CN102021158B

CN102021158B - 一种溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法

Info

Publication number: CN102021158B
Application number: CN 201010567727
Authority: CN
Inventors: 沈绍传; 贠军贤; 姚克俭
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2030-11-30
Also published as: CN102021158A

Abstract

本发明公开了一种溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，包括如下步骤：(1)用pH值6.0～10.5的缓冲溶液稀释含有溶菌酶的混合液得到上样液，以0.1～25cm/min的流速上晶胶床柱，进行吸附；(2)以去离子水或pH值6.0～10.5的缓冲溶液为冲洗液，冲洗掉晶胶内未被吸附的杂质；(3)用含有0.02～3M碱金属盐的pH值6.0～10.5的缓冲溶液为洗脱液，进行洗脱，收集含溶菌酶的洗脱峰，得到所述的溶菌酶。本发明方法的价值主要体现在：工艺过程简单，处理量大，得到的溶菌酶纯度高，且晶胶介质再生方便，可重复使用，是一种低成本的溶菌酶分离纯化方法。

Description

一种溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法

(一)技术领域

本发明涉及一种溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，尤其是利用一种晶胶吸附层析技术从蛋清中分离溶菌酶(Lysozyme)的方法。

(二)背景技术

溶菌酶(Lysozyme)又称胞壁溶解酶，因能够水解某些细菌中的黏多糖而被广泛应用于食品防腐剂、生物工程和抗菌剂等方面。国外报道已经通过动物的体外细胞培养实验证实溶菌酶是一种潜在的抗癌药物。

溶菌酶广泛存在于高等动物组织及分泌物、植物和微生物体内，其中蛋清和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的重要来源。鸡蛋作为生产原料优势在于原料丰富、廉价且鸡蛋清中溶菌酶的含量最高(约3.2％-3.5％)。从蛋清中提取溶菌酶的工业化技术比较复杂，通常需要几种技术联合使用，如：重复结晶、盐析、超滤、阳离子交换层析等。结晶法是目前工艺上提取蛋清中溶菌酶的首选方法，但需要通过反复结晶精制，其过程繁琐且生产周期长。常规阳离子交换树脂吸附层析溶菌酶，因其介质孔隙尺寸在纳米级范围，传质主要通过分子扩散，吸附平衡时间长，过程成本较高。本发明所用的阳离子交换型晶胶介质层析其传质利用对流扩散，传质阻力小，实现了溶菌酶的快速高效分离。

(三)发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用晶胶吸附层析技术快速高效提取溶菌酶的新方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，包括如下步骤：

(1)用pH值6.0～10.5的缓冲溶液稀释含有溶菌酶的混合液得到上样液，以0.1～25cm/min的流速上晶胶床柱，进行吸附；

(2)以去离子水或pH值6.0～10.5的缓冲溶液为冲洗液，冲洗掉晶胶内未被吸附的杂质；

(3)用含有0.02～3M碱金属盐的pH值6.0～10.5的缓冲溶液为洗脱液，进行洗脱，收集含溶菌酶的洗脱峰，得到所述的溶菌酶。

在所述的晶胶吸附层析分离过程中，通常在上样前，先以pH值6.0～10.5的缓冲溶液平衡晶胶床柱。

进一步，步骤(1)所述晶胶床柱中的晶胶介质优选为阳离子交换型，其功能基团为磺酸基。所述的阳离子交换晶胶介质的基质制备方法参照文献(Yao etal.，Chem.Eng.Sci.61，6701-6708，2006)；基质孔内接枝聚合反应及所用阳离子交换功能基团的磺酸基单体参照专利(CN100413590C)。本发明对上述两篇文献做全文引用。

进一步，步骤(1)中所述的含有溶菌酶的混合液为鸡蛋清或预处理后的鸡蛋清。所述的预处理后的鸡蛋清是指先用0.1～1M的盐酸溶液将蛋清的pH调至6.0-7.0，离心后将其上清液的pH用0.1～1M的氢氧化钠溶液调至7.0～10.0范围，再次离心后的上清液。通常是将含有溶菌酶的混合液稀释2～10倍，然后低温搅拌、离心得到上清液作为上样液。

进一步，步骤(2)中所述冲洗液的流速在0.1～25cm/min。

进一步，步骤(3)中的洗脱优选梯度洗脱，洗脱液流速0.2～20cm/min，先用含碱金属盐0.02～0.15M的pH值6.0～10.5的缓冲溶液进行洗脱，再用碱金属盐含量相应更高(0.15～3M)的pH值6.0～10.5的缓冲溶液进行洗脱，收集含溶菌酶的洗脱峰，得到所述的溶菌酶。

进一步，步骤(3)所述的碱金属盐优选NaCl或KCl。

本发明所述的pH值6.0～10.5的缓冲溶液可选自下列之一：①pH 6.0～8.0磷酸盐缓冲溶液、②pH 7.1～9.0Tris-盐酸缓冲溶液、③pH 9.1～10.5碳酸盐缓冲溶液。

本发明在步骤(3)洗脱完毕后，依次用0.1M HCl、1～2M NaCl和去离子水对使用过的晶胶床柱进行再生。

本发明具体推荐所述方法按照如下步骤进行：

(a)以pH值6.0～10.5的缓冲溶液平衡晶胶床柱；所述晶胶床柱中的晶胶介质为阳离子交换型，其功能基团为磺酸基；

(b)用pH值6.0～10.5的缓冲溶液稀释鸡蛋清或预处理后的鸡蛋清得到上样液，以0.1～25cm/min的流速上晶胶床柱，进行吸附；

(c)以去离子水或pH值6.0～10.5的缓冲溶液为冲洗液，以0.1～25cm/min的流速冲洗掉晶胶内未被吸附的杂质；

(d)用含有0.02～3M碱金属盐的pH值6.0～10.5的缓冲溶液为洗脱液，进行梯度洗脱，先用含碱金属盐0.02～0.15M的pH值6.0～10.5的缓冲溶液进行洗脱，再用碱金属盐含量相应更高的pH值6.0～10.5的缓冲溶液进行洗脱，洗脱液流速0.2～20cm/min，收集含溶菌酶的洗脱峰，得到所述的溶菌酶；所述的碱金属盐为NaCl或KCl；

(e)依次以0.1M HCl、1～2M NaCl和去离子水对晶胶床柱进行再生。

与现有溶菌酶分离技术相比，本发明提供的方法特色是利用晶胶层析实现了溶菌酶的直接分离。晶胶层析方法是一种新型生物分离技术，可在高流速、低背压下从含目标生物分子的复杂料液中直接提取目标物。与常规粒状介质不同，晶胶介质为整体状其内部有大量尺寸在数十至数百微米的孔隙，溶菌酶在晶胶内的吸附主要利用对流传质，具有传质阻力小，吸附容量大和层析分离高效等优点。本方法将现有溶菌酶分离工艺过程中的重复盐析、结晶、超滤、阳离子交换层析等多个结合或复杂的步骤简化为通过晶胶吸附层析一步实现。

本发明方法的价值主要体现在：工艺过程简单，处理量大，得到的溶菌酶纯度高，且晶胶介质再生方便，可重复使用，是一种低成本的溶菌酶分离纯化方法。

(四)具体实施方式

以下结合具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

用0.02M的磷酸盐缓冲溶液(pH 8.0)直接稀释鸡蛋清(以本地市场购买的鸡蛋为原料收集其中的鸡蛋清，下同)，在2℃下搅拌过夜然后4℃离心，离心后的上清液作为待分离用的料液(溶菌酶的含量2.5mg/ml)。料液溶质中溶菌酶(Lysozyme)占总溶质的3.4％(重量百分比)、卵清蛋白(Ovalbumin)占60％(重量百分比)、伴清蛋白(Ovotransferrin)占13％(重量百分比)、其它杂质占23.6％(重量百分比)，下同。选择内径16mm、高120mm的阳离子交换晶胶层析柱(孔径10～100μm，孔隙率65％)。

用磷酸盐缓冲溶液(pH 8.0)平衡晶胶床柱，将100mL料液以3cm/min流速上晶胶床柱，用流动式紫外检测器监测层析过程(UV 280nm)。在3cm/min流速下用250mL磷酸盐缓冲溶液(pH 8.0)冲洗床柱内未被吸附的杂质。然后，用300mL含有0.05M NaCl的磷酸盐缓冲溶液(pH 8.0)进行洗脱，以除去被吸附在晶胶中的杂质，洗脱流速2cm/min；以200mL含有0.5M NaCl的磷酸盐缓冲溶液(pH 8.0)进行洗脱，收集溶菌酶的洗脱峰，洗脱流速2cm/min。

用SDS-PAGE(Bio-rad的Mini-PROTEAN Tetra Cell电泳系统，分离胶浓度12％，浓缩胶浓度4％，考马斯亮蓝R-250染色液浓度0.1％，脱色液为水50％(W/W)、乙醇40％(W/W)、乙酸10％(W/W)的混合溶液)对收集的溶菌酶进行分析，下同。得到溶菌酶的收率85％，纯度98％。

实施例2

用0.05M的Tris-盐酸缓冲溶液(pH 9.0)直接稀释鸡蛋清，在2℃下搅拌5小时然后在4℃下离心，离心后的上清液作为待分离用的料液(溶菌酶的含量1mg/ml)。用Tris-盐酸缓冲溶液(pH 9.0)，对内径10mm、高120mm的晶胶床柱(孔径5～140μm，孔隙率82％)进行平衡。

将70mL料液以2cm/min流速上入晶胶床柱。于5cm/min流速下用200mL的Tris-盐酸缓冲溶液(pH 9.0)冲洗床柱后，依次用350mL含0.03M KCl的Tris-盐酸缓冲溶液(pH 9.0)，300mL含2M KCl的Tris-盐酸缓冲溶液(pH 9.0)进行洗脱，收集溶菌酶洗脱峰，洗脱流速4cm/min。得到溶菌酶收率90％，纯度94％。

实施例3

先用0.1～1M的盐酸溶液将鸡蛋清的pH调至6.0，离心后将其上清液的pH用0.1～1M的氢氧化钠溶液调至8.0范围，再次离心后的上清液即为预处理后的鸡蛋清。

用0.05M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)稀释预处理后的鸡蛋清，在4℃下离心，离心后的上清液作为待分离用的料液(溶菌酶的含量1.5mg/ml)。用0.05M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)，对内径26mm、高150mm的晶胶床柱(孔径50～200μm，孔隙率92％)进行平衡。

将165mL料液以6cm/min流速上入晶胶床柱。于6cm/min流速下用450mL去离子水冲洗床柱后，依次用200mL含0.1M KCl的0.05M磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)，360mL含1.0M KCl的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)进行洗脱，收集溶菌酶洗脱峰，洗脱流速5cm/min。得到溶菌酶收率76％，纯度87％。

实施例4

0.01M碳酸盐缓冲溶液(pH 10)直接稀释鸡蛋清，在2℃下搅拌8小时然后在4℃下离心，离心后的上清液作为待分离用的料液(溶菌酶的含量2mg/ml)。用碳酸盐缓冲溶液(pH 10)对内径55mm、高120mm的晶胶床柱(孔径60～300μm，孔隙率78％)进行平衡。

将2.2L料液以10cm/min流速上入晶胶床柱。于8cm/min流速下用3L碳酸盐缓冲溶液(pH 10)冲洗床柱后，依次用2.5L含0.1M NaCl的碳酸盐缓冲溶液(pH 10)，2.8L含1.5M NaCl的碳酸盐缓冲溶液(pH 10)进行洗脱，收集溶菌酶洗脱峰，洗脱流速10cm/min。得到溶菌酶收率93％，纯度92％。

实施例5

用0.02M的磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)直接稀释鸡蛋清，在2℃下搅拌6小时然后在4℃下离心，离心后的上清液作为待分离用的料液(溶菌酶的含量2mg/ml)。用0.02M的磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)对内径150mm、高280mm的晶胶床柱(孔径20～160μm，孔隙率98％)进行平衡。

将16L料液以20cm/min流速上入晶胶床柱。于15cm/min流速下用40L的磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)冲洗床柱后，依次20L用含0.08M NaCl的磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)，12L含2M NaCl的磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)进行洗脱，收集溶菌酶洗脱峰，洗脱流速6cm/min。得到溶菌酶收率87％，纯度90％。

Claims

1.一种溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，包括如下步骤：

（1）用去离子水或pH值6.0～10.5的缓冲溶液稀释含有溶菌酶的混合液得到上样液，以0.1～25cm/min的流速上晶胶床柱，进行吸附；所述的含有溶菌酶的混合液为鸡蛋清；所述晶胶床柱中的晶胶介质为阳离子交换型，其功能基团为磺酸基；

（2）以去离子水或pH值6.0～10.5的缓冲溶液为冲洗液，冲洗掉晶胶内未被吸附的杂质；

（3）用含有0.02～3M碱金属盐的pH值6.0～10.5的缓冲溶液为洗脱液，进行洗脱，收集含溶菌酶的洗脱峰，得到所述的溶菌酶。

2.如权利要求1所述的溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，其特征在于：所述的鸡蛋清为预处理后的鸡蛋清，所述的预处理是指先用0.1～1M的盐酸溶液将鸡蛋清的pH调至6.0-7.0，离心后将其上清液的pH用0.1～1M的氢氧化钠溶液调至7.0～10.0范围，再次离心后得到上清液。

3.如权利要求1或2所述的溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，其特征在于步骤（2）中所述冲洗液的流速在0.1～25cm/min。

4.如权利要求1或2所述的溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，其特征在于步骤（3）中的洗脱为梯度洗脱，洗脱液流速0.2～20cm/min，先用含碱金属盐0.02～0.15M的pH值6.0～10.5的缓冲溶液进行洗脱，再用碱金属盐含量相应更高的pH值6.0～10.5的缓冲溶液进行洗脱，收集含溶菌酶的洗脱峰，得到所述的溶菌酶。

5.如权利要求1或2所述的溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，其特征在于所述的碱金属盐为NaCl或KCl。

6.如权利要求1或2所述的溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，其特征在于所述的缓冲溶液选自下列之一：①pH 6.0～8.0磷酸盐缓冲溶液、②pH 7.1～9.0Tris-盐酸缓冲溶液、③pH 9.1～10.5碳酸盐缓冲溶液。

7.如权利要求1或2所述的溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，其特征在于依次用0.1M HCl、1～2M NaCl和去离子水对步骤（3）使用过的晶胶床柱进行再生。

8.如权利要求3所述的溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，其特征在于依次用0.1M HCl、1～2M NaCl和去离子水对步骤（3）使用过的晶胶床柱进行再生。

9.如权利要求4所述的溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，其特征在于依次用0.1M HCl、1～2M NaCl和去离子水对步骤（3）使用过的晶胶床柱进行再生。

10.如权利要求5所述的溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，其特征在于依次用0.1M HCl、1～2M NaCl和去离子水对步骤（3）使用过的晶胶床柱进行再生。

11.如权利要求6所述的溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，其特征在于依次用0.1M HCl、1～2M NaCl和去离子水对步骤（3）使用过的晶胶床柱进行再生。

12.如权利要求1所述的溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，其特征在于所述方法按照如下步骤进行：

（a）以pH值6.0～10.5的缓冲溶液平衡晶胶床柱；所述晶胶床柱中的晶胶介质为阳离子交换型，其功能基团为磺酸基；

（b）用pH值6.0～10.5的缓冲溶液稀释鸡蛋清或预处理后的鸡蛋清得到上样液，以0.1～25cm/min的流速上晶胶床柱，进行吸附；

（c）以去离子水或pH值6.0～10.5的缓冲溶液为冲洗液，以0.1～25cm/min的流速冲洗掉晶胶内未被吸附的杂质；

（d）用含有0.02～3M碱金属盐的pH值6.0～10.5的缓冲溶液为洗脱液，进行梯度洗脱，先用含碱金属盐0.02～0.15M的pH值6.0～10.5的缓冲溶液进行洗脱，再用碱金属盐含量相应更高的pH值6.0～10.5的缓冲溶液进行洗脱，洗脱液流速0.2～20cm/min，收集含溶菌酶的洗脱峰，得到所述的溶菌酶；所述的碱金属盐为NaCl或KCl；

（e）依次用0.1M HCl、1～2M NaCl和去离子水对晶胶床柱进行再生。