CN100394984C - 日本血吸虫双价dna疫苗及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及日本血吸虫双价DNA疫苗，包括真核表达载体和插入到真核表达载体的多克隆位点上的目的基因，目的基因为Sj23和SjFABP，真核表达载体为具有两套翻译单位的真核表达载体，Sj23和SjFABP分别插入到具有两套翻译单位的真核表达载体的多克隆位点上，构建日本血吸虫双价DNA疫苗。本发明日本血吸虫双价DNA疫苗具有安全、高效、制备简单、性能稳定、不需冷藏系统，利于储存运输和使用方便，一次免疫能产生较为持久的免疫保护效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及人兽共患寄生虫病核酸疫苗，特别是针对血吸虫病的核酸疫苗。
背景技术
血吸虫病是危害人类健康，影响国家经济发展的人兽共患寄生虫病，据1990年WHO资料，血吸虫病呈全球分布，在74个国家大约6亿人受到威胁，2亿人受到不同程度的感染，其中约1.2亿是现症患者，0.2亿出现严重并发症。WHO/TDR在上世纪70年代将血吸虫病列为六大热带病之一。我国为日本血吸虫病(schistosomiasis japonica)流行区，是日本血吸虫病4个流行国(中国、菲律宾、印尼、日本)中最严重的国家，也是全球血吸虫病危害最严重的4个国家(埃及、苏丹、中国、巴西)之一。我国的血吸虫病主要流行于长江流域及以南的江苏、浙江、安徽、江西、福建、上海、湖南、湖北、广东、广西、云南、四川等12个省、自治区、直辖市的370个县市，累计感染者达1160万人，钉螺面积为143亿m2，受威胁人群在1亿以上。
目前我国防治血吸虫病的基本方针是“积极防治、综合措施、因时因地制宜”。指积极治疗病人和开展各种预防措施，采取治疗病人、病畜、灭螺、防护、粪管、水管及宣传教育同时进行的措施，因时因地制宜是指在不同类型流行区，根据不同的流行因素，采取不同的防治策略。虽然已取得显著的成效，但仍然未能完全控制。究其原因主要是：日本血吸虫是一种人兽共患寄生虫，保虫宿主繁多，且钉螺广泛存在，使该病难以彻底阻断传播；此外，尽管吡喹酮反复群体化疗是安全、有效的防治手段，但是，药物对已经形成的虫卵肉芽肿没有作用，且疫水接触者可重复感染。重复化疗和长期的监测措施需要昂贵的费用和大批专业技术人员，且不能排除血吸虫有潜在的抗药性的危险。所有这些因素促使人们研究控制日本血吸虫病的辅助或替代方法。
自从30年代采用成虫或尾蚴乳剂作人工免疫研究以来，血吸虫疫苗研究已有70多年历史，经历了死疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗。减毒活疫苗虽可刺激机体产生细胞毒性T细胞(CTL)和辅助性T细胞(Th)及增强体液免疫等多种保护性反应，但接种时可引起免疫抑制，减毒不充分可导致临床感染，减毒过强又可使疫苗效价降低，且有回复为有毒株的潜在危险，还受到疫苗抗原材料来源的限制。死疫苗和基因工程疫苗比较安全，但免疫原性较低，只能产生Th和体液免疫应答，不能诱导CTL反应，而且基因工程疫苗要经过基因克隆、表达和蛋白纯化等复杂过程，技术难度大，成本较高。因此，需要寻找一种更好的可以弥补现有疫苗缺点的新方法，核酸疫苗应运而生。
自1990年Wolff等首次报道了小鼠肌肉注射质粒DNA，质粒及其携带的基因可被肌细胞摄取并进行表达，人们陆续制备出许多单价DNA疫苗，尽管可以产生特异性抗体，但与致弱尾蚴产生的高保护力相比，单价DNA疫苗的免疫保护效果并不令人满意。血吸虫是一种多细胞生物，抗原成分复杂，在长期与宿主共同进化的过程中产生了多种免疫逃避机制，单一抗原分子很难产生针对不同虫期的完全免疫力；为了提高疫苗的免疫保护性，人们逐渐开始研究抗血吸虫多价DNA疫苗。白细胞介素12(IL-12)以其对免疫系统独特的调节作用，尤其受到DNA疫苗研究者的重视，目前已有IL-12作为血吸虫DNA疫苗佐剂的研究报道，均不同程度地增强了疫苗诱导的免疫力。但外源IL-12与人体内产生的IL-12有较高的同源性，会干扰人体自身的免疫调控系统，增加DNA疫苗的不安全因素。日本血吸虫23KD抗原(Sj23)和脂肪酸结合蛋白(SjFABP)都是有希望的疫苗候选分子，以Sj23和SjFABP基因为目的片段构建的单价DNA疫苗都有较好的免疫保护力。
发明内容
本发明的目的在于提供日本血吸虫双价DNA疫苗及其制备方法，以获得安全、高效、制备简单、性能稳定、不需冷藏系统，利于储存运输和使用方便，一次免疫能产生较为持久的免疫保护效果的血吸虫双价DNA疫苗。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：日本血吸虫双价DNA疫苗，包括真核表达载体和插入到真核表达载体的多克隆位点上的目的基因，目的基因为Sj23和SjFABP(其核苷酸序列见Mol.Biochem.Parasitol.1991，48(1)：67-75.“Further characterisation of theSchistosoma japonicum protein Sj23 a target antigen of an immunodiagnostic monoclonalantibody”和《中国人兽共患病杂志》2005，21：14-17..“日本血吸虫Sj14FABP与细胞因子IL-12重组质粒的构建和表达”)，真核表达载体为具有两套翻译单位的真核表达载体，Sj23和SjFABP分别插入到具有两套翻译单位的真核表达载体的多克隆位点上，构建日本血吸虫双价DNA疫苗。
上述Sj23插入到真核表达载体的强表达多克隆位点上，SjFABP插入到真核表达载体的弱表达多克隆位点上。
或者，上述SjFABP插入到真核表达载体的强表达多克隆位点上，Sj23插入到真核表达载体的弱表达多克隆位点上。
所说的真核表达载体为pVIVO2-mcs。
日本血吸虫双价DNA疫苗的制备方法：以上游P1：CGG GAT CCA ATG GCG ACT TTGGGT ACT、下游P2：CGC GAA TTC TTA AAC ATT CTG ATA ATC GTG为引物，用限制性内切酶BamH I和EcoR I对Sj23双酶切，同时以限制性内切酶BamH I和EcoRI对真核表达载体pVIVO2-mcs进行双酶切，将以上两片段连接成pVIVO2-mcs-Sj23质粒；以上游P3：GCA TCA TGA ATG TCT TCT TTC TTG G、下游P4：CGT CCT AGG TGA CCA GTC TATCAG T为引物，用限制性内切酶BspH I和AvRII对SjFABP双酶切，同时以限制性内切酶BspH I和AvR II对pVIVO2-mcs-Sj23质粒进行双酶切，将以上两片段连接成pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP质粒即为日本血吸虫双价DNA疫苗；或者以上游P1：CGT GGA TCC ATG TCT TCT TTC TTG、下游P2：GAC GAA TTC TGA CCA GTC TAT CAG T为引物，用限制性内切酶BamH I和EcoR I对SjFABP双酶切，同时以限制性内切酶BamH I和EcoRI对真核表达载体pVIVO2-mcs进行双酶切，将以上两片段连接成pVIVO2-mcs-SjFABP质粒；以上游P3：CGT CAT GAA ATG GCG ACT TTG GGT A、下游P4：CCG CCT AGG TTA AACATT CTG ATA ATC GTG为引物，用BspH I和AvRII对Sj23双酶切，同时以限制性内切酶BspH I和AvR II对pVIVO2-mcs-SjFABP质粒进行双酶切，将以上两片段连接成pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23质粒即为日本血吸虫双价DNA疫苗；其中引物的下划线表示对应的酶切位点。
日本血吸虫Sj23的核苷酸序列：
长度：656bp 分子类型：cDNA 来源：日本血吸虫大陆株
atggcgact ttgggtactg ggatgaggtg tctgaagagt tgtgtgttca tattgaacat
tatctgtctg ttatgttccc ttgtattaat aggcgctggt gcatatgtag aagttaaatt
cagccagtat gaggctaatt tacataaagt ctggcaggcg gctcccatcg caattattgt
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gactggtgct ctggaaaatc caaacgagga aataacggca accatggata agatacaaac
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aagcatcgtt atagcttgtt gtttgggtca acgaatacac gattatcaga atgtttaa
日本血吸虫SjFABP的核苷酸序列：
长度：398bp分子类型：cDNA来源：日本血吸虫大陆株
atg tcttctttct tgggaaagtg
gaaactaagc gaatcacaca acttcgatgc tgttatgtca aagctcggtg tctcgtgggc
gacccgacaa attgggaaca cagtgacgcc aactgtcact ttcacaatgg atggggatac
gatgaccatg ctgacagagt cgactttcaa gaacctctca gtcacgttca aatttggtga
ggaatttgac gagaaaacca gtgatggcag aagcgttaag tcagtcgtta ccaaagattc
agagtcaaag ataactcaca ctcaaaagga tagtaagaac acaactgtaa tcgttcgtga
aatagtaggt gatactatga aaactactgt aactgtcgat gatgttacgg ctattcggaa
ttacaaacga ttgtaa
附图说明
图1为本发明所用载体pVIVO2-mcs的质粒谱图。
图2为本发明PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳结果图。
图3(A)为本发明两种双价DNA疫苗双酶切(AvrII+BspHI)图。
图3(B)为本发明两种双价DNA疫苗双酶切 (EcoRI+BamHI)图。
图4荧光显微镜下观察双价DNA疫苗在HEK-293细胞胞膜和胞浆中的表达(间接免疫荧光法×400)。
具体实施方式
实施例1单价DNA疫苗的制备
1.PCR引物设计与合成
根据Sj23、SjFABP基因序列各设计2对引物(引物长度范围：15-30个核苷酸)，每条引物的5′端分别引入下列酶切位点(下划线表示)，引物由上海生工公司代为合成：
Sj23(1)上游P1：CGG GAT CCA ATG GCG ACT TTG GGT ACT BamH I
下游P2：CGC GAA TTC TTA AAC ATT CTG ATA ATC GTG EcoR I
SjFABP(1)上游P1：CGT GGA TCC ATG TCT TCT TTC TTG BamH I
下游P2：GAC GAA TTC TGA CCA GTC TAT CAG T EcoR I
2.SjFABP和Sj23目的基因的制备：
1)PCR
总反应体系为50μl，反应体系如下：
pVIVO2-Sj23参见《中华医学杂志》2005，85：193-197.甘燕等“重组核酸疫苗诱导小鼠抗血吸虫感染的免疫学研究”；pVIVO2-SjFABP参见《中国人兽共患病杂志》2005，21：14-17..“日本血吸虫Sj14FABP与细胞因子IL-12重组质粒的构建和表达”。
PCR反应的循环参数为：95℃变性5分钟，以94℃(90-97℃)变性1分钟(5秒-1.5分钟)，55℃(30-60℃)复性1分钟(10秒-1.5分)，72℃延伸2分钟(30秒-5分钟)，循环35(20-40)次，最后72℃ 10分钟终止反应。取5ul反应液经1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描分析。
2)Sj23(或SjFABP)目的片段的酶切回收
Sj23(或SjFABP)的两次RT-PCR产物合并于1.5ml Ep管中，加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积无水乙醇，-20℃过夜；室温下14000rpm离心10min，弃上清，沉淀物用70％乙醇洗涤一次；室温干燥后，加入48μl ddH2O溶解DNA沉淀。双酶切反应体系如下：
总体积60μl，37℃水浴酶切2h。
产物以1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下用洁净的手术刀片切下大小约670bp和440bp的DNA条带，按胶回收试剂盒操作说明回收Sj23(或SjFABP)片段，具体步骤如下：
①切下的凝胶放入EP管，体积约200μl，加入3倍体积Binding Buffer，55～65℃孵育7min，每2～3min振荡一次使胶溶解。
②将柱子接在一洁净2ml收集管中，加750ulDNA/凝胶混合液，10000g，室温离心1min，弃掉液体。如果混合液的体积大于800ul，应分次离心，每次为750ul。
③加入300ul Binding Buffer洗柱。即10000g，室温离心1min。
④在柱子中加入750ul乙醇稀释的Wash Buffer，室温静置2～3min。
10000g，室温离心1min洗柱。
⑤弃掉液体，重复第④步再洗一次。
⑥弃掉液体，10000g，室温离心空柱1min。
⑦将柱子接在一洁净1.5ml EP，加入50ul ddH2O，10000g，室温离心1min洗脱DNA，于-20℃保存。
⑧取2ul样品测定DNA含量。
3.单价DNA疫苗的构建和鉴定
1)pVIVO2-mcs载体的制备
pVIVO2-mcs购自Invitrogen公司(序列和物理谱图见该公司的产品目录)，为5.8kb，是具有两套翻译单位的多基因表达载体，可以在同一个载体上非融合表达两个目的基因(参见图1，其中MCS2为强表达多克隆位点，MCS1为弱表达多克隆位点)。
将含有pVIVO2-mcs的GT110菌种分别接种至5ml TB(LB，100μg/ml潮霉素)培养基中，37℃，180rpm振摇培养过夜，按E.Z.N.A.
Plasmid Miniprep Kit操作说明提取质粒pVIVO2-mcs。具体步骤如下：
①取约0.5ml菌液保种，剩下菌液转移入Ep管中，10000rpm，离心2min。小心吸去上清。
②加入250ul溶液I/核糖核酸酶A悬浮细菌，轻轻吹打，使沉淀充分重悬。
③加入250ul溶液II，轻轻颠倒并旋转试管4～6次至溶液变为澄清，室温静置2min。
避免剧烈振摇。
④加入350ul溶液III，轻轻颠倒数次直至白色絮状沉淀出现。10000g，室温离心10min。
⑤将柱子接在2ml收集管上，小心吸取上清加入兰色柱子。确保没有沉淀和细胞碎片加入柱子。10000g，室温离心1min使溶菌液经过柱子。
⑥弃掉液体，加入500ul HB缓冲液，10000g室温离心1min洗柱。这一步可确保去掉残余的污染蛋白以得到高纯度的DNA。
⑦弃掉液体，加入750ul洗剂/乙醇，室温离心1min，弃掉液体。
用750ul洗剂重复洗一次。
⑧10000g室温离心空柱1min使柱子干燥。
⑨将柱子接在洁净1.5ml EP管上，加入50ul ddH2O，室温离心1min洗脱DNA，于-20℃保存。
⑩取2ul测定DAN含量。
2)双酶切反应
以限制性内切酶BamH I和EcoR I对提取质粒pVIVO2-mcs进行双酶切，37℃水浴反应2h，1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收大片段，方法同上，测定含量后-20℃保存。
3)连接反应
体系1：pVIVO2-mcs+Sj23
分别混匀后，于16℃水浴连接过夜，然后置-20℃保存。
4)转化
感受态细胞E.coli GT110的制备参见《分子克隆》(科学出版社，2002年三版)。取6μl连接产物加至50μl感受态细胞中，轻柔混匀，冰浴30min，42℃热休克90s，立即置冰上2min，加入450μl 37℃预热的无抗菌素的LB培养基，置37℃150rpm振摇培养1h，取50-200μl菌液涂于TB平板，37℃培养过夜。
5)重组子的筛选
从平板上挑取单个转化子菌落接种至含潮霉素(100μg/ml)的LB培养基，37℃过夜培养，小量快速提取质粒，用BamH I和EcoR I进行双酶切后电泳鉴定，同时酶切空载体质粒作对照。以重组质粒pVIVO2-mcs-SjFABP和pVIVO2-mcs-Sj23为模板，按前述扩增条件进行PCR扩增，鉴定有无阳性扩增条带。
6)Sj23和SjFABP核苷酸序列测定
以重组质粒pVIVO2-mcs-Sj23和pVIVO2-mcs-SjFABP为测序模板，用Sj23和SjFABP特异性引物，经上海生工生物技术公司用ABI PRISMTM377 DNA测序仪测序。
实施例2双价DNA疫苗的制备
1.PCR引物设计与合成
根据Sj23、SjFABP基因序列各设计2对引物，每条引物的5′端分别引入下列酶切位点(下划线表示)，引物由上海生工公司代为合成：
Sj23(2)上游P3：CGT CAT GAA ATG GCG ACT TTG GGT A BspH I
下游P4：CCG CCT AGG TTA AAC ATT CTG ATA ATC GTG AvR II
SjFABP(2)上游P3：GCA TCA TGA ATG TCT TCT TTC TTG G BspH I
下游P4：CGT CCT AGG TGA CCA GTC TAT CAG T AvRII
引物长度范围：10-35个核苷酸
2.SjFABP和Sj23目的基因的制备：
1)PCR
总反应体系为50μl，反应体系如下：
PCR反应的循环参数为：95℃变性5分钟，以94℃(90-97℃)变性1分钟(5秒-1.5分钟)，55℃(30-60℃)复性1分钟(10秒-1.5分)，72℃延伸2分钟(30秒-5分钟)，循环35(20-40)次，最后72℃ 10min终止反应。取5ul反应液经1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描分析。
2)Sj23(或SjFABP)目的片段的酶切回收
Sj23(或SjFABP)的两次RT-PCR产物合并于1.5ml Ep管中，加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积无水乙醇，-20℃过夜；室温下14000rpm离心10min，弃上清，沉淀物用70％乙醇洗涤一次；室温干燥后，加入51μl ddH2O溶解DNA沉淀。单酶切反应体系如下：
总体积60μl，37℃水浴酶切2h。在此酶切体系中加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积无水乙醇，-20℃过夜：室温下14000rpm离心10min，弃上清，沉淀物用70％乙醇洗涤一次；室温干燥后，加入51μl ddH2O溶解DNA沉淀。再次进行单酶切：
产物以1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下用洁净的手术刀片切下大小约670bp和440bp的DNA条带，按胶回收试剂盒操作说明回收Sj23(或SjFABP)片段，具体步骤如下：
①切下的凝胶放入EP管，体积约200μl，加入3倍体积Binding Buffer，55～65℃孵育7min，每2～3min振荡一次使胶溶解。
②将柱子接在一洁净2ml收集管中，加750ulDNA/凝胶混合液，10000g，室温离心1min，弃掉液体。如果混合液的体积大于800ul，应分次离心，每次为750ul。
③加入300ul Binding Buffer洗柱。即10000g，室温离心1min。
④在柱子中加入750ul乙醇稀释的洗液，室温静置2～3min。
10000g，室温离心1min洗柱。
⑤弃掉液体，重复第④步再洗一次。
⑥弃掉液体，10000g，室温离心空柱1min。
⑦将柱子接在一洁净1.5ml EP，加入50ul ddH2O，10000g，室温离心1min洗脱DNA，于-20℃保存。
⑧取2ul样品测定DNA含量。
3.双价DNA疫苗的构建
1)双酶切反应
以限制性内切酶BspH I和AvRII对提取质粒pVIVO2-mcs和Sj23(SjFABP)的连接产物pVIVO2-mcs-Sj23和pVIVO2-mcs-SjFABP进行双酶切，37℃水浴反应2h，1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收大片段，方法同上，测定含量后-20℃保存。
2)连接反应
体系1：pVIVO2-mcs-Sj23+SjFABP
体系2：pVIVO2-mcs-SjFABP+Sj23
分别混匀后，于16℃水浴连接过夜，然后置-20℃保存。
3)转化
感受态细胞E.coli GT110的制备参见前述《分子克隆》。取6μl连接产物加至50μl感受态细胞中，轻柔混匀，冰浴30min，42℃热休克90s，立即置冰上2min，加入450μl 37℃预热的无抗菌素的LB培养基，置37℃150rpm振摇培养1h，取50-200μl菌液涂于TB平板，37℃培养过夜。
4)重组子的筛选
从平板上挑取单个转化子菌落接种至含潮霉素(100μg/ml)的LB培养基，37℃过夜培养，小量快速提取质粒，用BspH I和AvR II进行双酶切后电泳鉴定，同时酶切pVIVO2-mcs-SjFABP和pVIVO2-mcs-Sj23作对照。以重组质粒pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23和pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP为模板，按前述扩增条件进行PCR扩增，鉴定有无阳性扩增条带。
5)Sj23和SjFABP核苷酸序列测定
以重组质粒pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23和pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP为测序模板，用Sj23和SjFABP特异性引物，经上海生工生物技术公司用ABI PRISMTM377 DNA测序仪测序。
4.双价DNA疫苗构建的鉴定
1)日本血吸虫Sj23和SjFABP基因的PCR扩增
取5μl的PCR反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳(含0.5μg/l的EB)，结果可见两条清晰的扩增条带，扩增片段分子大小为与SjFABP和Sj23一致，分别是440bp和670bp，见图2；图中1.小Marker；2.SjFABP(以pVIVO2-SjFABP为模板的PCR产物)；3.Sj23(以pVIVO2-Sj23为模板的PCR产物)。
2)质粒DNA的鉴定结果 酶切鉴定及电泳分析：取经过PCR扩增鉴定的数个重组质粒pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP(和pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23)，用双酶切鉴定，小片段的分子量分别与SjFABP和Sj23相一致，是440bp和670bp。结果见图3(A)[其中4.DNA Marker、5.pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23双酶切(Avr II+BspH I)、6.pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP双酶切(Avr II+BspH I)]、图3(B)[其中7.DNA Marker、8.pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23双酶切(EcoRI+BamH I)、9.pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP双酶切(EcoR I+BamH I)、10.pVIVO2-mcs-SjFABP双酶切(EcoR I+BamH I)、11.pVIVO2-mcs-Sj23双酶切(EcoR I+BamH I)]。测序结果，pVIVO2-mcs-Sj23、pVIVO2-mcs-SjFABP、pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP和pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23中插入Sj23或SjFABP与Mol.Biochem.Parasitol.1991，48(1)：67-75.“Furthercharacterisation of the Schistosoma japonicum protein Sj23 a target antigen of animmunodiagnostic monoclonal antibody”和《中国人兽共患病杂志》2005，21：14-17..“日本血吸虫Sj14FABP与细胞因子IL-12重组质粒的构建和表达”中的Sj23或SjFABP片段大小一致，结果提示：双价DNA疫苗构建成功。
3)重组质粒目的基因序列测定及分析
测序结果显示：插入的Sj23目的片段编码基因全长656bp，SjFABP目的片段编码基因全长399bp，同文献报道的序列同源性为100％。结果提示：目的片段插入正确。
实施例3：本发明效果评价实验
1.质粒DNA在体外的表达
1).质粒DNA的制备
以Omega公司质粒小量提取试剂盒制备两种质粒pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23及pVIVO2-mcs，方法同前。
2).转染前HEK-293细胞的培养
HEK-293细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为37℃，5％CO2。待细胞融合度达95％后用0.25％胰蛋白酶消化，1500rpm离心5min，弃上清，用少量无血清培养基重新悬浮，调整细胞浓度为1×106/ml。取1ml细胞悬液加入细胞培养皿(直径35mm)，每种质粒均设一放置了盖玻片的平皿，待细胞爬片生长。培养24h。
3).瞬时转染
按照Invitrogen公司LipofectamineTM 2000 Reagent操作说明转染细胞：
①细胞达到90-95％融合。
②各取4.0μg上述制备的3种质粒DNA(5μl)分别加至250μl RPMI 1640无血清培养基中，轻轻混匀。
③取lipofectamineTM2000 10μl加至250μl RPMI 1640无血清培养基中，轻轻混匀，室温孵育5min。
④将上述二液轻柔混合后室温孵育20min。
⑤每个培养皿加入500μl上述混合液，颠倒混匀，37℃，5％CO2培养4-6h。
⑥换新鲜培养基继续培养48h。
⑦取出培养皿中的细胞爬片，加1％多聚甲醛固定20min，待玻片干燥后，置-20℃保存。
4)间接免疫荧光法检测Sj23和SjFABP蛋白的表达
①PBS洗涤细胞爬片3次，每次10min。
②0.2％TritonX-100透化固定后的细胞2min(室温)。
③PBS洗涤4次，每次10min。
④加入3％BSA于37℃封闭30min。
⑤PBS洗涤3次，加小鼠感染血清(1∶20)至玻片上，4℃孵育过夜。
⑥PBS洗涤3次，加入FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶100)，37℃湿盒孵育2小时。
PBS洗涤，适当干燥后，以甘油∶PBS(1∶9)封片，荧光显微镜下观察结果并拍照。
5)结果
体外瞬时转染HEK-293细胞，间接免疫荧光染色显示pVIVO2-SjFABP-Sj23转染的细胞部分在胞浆和胞膜上有绿色荧光(参见图4)，pVIVO2-mcs质粒转染的细胞则未见荧光。结果提示：双价疫苗能在哺乳动物细胞内合成目的蛋白。
2.质粒DNA在小鼠体内的表达
1)免疫接种BALB/c小鼠
6只雄性BALB/c小鼠分成3组，每组2只，注射前一天以0.75％盐酸布比卡因30μl预处理，然后分别以pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23及pVIVO2-mcs质粒经股四头肌免疫，100μg/只，免疫后14天，将其用4％多聚甲醛灌流固定，取注射部位股四头肌做冰冻切片，厚度5-7μm，-20℃保存待检。
2)间接免疫荧光法检测抗原的表达
间接免疫荧光检测方法同前，以小鼠阳性感染血清作一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG作二抗孵育，荧光显微镜下观察结果。
3)结果
免疫组化反应片，置于荧光显微镜下观察可见某些肌细胞横切面组织中胞膜及胞浆出现强荧光，而周围肌细胞则未见荧光，阴性对照组未出现特异性荧光。表明有强荧光出现的肌细胞为特异性表达Sj23和SjFABP抗原的细胞。结果提示：双价DNA疫苗可在小鼠体内表达。
3.免疫保护性试验
1)DNA疫苗的大量制备
以Promega公司质粒DNA提取和纯化试剂盒大量制备质粒pVIVO2-mcs-Sj23-Sj14FABP、pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23、pVIVO2-mcs-Sj23、pVIVO2-mcs-SjFABP及pVIVO2-mcs方法同前。
2).免疫方案
70只雄性BALB/c小鼠随机分成7组。每鼠经股四头肌内侧肌肉注射0.75％盐酸布比卡因35μl预处理，隔天在相同部位分别注射：A组，生理盐水100μl/只；B组，pVIVO2-mcs 100μg/只；C组，pVIVO2-mcs-Sj23100μg/只；D组，pVIVO2-mcs-SjFABP 100μg/只；E组，pVIVO2-mcs-Sj23-Sj14FABP 100μg/只；F组，pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23100μg/只。其中，pVIVO2-mcs组为载体质粒对照组，生理盐水组为攻击感染对照组。另设立G组：pVIVO2-mcs-Sj23-Sj14FABP100μg/只和香菇多糖100μg/只，以观察多糖佐剂(香菇多糖)与DNA疫苗联合免疫能否提高小鼠抵抗日本血吸虫攻击感染的免疫保护力。其中，香菇多糖(下同)IR(cm-1)3405(O-H)，116，861(C-O)；UV-VIS(nm)197，MW 3.01×104。
3).攻击感染
免疫后30d，每鼠经腹部皮肤感染40±2条日本血吸虫尾蚴。
4).免疫保护效果的观察
攻击感染后45d剖杀小鼠，肝门静脉灌注法和压片法收集成虫并计数。每只小鼠从固定部位取肝组织1g，加入5％的KOH 20ml，于37℃孵箱中消化过夜，计数每克肝组织虫卵数(EPG)。然后按下述公式计算减虫率和减卵率。
减虫率(％)＝(攻击感染对照组平均检获成虫数-免疫组平均检获成虫数)/攻击感染对照组平均检获成虫数×100％
减卵率(％)＝(攻击感染对照组平均EPG-免疫组平均EPG)/攻击感染对照组平均EPG×100％
5).肝脏病理学观察
攻击感染后45d剖杀小鼠，观察A、B、F和G组小鼠肝脏虫卵肉芽肿病理学变化。从固定部位切取小鼠肝组织一块，用10％福尔马林液固定，石蜡包埋，切片，H.E.染色，低倍镜下观察其病理学变化，并用HPLAS-1000彩色病理图文分析系统进行测量。每组随机观察50个虫卵肉芽肿，按垂直方向测量虫卵及其周围炎症反应(肉芽肿)截面的两个直径(长径和横径)，求出每组鼠肝脏虫卵肉芽肿平均直径的均数，并测量每个虫卵肉芽肿的面积。
6).统计方法
用SAS软件包对数据进行ANOVA检验分析。
7)结果
①各实验组减虫减卵率，结果见表1。各疫苗组减虫率和减卵率与空质粒组相比，均有显著性差异(P＜0.05)。多价DNA疫苗免疫保护力优于同一目的分子构建的单价DNA疫苗(P＜0.05)，双价共表达质粒可诱导小鼠产生明显的抗血吸虫免疫保护效果，其中pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23疫苗组减虫率超过50％。双价疫苗pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP和多糖佐剂联合免疫组获得68.89％的减虫率和84.04％的减卵率，显著高于单价和双价疫苗单独免疫组(P＜0.05)，是非常优秀的抗血吸虫病疫苗，具有很大的应用价值。
表1 实验组和对照组成虫数和每克肝组织虫卵数
注：*与盐水对照组比较，P＞0.05；#与pVIVO2-mcs比较，P＜0.05；▲与pVIVO2-mcs-Sj23比较，P＜0.05；★与pVIVO2-mcs-Sj23比较，P＜0.05；◆与pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP比较，P＜0.05。
②肝脏的病理变化：小鼠肝脏卵肉芽肿平均直径和面积见表2，与pVIVO2组相比，pVIVO2-SjFABP-Sj23组和pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP与香菇多糖混合组虫卵肉芽肿面积减小率为33.34％和33.65％，两实验组间无显著性差异(p＞0.05)。结果提示：双价疫苗在减少虫卵个数的同时，还减轻了虫卵引起的炎症反应，缩小了虫卵肉芽肿的面积，具有抗病作用。香菇多糖无协同抗病作用。
表2各实验组小鼠肝脏肉芽肿直径和面积的比较(X±S)
肝脏肉芽肿面积的变化
本发明双价核酸疫苗的减虫率为41.2％-53.85％，减卵率为42.65％-45.59％，按照WHO制定的血吸虫疫苗评价标准，本发明结果较好。使用本发明血吸虫DNA疫苗针剂，进行肌肉免疫或皮下免疫小鼠先后2批共计250余只小鼠观察，证实疫苗能有效诱导抗血吸虫的免疫保护力，对动物反复多次的实验观察未发现不良反应。香菇多糖是良好的佐剂，可以显著的提高双价核酸疫苗的免疫保护力(减虫率68.89％、减卵率84.04％)，但无协同抗肝脏病理变化的作用，具有很好的应用前景。本发明血吸虫双价DNA疫苗安全、高效、制备简单、性能稳定、不需冷藏系统，利于储存运输和使用方便，一次免疫能产生较为持久的免疫保护效果。
Claims (5)
1.日本血吸虫双价DNA疫苗，包括真核表达载体和插入到真核表达载体多克隆位点上的目的基因，其特征是：目的基因为Sj23和SjFABP，真核表达载体为具有两套翻译单位的真核表达载体，Sj23和SjFABP分别插入到具有两套翻译单位的真核表达载体的多克隆位点上，构建日本血吸虫双价DNA疫苗。
2.根据权利要求1所述的日本血吸虫双价DNA疫苗，其特征是：Sj23插入到真核表达载体的强表达多克隆位点上，SjFABP插入到真核表达载体的弱表达多克隆位点上。
3.根据权利要求1所述的日本血吸虫双价DNA疫苗，其特征是：SjFABP插入到真核表达载体的强表达多克隆位点上，Sj23插入到真核表达载体的弱表达多克隆位点上。
4.根据权利要求1或2或3所述的日本血吸虫双价DNA疫苗，其特征是：所说的真核表达载体为pVIVO2-mcs。
5.权利要求4所述日本血吸虫双价DNA疫苗的制备方法，其特征在于：以上游P1：CGG GAT CCA ATG GCG ACT TTG GGT ACT、下游P2：CGC GAA TTC TTA AAC ATT CTG ATAATC GTG为引物，用限制性内切酶BamH I和EcoR I对Sj23双酶切，同时以限制性内切酶BamH I和EcoR I对真核表达载体pVIVO2-mcs进行双酶切，将以上两片段连接成pVIVO2-mcs-Sj23质粒；以上游P3：GCA TCA TGA ATG TCT TCT TTC TTG G、下游P4：CGT CCT AGG TGA CCA GTC TAT CAG T为引物，用限制性内切酶BspH I和AvR II对SjFABP双酶切，同时以限制性内切酶BspH I和AvR II对pVIVO2-mcs-Sj23质粒进行双酶切，将以上两片段连接成pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP质粒即为日本血吸虫双价DNA疫苗；或者以上游P1：CGTGGA TCCATG TCT TCT TTC TTG、下游P2：GAC GAA TTCTGA CCA GTC TAT CAG T为引物，用限制性内切酶BamH I和EcoR I对SjFABP双酶切，同时以限制性内切酶BamH I和EcoR I对真核表达载体pVIVO2-mcs进行双酶切，将以上两片段连接成pVIVO2-mcs-SjFABP质粒；以上游P3：CGT CAT GAA ATG GCGACT TTG GGT A、下游P4：CCG CCT AGG TTA AAC ATT CTG ATA ATC GTG为引物，用BspH I和AvR II对Sj23双酶切，同时以限制性内切酶BspH I和AvR II对pVIVO2-mcs-SjFABP质粒进行双酶切，将以上两片段连接成pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23质粒即为日本血吸虫双价DNA疫苗；其中引物的下划线表示对应的酶切位点。
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| . Marion M. Becker,et al.Gene,Vol.148 . 1994 |
| . Kathleen M. Davern,et al.Molecular and Biochemical Parasitology,Vol.48 . 1991 * |
| . Marion M. Becker,et al.Gene,Vol.148 . 1994 * |
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