CN100420484C - 人溶菌酶栓剂、制法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药，特别是涉及针对抗耐药菌、病毒的人溶菌酶药物及其制法、应用。人溶菌酶栓剂，含有活性300U～300万U/ml人溶菌酶。本发明基因重组人溶菌酶安全无毒副作用，来源丰富，有很好的药用前景，制备工艺简单，做成栓剂给药药物不受胃肠pH或酶的破坏而失去活性；对胃粘膜有刺激性的药物可用直肠给药，可免受刺激；药物直肠吸收，不象口服药物受肝脏首过作用破坏；直肠吸收比口服干扰因素少；对不能或者不愿吞服片、丸及胶囊的病人，尤其是婴儿和儿童可用此法给药；对伴有呕吐的患者的治疗为一有效途径；制备方法成熟，简单。
Description
技术领域：
本发明涉及生物制药，特别是涉及针对抗耐药菌、病毒的人溶菌酶药物及其制法、应用。
背景技术：
21世纪的今天，耐药菌的发展令人触目惊心。所谓耐药菌就是细菌对药物产生抗性，是细菌多次与药物接触后，对药物的敏感性减小甚至消失，致使药物对细菌的敏感性降低甚至无效。其中耐药菌包括金黄色葡萄球菌MRSA、表皮葡萄球菌MRSE、肺炎链球菌、溶血性链球菌、肠球菌属、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、丙酸杆菌、淋病双球菌、枸橼酸杆菌、沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单孢菌、白色念珠菌等。主要是对下列药品产生耐药性：克拉霉素、罗红霉素、阿莫西林、万古霉素、德可霉素、广谱青霉素、甲氧西啉类、头孢类、青霉素钠、青霉素钾、磺胺类。
具体的耐药标准是：(抑菌圈直径mm)
从细菌的耐药发展史可以看出，在某种新的抗生素出现以后，就有一批耐药菌株出现。开发一种新的抗生素一般需要10年左右的时间，而一代耐药菌的产生只要2年的时间，抗生素的研制速度远远赶不上耐药菌的发展速度。目前急需开发一种针对不同耐药菌株均有效的“超级抗生素”用于临床治疗。如中国专利03110824.5所公开了人溶菌酶针对抗耐药菌的用途，但是针对某些疾病是否有更合理有效的剂型，以及在制备治疗更多种疾病的开发上仍有很大空白。
发明内容：
本发明的目的提供一种人溶菌酶栓剂，针对抗耐药菌包括对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的抗耐药性，胃肠免受刺激，直接作用于患处，使用方便，效果好。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：人溶菌酶栓剂，含有活性300U～300万U/mL人溶菌酶。
所述人溶菌酶包括基因工程表达的重组人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶、基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
本发明栓剂制备工艺流程为：配方原料药物准备→配方药物分别制备→配方药物混合制备→倒入栓剂模具→冷却固化成型→含量及其它质量测定→成品包装。(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)。
具体的制法如下：
第一步、基因重组人溶菌酶的制备：基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为准，用磷酸6毫升、硫酸镁3克，硫酸钾4克，氢氧化钾1克，硫酸钙1.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液进行冻干，测蛋白测活性保存。
第二步、栓剂制备：将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得300U～300万U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)，75～85％丙二醇、万分之五吐温80，明胶15％，称取明胶，加磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)适量，浸泡20分钟，使其变软，将多余的液体倒出，称取丙二醇加入，置水浴上加热溶化蒸发，无液体后取下，冷却50℃以下，加入重组人溶菌酶和万分之五吐温80，搅拌均匀，接近凝固时，倒入栓剂模具中，冷却、固化、成型，产品活性含量及其它质量测定，成品包装。
本发明栓剂在制备针对抗耐药菌包括对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的抗耐药性的药物中的应用。
涉及人溶菌酶栓剂在制备预防或治疗由耐药白色念珠菌引起的阴道炎的药物中的应用。
涉及人溶菌酶栓剂在制备预防或治疗由II型疱疹病毒引起的子宫颈炎的药物中的应用。
涉及人溶菌酶栓剂在制备预防或治疗由耐药淋病双球菌引起的尿道炎的药中的应用。
涉及人溶菌酶栓剂在制备治疗由细菌、病毒、和自身免疫异常引起的溃疡性结肠炎的药中的应用。
本发明基因重组人溶菌酶安全无毒副作用，来源丰富，有很好的药用前景，制备工艺简单，做成栓剂给药有如下特点：①药物不受胃肠pH或酶的破坏而失去活性；②对胃粘膜有刺激性的药物可用直肠给药，可免受刺激；③药物直肠吸收，不象口服药物受肝脏首过作用破坏；④直肠吸收比口服干扰因素少；⑤对不能或者不愿吞服片、丸及胶囊的病人，尤其是婴儿和儿童可用此法给药；⑥对伴有呕吐的患者的治疗为一有效途径；⑦制备方法成熟，简单。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用基因重组人溶菌酶的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为准，用磷酸6毫升、硫酸镁3克，硫酸钾4克，氢氧化钾1克，硫酸钙1.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液进行冻干，测蛋白测活性保存。将合格的基因重组人溶菌酶制得30000U/ml备用；
将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得300U～300万U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)，75～85％丙二醇、万分之五吐温80，明胶15％，制成栓剂(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)。
一、对动物的模型试验：
A、基因重组人溶菌酶(HLZ)体内外抗菌作用评价
(1)体外抗菌作用：
受试药品及试剂：
1、人溶菌酶(Human Lysozyme HLZ)：活性单位：30000单位/mL，由大连奇龙生物技术研究所提供。
2、对照溶菌酶(contral Lysozyme，CLZ)：白色粉未，活性单位：50000单位/mg，美国SIGMA公司产品，批号：L6876。
3、克拉霉素：效价948μ/mg，中国药品生物制品检定所标准品，批号：
4、罗红霉素：效价878μ/mg，中国药品生物制品检定所标准品，批号：
5、注射用阿莫西林：哈尔滨制药厂产品，批号：010504。
6、琼脂糖(B10WEST AGAROSE)：
7、三羟甲基氨基甲烷(Tris)：成都化学试验厂，批号010211试验菌株：
所用菌株均为2001.4~2002.4月于四川、北京地区收集的临床分离致病菌。经本室用PI方法重新鉴定后用于试验。
质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923
大肠埃希菌ATCC25922
铜绿假单孢菌ATCC27853
培养基：
4、Tris-HCl缓冲液：0.1M Tris 100ml，0.1M HCl 70ml，High Water 800ml，测PH值，用HCl溶液调至PH7.2，加High Water至1000ml。
2、Tris-HCl琼脂培养基：在Tris-Cl缓冲液中加入琼脂糖116℃无菌后使用。
3、M-H培养基：中国药品生物制品检定所产品，M-H肉汤培养基：称取25g加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌，116℃20分钟。M-H固体培养基：称取36g，加1000ml蒸馏水，高压灭菌，116℃20分钟，用于革兰阳性、阴性需氧菌的药敏试验。
4、血培养基，即在M-H培养基中加5-10％脱纤维兔血配制而成，用于肠球菌、链球菌的药敏试验。
试验方法：
体外抗菌活性(MIC)测定：采用琼脂二倍稀释法测定受试药物对试验菌株的最低抑菌浓度(MIC)。将受试药物用灭菌蒸馏水溶解，适当稀释。分别取1ml药液加9ml融化的Tris-HCl琼脂糖固体培养基混匀，以二倍稀释，制备系列含药平皿。每皿所含药物终浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03……0.001mg/ml；用多点接种仪(Denley A400，England)将稀释至105CFU/ml的试验菌液接种于各含药平皿表面，置于37℃培养8-10小时，取出分别吸取6ml融化的M-H培养基(50℃)覆盖上述系列平皿表面，再置于37℃培养10小时取出，观察结果，以无细菌生长平皿内所含最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度(MIC)。
(2)体内抗菌作用评价：
药品：人溶菌酶来源同前。
克拉霉素来源同前。
罗红霉素来源同前。
阿莫西林来源同前。
细菌：金黄色葡球菌01193，金黄色葡球菌MRSA021923均为临床分离致病菌。
动物：昆明种小鼠，体重18-22克，由本所动物室提供。
试验方法：
体内保护试验：挑取一定量的菌苔接种于2ml M-H液体培养基中，37℃培养6小时后，取出用灭菌干酵母液进行适当稀释(10-1，10-2，10-3，10-4)，再取昆明种小鼠，随机分组，每组5只鼠，分别腹腔感染不同菌量的受试菌液，测定引起小鼠100％死亡的最小致死菌量(MLD)。再按1∶0.5剂间距设置5个剂量组，每组10只鼠，每只小鼠腹腔感染1MLD菌量的菌液0.5ml，感染后即刻静脉注射受试药0.5ml，设感染对照组(不给药)，观察1周，记录小鼠死亡数。按Bliss法计算半数有效剂量ED50及95％可信限。
小鼠皮肤烧伤感染模型的疗效评价：昆明种小鼠26-30g，随机分组，每组5只鼠，分别皮肤烧伤感染模型喷涂金黄色葡萄球菌菌液100ml，菌量为108CFU/ml，连续喷5次(间隔10分钟喷一次)，末次喷菌后6小时，分别用无菌棉签挑取皮肤烧伤感染模型涂于无药琼脂平板表面，37℃培养18小时，皮肤烧伤感染模型感染细菌数在＞103CFU/ml，且经革兰氏染色、光镜检测为金黄色葡萄球菌的小鼠为感染模型成功。
选取皮肤烧伤感染模型感染成功小鼠随机分组，每组10只鼠，分别用喷雾器喷涂受试药物100μl/次，4次/日，连续5日，每日采用咽试子涂片法，于琼脂平板表面进行活菌计数，作统计学处理，与感染对照组和克拉霉素组、罗红霉素给药组作比较。
试验结果：
(1)人溶菌酶对临床分离菌株的体外抗菌活性见表1。
(2)克拉霉素、罗红霉素、阿莫西林与人溶菌酶以1∶1联合用药的体外抗菌作用结果见表2。
(3)人溶菌酶对379株临床分离致病菌的MIC50、MIC90见表3。
根据以上试验结果表明：人溶菌酶体外具有一定抗菌作用，体内对伤口感染溃烂的疗效较确切。对多数菌株的抗菌活性比不上克拉霉素、罗红霉素和阿莫西林。人溶菌酶与克拉霉素、罗红霉素联用(1∶1)，可使克拉霉素、罗红霉素对其耐药菌株的抗菌活性增效2-16倍以上，个别菌株增效倍数在1000倍。溶菌酶是一种小分子蛋白质，存在于机体的泪液、唾液、白细胞和血清中，对多种革兰氏阳性菌和少数革兰氏阴性菌有杀菌作用，由大连奇龙生物技术研究所研制的基因重组人溶菌酶(Human Lysozyme)也具有溶菌酶相同作用机制，主要切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1、4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，引起细菌裂解。
表1人溶菌酶、鸡溶菌酶、克拉霉素和罗红霉素体内外抗菌活性
续表2
续表3
注：HLZ指人溶菌酶，CLZ指对照溶菌酶(鸡溶菌酶)，CLA指克拉霉素，ROX指罗红素
B、重组人溶菌酶抗病毒试验模型
实验材料：
1、动物：健康家兔20只，雌性，体重2000克左右，由四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供，质量符合壹级标准。
2、试药：重组人溶菌酶效价30000u/mL，由大连奇龙生物技术研究所提供，临用前用磷酸盐缓冲液PH6.5～7.5配成所需浓度备用。
3、试剂：AR级盐酸，市售。用蒸馏水配制成1N浓度备用。
4、BL 3100型，BS 200S-WE1型电子天平，北京赛多利斯天平公司生产。玻璃干燥器：大小φ23×12.5cm。
5、医用无菌棉签。
6、II型疱疹病毒100～1000TCID50(由四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供)
7、用德国菲弗公司100ul喷雾泵向阴道内喷雾重组人溶菌酶。
实验方法及剂量设计：
将20只家兔随机均分四组，每组5只，进行阴道宫颈造模。用医用无菌棉签粘取II型疱疹病毒100～1000TCID50擦家兔阴道宫颈感染家兔子宫颈炎膜型。每天一次，连续三天。第三天家兔阴道出现分泌物，第四天家兔阴道出现分泌物增多，模型成立。将造模后的20只家兔重新合并后再随机分成四组，分别设立三个给药组和一模型组。
重组人溶菌酶溶液以15000u/ml(每喷1500U)为低剂量浓度基础上再配制30000u/ml(每喷3000U)、60000u/ml(每喷6000U)二浓度作为中、高剂量组治疗时的药液浓度。在造模型第四天开始给家兔阴道内宫颈喷雾重组人溶菌酶药液，每天三次，每次100ul，肉眼观察家兔形态变化情况及时间。
实验结果：
给药重组人溶菌酶药液第二天，给药重组人溶菌酶药液中、高剂量组治疗效果凸现，家兔阴道分泌物减少。给药重组人溶菌酶药液第三天，给药重组人溶菌酶药液低剂量组也出现好转治疗效果。给药重组人溶菌酶药液第六天，给药模型低、中、高组家兔阴道无分泌。模型对照组家兔阴道分泌增多，并伴有血丝。给药重组人溶菌酶模型组和一模型对照组有明显区别。见表4、见表5
表4
表5
综合以上实验结果分析，试验重组人溶菌酶药液对抗II型疱疹病毒100～1000TCID50感染家兔子宫颈炎膜型，有很好的治疗效果。其治疗效果与使用剂量有明显量效关系。
C、重组人溶菌酶抗耐药淋病双球菌试验：
耐药淋病双球菌青霉素钠抑菌圈≤2.7，耐药菌淋病双球菌尿道感染所致小鼠尿道炎模型的制备：
选用健康昆明种小鼠10只，雌雄各半，体重为18-22克，挑取一定量的耐药淋病双球菌用注射方式感染小鼠尿道致小鼠尿道炎10只，感染后即刻静脉注射受试药30000U/ml/20g鼠重，观察一周，每日一次给药，记录小鼠有效率。实验结果表明基因重组人溶菌酶对耐药淋病双球菌尿道感染所致小鼠尿道炎有明显疗效。结果如下表：
| 病种 | 受试动物(只) | 痊愈 | 显效 | 无效 | 有效率％ |
| 尿道炎 | 10 | 7 | 3 | 0 | 100 |
D、重组人溶菌酶抗耐药白色念珠菌试验：
耐药白色念珠菌广谱青霉素抑菌圈≤2.7，耐药大肠埃希菌染所致小鼠阴道炎模型的制备：
选用健康昆明种小鼠10只，雌雄各半，体重为18-22克，挑取一定量的耐药白色念珠菌用涂抹方式感染小鼠阴道致小鼠阴道炎10只，感染后即喷雾给药重组人溶菌酶30000U/ml/20g鼠重，每次100ul，3000U，观察一周，每日三次给药，记录小鼠有效率。实验结果表明基因重组人溶菌酶对耐药白色念珠菌感染所致小鼠阴道炎有明显疗效。结果如下表：
| 病种 | 受试动物(只) | 痊愈 | 显效 | 无效 | 有效率％ |
| 阴道炎 | 10 | 7 | 3 | 0 | 100 |
二、用法与用量：
用手推入阴道内部或直肠深部，直接作用于病灶，局部给药，每日1～2次，每次一枚。
具体实施方式
实施例1
第一步、基因重组人溶菌酶的制备：基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为准，用磷酸6毫升、硫酸镁3克，硫酸钾4克，氢氧化钾1克，硫酸钙1.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液进行冻干，测蛋白测活性保存。
第二步、栓剂制备：将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得3000U/mL，磷酸盐缓冲液12mM(pH6.5～7.5)，75％丙二醇、万分之五吐温80，明胶15％，称取明胶，加磷酸盐缓冲液12mM(pH6.5～7.5)适量，浸泡20分钟，使其变软，将多余的液体倒出，称取丙二醇加入，置水浴上加热溶化蒸发，无液体后取下，冷却50℃以下，加入重组人溶菌酶和万分之五吐温80，搅拌均匀，接近凝固时，倒入栓剂模具中，冷却、固化、成型，产品活性含量及其它质量测定，成品包装。
实施例2
按实施例1所述方法，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得100万U/mL，磷酸盐缓冲液15mM(pH6.5～7.5)，80％丙二醇、万分之五吐温80，明胶15％，制成栓剂。
实施例3
按实施例1所述方法，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得200万U/mL，磷酸盐缓冲液20mM(pH6.5～7.5)，85％丙二醇、万分之五吐温80，明胶15％，制成栓剂。
Claims (8)
1. 人溶菌酶栓剂，其特征是：由纯度95％的基因重组人溶菌酶制得300U～300万U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM、pH6.5～7.5，75～80％丙二醇、万分之五吐温80，明胶15％，制成栓剂。
2. 根据权利要求1所述的人溶菌酶，其特征是：人溶菌酶包括基因工程表达的重组人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶、基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
3. 根据权利要求1或2所述的人溶菌酶栓剂的制法，其特征是：将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得300U～300万U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM、pH6.5～7.5，75～80％丙二醇、万分之五吐温80，明胶15％，称取明胶，加10～20mM、pH6.5～7.5磷酸盐缓冲液适量，浸泡20分钟，使其变软，将多余的液体倒出，称取丙二醇加入，置水浴上加热溶化蒸发，无液体后取下，冷却50℃以下，加入重组人溶菌酶和万分之五吐温80，搅拌均匀，接近凝固时，倒入栓剂模具中，冷却、固化、成型，产品活性含量及其它质量测定，成品包装。
4. 权利要求1或2所述的人溶菌酶栓剂在制备针对抗耐药菌包括对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的抗耐药性的药物中的应用。
5. 权利要求1或2所述的人溶菌酶人溶菌酶栓剂在制备预防或治疗由耐药白色念珠菌引起的阴道炎的药物中的应用。
6. 权利要求1或2所述的人溶菌酶人溶菌酶栓剂在制备预防或治疗由II型疱疹病毒引起的子宫颈炎的药物中的应用。
7. 权利要求1或2所述的人溶菌酶人溶菌酶栓剂在制备预防或治疗由耐药淋病双球菌引起的尿道炎的药中的应用。
8. 权利要求1或2所述的人溶菌酶人溶菌酶栓剂在制备治疗由细菌、病毒、和自身免疫异常引起的溃疡性结肠炎的药中的应用。
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Families Citing this family (1)
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2004
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Patent Citations (1)
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