CN100408686C - 基因工程制备人白细胞介素24的方法及其表达载体和工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高效地制备具有一定生物活性的基因工程人白介素24的方法，及其表达载体和工程菌。本发明选用融合表达载体来表达hIL-24或hsIL-24蛋白，所述的表达载体为含有人白细胞介素24基因序列(IL-24)或人白细胞介素24基因突变序列(sIL-24)的质粒载体pET32a(+)，且hIL-24或hsIL-24编码序列位于pET32a(+)载体上Kpn1和BamH1酶切位点之间。所述的基因工程菌是大肠杆菌，并被本发明所述的表达载体所转化，是pET32a(+)-hIL-24/BL21或pET32a(+)-hsIL-24/BL21。本发明的制备工艺中提供了全套的溶解、复性、消化以及纯化的工艺，使目的蛋白的表达量能够达到30%，复性得率大于50%，IL-24的纯度大于95%，且完全适用于工业大规模生产。

Description

基因工程制备人白细胞介素24的方法及其表达载体和工程菌

技术领域

本发明涉及利用DNA重组技术生产蛋白质或多肽药物的领域，更具体地，本发明涉及基因工程制备人白细胞介素24(human interleukin-24，hIL-24)及其突变体hsIL-24的方法，还涉及有关的表达载体和工程菌。

背景技术

IL-24具有显著的抑制肿瘤的作用，能选择性地抑制多种肿瘤生长，诱导肿瘤细胞凋亡，包括人黑色素瘤、神经胶质母细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌等。这种抑制作用不依赖p53、Rb和p16等抑癌基因，且对正常细胞没有影响。IL-24抑制肿瘤的机制尚未清楚，目前认为通过多种途径发挥抑制肿瘤的作用，抗肿瘤的效果十分显著，成为肿瘤特异治疗药物的研究开发热点。

IL-24是1995年哥伦比亚大学Paul.B.F用差减杂交方法在黑色素瘤细胞cDNA文库中发现一个新的与黑色素瘤分化相关基因，即mda-7(melanoma differentiation-associatedgene 7)，并初步试验证明了mda-7具有抑制黑色素瘤增生特性和在黑色素瘤进程中促进终末分化的能力。随后mda-7一直作为肿瘤抑制物被研究，直到2002年Caudell等用一系列的实验证实了mda-7的细胞因子属性，提出将mda-7重新命名为白细胞介素24(interleukin-24，IL-24)，归于IL-10家族。

IL-24基因位于人染色体1q32.2-1q41，有7个外显子和6个内含子。IL-24全长mRNA为1975bp(GENEBANK NM_006850)。IL-24共有206个氨基酸，其中N端有48个氨基酸为信号肽，引导IL-24分泌到细胞外行使功能。带信号肽的IL-24分子量为23.8kD，成熟蛋白的分子量18.4kD。

IL-24的表达在人细胞中存在较高的组织特异性，主要为免疫细胞亚群，包括正常的或LPS刺激的单核细胞和T细胞，进一步亚型分类显示约15-20％的CD19+和50-80％的CD56+为IL-24表达呈阳性。IL-24在正常黑素细胞和初期黑色素瘤细胞中均有表达，随着黑色素瘤发展IL-24的表达逐渐减少，并在黑色素瘤的转移和浸润期间几乎检测不到IL-24的表达。在50多个不同起源的肿瘤细胞株中都没有测定IL-24蛋白表达。Vincenti等的研究表明IL-24mRNA可被致炎细胞因子——白细胞介素-1β诱导强烈上调，暗示IL-24为早期响应基因具有响应应激的功能。

IL-24诱导肿瘤细胞凋亡与改变线粒体通透性，以及线粒体相关凋亡调节因子的含量和比例有关。在p53野生型和p53缺陷型的NSCLC皮下肿瘤中，腺病毒介导的IL-24过表达引起显著的肿瘤生长抑制。与对照组肿瘤相比，Ad.IL-24或IL-24质粒转化的肿瘤组实体更小、血管生成更少，暗示IL-24具有抗血管形成活性。在肺癌模型中Ad.IL-24转染肿瘤的血管数量明显减少，凋亡数量增加。数据显示血管内皮生长因子(VEGF)和转化生长因子(TGF-β)下调。在鼠异种移植模型上IL-24能抑制肺肿瘤生长，肿瘤微血管密度和血红素含量减少，表明IL-24具有肿瘤血管生成抑制活性。

IL-24可诱导p38MAPK，PKR和STAT3等多种信号转化途径，其中p38MAPK和PKR是IL-24介导凋亡必需的。引起凋亡相关蛋白的表达量改变、磷酸化或涉及死亡受体Fas/FADD途径的活化，最终引起肿瘤细胞选择性凋亡。从人胎盘基因组文库中分离IL-24启动子区域。GCG序列分析鉴定多个AP-1和C/EBP转录因子识别位点，而AP-1/cJun或C/EBP的异位表达能显著提高黑色素瘤细胞IL-24启动子的表达，证实IL-24基因调控机制。

iNOS内源表达增强促进黑色素瘤的发生、侵袭和转移。NO具有肿瘤促进和抑制双重效应，取决于局部的NO浓度、以及NO与肿瘤中其它分子的交互作用，最重要的可能是肿瘤微环境中的细胞因子。Ad.IL-24转染到恶性黑素瘤后，IL-24表达将降低iNOS表达，而用重组人IL-24蛋白处理的黑色素瘤细胞也引起iNOS表达下调，表明IL-24表达与肿瘤iNOS表达呈负相关。

Ad.IL-24转染的黑色素瘤细胞系和NSCLC细胞系中细胞周期中G₂/M期细胞比例增加，而在正常黑色细胞和内皮细胞中没有细胞周期停滞，说明Ad.IL-24能阻滞肿瘤细胞周期的进行，而对正常细胞的细胞周期没有影响。

Introgen公司与德克萨斯大学合作研制基因治疗制剂Ad.IL-24(商品名为INGN 241)已经进入II期临床试验，其体内外试验和临床实验均证实了IL-24显著的抗肿瘤效果。但是由腺病毒介导IL-24在肿瘤细胞中瞬时表达，诱导细胞凋亡的效果十分显著，存在问题一是腺病毒的安全性，二是作用效果短暂，临床上应用受到限制。在国内有两篇文献，一篇是在COS细胞中瞬时表达，其诱导细胞凋亡的效果显著，但也存在作用效果短暂的问题，临床上应用受到限制；另一篇虽然应用大肠杆菌来表达IL-24蛋白，但存在一个大的障碍——其包涵体蛋白溶解复性十分困难，没有进行后续的实验研究和其生物学活性验证。

随着IL-24诱导肿瘤细胞凋亡机制的深入研究和内外试验和临床实验的深入开展一方面肯定了IL-24选择性抑制肿瘤生长的功能，另一方面IL-24的临床应用前景越来越广阔，扩展了其应用范围，同时也表现出对IL-24的大量需求。所以，通过基因工程手段大规模生产高纯度较好生物活性的重组人IL-24成为必然。

有研究证实非糖基化后修饰的IL-24同样具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡的能力，这就为原核表达有活性的IL-24提供了理论基础。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效地制备具有一定生物活性的基因工程人白介素24的方法，及其有关的表达载体和工程菌。

本发明的第一方面，提供一种基因工程人白细胞介素24的表达载体，该载体为含有人白细胞介素24基因序列(IL-24)或人白细胞介素24基因突变序列(sIL-24)的质粒载体pET32a(+)，且hIL-24或hsIL-24编码序列位于pET32a(+)载体上Kpn1和BamH1酶切位点之间。该表达载体是pET32a(+)-hIL-24或pET32a(+)-hsIL-24，其构建过程如图1所示。

本发明的第二方面，提供一种基因工程菌，它是大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE)(购置NOVEGA公司)，并被本发明所述的表达载体所转化。该基因工程菌是pET32a(+)-hIL-24/BL21或pET32a(+)-hsIL-24/BL21。

本发明的第三方面，提供一种表达基因工程人白细胞介素24的方法，该方法包括：

a)基因重组工程菌pET32a(+)-hIL-24/BL21或pET32a(+)-hsIL-24/BL21用发酵罐高密度发酵；

a)离心收集细菌；

b)洗涤和溶解包涵体，包涵体溶解液配方为10mmol/L Tris-Hcl，5mmol/L EDTA，8mol/L尿素，pH 9.0；

c)包涵体复性：在4℃搅拌的条件下，缓慢滴加10-20倍体积的复性缓冲液I，4℃搅拌复性24h，再假如10-20倍体积的复性缓冲液II，充分混匀后，4℃搅拌复性24h。复性缓冲液I的配方为10mmol/L Tris-Hcl，0.9mmol/L谷胱甘肽氧化型，0.8mmol/L谷胱甘肽还原型，pH 8.5。复性缓冲液II的配方为10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0；

d)超滤浓缩100-400倍；

e)融合蛋白Trx-hIL-24或Trx-hsIL-24肠激酶水解：用消化缓冲液调整总蛋白浓度为2-8mg/ml，按蛋白重量比1∶300-1∶400加入肠激酶，在16℃-25℃下消化融合蛋白，时间为24-32h，制备hIL-24或hsIL-24蛋白。消化缓冲液的配方为10mmol/LTris-HCl，pH8.0；

f)亲和层析纯化；

g)凝胶过滤层析除盐；

h)目的蛋白hIL-24或hsIL-24的鉴定；

i)目的蛋白hIL-24或hsIL-24诱导肿瘤细胞凋亡的活性实验：MTT比色法测定肿瘤细胞增殖情况；DNA ladder实验；流式细胞仪定量分析。

本发明首次选用融合表达载体来表达hIL-24或hsIL-24蛋白，其优势在于：一是可以利用融合表达载体中的分子伴侣——Trx(氧还硫蛋白)的功能，Trx具有促进目的蛋白正确折叠和有利于目的蛋白的稳定等功能；二是可以利用融合蛋白的6xHis的纯化标签，十分利于后续的纯化工艺；三是可以利用肠激酶(enterokinase)消化得到完整的IL-24，为避免在N端引入Ala和Met两个多余的氨基酸(对于白细胞介素任何一个氨基酸的变化都可能引起它的活性变化)，在设计引物时将肠激酶识别位点的编码碱基，即加黑斜体部分，加入到上游引物中。生物活性实验证实了本发明能够高效制备高纯度的IL-24，也证实了本发明制备的IL-24具有良好的生物学活性。这是本发明的创新点之一。

对于以包涵体形式融合表达的蛋白，高效制备并纯化得到高纯度具有诱导肿瘤细胞凋亡的目的蛋白——IL-24是关键所在，本发明提供了全套的溶解、复性、消化以及纯化的工艺目的蛋白的表达量能够达到30％，复性得率大于50％，IL-24的纯度大于95％，且完全适用于工业大规模生产，这在国内外尚未报道，为本发明的创新点之二。本发明工艺的显著优点在于：第一，采用pH 9.0条件下2mol/L尿素溶解包涵体，不同于常规8mol/L尿素溶解包涵体溶解条件，通过提高pH可以在较低尿素浓度就能充分溶解融合蛋白，较低尿素浓度能够降低对蛋白性质的影响，也提高了复性效果与得率。第二，采用两步法复性工艺，在复性的同时将蛋白溶液的pH缓慢降至肠激酶的最适工作值(pH8.0)，避免了较大pH值波动引起目的蛋白的析出，同时也保证了复性的效果。由于复性充分，目的蛋白在复性的状态下一步亲和层析得到高纯度具有诱导肿瘤细胞凋亡的目的蛋白——IL-24。

附图说明

图1：重组质粒pET32a(+)-hIL-24或pET32a(+)-hsIL-24的构建图

图2：目的基因hIL-24或hsIL-24的RT-PCR克隆

图3：pET32a(+)-hIL-24和pET32a(+)-hsIL-24重组表达质粒的酶切鉴定。

图4：hIL-24和hsIL-24基因重组菌诱导表达PAGE电泳图

图5：融合蛋白Trx-hIL-24或Trx-hsIL-24肠激酶消化效果PAGE电泳图

图6：目的蛋白hIL-24或hsIL-24纯化效果图

图7：不同浓度的hIL-24或hsIL-24对MCF-7细胞的存活率的影响(MTT比色法)

图8：hIL-24或hsIL-24诱导MCF-7细胞凋亡的DNA ladder实验结果

图9：流式细胞仪定量分析hIL-24或hsIL-24诱导肿瘤细胞凋亡的结果

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明进行进一步的描述。

实施例1人IL-24的编码基因的克隆：

1.抽提总RNA：取健康人抗凝血各5mL，用淋巴细胞分离液收集白膜层。加入RPMI1640完全培养基和总浓度为25mg/L的ConA，37℃，50mL/L CO₂孵育48h，离心收集细胞。RNA抽提试剂盒抽提总RNA。

2.RT-PCR：以总mRNA为模板，逆转录得到IL-24cDNA，条件为30℃10s，50℃30s，99℃5s，5℃5s，1个循环。

3.目的基因的PCR扩增：根据GenBank公布的IL-24序列设计一对引物，引物为：

P1 5’-GGTACCGACGACGACGACAAGGCCCAGGGCCAAGAATT(Kpn1)

P2 5’-GGATCCTTACAGAGCTTGTAGAATTTCTG(BamH l)

为避免在N端引入Ala和Met两个多余的氨基酸，在设计引物时将肠激酶识别位点的编码碱基(加黑斜体部分即GACGACGACGACAAG)加入到上游引物中。采用如下PCR体系和程序：

在一500μl微量离心管中加入下列试剂：

模板DNA 2μl

10×PCR缓冲液(含氯化镁)5μl

dNTPs(10mmol/L)4μl

上、下游引物(0.025mmol/L)各1μl

Taq DNA聚合酶(5u/μl)1μl

加去离子水至终体积50μl

混合后加入矿物油3滴

反应条件：94℃预变性5分钟后，94℃，90s；60℃，60s；72℃，90s，35个循环周期，然后72℃延伸10min。

扩增出人白细胞介素24基因序列(hIL-24)或人白细胞介素24基因突变序列(hsIL-24)，IL-24的DNA序列与GENBANK公布的序列完全一致，hsIL-24的DNA序列与Genbank公布的序列对比在同一位置发生碱基的点突变，核酸的序列见序列表。

4.PCR产物的克隆

采用TA克隆方法克隆PCR产物，方法见文献[于永利，麻彤辉，杨贵贞：TA克隆及双链DNA测序，介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法，中国免疫学杂志，1994，10(1)：5]。

5.PCR产物的序列分析

将TA克隆转化菌株送至公司，按常规方法(J.Sambrook，分子克隆，冷泉港实验室出版社1989聚丙烯酰胺凝胶电泳1.21-1.32)提取质粒，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行序列测定。

PCR扩增效果如附图2所示：

泳道1为目的基因hIL-24的RT-PCR扩增产物(约480bp)；

泳道2为目的基因hsIL-24的RT-PCR扩增产物(约480bp)；

泳道3为核酸(DNA)分子量标准(Marker)。

表明目的基因hIL-24和hsIL-24与预计大小基本一致。

实施例2重组表达质粒pET32a(+)-IL-24或pET32a(+)-hsIL-24的构建及高效表达工程菌的构建及筛选

1.重组质粒的构建

将IL-24或hsIL-24基因扩增(PCR)产物经1.0％琼脂糖电泳、胶回收纯化后与载体pMD-18T连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，用Kpn1和BamH1酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

将含IL-24或hsIL-24目的基因的pMD-18T载体及pET-32a(+)用Kpn1和BamH1酶切，酶切产物经1.0％琼脂糖电泳、目的片段胶回收纯化后，用连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，Kpn1和BamH1酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。酶切鉴定结果如附图3所示：

泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；

泳道2为重组质粒pET32a(+)-hI L-24双酶切Kpn1/BamH1产物(约480bp)；

泳道3为重组质粒pET32a(+)-hsIL-24双酶切Kpn1/BamH1产物(约480bp)。

酶切片段大小与设计一致，初步证明重组质粒构建成功。

有关操作具体步骤如下：

1)质粒DNA抽提(使用Omega公司质粒抽提试剂盒)

[1]挑取平板上分隔良好的菌落转种于带相应抗生素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。

[2]取菌液分装于1.5mL离心管中，12000g离心3min，留取沉淀。

[3]每管加100μL Solution I悬浮，充分振荡混匀。

[4]加入100μL Solution II，轻柔混匀，冰水浴5min。

[5]加入250μL SolutionIII，轻振混匀，室温放置10min。

[6]4℃、12000g离心10min，将上清移至分离管中。

[7]12000g离心1min，倾倒收集管中的废液。

[8]加入500μL washing buffer于分离管中，同上离心并弃去收集管中的废液。重复洗涤一次。

[9]12000g离心1min，使乙醇完全挥发。

[10]将分离管置于另一干净EP管中并加入一定量的TE buffer，65℃水浴5min，12000g离心1min。

[11]取一定量洗脱液进行电泳，其余置于-20℃保存备用。

2)琼脂糖凝胶电泳：

1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，120-150mA，电泳20-40分钟。

50×TAE储存液配方：2.0mol/L Tris base，1.0mol/L NaAc，0.1mol/L Na₂EDTA；用冰醋酸调节pH8.3。

3)质粒DNA的酶切反应：

1μg质粒DNA

1μl 10×缓冲液(见Takara公司产品说明书)

1μl 限制性内切酶Kpn1(10u/μl)

1μl 限制性内切酶和BamH 1(10u/μl)

用双蒸水补齐至10μl

混合后37℃温育2-3小时。

4)琼脂糖电泳胶的目的DNA回收纯化：

在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带，移入1.5mL EP管。

加入Omega公司胶回收试剂盒的DNA binding buffer，65℃水浴使凝胶完全溶化并保持溶液pH在5.0~6.0之间。将溶胶液移入分离管，12000g离心1min，弃去收集管中的液体。

加入配套的Washing buffer，12000g离心1min，弃去收集管中的液体。重复洗涤1次。

12000g离心1min，分离管移置另一干净1.5mL EP管，加入一定体积的TE buffer，65℃孵育10min，12000g离心1min，取一定量电泳，UVP紫外扫描仪检测回收纯化效果。

5)连接反应(使用Takara公司连接试剂盒)

通过紫外分光光度计检测目的D N A片段和载体片段的浓度，根据外源片段与载体摩尔数比一般为1∶2～10的原则，设计连接反应体系如下：

目的DNA   1μL

质粒载体  1～2μL

ligation solution  5μL

ddH₂O  2～3μL

Total volume  10μL

16℃连接12-24h。

6)感受态菌的制备(CaCl₂法)

(1)无菌接种环蘸取-70℃冻存的细菌保种液，三线法划线接种于LB平板，37℃培养12～16小时。

(2)挑取单个菌落接种于2mL LB培养液中，37℃摇床培养12～16h。

(3)将过夜培养的DH5a按1％比例转种至LB培养液中，37℃摇床培养至OD₆₀₀为0.2～0.4时，8000g离心5min收集细菌。

(4)加入1mL预冷的0.1M CaCl₂重悬沉淀，冰水浴3h。4℃8000g离心5min，弃上清。加入100μL预冷的0.1M CaCl₂悬浮沉淀，冰水浴1h，备用。

7)连接产物转化

(1)取感受态菌液100μL，加入连接反应产物；冰水浴60min，42℃水浴热休克100s，迅速放置冰水浴1～2min。

(2)加100μL LB培养液，37℃摇床培养1h。

(3)以8000g离心10min，吸弃100μL上清后混匀沉淀，各取50μL涂布平板，37℃孵箱培养过夜。

高效表达融合蛋白工程菌的构建及筛选

将含IL-24或hsIL-24基因的重组质粒pET-32a(+)转化大肠杆菌BL21(DE)并提取质粒酶切鉴定。基因工程大肠杆菌BL21的感受态菌制备、转化及重组菌的质粒抽提酶切鉴定同前。

取鉴定无误的重组菌接种于3mL含Amp的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。次日将过夜培养的重组工程菌按1％的比例转种于20mL含Amp的LB培养液中，37℃摇床培养2.5小时，以IPTG诱导4小时，SDS-PAGE检测融合蛋白的表达形式和表达量，筛选高效表达菌株。

诱导表达及表达方式鉴定结果如附图4所示：

泳道1：工程菌pET32a(+)-hIL-24/BL21诱导后(4hr)；

泳道2：工程菌pET32a(+)hIL-24/BL21诱导前(0hr)；

泳道3：工程菌pET32a(+)-hsIL-24/BL21诱导后(4hr)；

泳道4：工程菌pET32a(+)-hsIL-24/BL21诱导前(0hr)；

泳道5：空质粒菌pET32a(+)诱导后(4hr)；

泳道6：空质粒菌pET32a(+)诱导前(0hr)；

泳道7：蛋白质分子量标准(Marker)。

基因重组菌经过诱导后在分子量35KDa处有增加的蛋白表达条带，与目的蛋白分子量一致。

实施例3基因重组菌的发酵

发酵工艺如下：

采用德国B.Bron 10L发酵罐，发酵过程中种子菌10％比例接种，保持70％溶氧、温度37℃、pH7.0，在A600未达到2时不加补料，之后每0.5h流加补料一次使葡萄糖、胰化蛋白胨和8％酵母抽提物的终浓度分别为0.5％、0.2％、和0.2％。在第4次补料后待葡萄糖浓度降为0.1％时加入IPTG 500μmol/L诱导4h收菌。

发酵过程在级联溶氧控制的分批培养基础上，流加补料。

发酵过程所用培养基为改良M9CAA培养基，在M9-CAA的基础上添加0.6％酵母浸出液和2mg/L ZnCl₂·4H₂O、2mg/LCoCl₂·4H₂O、4mg/L FeSO₄·16H₂O、5mg/L H₃BO₃、1.6mg/LMnCl₂·4H₂O、4mg/LCuSO₄而成。

发酵结束后回收菌液，4℃离心(8000g)15分钟。吸弃上清，收集细菌，称重后冻存备用。

结果：10L发酵菌液可以收获细菌湿重800克。

实施例4目的蛋白hIL-24或hsIL-24的制备和纯化

1.包涵体提取：将高效表达的菌体200-500g以TE缓冲液1∶10(W/V)比例悬浮，4℃预冷后采用细胞匀浆机使其混合均匀。采用高压均质机在压力为40-70Mpa的条件下进行破菌(共破菌4~6次)，破菌完毕后，取少量菌液涂片染色，显微镜下观察细胞的完整性，确保细胞破碎完全，随后以500g离心25min，弃沉淀，再以15,000g离心40min，弃上清收集沉淀。以1∶10(W/V)的比例分别用洗涤液A和B各洗涤2次。洗涤条件为：4℃搅拌20min，15,000g离心40min，收集包涵体沉淀；最后将包涵体用包涵体溶解液以1∶10(W/V)的比例混合，4℃搅拌3h，15,000g离心45min，取上清备用。

包涵体提取所用缓冲液：

1)TE缓冲液：20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH 7.5

2)包涵体洗涤液A：5mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、1％Triton X-100，pH 7.5

3)包涵体洗涤液B：20mmol/L Tris，pH 7.5

4)包涵体溶解液：1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、2mol/L尿素(pH 9.0)

2.蛋白复性：在4℃搅拌的条件下，缓慢滴加10-20倍体积的复性缓冲液I，4℃搅拌复性24h，再假如10-20倍体积的复性缓冲液II，充分混匀后，4℃搅拌复性24h。复性缓冲液I的配方为10mmol/L Tris-Hcl，0.9mmol/L谷胱甘肽氧化型，0.8mmol/L谷胱甘肽还原型，pH 8.5。复性缓冲液II的配方为10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0。

3.超滤除盐浓缩：将上述复性溶液4℃下进行超滤，膜孔径为10KDa，体积浓缩100-400倍。再用10mmol/L Tris-HCL，pH 8.0将其稀释至蛋白浓度为2mg/ml-5mg/ml左右。

4.IL-24或hsIL-24的制备：按蛋白重量比1∶300-1∶400加入肠激酶，在16℃-25℃下消化融合蛋白，时间为24-32h，制备hIL-24或hsIL-24蛋白。消化缓冲液的配方为10mmol/L Tris-HCl，pH8.0。肠激酶消化融合蛋白的效果见图5：

泳道1：工程菌pET32a(+)-hIL-24/BL21诱导表达融合蛋白Trx-hIL-24；

泳道2，3，4：融合蛋白Trx-hIL-24肠激酶消化0，16，24hr；

泳道5，6：肠激酶消化后混合物经亲和层析纯化收集洗脱峰部分；

泳道7，8：肠激酶消化后混合物经亲和层析纯化收集流穿峰部分；

泳道9：流穿峰部分浓缩10倍；

泳道M：蛋白质分子量标准(Marker)。

融合蛋白Trx-hIL-24或Trx-hsIL-24被肠激酶消化成两个多肽段，一个是Trx段(理论分子量为20KDa)含有6个His的纯化标签，在镍离子亲和层析柱上能被亲和吸附，而后被洗脱下来，出现在洗脱峰中；一个是IL-24段(理论分子量为18.3KDa)不含有6个His的纯化标签，不会吸附到镍离子亲和层析柱上，出现在流穿峰中。实验结果与设计一致，且Trx和hIL-24两部分水充分解，经一步镍离子亲和层析可以获得纯度大于95％的hIL-24。

5.镍离子亲合柱纯化：XK16/10Chelating Sepharose Fast Flow镍离子亲合柱层析填料：上样缓冲液为20mmol/L Tris-HCL，pH 8.0；上样蛋白总量约为30mg；洗脱缓冲液为20mmol/L Tris-HCL，20mmol/L咪唑，pH 8.0。上柱后用上样缓冲液流洗，待流穿峰出现并洗至基线后，30min，0-50％梯度洗脱。分别收集流穿峰和洗脱峰的馏分，亲合纯化过程见图6：

Peak₀：流穿峰

Peak₁：洗脱峰

融合蛋白Trx-hIL-24或Trx-hsIL-24经肠激酶消化得到的hIL-24或hsIL-24，用镍离子亲和层析柱一步法纯化，均在流穿峰中流出，获得95％以上的纯度，目标蛋白的回收率在70％左右。

6.Superdex凝胶过滤层析纯化：用凝胶过滤柱Superdex纯化，用凝胶过滤平衡缓冲液平衡。

7.纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE，检定其纯度。Lowry法检测蛋白浓度。

实施例6目的蛋白hIL-24或hsIL-24诱导肿瘤细胞凋亡的活性实验

抗肿瘤活性实验所用肿瘤细胞为MCF-7(乳癌细胞，购于ATCC)。

肿瘤细胞培养基为含有1％小牛血清的PRIM1640(GIBCO公司)，胰蛋白酶(为promega公司产品)。

抗肿瘤活性实验涉及蛋白hIL-24或hsIL-24，用NaOH调节pH值为7.2备用。

抗肿瘤活性实验包括三个方面：

i.MTT比色法测定肿瘤细胞增殖情况：对数生长期细胞接种于96孔板中，待细胞数量达到10¹-10⁴个/ml，用不同剂量的hIL-24或hsIL-24蛋白处理24h后，每孔加入25μl MTT溶液(终浓度1mg/ml)，37℃下继续培养4h，每孔再加入100μl 20％DMF，37℃放置20h，用微孔酶标仪在570nm处测定其光吸收值(OD值)。96孔板上加入的蛋白浓度分别为1、2、4、8、16及32mg/L，MTT比色法测定不同剂量的蛋白hIL-24或hsIL-24对MCF-7细胞增殖的影响。结果表明蛋白hIL-24或hsIL-24对乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制呈剂量依赖性，两种蛋白没有明显差异。实验组(hIL-24)与阴性对照组具有显著的差异(P＜0.05)，见图7：MTT试验结果显示，不同剂量的hIL-24或hsIL-24蛋白作用24h后，对MCF-7细胞的生长抑制随处理浓度的增加而增加，8mg/L处理组时已达50％，具有明显的细胞毒性作用。

ii.DNA ladder实验：对数生长期细胞10⁶-10⁷个/ml，用30ng/ml的蛋白hIL-24或hsIL-24处理24h后，用0.25％胰酶消化后，PBS或生理盐水洗一次，1000-2000g离心1-2分钟，弃上清，收集细胞。样品处理完毕后，每1毫升样品裂解液中加入5微升蛋白酶K，混匀。对于上述处理好的样品，每5毫克组织或者106个细胞中加入500微升添加了蛋白酶K的样品裂解液，Vortex混匀，充分裂解组织或细胞。50℃水浴消化过夜。加入500微升Tris平衡苯酚抽提样品。加入Tris平衡苯酚后可以Vortex，或剧烈颠倒或晃动10-30秒，以使酚相和水相充分相互作用。然后4℃，约12000g离心5分钟。吸出酚相及中间相(可以吸除少量靠近中间相的水相液体)，剩余的水相用等体积Tris平衡酚再抽提一次。吸出酚相及中间相(可以吸除少量靠近中间相的水相液体)，剩余的水相用等体积氯仿再抽提一次吸出约300微升上清液，加入60微升10M醋酸铵和600微升无水乙醇，颠倒数次混匀，此时可见DNA沉淀产生。-20℃冻存1小时，以充分沉淀小片断DNA。12,000g离心10分钟，弃上清。加入70％乙醇洗涤DNA沉淀一次。尽量吸除残余的乙醇，待看不到明显的液体，立即加入50-100微升TE溶解DNA。取部分抽提得到的基因组DNA，1.5％-1.8％琼脂糖凝胶中进行电泳分析如果细胞发生凋亡，就观察到典型的DNA ladder，见图8：

泳道1：阴性对照组

泳道2：hIL-24实验组

泳道3：hsIL-24实验组

泳道4：阳性对照组

在DNA琼脂糖凝胶电泳中，hIL-24或hsIL-24诱导MCF-7细胞的DNA均出现典型的梯状条带(DNA ladder)，与对照细胞有明显区别。由于DNA ladder的出现是细胞凋亡的特征性变化，进一步证实sTRAIL41～281已诱导了经典的细胞凋亡。

iii.流式细胞仪定量分析肿瘤细胞凋亡对数生长期细胞10⁶-10⁷个/ml，用不同剂量的hIL-24或hsIL-24蛋白处理24h后，先用0.25％的胰酶消化，用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10ul，室温避光30min，再加入PI(50ug/ml)5ul，避光反应5min后，加入400ul BindingBuffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1h)，同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。结果表明蛋白hIL-24或hsIL-24对乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制呈剂量依赖性，两种蛋白没有明显差异，实验组与阴性对照组具有显著的差异，见图9。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>酵母细胞表达人白细胞介素24的方法

<160>3

<210>1

<211>473

<212>DNA

<213>人白细胞介素24

<400>1

cagggccaag aattccactt tgggccctgc caagtgaagg gggttgttcc ccagaaactg    60

tgggaagcct tctgggctgt gaaagacact atgcaagctc aggataacat cacgagtgcc    120

cggctgctgc agcaggaggt tctgcagaac gtctcggatg ctgagagctg ttaccttgtc    180

cacaccctgc tggagttcta cttgaaaact gttttcaaaa actaccacaa tagaacagtt    240

gaagtcagga ctctgaagtc attctctact ctggccaaca actttgttct catcgtgtca    300

caactgcaac ccagtcaaga aaatgagatg ttttccatca gagacagtgc acacaggcgg    360

tttctgctat tccggagagc attcaaacag ttggacgtag aagcagctct gaccaaagcc    420

cttggggaag tggacattct tctgacctgg atgcagaaat tctacaagct ctg           473

<210>2

<211>473

<212>DNA

<213>具有一个碱基突变的人白细胞介素24

<400>2

cagggccaag aattccactt tgggccctgc caagtgaagg gggttgttcc ccagaaactg    60

tgggaagcct tctgggctgt gaaagacact atgcaagctc aggataacat cacgagtgcc    120

cggctgctgc agcaggaggt tctgcagaac gtctcggatg ctgagagctg ttaccttgtc    180

cacaccctgc tggagttcta cttgaaaact gttttcaaaa accaccacaa tagaacagtt    240

gaagtcagga ctctgaagtc attctctact ctggccaaca actttgttct catcgtgtca    300

caactgcaac ccagtcaaga aaatgagatg ttttccatca gagacagtgc acacaggcgg    360

tttctgctat tccggagagc attcaaacag ttggacgtag aagcagctct gaccaaagcc    420

cttggggaag tggacattct tctgacctgg atgcagaaat tctacaagct ctg           473

<210>3

<211>158

<212>PRT

<213>人白细胞介素24

<400>3

Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly Val

1                5                      10                   15

Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr Met

             20                     25                   30

Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu Val

         35                     40                   45

Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr Leu

    50                    55                    60

Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg Thr

65                 70                    75                    80

Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe

                  85                    90                   95

Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe

              100                    105                  110

Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala

          115                   120                  125

Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu

    130                   135                   140

Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu

145                   150                   155

Claims (6)

1. 一种基因工程人白细胞介素24的表达载体，其特征在于，该载体为含有人白细胞介素24基因序列hIL-24或人白细胞介素24基因突变序列hsIL-24的质粒载体pET32a(+)，且hIL-24或hsIL-24编码序列位于pET32a(+)载体上Kpn1和BamH1酶切位点之间，该载体为pET32a(+)-hIL-24或pET32a(+)-hsIL-24；克隆hIL-24或hsIL-24基因的引物为：

P1  5’-GGTACCGACGACGACGACAAGGCCCAGGGCCAAGAATT Kpn1

P2  5’-GGATCCTTACAGAGCTTGTAGAATTTCTG          BamH I

为避免在N端引入Ala和Met两个多余的氨基酸，在设计引物时将肠激酶识别位点的编码碱基，即GACGACGACGACAAG，加入到上游引物中；

其中，hsIL-24的序列见序列表2。

2. 一种基因工程菌，其特征在于，它被权利要求1所述的载体所转化。

3. 如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，它是大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE)。

4. 一种制备人白细胞介素24的方法，其特征在于，在25℃-37℃培养和IPTG诱导条件下大肠杆菌pET32a(+)-hIL-24/BL21或pET32a(+)-hsIL-24/BL21表达融合蛋白Trx-hIL-24或Trx-hsIL-24，经包涵体洗涤、包涵体溶解和融合蛋白复性、肠激酶消化和纯化得到hIL-24或hsIL-24；

包括以下步骤：

(1)重组工程菌pET32a(+)-hIL-24/BL21或pET32a(+)-hsIL-24/BL21用发酵罐发酵；

(2)离心收集细菌；

(3)洗涤和溶解包涵体；

(4)包涵体复性；

(5)超滤浓缩；

(6)融合蛋白肠激酶消化；

(7)亲和层析纯化；

(8)凝胶过滤层析除盐；

所述包涵体溶解液配方如下：10mmol/L Tris-Hcl，5mmol/L EDTA，2mol/L尿素，pH9.0；

所述复性步骤如下：

在4℃搅拌的条件下，缓慢滴加10-20倍体积的复性缓冲液I，4℃搅拌复性24h，再加入10-20倍体积的复性缓冲液II，充分混匀后，4℃搅拌复性24h；复性缓冲液I的配方为10mmol/L Tris-Hcl，0.9mmol/L谷胱甘肽氧化型，0.8mmol/L谷胱甘肽还原型，pH8.5；复性缓冲液II的配方为10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0。

5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，超滤浓缩100-400倍。

6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，融合蛋白肠激酶消化步骤如下：

用消化缓冲液调整总蛋白浓度为2-8mg/ml，按蛋白重量比1∶300-1∶400加入肠激酶，在16℃-25℃下消化融合蛋白，时间为24-32h，制备hIL-24或hsIL-24蛋白；消化缓冲液的配方为10mmol/L Tris-HCl，pH8.0。

Images