低，得到的CTP纯度高，晶胶介质可方便地进行再生，重复使用，规模化生产分离十分方便。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种三磷酸胞苷的晶胶吸附层析分离方法，尤其是一种利用超大孔连续床晶胶层析技术(Supermacroporous Cryoge1Chromatography，简称晶胶层析)从微生物发酵液中分离三磷酸胞苷(CTP)的方法。
(二)背景技术
CTP是机体内的高能磷酸化合物，参与RNA、磷脂的生物合成与代谢，其二钠盐在临床上广泛用于改善脂肪代谢、促进神经组织修复、软化血管等的治疗，对神经官能症、高胆固醇、脑震荡、脂肪肝等疾病有显著疗效。
CTP可通过光合磷酸化法转化、微生物(如酵母)发酵或化学合成等方式进行制备。目前，以胞嘧啶核苷一磷酸(CMP)为原料，经微生物发酵法生产CTP，是工业上广泛采用的方法。其主要工艺过程包括培养发酵、菌体过滤、杂蛋白沉淀、阳离子交换脱盐、乙醇沉淀、过滤、阴离子交换树脂吸附、活性炭脱色、精制干燥等多个步骤，工艺过程复杂，过程成本高。在工业生产中，阴离子交换树脂吸附CTP时达到吸附平衡需要的时间很长，使得料液吸附层析柱内停留的时间常常长达数天至十多天，环境温度较高时(如高于25～30℃的夏季)，料液很容易变质，导致生产操作无法顺利进行，严重影响了生产效率和CTP产品的质量。简化分离工艺，提高分离效率，降低分离过程成本，是CTP制备生产中需要解决的难题。
(三)发明内容
为了克服现有CTP分离纯化技术中的上述不足，本发明提供了一种迅速高效地分离CTP的新方法。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是：
一种三磷酸胞苷的晶胶吸附层析分离方法，所述方法如下：(1)将含有三磷酸胞苷的混合液调pH为酸性，以0.1～30cm/min流速上超大孔连续床晶胶介质床柱，进行吸附；所述晶胶介质为阴离子交换晶胶介质，所述阴离子交换晶胶介质的孔径为5～400μm、孔隙率为50～98％、功能基团为胺基或其衍生基团；(2)以去离子水或pH值1～6的稀酸溶液为冲洗液冲洗床柱，除去晶胶介质内残留的混合液；(3)用洗脱液进行洗脱，收集含三磷酸腺苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸腺苷，所述的洗脱液为含有0.001～3M碱金属盐的稀酸溶液。
阴离子交换超大孔晶胶介质的制备可通过结晶致孔、聚合反应和孔内接枝方法实现。首先，将聚合物单体、交联剂、催化剂的水溶液装入层析柱(如常规层析玻璃柱)，在冷冻条件下进行结晶致孔，得到超大孔晶胶基质。然后，将带有阴离子交换功能基团的接枝单体溶液注入晶胶基质，在催化剂作用下进行孔内接枝聚合反应，得到阴离子交换超大孔连续床晶胶介质。晶胶基质的制备方法可参照文献中介绍的方法(Yao et al.，Chem.Eng.Sci.61，6701-6708，2006)；基质孔内接枝聚合反应也可参照文献(Savina et al.，J.Chromatogr.A 1092，199-205，2005)。具体过程见后面的实例。
所述胺基或其衍生基团优选为叔胺或季胺型阴离子交换晶胶介质。
所述胺基或其衍生基团优选为下列之一：①-N+(CH3)3、②-N(CH3)2、③-N(C2H5)2。
所述步骤(2)中冲洗液流速0.1～20cm/min。
所述步骤(3)中的洗脱为梯度洗脱，洗脱液流速0.1～20cm/min，步骤如下：先用含碱金属盐0.001～0.06M、pH 1～6的稀酸溶液I进行洗脱，再用含碱金属盐0.1～3M、pH 1～6的稀酸溶液II进行洗脱，收集含三磷酸胞苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸胞苷。
所述稀酸溶液、稀酸溶液I、稀酸溶液II各自独立为下列之一：①盐酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④柠檬酸溶液。
所述碱金属盐优选为NaCl或KCl。
所述步骤(1)中含有三磷酸胞苷的混合液为酵母发酵液。
具体的，所述方法如下：
(1)将含有三磷酸胞苷的酵母发酵液调pH为2～3，以2～10cm/min流速上超大孔连续床晶胶介质床柱，进行吸附；所述晶胶介质为阴离子交换晶胶介质，所述阴离子交换晶胶介质的孔径为5～400μm、孔隙率为50～98％、功能基团为下列之一：①-N+(CH3)3、②-N(CH3)2、③-N(C2H5)2；
(2)用冲洗液以2～10cm/min流速冲洗床柱，除去晶胶介质内残留的混合液；所述冲洗液为下列之一：①去离子水、②pH2～4的盐酸溶液、③pH2～4的硫酸溶液、④pH2～4的乙酸溶液、⑤pH2～4的柠檬酸溶液；
(3)用洗脱液以2～10cm/min流速进行梯度洗脱：先用含NaCl或KCl 0.001～0.06M、pH 1～6的稀酸溶液I进行洗脱，再用含NaCl或KCl 0.1～3M、pH 1～6的稀酸溶液II进行洗脱，收集含三磷酸胞苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸胞苷；所述稀酸溶液I、稀酸溶液II各自独立为下列之一：①盐酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④柠檬酸溶液。
与现有CTP分离技术相比，本发明方法的特色是将CTP分离过程中的过滤、沉淀、阳离子交换、阴离子交换树脂吸附等多个步骤通过晶胶层析一步实现。晶胶层析方法是2002年出现的新型生物分离技术，其所用的层析填料为连续床晶胶介质，与常规树脂或粒状介质不同。晶胶介质内有很多尺寸在数十至数百微米的超大孔隙，可允许发酵液中的微生物细胞顺利通过，可在高流速下从含有微生物细胞的复杂料液系统中直接CTP。晶胶介质内CTP的吸附主要利用对流传递，传质阻力小，吸附和层析分离十分迅速。
本发明方法的有益效果主要体现在：工艺简单，分离迅速，处理流速较高，料液在柱内停留时间短，得到的CTP纯度高，分离过程成本低。另外，本发明提供的CTP分离方法中，操作压力低(优选操作条件下柱内压降梯度在0.001～0.02atm/cm左右)，规模化生产十分容易；而且，晶胶介质可方便地进行再生，重复使用，进一步降低了成本。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
用0.02M的盐酸，将含有CTP的酵母发酵液(以CMP、葡萄糖、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化镁、硫酸铵等为底物，用啤酒酵母发酵所得，菌体浓度约12g/L，湿重，下同)的pH调为1，作为待分离用的料液，该料液OD600为0.2，料液溶质中，CTP含量61％(重量百分比)，胞嘧啶核苷二磷酸(CDP)22％，CMP为6％，其它杂质11％，CTP浓度10.3mg/mL，下同。选择内径26mm、高150mm的阴离子交换晶胶层析柱(孔径5～80μm，孔隙率50％，功能基团-N(CH3)2，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)。晶胶介质的制备如下：将9g丙烯酰胺、2g甲双叉丙烯酰胺、0.5g过硫酸铵、0.3g四甲基乙二胺溶于75mL水，装入层析柱，在冷冻条件下(-20℃)进行结晶致孔和聚合反应(48h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将50mL 0.5M的接枝单体CH2＝CHCO2(CH2)2N(CH3)2注入晶胶基质，于63℃下反应24h，得到阴离子交换晶胶介质。
将380mL料液以5cm/min流速通过盐酸溶液(pH 1)平衡的晶胶床柱，UV 254nm紫外检测。在5cm/min流速下用360mL去离子水冲洗床柱，冲出柱内的发酵液和未吸附的杂质。然后，用800mL含有0.006M NaCl的盐酸溶液(pH 1)进行洗脱，除去吸附在晶胶介质中的杂质，洗脱流速2cm/min；以100mL含有0.2M NaCl的盐酸溶液(pH 1)进行洗脱，收集CTP洗脱峰，洗脱流速2cm/min。
用高效液相色谱(HPLC，5μm、4.6mm×250mm的WatersSymmetryShield RP C18分析柱，柱温25℃，流动相为100mM的磷酸氢二钠、100mM磷酸二氢钾和5mM四丁基溴化氨的混合液，用NaOH调pH 7，流速1mL/min，紫外检测波长271nm，进样量20μL，外标法定量)对收集的CTP进行分析，CTP收率88％，纯度90.2％。
实施例2：
用0.1M的柠檬酸，将含有CTP的酵母发酵液的pH调为3。用柠檬酸溶液(pH 3)平衡晶胶床柱(柱内径55mm、高100mm，孔径20～150μm，孔隙率74％，功能基团-N(C2H5)2，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)。晶胶介质的制备如下：将10g丙烯酰胺、0.5g甲双叉丙烯酰胺、1.2g过硫酸铵、1g四甲基乙二胺溶于230mL水，装入层析柱，在冷冻条件下(-30℃)进行结晶致孔和聚合反应(60h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将200mL0.2M的接枝单体CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(C2H5)2，注入晶胶基质，于53℃下反应12h，得到阴离子交换晶胶介质。
将240mL料液以2cm/min流速上入晶胶床柱。于2cm/min流速下用500mL柠檬酸溶液(pH 3)冲洗床柱后，依次用1.3L含0.03M KCl的柠檬酸溶液(pH 3)、270mL含2.9M KCl的乙酸溶液(pH 3)进行洗脱，收集CTP洗脱峰，洗脱流速2cm/min。CTP收率90％，纯度92.4％。
实施例3：
用0.01M的盐酸，将含有CTP的酵母发酵液pH调为2。用盐酸溶液(pH 2)平衡晶胶床柱(柱内径150mm、高600mm，孔径10～200μm，孔隙率82％，功能基团-N+(CH3)3，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)。晶胶介质的制备如下：将500g丙烯酰胺、60g甲双叉丙烯酰胺、40g过硫酸铵、68g四甲基乙二胺溶于10L水，装入层析柱，在冷冻条件下(-60℃)进行结晶致孔和聚合反应(72h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将5L 1.8M的接枝单体CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(CH3)3Cl，注入晶胶基质，于50℃下反应5h，得到阴离子交换晶胶介质。
将12L料液以10cm/min流速上入晶胶床柱，在10cm/min流速下用20L去离子水冲洗后，依次用31L含0.01M NaCl的盐酸溶液(pH 2)、14L含2M NaCl的盐酸溶液(pH 2)进行洗脱，收集CTP洗脱峰，洗脱流速8cm/min。ATP收率93％，纯度96.5％。
实施例4：
用0.01M的盐酸，将含有CTP的酵母发酵液的pH调为5。用盐酸溶液(pH 3)平衡晶胶床柱(柱内径150mm、高300mm，孔径50～400μm，孔隙率98％，功能基团-N(C2H5)2，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)。晶胶介质的制备如下：将180g丙烯酰胺、20g甲双叉丙烯酰胺、10g过硫酸铵、30g四甲基乙二胺溶于5L水，装入层析柱，在冷冻条件下(-50℃)进行结晶致孔和聚合反应(48h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将3L 0.5M的接枝单体CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(C2H5)2，注入晶胶基质，于40℃下反应15h，得到阴离子交换晶胶介质。
将8L料液以7cm/min流速上入晶胶床柱，在3cm/min流速下用18L盐酸溶液(pH 3)冲洗床柱，依次用16L含0.04M KCl的盐酸溶液(pH 3)、7L含0.1M KCl的盐酸溶液(pH 3)进行洗脱，收集CTP洗脱峰，洗脱流速5cm/min。CTP收率85％，纯度91.0％。
实施例5：
用0.02M的硫酸，将含有CTP的酵母发酵液pH调为4。用稀硫酸溶液(pH 4)平衡晶胶床柱(柱内径16mm、高60mm，孔径30～300μm，孔隙率91％，功能基团-N(CH3)2，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)。晶胶介质的制备如下：将0.5g丙烯酰胺、0.07g甲双叉丙烯酰胺、0.08g过硫酸铵、0.04g四甲基乙二胺溶于10mL水，装入层析柱，在冷冻条件下(-15℃)进行结晶致孔和聚合反应(30h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将10mL 0.5M的接枝单体CH2＝CHCO2(CH2)2N(CH3)2注入晶胶基质，于55℃下反应8h，得到阴离子交换晶胶介质。
将26mL料液以30cm/min流速上入晶胶床柱，在30cm/min流速下用100mL稀硫酸溶液(pH 4)冲洗后，依次用220mL含0.05M NaCl的硫酸溶液(pH 4)、22mL含0.8M NaCl的硫酸溶液(pH 4)进行洗脱，收集CTP洗脱峰，洗脱流速20cm/min。CTP收率83％，纯度89.0％。
实施例6：
用0.01M的乙酸，将含有CTP的酵母发酵液pH调为6。用乙酸溶液(pH 6)平衡晶胶床柱(柱内径10mm、高100mm，孔径10～90μm，孔隙率83％，功能基团-N+(CH3)3，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)。晶胶介质的制备如下：将0.8g丙烯酰胺、0.1g甲双叉丙烯酰胺、0.07g过硫酸铵、0.06g四甲基乙二胺溶于10mL水，装入层析柱，在冷冻条件下(-15℃)进行结晶致孔和聚合反应(72h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将10mL 0.5M的接枝单体CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(CH3)3Cl，注入晶胶基质，于58℃下反应15h，得到阴离子交换晶胶介质。
将15mL料液以0.1cm/min流速上入晶胶床柱，于0.1cm/min流速下用100mL去离子水冲洗床柱。然后，依次用250mL含0.03M KCl的乙酸溶液(pH 6)、25mL含0.1M KCl的乙酸溶液(pH 6)进行洗脱，收集CTP洗脱峰，洗脱流速0.1cm/min。CTP收率77％，纯度87.0％。
Claims (6)
1.一种三磷酸胞苷的晶胶吸附层析分离方法，所述方法如下：(1)将含有三磷酸胞苷的混合液调pH为酸性，以0.1～30cm/min流速上超大孔连续床晶胶介质床柱，进行吸附；所述晶胶介质为阴离子交换晶胶介质，所述阴离子交换晶胶介质的孔径为5～400μm、孔隙率为50～98％、功能基团为胺基或其衍生基团；所述胺基或其衍生基团为下列之一：①-N+(CH3)3、②-N(CH3)2、③-N(C2H5)2；(2)以去离子水或pH值1～6的稀酸溶液为冲洗液冲洗床柱，除去晶胶介质内残留的混合液；(3)用洗脱液进行洗脱，收集含三磷酸腺苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸腺苷，所述的洗脱液为含有0.001～3M碱金属盐的稀酸溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中的洗脱为梯度洗脱，洗脱液流速0.1～20cm/min，步骤如下：先用含碱金属盐0.001～0.06M、pH 1～6的稀酸溶液I进行洗脱，再用含碱金属盐0.1～3M、pH 1～6的稀酸溶液II进行洗脱，收集含三磷酸胞苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸胞苷。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述稀酸溶液I、稀酸溶液II各自独立为下列之一：①盐酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④柠檬酸溶液。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述碱金属盐为NaCl或KCl。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中含有三磷酸胞苷的混合液为酵母发酵液。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：
(1)将含有三磷酸胞苷的酵母发酵液调pH为2～3，以2～10cm/min流速上超大孔连续床晶胶介质床柱，进行吸附；所述晶胶介质为阴离子交换晶胶介质，所述阴离子交换晶胶介质的孔径为5～400μm、孔隙率为50～98％、功能基团为下列之一：①-N+(CH3)3、②-N(CH3)2、③-N(C2H5)2；
(2)用冲洗液以2～10cm/min流速冲洗床柱，除去晶胶介质内残留的混合液；所述冲洗液为下列之一：①去离子水、②pH2～4的盐酸溶液、③pH2～4的硫酸溶液、④pH2～4的乙酸溶液、⑤pH2～4的柠檬酸溶液；
(3)用洗脱液以2～10cm/min流速进行梯度洗脱：先用含NaCl或KCl0.001～0.06M、pH 1～6的稀酸溶液I进行洗脱，再用含NaCl或KCl 0.1～3M、pH 1～6的稀酸溶液II进行洗脱，收集含三磷酸胞苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸胞苷；所述稀酸溶液I、稀酸溶液II各自独立为下列之一：①盐酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④柠檬酸溶液。
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