CN100374429C - 以10-去乙酰紫杉醇为原料转化生产多烯紫杉醇的方法 - Google Patents

Abstract

以10-去乙酰紫杉醇为原料转化生产多烯紫杉醇的方法，首先采用氯甲酸苄酯及三乙基氯硅烷保扩10-去乙酰紫杉醇的C-2′位、C-7及C-10位上3个羟基，得到三羟基受保护的中间体B，其次用酶水解去除中间体B侧链C-3′N位上的苯甲酰基，得到中间体C，中间体C与叔丁氧碳酸酐反应得到C-3′N位带叔丁氧羰基的中间体D；中间体D去保护即得到产物多烯紫杉醇E，特征在于：以10-去乙酰紫杉醇为原料，通过常规的选择性保护，采用酶水解方法去除10-去乙酰紫杉醇侧链C-3′N位上的苯甲酰基，再通过常规方法，最终转化生产得到多烯紫杉醇。

Description

以10-去乙酰紫杉醇为原料转化生产多烯紫杉醇的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其是一种以10-去乙酰紫杉醇为原料转化生产多烯紫杉醇的方法。

背景技术

据统计，美欧等发达国家每年新增癌症患者400万人左右，全世界每年死亡癌症病人约630万人，抗癌药物约占有世界药品销售15％左右的药品市场分额，即大约300亿美元的市场。

紫杉醇类药物表现出广谱而高效的抗癌活性，被誉为20世纪最伟大的医药发现，是迄今为止人类发现的疗效最好的抗癌药物之一。其中又以第二代药物多烯紫杉醇发展迅速，市场销售额逐步上升至20亿美元，且还在以每年约20％的速度递增。目前原料供应远远不能满足市场需求。

紫杉醇类药物首先是从植物中发现的，率先进入市场的是紫杉醇，其英文名为paclitaxel，结构式见F。然而，紫杉醇类药物在植物中含量极低，提取过程复杂而且收率很低。更主要的是，红豆杉是一类生长极为缓慢的植物，大量砍伐红豆杉、剥取树皮提取紫杉醇，已使这种植物濒临灭绝。人们必须寻找其他途径来解决紫杉醇的大量供应问题，化学合成是人们首先想到的解决紫杉醇类药物药源问题的一条途径。现有的化学合成方法又分为全合成和半合成。

紫杉醇类药物具有复杂新颖的化学结构，全合成制备成本昂贵，虽然具有重要的理论意义，但不适合大规模工业化生产。

实践证明，半合成是最具有实用价值的制备紫杉醇类药物的方法。多烯紫杉醇，结构式见E，就是进行紫杉烷类半合成研究时得到的一种紫杉醇的类似物。二者结构相似，只是多烯紫杉醇的C-10位缺少乙酰基，在C-3′位叔丁氧基取代了紫杉醇中该位置中的苯基。

目前合成多烯紫杉醇的方法仍然是以10-去乙酰基巴卡亭III为底物，结构式见G：

将全合成的β-内酰胺类侧链连接于紫杉烷C-13位而得到多烯紫杉醇。现有的专利技术基本上集中于侧链合成的立体化学控制与光学活性单体拆分方法等。其半合成技术路线如下所示：

多烯紫杉醇活性和生物利用度均高于紫杉醇，目前是最受欢迎的抗肿瘤一线药物之一。临床应用范围还在不断扩大。因此，对多烯紫杉醇半合成原料的需求急剧增加。研发半合成生产多烯紫杉醇的原料和新工艺路线，是世界范围内医药领域研究热点之一。

与半合成紫杉醇类似，国内外半合成多烯紫杉醇，基本上是将完整的N-叔丁氧羰基-2R，3S-3-苯基异丝氨酸侧链，与带保护的10-DAB进行酯化反应，此反应也存在很大的局限性，不仅需要极为苛刻的反应条件，而且反应的转化率低，还会形成C-2′的表位异构化产物。为此人们也采用不同的环状侧链前体来制备多烯紫杉醇，主要是β-内酰胺型和恶唑烷型环状侧链。这是迄今为止多烯紫杉醇的半合成的最佳工艺路线。在侧链的合成、光学拆分等方面有大量的专利技术，这是半合成多烯紫杉醇的基本现状。

发明内容

针对上述现有半合成多烯紫杉醇技术存在的不足，本发明提出一种以10-去乙酰紫杉醇为原料转化生产多烯紫杉醇的方法，10-去乙酰紫杉醇的结构式见A，英文名为10-deacetyl-paclitaxel，简称10-DAT。该方法以红豆杉属植物的枝叶或提取紫杉醇时所得副产物10-DAT为原料，开发出了一条全新的、优良的、具有实际生产价值的多烯紫杉醇半合成路线，实现了规模化生产。值得指出的是10-DAT在云南红豆杉植物枝叶中的含量是紫杉醇含量的3倍以上，资源较丰富，本发明的合成路线如下：

以上合成路线中反应条件为：

步骤①：原料10-DAT，结构式A，在二甲氨基吡啶的二氯甲烷中，采用氯甲酸苄酯、三乙基氯硅烷简写为TES的咪唑液，保护其C-2′位、C-7及C-10位的3个羟基得到中间体B，结构式为B。

步骤②：中间体B用水解酶处理，去除中间体B侧链C-3’N位上的苯甲酰基，得到中间体C，结构式为C。

步骤③：中间体C与叔丁氧碳酸酐在二甲氨基吡啶的乙腈中反应，产物在氯仿中于室温下停留3h，得到中间体D，结构式为D。

步骤④：中间体D在HF-吡啶四氢呋喃中，除去保护基得到最终产物多烯紫杉醇，结构式为E。

本发明由于使用原料为10-DAT并在关键的步骤②中采用酶水解的方法半合成得到中间体C，与已有的半合成方法相比，拥有完全不同的技术路线和合成技术路线思路。

酶是理想的生物催化剂，具有很高的催化效率。在21世纪将日益广泛的用于医药、精细化学品及食品工业中。在医药、精细化学品及食品领域非水相介质酶催化方法发展十分迅速，因为酶在有机相中进行催化反应中具有许多优点，在有机合成中特别有用。虽然，紫杉烷C-2，C-4，C-10及C-13位酯基的选择性切断己有不少报导，但C-3′-N-苯甲酰基的选择性切断报导很少，而且仅有几例均采用化学选择性切断，如三尖杉宁碱和紫杉醇的N-取代基的选择性切断，且转化率较低。

具体实施方式：

根据本发明，以10-DAT为原料转化合成多烯紫杉醇的第一步是采用氯甲酸苄酯及三乙基氯硅烷与其反应，使C-2′位、C-7及C-10位的3个羟基先后被PhCH₂OOC-及TES保护后得到中间体B；紧接着的第二步是本发明最重要的环节，即采用水解酶去除中间体B侧链C-3’N位上的苯甲酰基，得到中间体C；第三步为中间体C与叔丁氧碳酸酐反应得到中间体D；第四步为中间体D脱掉保护基PhCH₂OOC-及TES即得到产物多烯紫杉醇E，总收率≥50％。

以下通过具体实施例对本发明作更详细地阐述。

实施例1：

以10-DAT，为原料，采用大肠杆菌酰胺酶水解方法合成多烯紫杉醇。

取10-DAT 250mg为原料，其纯度为80-90％，结构式为A，在二甲氨基吡啶的二氯甲烷中，采用氯甲酸苄酯及三乙基氯硅烷的咪唑液，25℃条件下，搅拌0.5-1h，生成C-2′位、C-7及C-10位3个羟基受PhCH₂OOC-及TES保护的中间体B，产率≥96％。

中间体B在90ml含7％水的异丙醇溶液与1g大肠杆菌酰胺酶，在pH为7.0及38℃条件下搅拌，用TLC监控，HPLC检测，直到所有中间体B转化完全为止，反应混合物用柱色谱分离纯化，得到C-3′-N位上去除苯甲酰基的衍生物中间体C，产率为92％。

中间体C与叔丁氧碳酸酐(t-BuOCO)₂O，在二甲氨基吡啶的乙腈中，22℃条件下，搅拌反应24h，反应产物在氯仿中于室温下停留3h，得到在C-3′N位上带叔丁氧羰基的中间体D，产率为87％。

中间体D在HF-吡啶四氢呋喃中，在20℃，搅拌2h，将保护基脱除，反应混合物用柱色谱分离纯化，得到多烯紫杉醇，结构式为E。总产率为51％，纯度为98.5％。

实施例2：

以10-DAT为原料，采用青霉素酰胺酶水解方法合成多烯紫杉醇。

取10-DAT 200mg为原料，其纯度为80-90％，结构式为A，在二甲氨基吡啶的二氯甲烷中，采用氯甲酸苄酯及三乙基氯硅烷的咪唑液，30℃条件下，搅拌0.5-1h，生成C-2′位、C-7及C-10位3个羟基受保护的中间体B，产率≥95％。

中间体B在75ml异丙醇的含水5％的溶液与1.5g大肠杆菌酰胺酶，在pH为7.0及30℃条件下搅拌，用TLC监控，HPLC检测，直到所有中间体B转化完全为止，反应混合物用柱色谱分离纯化，得到C-3′N位上去除苯甲酰基的中间体C，产率91％。

中间体C与叔丁氧碳酸酐，(t-BuOCO)₂O，在二甲氨基吡啶的乙腈中，25℃条件下，搅拌反应18h，反应产物在氯仿中于室温下停留3h，得到在C-3′-N位上带叔-丁氧羰基的衍生物中间体D，产率为86％。

中间体D在HF-吡啶四氢呋喃中，在23℃，搅拌2h，将保护基脱除，反应混合物用柱色谱分离纯化，得到多烯紫杉醇，结构式为E。总产率为50％，纯度为98.7％。

实施例3：

以同实施例1相同方式制备的中间体B为原料，采用无花果蛋白酶水解，制备中间体C。

取中间体B 171.5mg，溶于65ml异丙醇含水1.3％的溶剂中，pH约为7.0，在21℃，加入无花果蛋白酶1.2g，搅拌、水解，用TLC监控，HPLC检测，直到所有中间体B转化完全为止，反应混合物用柱色谱分离纯化，得到白色晶体中间体C，产率90％

实施例4：

以同实施例2相同方式制备的中间体B为原料，通过菠萝蛋白酶与聚酯固定相结合的水解方法，制备中间体C。

取中间体B 228.5mg，溶于80ml含水1.5％的异丙醇溶液中，用5％醋酸溶液调节pH为6.0，在30℃条件下，将原料溶液加入菠萝蛋白酶与聚酯化合物以共价形成的固定相柱，单次转化率35-40％，直到所有中间体B转化完全为止，采用TLC监控，HPLC检测。将流出液真空浓缩，反复重结晶得到白色晶体中间体C，总酶水解转化产率89％。

实施例5：

以同实施例1相同方式制备的中间体B为原料，通过青霉素酰胺酶与聚酰胺化合物固定结合的水解方法，制备中间体C。

取中间体B 228.5mg，溶于85ml 2.5％的异丙醇水溶剂中，用5％碳酸氢钠溶液调节pH为8.0，在35℃条件下，将原料溶液加入青霉素酰胺酶与聚酰胺化合物以共价形成的固定相柱，单次转化率37-40％，直到所有中间体B转化完全为止，采用TLC监控，HPLC检测。将流出液真空浓缩，反复重结晶得到白色晶体中间体C，总酶水解转化产率92％。

实施例6：

以同实施例1相同方式制备的中间体B为原料，通过木瓜蛋白酶水解，制备中间体C。

取中间体B 114mg，溶于40ml含10％水的丙酮溶剂中，用10％醋酸溶液调节pH为5.8，在25℃条件下，加入1.7g木瓜蛋白酶，搅拌，直到所有中间体B转化完全为止，采用TLC监控，HPLC检测。反应混合物用柱色谱分离纯化，得到白色晶体中间体C，产率84％。

实施例7：

以同实施例1相同方式制备的中间体B为原料，采用羧肽酶A水解，制备中间体C。

取中间体B 171.5mg，溶于67ml去离子水中，用5％碳酸氢钠溶液调节pH为7.5，在27℃，加入羧肽酶A 1.5g，搅拌，采用TLC监控，HPLC检测，直到所有中间体B转化完全为止，反应混合物用柱色谱分离纯化，得到白色晶体中间体C，产率84％。

实施例8：

以同实施例2相同方式制备的中间体B为原料，采用青霉素酰胺酶在水相水解，制备中间体C。

取中间体B 171.5mg，溶于65ml去离子水，pH约为7，在30℃，加入青霉素酰胺酶1.4g，搅拌，直到所有中间体C转化完全为止，采用TLC监控，HPLC检测，反应混合物用柱色谱分离纯化，得到白色晶体中间体C，产率92％。

实施例9：

以实施例1相同方式制备的中间体B为原料，采用青霉素酰胺酶在50％异丙醇水溶液中，水解制备中间体C。

取中间体B 171.5mg，溶于50％异丙醇水溶液55ml，pH为7，在30℃，加入青霉素酰胺酶1.0g，搅拌，直到所有中间体B转化完全为止，采用TLC监控，HPLC检测，反应混合物用柱色谱分离纯化，得到白色晶体中间体C，产率91％。

Claims (7)

1.以10-去乙酰紫杉醇为原料转化生产多烯紫杉醇的方法，10-去乙酰紫杉醇的结构式见A，英文名为10-deacetyl-paclitaxel，简称10-DAT，其来源于红豆杉属植物枝叶或提取紫杉醇工艺所得的副产物，采用氯甲酸苄酯及三乙基氯硅烷保护10-DAT的C-2′位、C-7及C-10位上3个羟基，得到三羟基受保护的中间体B，其结构式见B；采用酶水解去除中间体B侧链C-3′N位上的苯甲酰基，得到中间体C，其结构式见C；中间体C与叔丁氧碳酸酐反应得到C-3′N位带叔丁氧羰基的中间体D，其结构式见D；中间体D去保护即得到产物多烯紫杉醇，结构式见E，英文名为Docetaxel，

2.根据权利要求1所述的转化生产多烯紫杉醇的方法，其特征在于：用酶水解得到中间体C所用的水解酶包括：

a.由微生物所产生的酰胺酶；

b.由植物或动物产生的各种蛋白酶或羧肽酶。

3.根据权利要求2所述的转化生产多烯紫杉醇的方法，其特征在于：酰胺酶是由大肠杆菌、巨大芽孢杆菌为出发菌株产生的大肠杆菌酰胺酶、青霉素酰胺酶；蛋白酶或羧肽酶是无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶或羧肽酶A。

4.根据权利要求1或2所述的转化生产多烯紫杉醇的方法，其特征在于：酶水解进行水解反应的条件是pH值范围为5.8-8.0，温度范围为21-39℃，溶剂为水相、含水有机相，溶剂用量为所用中间体B的200-400倍。

5.根据权利要求4所述的转化生产多烯紫杉醇的方法，其特征在于：水解时将水解酶制成固相酶装在柱中串联连续使用，或者是将非固定化水解酶置于罐中分批操作。

6.根据权利要求5所述的转化生产多烯紫杉醇的方法，其特征在于：固相酶装在柱中串联连续使用的水解酶以共价键的形式与多孔性颗粒状高分子聚合物载体相结合。

7.根据权利要求6所述的转化生产多烯紫杉醇的方法，其特征在于：多孔性颗粒状高分子聚合物载体是聚酯化合物或者是聚酰胺化合物。