CN100400059C

CN100400059C - 一种注射剂的指纹图谱鉴别方法

Info

Publication number: CN100400059C
Application number: CNB2005101342990A
Authority: CN
Inventors: 肖伟; 戴翔翎; 凌娅; 王振中; 毕宇安; 刘涛; 梁慧
Original assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2004-12-17
Filing date: 2005-12-16
Publication date: 2008-07-09
Anticipated expiration: 2025-12-16
Also published as: CN1813983A

Abstract

本发明公开一种由青蒿1000～1400重量份，金银花600～900重量份，栀子500～700重量份制成的中药注射剂的指纹图谱测定方法，该方法包括液相色谱法测定以栀子苷峰为参照物峰记录得指纹图谱和/或气相色谱法测定以与樟脑峰相对保留时间为0.74～0.75的色谱峰为参照物峰记录得供试品指纹图谱的检测方法。本发明指纹图谱的检测方法进一步加强了热毒宁注射剂的质量控制。

Description

一种注射剂的指纹图谱鉴别方法

发明领域

本发明涉及一种中药组合物的质量控制方法，特别涉及一种中药组合物的注射剂的指纹图谱鉴别方法。

背景技术

目前中药的质量标准很不规范和完善，质量分析和评价的手段还很落后，无法准确的反映现有中药的质量状况，成为中药走出国门，走向世界的障碍。中成药指纹图谱是借鉴法医学中指纹鉴定的概念，将适当处理后的药材或药品，用一定的分析手段来得到能够反映该药材或药品特征的共有的峰图谱。通过对共有峰图谱的分析来辨别、鉴定药材或药品的质量，确保药品的质量稳定可控。

专利名称为<具有解热作用的中药组合物及其制备方法和质量控制方法>(200410000134.X)公开了一种具有解热、抗病毒、抗菌作用的中药物组合物是由青蒿1000～1400重量份，金银花600～900重量份，栀子500～700重量份制成，本发明即是为了进一步加强该组合物注射剂质量管理，应用液相指纹图谱测定方法和气相指纹图谱测定方法控制该注射剂的质量，从而能够更全面、有效地控制制剂质量。

发明内容

本发明目的在于公开一种中药组合物的注射剂的指纹图谱鉴别方法，特别是一种青蒿、金银花和栀子制成具有解热作用中药组合物的指纹图谱鉴别方法。

本发明通过如下技术方案实现的：本发明指纹图谱鉴别方法包括下述液相色谱法和/或气相色谱法。

液相色谱法测定：

取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得参照物溶液；取药物组合物注射剂1ml，置25ml量瓶中，加40-60％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定；其中色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液系统梯度洗脱，检测波长为225nm；理论板数按参照物栀子苷峰计算，应不低于6000，以栀子苷峰为参照物峰记录60分钟得供试品指纹图谱；

流动相甲醇-0.1％磷酸水溶液系统的梯度洗脱程序为：

时间(分钟) 甲醇(％) 0.1％磷酸(％)

0 20 80

50 60 40

60 60 40

，流速为0.8ml/min。

供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算软件计算，相似度大于0.8，或优选大于0.9，本发明指纹图谱的(峰号)相对保留时间和(峰号)峰面积比值如下：(峰号)相对保留时间，(1)0.286±20％、(2)0.398±20％、(3)0.458±20％、(4)0.748±20％、(5)0.804±20％、(6)0.848±20％、(7)0.915±20％、(8)0.940±20％、(S)1、(9)1.372±20％、(10)1.592±20％、(11)1.625±20％、(12)1.890±20％、(13)1.941±20％；(峰号)峰面积比值：(3)0.34-0.56、(4)0.83-1.24、(5)0.32-0.53、(S)1。(参见附图1)：

气相色谱法测定：

取樟脑对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.2-0.4mg的溶液，精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液10ml置20ml顶空瓶中，轧盖，即得对照品溶液；精密吸取本药物组合物注射液10ml，置20ml顶空瓶中，轧盖，即得供试品溶液；气相色谱顶空进样法测定；其中顶空恒温箱温度90-95℃，传输管温度105-115℃，进样环温度115-125℃，平衡时间：50-80min；用5-10％二苯基∶90-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱；进样口温度：200-250℃；检测器温度：200-250℃；顶空进样测定，分流比：1∶1；程序升温：初始温度50℃，保持4-8分钟，以每分钟10℃升至80℃，保持8-12分钟，以每分钟10℃升至130℃，保持5-8分钟，再以每分钟5℃升至240℃，保持8-12分钟，测定；载气流速：2.0ml/min；理论板数按对照品樟脑峰计算，应不低于30000；以与樟脑峰相对保留时间为0.74～0.75的色谱峰为参照物峰，记录60分钟得供试品指纹图谱。

本发明供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算软件计算，相似度大于0.8，或优选大于0.9，本发明指纹图谱的(峰号)相对保留时间和(峰号)峰面积比值如下：(峰号)相对保留时间，(1)0.199±20％、(2)0.650±20％、(3)0.818±20％、(4)0.898±20％、(S)1、(5)1.343±20％、(6)1.461±20％(7)1.572±20％；(峰号)峰面积比值，(3)0.09～0.22、(4)0.50～0.93、(S)1。(参见附图2)

本发明上述所用的计算软件可以选用药典会推荐的″中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件″计算。

本发明药物组合物注射剂是按照200410000134.X中的技术方案制备的，其中方法一包括如下步骤：

取青蒿1000-1400重量份金银花600-900重量份栀子500-700重量份。上述本发明药物组合物的原料药优选配比为：青蒿1250重量份、金银花750重量份、栀子600重量份或青蒿1100重量份金银花800重量份栀子700重量份；

以上三味，金银花、青蒿加13-18倍量水浸泡2-4小时，加热煎煮蒸馏1-3次，每次1-3小时，同时收集挥发油，备用。

取青蒿、金银花挥发油，加入5-7重量份波洛沙姆108研磨混匀后，加入900体积份(本文中重量份/体积份为g/ml)注射用水中，搅拌使澄明，再加入上述工艺中金银花、青蒿干膏粉，栀子干膏粉搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调PH值为7.5～8.0，加注射用水至1000体积份。用G1垂熔漏斗滤过，灌封，100℃流通蒸汽灭菌，即得注射液，每支10ml；还可以在灌封、灭菌后通过冷冻干燥法制成冻干粉针剂；或在注射用水中加入金银花、青蒿干膏粉，栀子干膏粉时，再加入总干膏粉的0.2～5倍的支架剂，如葡萄糖或甘露醇或氯化钠等，溶解，调PH值为7.5～8.0，过滤、灭菌，分装，冷冻干燥，制成粉针剂。或通过常规工艺，制成其他注射剂型如混悬液型注射剂、输液剂等。

其中方法二包括如下步骤：

金银花、青蒿干膏粉的制备：金银花加水提取1-3次(80-100℃)，每次1-2小时，加水量为9-16倍，提取液另置；青蒿加3-6倍量水润透后，水蒸气蒸馏5-8小时提取挥发油，挥发油另置，提取金银花与青蒿提取液，滤过，减压浓缩至相对密度为1.10(60℃)，加入乙醇使含醇量为70-80％，静置20-36小时，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.20(60℃)，用盐酸调PH值为1.8-2.3左右，用等量乙酸乙酯萃取9-12次，取萃取液，减压浓缩至无乙酸乙酯味，倾出浓缩液，真空干燥，得金银花、青蒿干膏粉；

栀子干膏粉的制备：栀子粉碎成粗粉，用5-8倍量70-90％乙醇加热回流1-3次，每次1-2小时，合并药液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至1∶1，用盐酸调Ph为2.5-3.5，100℃加热1-2小时，加入1％药材量的固体石蜡，搅匀，冷藏10-14小时，滤过，滤液用等量的正丁醇萃取5-7次，减压浓缩到无正丁醇味，真空干燥，得栀子干膏粉。

取注射用水800-1200体积份煮沸，投入上述制得两中间体，搅匀，沸腾3-7分钟后，冷却至室温，冷藏20-36小时，滤过，滤液调PH为2-3，加入1％活性炭，煮沸8-14分钟，冷藏20-36小时后过滤，滤液，加热至沸腾，加热过程中调PH为5.05，沸腾9-13分钟冷却到室温，冷藏40-58小时，滤过，加入0.3-0.8重量份亚硫酸氢钠，定容1000体积份，搅拌取溶液50体积份，加热到65℃加入吐温-80 3-5体积份，搅匀，加入挥发油，搅匀，滤过超滤(分子量为3万、1万)，过0.22μm的微孔滤膜，分装，流通蒸汽灭菌35-50min。

本发明所述体积份/重量份与ml/g相对应。

附图说明

图1为本发明液相色谱法测定图；

图2为本发明气相色谱法测定图；

在液相色谱法的参照物溶液的制备中，由于热毒宁注射液(本药物组合物注射液)主要有效成分为栀子苷、绿原酸等，上述两主要成分均有对照品，纯度也符合含量测定要求。选择栀子苷作为参照物；供试品溶液的制备中，采用注射液直接进样的方法，经实验研究，直接进样的方法所得到的指纹图谱色谱峰峰面积较大，分离度不好。后经试验优选，采用50％甲醇稀释后进样，所得到得指纹图谱较为理想，各色谱峰分离度较好；延长测试时间1倍至2小时，结果未见滞后峰出现。

在气相色谱法的参照物溶液的制备中，由于制剂中加入了青蒿及金银花的挥发油，所以采用气相色谱法测定其挥发性成分的指纹图谱，以达到全面控制成品质量的目的；热毒宁注射液挥发性成分主要由青蒿挥发油及金银花挥发油组成，成分较为复杂，通过试验研究，挥发油中可测出的已知成分为樟脑，且能得到其标准品，但樟脑的色谱峰在多批青蒿药材及制剂色谱图中，其峰面积变化很大，难以选其做为参照峰，所以用它进行定位，确定在各指纹图谱中出峰情况相对稳定且峰面积较高的色谱峰为参照物峰，其保留时间为10min左右，与樟脑峰相对保留时间为0.74～0.75，选择其做为参照物峰进行分析，计算相似度；结果能够较真实地反应成品中挥发性成分的情况。供试品溶液的制备中，由于其青蒿及金银花的挥发油量较少，采用直接进样气相色谱法，难以测出其挥发性成分，若进行有机溶剂萃取富集的方法，操作繁琐且损失较大，难以真实反映制剂中挥发性成分的情况，所以试验采用气相色谱顶空进样法，进样量为1ml，增大了进样体积，使样品不须富集处理便能很好的进行分析。该方法最大限度地保留了样品中的化学成分，客观准确地对成品中挥发性成分进行分析；延长测试时间1倍至2小时，结果未见滞后峰出现。

液相色谱法测定与气相色谱法测定是在热毒宁注射液(本药物组合物的注射液)进行临床研究基础上，对热毒宁注射液液相指纹图谱测定方法进行了研究及优选；其中对测定指纹图谱的仪器，色谱柱、流动相、检测波长等条件进行了优选，建立了新的液相指纹图谱测定条件并进行了方法学考察，根据十批大生产样品制订了热毒宁注射液液相指纹图谱标准。另外，增加了制剂中挥发性成分的指纹图谱测定，采用气相色谱顶空进样法测定，经过试验研究，确定了测定方法，并进行了方法学考察，根据十批大生产样品制订了热毒宁注射液气相指纹图谱标准，从而能够更全面、有效地控制制剂质量。

下面实验例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1液相色谱测定的波长选择实验

根据紫外光谱可见该制剂中主要成分栀子苷和绿原酸的最大吸收波长分别为235nm和327nm。为了能更全面的反映制剂中的成分，检测了225、235、270、245、327nm五个波长的下的指纹图谱，235nm及327nm分别为栀子苷和绿原酸的最大吸收波长，在这两个波长下的制剂指纹图谱中栀子苷及绿原酸虽有较大的吸收，但其余色谱峰则相对偏小，不能全面反映制剂所含成分的情况，经比较分析，确定225nm为制剂指纹图谱的检测波长，在该波长下的制剂指纹图谱中，除已知成分栀子苷和绿原酸能够较好的检测出外，其它成分指纹峰也能被较好地体现，且各峰分离度好。

实验例2液相色谱测定的稳定性试验

取批号为021102的热毒宁注射液5支，按技术方案中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，每隔3小时测定一次其指纹图谱，共测6次，所得指纹图谱为对照计算相似度，相似度结果均不小于0.99，表明供试品溶液15小时内成分是稳定的。

表1分析结果

实验例3液相色谱测定的精密度试验

取批号为021102的热毒宁注射液5支，按技术方案中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，连续进样6次进行测定。测定结果见表2、3。结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(占总峰面积5％以上)的峰面积基本一致(RSD＜3％)，又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均不小于0.99，表明该方法精密度良好。

表2热毒宁注射液液相指纹图谱精密度考察结果

(占总峰面积5％以上主要峰的保留时间)

表3热毒宁注射液液相指纹图谱精密度考察结果

(占总峰面积5％以上的主要峰的保留时间)

表4分析结果

实验例4液相色谱测定的重复性试验

取批号为021102的热毒宁注射液5支，按技术方案中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，同法制备供试品溶液6份，依法测定，结果计算相似度，相似度结果均不小于0.98。

表5分析结果

根据以上方法学考察结果，表明该方法测定热毒宁注射液的指纹图谱，精密度、重复性、稳定性均较好，能够准确测定该制剂的指纹图谱。

实验例5成品的测定及对照指纹图谱确定试验

十批成品均由江苏康缘药业股份有限公司生产，批号分别为：021102、021108、021114、030103、030121、030204、030210、030216、030222、030228。按本发明中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，依法测定，结果计算相似度，用相似度软件中以这十批供试品指纹图谱为基础获得“共有模式”作为对照指纹图谱，结果如下：

表6分析结果

生成对照指纹图谱为，根据十批成品指纹图谱与对照指纹图谱计算相似度，其结果均大于0.90，根据大生产实际及为了有效、全面控制产品质量，规定热毒宁注射液指纹图谱与对照指纹图谱经相似度软件计算，相似度应大于0.90。

实验例6气相色谱测定的稳定性试验

取批号为021102的热毒宁注射液10支，置100ml干燥量瓶中，混匀，按本发明中方法每隔3小时精密吸取10ml置20ml顶空瓶中，测定，共测定6次，相似度结果均不小于0.99，表明供试品溶液15小时内成分是稳定的。

表7分析结果

实验例7气相色谱测定的精密度试验

取批号为021102的热毒宁注射液10支，置100ml干燥量瓶中，混匀，分别精密吸取10ml，置6个20ml顶空瓶中，连续进样6次进行测定。测定结果见表8、9。结果表明，供试液中各共有峰的保留时间及主要峰(占总峰面积3％以上)的峰面积基本一致(RSD＜3％)，又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均不小于0.99，表明该方法精密度良好。

表8热毒宁注射液气相指纹图谱精密度考察结果

(占总峰面积3％以上主要峰的保留时间)

表9热毒宁注射液气相指纹图谱精密度考察结果

(占总峰面积3％以上的主要峰的峰面积)

表10分析结果

实验例8气相色谱测定的重复性试验

取批号为021102的热毒宁注射液10支，置100ml干燥量瓶中，混匀，分别精密吸取10ml，置6个20ml顶空瓶中，进样测定，测定结果经计算相似度，相似度结果均不小于0.99，符合指纹图谱的技术要求。表明该方法测定热毒宁注射液的指纹图谱，精密度、重复性、稳定性均较好，能够准确测定热毒宁注射液的指纹图谱。

表11分析结果

具体实施方式如下

实施例1：热毒宁注射液液相指纹图谱测定方法

色谱条件与系统适应性试验：Agilent 1100液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：phenomenex luna C₁₈，4.6×250mm，5μm)；甲醇-0.1％磷酸水溶液系统为流动相，洗脱程序为：

时间(分钟) 甲醇(％) 0.1％磷酸(％)

0 20 80

50 60 40

60 60 40

流速为0.8ml/min；检测波长为225nm。理论板数按参照物(栀子苷)峰计算，应不低于6000。

参照物溶液的制备：取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50g的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品1ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法：精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定。

供试品指纹图谱的主要特征，(峰号)相对保留时间：(1)0.286、(2)0.398、(3)0.458、(4)0.748、(5)0.804、(6)0.848、(7)0.915、(8)0.940、(S)1、(9)1.372、(10)1.592、(11)1.625、(12)1.890、(13)1.941；(峰号)峰面积比值：(3)0.56、(4)0.83、(5)0.53、(S)1。

供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算机软件计算，相似度大于0.9。(计算软件为中国药品生物检定所、浙江大学、空军雷达学院所提供的中药色谱图分析和数据管理系统。)

实施例2：热毒宁注射液气相指纹图谱测定方法

色谱条件与系统适应性试验Agilent 6890气相色谱仪，气相色谱顶空进样法测定，顶空恒温箱温度95℃，传输管温度110℃，进样环温度125℃，平衡时间：60min；用5％二苯基-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱(HP-5：30m×0.32mm×0.25μm)；进样口温度：240℃；检测器温度(FID)：240℃；顶空进样测定，分流比：1∶1；程序升温：初始温度50℃，保持5分钟，以每分钟10℃升至80℃，保持10分钟，以每分钟10℃升至130℃，保持6分钟，再以每分钟5℃升至240℃，保持9分钟，测定；载气流速：2.0ml/min；理论板数按对照品(樟脑)峰计算，应不低于30000。

对照品溶液的制备：取樟脑对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.2mg的溶液，精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液10ml置20ml顶空瓶中，轧盖，即得。

供试品溶液的制备：取本品5支，混匀，精密吸取10ml，置20ml顶空瓶中，轧盖，即得。

测定法：顶空进样测定。

供试品指纹图谱的主要特征：(峰号)相对保留时间：(1)0.199、(2)0.650、(3)0.818、(4)0.898、(S)1、(5)1.343、(6)1.461(7)1.572；(峰号)峰面积比值：(3)0.09、(4)0.93、(S)1

以与樟脑峰相对保留时间为0.74～0.75的色谱峰为参照物峰，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算软件计算，相似度大于0.9。(计算软件为中国药品生物检定所、浙江大学、空军雷达学院所提供的中药色谱图分析和数据管理系统。)

实施例3：热毒宁注射液双相指纹图谱测定方法

液相色谱测定：色谱条件与系统适应性试验：Agilent 1100液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：phenomenex luna C₁₈，4.6×250mm，5μm)；甲醇-0.1％磷酸水溶液系统为流动相，洗脱程序为：

时间(分钟) 甲醇(％) 0.1％磷酸(％)

0 20 80

50 60 40

60 60 40

参照物溶液的制备：取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。供试品溶液的制备：取本品1ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。测定法：精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定。

气相色谱法测定：色谱条件与系统适应性试验Agilent 6890气相色谱仪，气相色谱顶空进样法测定，顶空恒温箱温度95℃，传输管温度110℃，进样环温度125℃，平衡时间：60min；用5％二苯基-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱(HP-5：30m×0.32mm×0.25μm)；进样口温度：240℃；检测器温度(FID)：240℃；顶空进样测定，分流比：1∶1；程序升温：初始温度50℃，保持5分钟，以每分钟10℃升至80℃，保持10分钟，以每分钟10℃升至130℃，保持6分钟，再以每分钟5℃升至240℃，保持9分钟，测定；载气流速：2.0ml/min；理论板数按对照品(樟脑)峰计算，应不低于30000。对照品溶液的制备：取樟脑对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.2mg的溶液，精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液10ml置20ml顶空瓶中，轧盖，即得。供试品溶液的制备：取本品5支，混匀，精密吸取10ml，置20ml顶空瓶中，轧盖，即得。测定法：顶空进样测定。

供试品指纹图谱的主要特征：(峰号)相对保留时间：(1)0.199、(2)0.650、(3)0.818、(4)0.898、(S)1、(5)1.343、(6)1.461(7)1.572；(峰号)峰面积比值：(3)0.09、(4)0.93、(S)1。以与樟脑峰相对保留时间为0.74～0.75的色谱峰为参照物峰，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算软件计算，相似度大于0.9。(计算软件为中国药品生物检定所、浙江大学、空军雷达学院所提供的中药色谱图分析和数据管理系统。)

Claims

1.一种由青蒿1000～1400重量份，金银花600～900重量份，栀子500～700重量份制成的中药注射剂的指纹图谱测定方法，其特征在于该方法为：

液相色谱法测定，取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得参照物溶液；取药物组合物注射剂1ml，置25ml量瓶中，加40～60％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定；其中色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液系统梯度洗脱，检测波长为225nm；理论板数按参照物栀子苷峰计算，应不低于6000，以栀子苷峰为参照物峰记录60分钟得指纹图谱；

其中流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液系统进行梯度洗脱，0到50分钟时甲醇体积比由20％线性上升到60％，0.1％磷酸体积比由80％线性下降到40％；50分钟到60分钟时按甲醇与0.1％磷酸溶液体积比维持60％∶40％的比例关系进行洗脱，总洗脱时间为60分钟；流速为0.8ml/min。

2.如权利要求1所述的指纹图谱测定方法，其特征在于该方法为：

液相色谱法测定，取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得参照物溶液；取药物组合物注射剂1ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定；其中色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，250×4.5mm，5μm；流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液系统梯度洗脱，检测波长为225nm；理论板数按参照物栀子苷峰计算，应不低于6000，记录60分钟得供试品指纹图谱。

3.如权利要求1或2所述的指纹图谱测定方法，其特征在于该方法中供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度经计算大于0.8，对照指纹图谱的相对保留时间和峰面积比值如下：

各峰的相对保留时间为：1号峰：0.286±20％、2号峰：0.398±20％、3号峰：0.458±20％、4号峰：0.748±20％、5号峰：0.804±20％、6号峰：0.848±20％、7号峰：0.915±20％、8号峰：0.940±20％、参照峰：1、9号峰：1.372±20％、10号峰：1.592±20％、11号峰：1.625±20％、12号峰：1.890±20％、1 3号峰：1.941±20％；各峰的峰面积比值：3号峰：0.34-0.56、4号峰：0.83-1.24、5号峰：0.32-0.53、参照峰：1。

4.如权利要求3所述的指纹图谱测定方法，其特征在于该方法中供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度大于0.9。

5.一种由青蒿1000～1400重量份，金银花600～900重量份，栀子500～700重量份制成的中药注射剂的指纹图谱测定方法，其特征在于该方法为：

气相色谱法测定，取樟脑对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.2～0.4mg的溶液，精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液10ml置20ml顶空瓶中，轧盖，即得对照品溶液；精密吸取本药物组合物注射液10ml，置20ml顶空瓶中，轧盖，即得供试品溶液；气相色谱顶空进样法测定；其中顶空恒温箱温度90～95℃，传输管温度105～115℃，进样环温度115～125℃，平衡时间：50～80min；用5-10％二苯基：90～95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱；进样口温度：200-250℃；检测器温度：200～250℃；顶空进样测定，分流比：1∶1；程序升温：初始温度50℃，保持4～8分钟，以每分钟10℃升至80℃，保持8～12分钟，以每分钟10℃升至130℃，保持5～8分钟，再以每分钟5℃升至240℃，保持8～12分钟，测定；载气流速：2.0ml/min；理论板数按对照品樟脑峰计算，应不低于30000；以与樟脑峰相对保留时间为0.74～0.75的色谱峰为参照物峰，记录60分钟得供试品指纹图谱。

6.如权利要求5所述的指纹图谱测定方法，其特征在于该方法为：

取樟脑对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.2mg的溶液，精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液10ml置20ml顶空瓶中，轧盖，即得对照品溶液；精密吸取本药物组合物注射液10ml，置20ml顶空瓶中，轧盖，即得供试品溶液；气相色谱顶空进样法测定；其中顶空恒温箱温度95℃，传输管温度110℃，进样环温度125℃，平衡时间：60min；用5％二苯基-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱；进样口温度：240℃；检测器温度：240℃；顶空进样测定，分流比：1∶1；程序升温：初始温度50℃，保持5分钟，以每分钟10℃升至80℃，保持10分钟，以每分钟10℃升至130℃，保持6分钟，再以每分钟5℃升至240℃，保持9分钟，测定；载气流速：2.0ml/min；理论板数按对照品樟脑峰计算，应不低于30000；以与樟脑峰相对保留时间为0.74～0.75的色谱峰为参照物峰，记录60分钟得供试品指纹图谱。

7.如权利要求5或6所述的指纹图谱测定方法，其特征在于供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度经计算大于0.8，其中对照指纹图谱的相对保留时间和峰面积比值如下：

各峰的相对保留时间为：1号峰：0.199±20％、2号峰：0.650±20％、3号峰：0.818±20％、4号峰：0.898±20％、参照峰：1、5号峰：1.343±20％、6号峰：1.461±20％7号峰：1.572±20％；各峰的峰面积比值：3号峰：0.09～0.22、4号峰：0.50～0.93、参照峰：1。

8.如权利要求7所述的指纹图谱测定方法，其特征在于供试品指纹图谱与质量标准的对照指纹图谱相似度经计算大于0.9。

9.一种由青蒿1000～1400重量份，金银花600～900重量份，栀子500～700重量份制成的中药注射剂的指纹图谱测定方法，其特征在于该方法为：

液相色谱法测定，取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得参照物溶液；取药物组合物注射剂1ml，置25ml量瓶中，加40-60％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定；其中色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液系统梯度洗脱，检测波长为225nm；理论板数按参照物栀子苷峰计算，应不低于6000，以栀子苷峰为参照物峰记录60分钟得指纹图谱；

其中流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液系统进行梯度洗脱，0到50分钟时甲醇体积比由20％线性上升到60％，0.1％磷酸体积比由80％线性下降到40％；50分钟到60分钟时按甲醇与0.1％磷酸溶液体积比维持60％∶40％的比例关系进行洗脱，总洗脱时间为60分钟；流速为0.8ml/min；供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度经计算大于0.8或0.9，对照指纹图谱的相对保留时间和峰面积比值如下：各峰的相对保留时间为，1号峰：0.286±20％、2号峰：0.398±20％、3号峰：0.458±20％、4号峰：0.748±20％、5号峰：0.804±20％、6号峰：0.848±20％、7号峰：0.915±20％、8号峰：0.940±20％、参照峰：1、9号峰：1.372±20％、10号峰：1.592±20％、11号峰：1.625±20％、12号峰：1.890±20％、13号峰：1.941±20％；各峰的峰面积比值，3号峰：0.34-0.56、4号峰：0.83-1.24、5号峰：0.32-0.53、参照峰：1；

气相色谱法测定，取樟脑对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.2～0.4mg的溶液，精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液10ml置20ml顶空瓶中，轧盖，即得对照品溶液；精密吸取本药物组合物注射液10ml，置20ml顶空瓶中，轧盖，即得供试品溶液；气相色谱顶空进样法测定；其中顶空恒温箱温度90～95℃，传输管温度105-115℃，进样环温度115～125℃，平衡时间：50～80min；用5-10％二苯基：90-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱；进样口温度：200～250℃；检测器温度：200～250℃；顶空进样测定，分流比：1∶1；程序升温：初始温度50℃，保持4～8分钟，以每分钟10℃升至80℃，保持8～12分钟，以每分钟10℃升至130℃，保持5～8分钟，再以每分钟5℃升至240℃，保持8～12分钟，测定；载气流速：2.0ml/min；理论板数按对照品樟脑峰计算，应不低于30000；以与樟脑峰相对保留时间为0.74～0.75的色谱峰为参照物峰，记录60分钟得供试品指纹图谱；供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度经计算大于0.8或0.9，其中对照指纹图谱的相对保留时间和峰面积比值如下：各峰的相对保留时间为，1号峰：0.199±20％、2号峰：0.650±20％、3号峰：0.818±20％、4号峰：0.898±20％、参照峰：1、5号峰：1.343±20％、6号峰：1.461±20％7号峰：1.572±20％

各峰的峰面积比值，3号峰：0.09～0.22、4号峰：0.50～0.93、参照峰：1。

10.如权利要求9所述的指纹图谱测定方法，其特征在于该方法为：

液相色谱法测定，取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得参照物溶液；取药物组合物注射剂1ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定；其中色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，250×4.5mm，5μm；流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液系统梯度洗脱，检测波长为225nm；理论板数按参照物栀子苷峰计算，应不低于6000，记录60分钟得供试品指纹图谱；

气相色谱法测定，取樟脑对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.2～0.4mg的溶液，精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液10ml置20ml顶空瓶中，轧盖，即得对照品溶液；精密吸取本药物组合物注射液10ml，置20ml顶空瓶中，轧盖，即得供试品溶液；气相色谱顶空进样法测定；其中顶空恒温箱温度90～95℃，传输管温度105～115℃，进样环温度115～125℃，平衡时间：50～80min；用5～10％二苯基：90-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱；进样口温度：200～250℃；检测器温度：200～250℃；顶空进样测定，分流比：1∶1；程序升温：初始温度50℃，保持4～8分钟，以每分钟10℃升至80℃，保持8～12分钟，以每分钟10℃升至130℃，保持5～8分钟，再以每分钟5℃升至240℃，保持8～12分钟，测定；载气流速：2.0ml/min；理论板数按对照品樟脑峰计算，应不低于30000；以与樟脑峰相对保留时间为0.74～0.75的色谱峰为参照物峰，记录60分钟得供试品指纹图谱。