CN100453555C - 水稻脆秆控制基因bc1及其应用 - Google Patents

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    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Abstract

本发明从水稻脆秆突变体brittle culm1(bc1)中克隆并鉴定了控制水稻茎秆脆性的基因，命名为BC1。转基因功能互补实验证明BC1具有调控水稻茎秆机械强度的功能。对该基因编码的氨基酸序列分析证明该基因所编码的蛋白与拟南芥COB基因所编码的COBRA蛋白具有60.7%的同源性。细胞学观察和水稻茎秆的物理指标，进一步证明本发明克隆的基因具有调控植物细胞壁的厚度和植株茎秆的支撑力的功能。本发明还在利用基因工程技术有目的地提高农作物的抗倒伏、抗逆和抗病虫害能力；改善木本植物的材质；提高秸秆资源的利用率等方面具有更广泛的应用价值。

Description

水稻脆秆控制基因BC1及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种利用图位克隆技术分离的水稻BC1(Brittle Culm)基因，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及含有该基因和具类似功能的同源序列的基因和相关载体与转化方法；本发明还涉及利用该基因或其功能类似物调控植物细胞壁厚度，主要是改变细胞壁中一些次生代谢产物如纤维素、木质素或半纤维素等含量及成分，从而增加或减少农作物茎秆、叶片、叶鞘的机械强度和硬度，用以提高农作物的抗倒伏、抗病、抗虫和抗逆性；以及利用该基因在木本植物中提高纤维素的含量与质量以改善材质等；还可以和提高秸秆的利用效率包括利用农作物的秸秆资源作为饲料和提高秸秆还田效率，减少秸秆焚烧导致的环境污染。
背景技术
植株茎秆的支撑力是植物，尤其是农作物的重要农艺性状。而茎秆的支撑力又与茎秆组织中相关细胞的细胞壁厚度直接有关。植物细胞壁是一种强的纤维网络结构，由不同的高聚多糖，芳香族物质和蛋白质高度有序地组成，其结构对保持细胞形态，维持植株直立生长的机械支撑力具有重要作用。植物细胞壁的生物合成是一个非常复杂的代谢过程，涉及纤维素、木质素和一些非纤维素成分的合成途径。因此，细胞壁中纤维素、木质素等主要成分的合成与分布以及沉积是影响植株茎秆支撑力的主要影响因素。对不同细胞壁突变体的研究是揭示与茎秆支撑力有关的细胞壁生物合成生理生化以及分子生物学机理有效途径。
对于大麦茎秆突变体(brittle culm)的细胞学和生物化学研究发现这些突变体脆秆的特征源于细胞壁变薄，纤维素含量减少，尤其是纤维素合酶复合体在质膜上分布数量的减少，证明该性状与纤维素的合成有关。Kokubo A与Kimura S分别在1991年和1999年利用遗传定位方法研究证明控制脆秆性状的基因(Fragile Stem，FS)至少有三个，分别位於不同的染色体上，但至今未见有关基因克隆的详细报道。Taylor分别在1999年和2000年对拟南芥不正常木质部突变体(irregular xylem)irx1和irx3进行了详细的研究发现，这些突变体的成熟茎硬度均明显降低，有的甚至不能保持茎秆直立，同时木质部发育也不正常。图位克隆分离了突变体相对应的基因表明它们编码纤维素合酶的催化亚基，证明了植物茎秆的支撑力与纤维素的合成有关。而Jones L在2001年对另一个表型相似的不正常木质部突变体irx4研究证实木质素代谢途径中的一个关键酶即肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase，CCR)与该突变表性有关。由於CCR基因的突变，导致木质素合成途径提前终止，细胞壁中木质素含量较正常植株减少了50％，从而导致茎秆支撑力度的下降。
Zhong RQ在1999年对缺乏中间纤维突变体Interfascicular fiberless(ifl1)的研究发现IFL1属於植物同域亮氨酸拉链(homeodomain Leucinezipper)基因家族中的一员，可调控中间纤维的分化及茎秆的力度。BurkH在2001年证明拟南芥脆纤维突变体(fra2)的表型是由于可调控细胞壁的厚度与细胞伸长类似剑蛋白(katanin)的突变造成的。上述结果表明除了直接参与纤维素和木质素合成的基因外，调控纤维素和木质素的有序分布与沉积以及细胞壁的厚度的基因对植株的支撑力也有影响。
研究表明糖基磷脂酰肌醇(GPI)具有锚定多种质膜蛋白质的功能，这些蛋白直接影响信号传递、植物的免疫反应、细胞与细胞间的应答反应以及营养吸收等重要功能。Schindelman G等在2001年证明了拟南芥的COBRA编码一个糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白质，它影响根细胞膨胀伸长方向，并造成根伸长区细胞壁纤维素含量的减少，说明COBRA与细胞壁形态的维持有关。有关水稻脆秆突变体研究早有报道，但仅限於表型、生理及遗传初步定位等方面。本发明通过图位克隆技术从脆秆突变体bc1中首次分离了BC1基因，该基因编码一种GPI-锚定蛋白，细胞学和生物化学分析表明该基因影响水稻茎秆、叶片、叶鞘中细胞壁的厚度和纤维素的含量。转基因功能互补实验鉴定了该基因的功能。
发明内容
针对上述研究背景，本发明的目的是提供一种从水稻突变体bc1中克隆的新基因，BC1，如图7和seq ID No1所示的DNA序列，也包括与图7所示的DNA序列至少有52％同源性的基因序列；也包括在添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的突变体等位基因或衍生物，还含具有相同功能并能达到本发明目的的基因序列。本发明中的seq ID No2和图8所示的蛋白质属於GPI-锚定蛋白，其中进行一个或几个氨基酸的替换、插入或缺失氨基酸所获得的功能类似物。BC1与拟南芥COBRA蛋白同源性为60.7％，该蛋白可能编码一种GPI-锚定蛋白，直接或间接与细胞壁生物合成有关。因此，本发明也包括与seq ID No2所示的氨基酸序列具有60％以上(包括60％)同源性的功能类似物。
本发明的另一个目的是提供一种用BC1进行高效植物遗传转化的方法。具体地说，本发明提供了一种含有图7和Seq ID No.1所示序列的基因或该基因的部分类似功能片段的载体，其中如图5所示的(pCna18和pCna181T)，该载体可以表达由上述核酸序列编码的多肽或同源类似物。本发明还提供了一种含有以上表达载体的宿主细胞。宿主细胞包括大肠杆菌、农杆菌和植物细胞。
本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞以影响农作物植株茎秆的支撑力或改变木本植物材质中纤维素含量的方法。
实现本发明的具体技术步骤如下：
一、水稻脆秆突变体bc1-101的分离和遗传分析
“双科早”籼稻品种(Indica)经γ射线辐射后，通过大量筛选和回交而得到的表型稳定的水稻脆秆突变体bc1-101。该突变体除了茎秆、叶片、叶鞘表现出脆性外，其它表型均与野生型相似，如图1所示。遗传学实验表明bc1-101是一个符合单基因控制遗传规律的隐性突变体。
二、图位克隆BC1基因
BC1基因的初步定位
本发明首先建立了一个大的多态性高的定位群体，由bc1-101与C-Bao品种(Japonica)杂交而形成的F2群体，利用SSLP、CAPS和RFLP等分子标记对BC1位点进行初步定位，将其初步定位在水稻第3染色体的着丝粒区，位于C80a和C524a两CAPS标记之间，见图2。
BC1基因的物理定位
用C80a和C524a做探针筛选水稻BAC文库，通过分离BAC末端和发展新的分子标记进行连锁分析构建BC1位点区域的BAC克隆重叠群。BC1基因被进一步定位于BAC克隆OSJNBa0036N23上，见图3。
BC1基因的精细定位
用鸟枪法对BAC克隆OSJNBa0036N23进行测序并根据BAC克隆OSJNBa0036N23的序列发展了一个新的STS标记(P1)和六个CAPS标记(P2-P7)，将BC1精确定位于CAPS标记P2和P4之间的33kb基因组区域(图4)。通过分析此区段的开放阅读框(ORF)推测候选基因。
BC1基因的鉴定和功能分析
转基因功能互补试验表明本发明获得的候选基因能使突变体恢复了正常功能(见图6)；证明了本发明正确克隆了如图7和Seq No.1所示的BC1基因。氨基酸序列分析表明BC1基因编码一种GPI-锚定蛋白(图8)。
三、利用双元载体pCAMBIA1300构建用于转化的质粒pCna18和pCna181T(见图5)并利用电击法将该两种质粒转入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系LBA4404中转化水稻。
随着我国人口不断增多和耕地面积的日益减少，人畜争粮矛盾将日益突出，秸秆资源的有效利用无疑在农业发展中具广泛的应用前景。BC1基因的发现与克隆，使得应用基因工程技术调控植物茎秆的支撑力、叶片、叶鞘细胞壁的厚度成为可能。一方面可以增加植物的抗倒伏和抗逆的能力以增加农作物的产量和品质，另一方面还可在用秸秆作为饲料，及饲料深加工方面；同时也在秸秆还田、减少环境污染方面发挥重要的作用。而在相关领域，如林业方面，本发明对改善木材的材质，提高纤维素的含量和质量有重要的作用。
附图说明
下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。
图1.水稻脆秆突变体bc1的表型。
图2.BC1在水稻第3染色体上的初步定位图
图3.BC1基因的物理定位
图4.BC1基因的精细定位
图5.PCna18载体图谱
图6.功能互补实验T1代转基因水稻的表型.左：野生型；中：质粒 转
化T1代；右：质粒转化T1代。
图7.BC1基因的DNA序列
图8.BC1基因编码的氨基酸序列
具体实施方式
实施例1：
1、水稻材料
水稻(ORyza sativa ssp.)突变体Brittle Culm1-101，原始野生型材料为“双科早”籼稻品种。
2、分析和定位群体
纯合的bc1-101突变体和原始野生型品种C-Bao进行杂交，F1代自交，共得到30,000 F2个体，并从中选出7068个bc1-101突变个体作为定位群体。在苗期每株取2克左右的嫩叶，用来提取DNA。
3、通过SSLP，RFLP，和CAPS标记定位BC1基因
采用改进的CTAB方法[9]从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约100mg水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于100μl超纯水中。每一个SSLP和CAPS反应用1μl DNA样品，而每个RFLP分析用30μl DNA样品。
在BC1基因的初步定位阶段，对由250个F2个体组成的小群体进行SSLP和CAPS分析。BC1基因被定位在第3号染色体着丝粒区RM16和C524a标记间。在此基础上，我们设计了PCR引物分别以两个亲本的基因组DNA为模板进行PCR扩增。两个亲本的PCR产物分别用100多种不同的限制酶消化，经2％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测酶切产物的多态性。以此发展了CAPS标记，并将BC1初步定位在C80a和C524a之间。
为了将BC1定位在一个BAC克隆上，我们分别用标记C80a和C524a筛选水稻品种Nipponbare的BAC文库(由Clemson UniversityGenomics Institute，CUGI提供)。由于C80a标记筛选出的BAC克隆末端在水稻基因组中均为重复序列，因此C80a标记不能用作染色体步行的起点。而C524a筛选出六个阳性BAC克隆，根据这些克隆的详细指纹图谱和CUGI STC测序计划产生的BAC末端序列(http://www.genome.clemson.edu/projects/rice/rice_bac_end/)，我们构建了一个小的重叠群。我们分离了BAC克隆OSJNBa0052G19末端，发展了一个CAPS标记52G19f。群体遗传分析发现它比C524a更接近bc1-101突变位点。接着再用标记52G19f进一步筛选水稻BAC文库，并进行RFLP分析。用不同的限制性内切酶完全消化基因组DNA，经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，转移到Hybond N+尼龙膜(Amersham)上。用Prime-a-Gene Labeling System(Cat.No.U 1100，Promega)和α-32P-dCTP标记探针。杂交后的尼龙膜用磷屏分子成像仪(PhosphorImager，Molecular Dynamics)检测多态性。遗传连锁分析表明，bc1-101突变位点被定位在两个RFLP标记57M10r和36N23f之间，且分别检测到了6个重组。因此，BC1被定位在一个BAC克隆OSJNBa0036N23上。
4、BC1基因的精细定位
利用鸟枪法测序BAC克隆OSJNBa0036N23，然后在此基础上发展一个STS标记(P1)和六个CAPS标记(P2-P7)，精细定位了突变基因的位点。最后通过连锁分析将BC1定位在CAPS标记P2和P4之间的3.3kb基因组区域内。(实验用到的标记应该详细说明，以方便他人重复)
5、BC1 cDNA全长基因的获得
首先通过3.3kb的全长测序，并对基因组序列用GENSCAN软件(http:/genes.mit.edu/GENSCAN.html)预测可能的编码区(ORF)，发现其间只有一个开放阅读框；然后将预测的ORF在GenBank中的蛋白质数据库中进行BLASTX分析。用DNAStar软件(Lasergene)中MegAlign程序进行了蛋白质序列比较。RT-PCR和RACE-PCR分析得到BC1基因的全长cDNA序列。RT-PCR引物BC1F(5’GGT AGT TGAAGT TTG TGA TGG C3’)和BC1R(5’GCT CTC TCC TCG CTC GGCTCC 3’)被用来扩增野生型水稻总RNA的逆转录产物。再设计5’步行的两对引物：N1F(5’GTC ACG GCG AGG AGC CGA GC3’)和N1R(5’ACA TCA CGT TAA AGT GGG ACG 3’)；N2F(5’GAGCCGAGC GAG GAG AGA GC 3’)和N2R(5’CCA GAT GTA CCG GCAGAT CC3’)；及3’步行的一对引物：BC4R(5’GGA GAG CAG TGTAGG TAG GG 3’)和BC11R(5’CAG TCC CCA GTT AGG CCA CG3’)。通过测序RT-PCR和RACE-PCR产物，得到了BC1基因的全长cDNA序列。在上述研究的基础上发现了基因突变的位置，并推测该基因可能编码一种GPI锚定蛋白，与拟南芥COBRA蛋白有较高的同源性。
实施例2转化植物(水稻为例)
nh12和aa06是用于测定BAC克隆OSJNBa0036N23序列的随机文库中的两个质粒克隆，通过共有的NheI位点将它们连接成一个5.8kb(na18)片段，其中包括BC1完整的ORF区。同时用BamHI酶切na18，产生一个3.3kb片段，只含有BC1前半部分的ORF。5.8kb和3.3kb片段分别克隆到双元载体pCAMBIA1300中，获得了用于转化的质粒pCna18和pCna181T(图5)。这两个质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系LBA4404中转化水稻。将bc1-101突变体的成熟种子脱壳灭菌，接种到诱导愈伤的培养基中。培养3周后，从盾片处生长出愈伤组织，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤，用作转化的受体。用含有双元质粒载体的LBA4404菌株侵染水稻愈伤，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤和转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处炼苗，几天后移栽到水田。该植株恢复野生表型，证明该基因具有调节植株茎杆脆性和机械强度的作用。
BC1.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>中科院遗传与发育生物学研究所
<120>水稻脆杆控制基因BC1及其应用
<130>patent
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1407
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1407)
<223>
<400>1
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         325          330            335
tac cgc atg aac tac acc cag tgg acg ctc gtc gcc cag cac ccc aac  1056
Tyr Arg Met Asn Tyr Thr Gln Trp Thr Leu Val Ala Gln His Pro Asn
       340          345          350
ctc aac aac gtc acc gag gtc ttc agc ttc cag tac aag ccc ctc ctc  1104
Leu Asn Asn Val Thr Glu Val Phe Ser Phe Gln Tyr Lys Pro Leu Leu
    355          360          365
ccc tac ggc aac atc aac gac acc ggc atg ttc tac ggg ctc aag ttc  1152
Pro Tyr Gly Asn Ile Asn Asp Thr Gly Met Phe Tyr Gly Leu Lys Phe
  370           375          380
tac aac gac ctg ctc atg gag gca ggg ccg ttc ggc aac gtg cag tcg  1200
Tyr Asn Asp Leu Leu Met Glu Ala Gly Pro Phe Gly Asn Val Gln Ser
385          390          395           400
gag gtg ctg atg aga aag gac tac aac acc ttc acc ttc agc cag ggc  1248
Glu Val Leu Met Arg Lys Asp Tyr Asn Thr Phe Thr Phe Ser Gln Gly
         405          410           415
tgg gcg ttc ccg cgc aag atc tac ttc aac ggc gac gag tgc aag atg  1296
Trp Ala Phe Pro Arg Lys Ile Tyr Phe Asn Gly Asp Glu Cys Lys Met
        420         425            430
ccg ccg ccg gac tcc tac ccc tac cta ccc aac tcc gct ccg atc ggg  1344
Pro Pro Pro Asp Ser Tyr Pro Tyr Leu Pro Asn Ser Ala Pro Ile Gly
    435           440           445
ccg ccg cgt tcc gtg gcc gcc gcc gcc tcg gcg atc ttg gtg gtg ctc  1392
Pro Pro Arg Ser Val Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ile Leu Val Val Leu
  450           455            460
ctc ctg gtg gca tga                                              1407
Leu Leu Val Ala
465
<210>2
<211>468
<212>PRT
<213>Oryza sativa
<400>2
Met Glu Leu His Arg Cys Ser Leu Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Thr
1        5            10           15
Cys Ser Val Ala Val Ala Tyr Asp Pro Leu Asp Pro Lys Gly Asn Ile
       20            25           30
Thr Ile Lys Trp Asp Val Ile Ser Trp Thr Pro Asp Gly Tyr Val Ala
     35           40             45
Met Val Thr Met Ser Asn Tyr Gln Met Tyr Arg Gln Ile Leu Ala Pro
 50           55            60
Gly Trp Thr Val Gly Trp Ser Trp Ala Lys Lys Glu Val Ile Trp Ser
65          70            75            80
Ile Val Gly Ala Gln Ala Thr Glu Gln Gly Asp Cys Ser Lys Phe Lys
          85            90          95
Gly Gly Ile Pro His Ser Cys Lys Arg Thr Pro Ala Ile Val Asp Leu
      100             105           110
Leu Pro Gly Val Pro Tyr Asn Gln Gln Ile Ala Asn Cys Cys Lys Ala
    115           120          125
Gly Val Val Ser Ala Tyr Gly Gln Asp Pro Ala Gly Ser Val Ser Ala
  130            135          140
Phe Gln Val Ser Val Gly Leu Ala Gly Thr Thr Asn Lys Thr Val Lys
145          150           155           160
Leu Pro Thr Asn Phe Thr Leu Ala Gly Pro Gly Pro Gly Tyr Thr Cys
         165          170           175
Gly Pro Ala Thr Ile Val Pro Ser Thr Val Tyr Leu Thr Pro Asp Arg
       180           185            190
Arg Arg Arg Thr Gln Ala Leu Met Thr Trp Thr Val Thr Cys Thr Tyr
     195          200           205
Ser Gln Gln Leu Ala Ser Arg Tyr Pro Thr Cys Cys Val Ser Phe Ser
  210           215           220
Ser Phe Tyr Asn Ser Thr Ile Val Pro Cys Ala Arg Cys Ala Cys Gly
225          230            235           240
Cys Gly His Asp Gly Tyr Arg Gly Asn Gly Gly Gly Gly Lys Asn Ala
         245          250           255
Arg Ala Gly Asp Gly Arg Ser Arg Arg Asn Ser Gly Gly Gly Gly Gly
      260           265           270
His Ser Gly Gly Thr Glu Cys Ile Met Gly Asp Ser Lys Arg Ala Leu
    275           280            285
Ser Ala Gly Val Asn Thr Pro Arg Lys Asp Gly Ala Pro Leu Leu Gln
  290           295           300
Cys Thr Ser His Met Cys Pro Ile Arg Val His Trp His Val Lys Leu
305           310          315            320
Asn Tyr Lys Asp Tyr Trp Arg Ala Lys Ile Ala Ile Thr Asn Phe Asn
         325          330           335
Tyr Arg Met Asn Tyr Thr Gln Trp Thr Leu Val Ala Gln His Pro Asn
      340           345          350
Leu Asn Asn Val Thr Glu Val Phe Ser Phe Gln Tyr Lys Pro Leu Leu
    355          360          365
Pro Tyr Gly Asn Ile Asn Asp Thr Gly Met Phe Tyr Gly Leu Lys Phe
  370          375           380
Tyr Asn Asp Leu Leu Met Glu Ala Gly Pro Phe Gly Asn Val Gln Ser
385          390          395           400
Glu Val Leu Met Arg Lys Asp Tyr Asn Thr Phe Thr Phe Ser Gln Gly
         405          410           415
Trp Ala Phe Pro Arg Lys Ile Tyr Phe Asn Gly Asp Glu Cys Lys Met
        420          425            430
Pro Pro Pro Asp Ser Tyr Pro Tyr Leu Pro Asn Ser Ala Pro Ile Gly
     435          440           445
Pro Pro Arg Ser Val Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ile Leu Val Val Leu
  450           455           460
Leu Leu Val Ala
465

Claims (10)

1、一种水稻脆秆控制基因BC1编码的蛋白质，如Seq ID No.2所示的氨基酸序列。
2、一种编码权利要求1所述的蛋白质的基因。
3、权利要求2所述的基因，如Seq.ID.No.1所示的核苷酸序列。
4、一种含有权利要求2或3所述的基因的质粒。
5、一种宿主细胞，该细胞含有权利要求4所述的质粒。
6、根据权利要求5所述的宿主细胞，该细胞为大肠杆菌细胞。
7、根据权利要求5所述的宿主细胞，该细胞为农杆菌细胞。
8、根据权利要求5所述的宿主细胞，该细胞为植物细胞。
9、一种培育植物茎杆变脆或更坚韧的方法，包括用权利要求4所述的质粒转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株。
10、按照权利要求9所述的方法，其中所述的转化是通过农杆菌介导法或基因枪法进行的。
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