CH665752A5

CH665752A5 - Molken-fermentierungsverfahren.

Info

Publication number: CH665752A5
Application number: CH4836/85A
Authority: CH
Inventors: William P Ahern; Dale F Andrist; Lawrence E Skogerson
Original assignee: Stauffer Chemical Co
Priority date: 1984-11-13
Filing date: 1985-11-12
Publication date: 1988-06-15
Also published as: AU575698B2; AU4978685A; NZ214157A; CA1256738A; US4743453A

Description

BESCHREIBUNG Die vorliegend beschriebene Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Molkenfermentates mit einer Konzentration bis zu 2,6 Gew.-% an zweiwertigen Metallpropionaten.

Molke, eine auf natürlichem Weg erhaltene Substanz, ist das Serum oder der wässrige Teil von Milch, der nach der Gerinnung derselben bei der Käseherstellung abgetrennt wird. Getrocknete Molke enthält etwa 13% Protein und 73% Lactose, Rest anorganische Salze. Eine kommerzielle Verwendung von Molke beruht auf der Fermentierung derselben und der Zugabe des Fermentats in Backwaren, worin das Molkenprodukt als Mykostatikum wirkt. Die Frischedauer von Backwaren, die derartige Molkenprodukte enthalten, ist wesentlich länger als diejenige von entsprechenden

Backwaren ohne solche Zusätze. Es ist festgestellt worden, dass der aktive mykostatische Wirkstoff im Molkenprodukt Propionsäure ist, welche während des Fermentierungspro-zesses der Molke hergestellt wird.

Bakterienstämme zur Ausführung der genannten Fermentation werden unter anderem in den US-Patenten Nrn. 1 910 130 und 1 898 320 vorgeschlagen; sie umfassen auch Bacterium acidi-propionici. Gemäss früheren Spezifikationen von Molkenfermentierungs-Verfahren war es wünschenswert, die Molke zu sterilisieren und sie dann mit einer bekannten, nicht pathogenen Kultur zu fermentieren. Dadurch wurden einmal pathogene Organismen aus dem Produkt ausgeschlossen und die Qualität und die Spezifikation des Produktes besser unter Kontrolle gehalten. Ein Verfahrensschritt der Fermentation ist die Sterilisation des Molkensubstrates. Diese Sterilisation muss so ausgeführt werden, dass sie die anschliessende Fermentation nicht negativ beeinflusst. Die Sterilisation ist jedoch notwendig, um alle Restorganismen in der Molke zu vernichten, und so deren Einführung in die Fermentation zu verhindern.

Weiter war es früher notwendig, eine schwierig zu handhabende und zu sterilisierende Aufschlämmung Ca-(OH)2/ NaOH oder M(OH)2NaOH bereitzustellen, um das gewünschte Calciumpropionat oder andere Propionate von zweiwertigen Metallen zu erhalten. Dieses Gemisch wird benötigt, um beim Neutralisationsschritt vor der Fermentation den pH zu regulieren. Oft wurde dabei steriles NaOH für die pH-Kontrolle verwendet; dies führt jedoch zum weniger gewünschten Natriumpropionat.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung eines Molkenfermentates mit einer Konzentration bis zu 2,6 Gew.-% an zweiwertigen Metallpropionaten, durch Sterilisierung und darauf Fermentierung von Molke mit zwischen 0,5 und 18 Gew.-% an Molkenfeststoffen mit einem Propionsäure produzierenden Mikro-Organismus, ist in den vorangestellten sieben Ansprüchen gekennzeichnet.

Im verbesserten, Zwei-Schritt-Fermentationsverfahren wird also das Calcium- oder das andere zweiwertige Metallion zugegeben, indem pasteurisierte Molke mit einem Galactose und Glucose verbrauchenden und Milchsäure produzierendem Mikro-Organismus oder Mischungen solcher Bakterienkulturen fermentiert wird, wobei der pH mittels Zugabe von Ca(OH)2 oder M(OH)2 kontrolliert wird. Diese fermentierte Molke weist nun eine relativ hohe Konzentration an Calciumlactat oder M-lactat auf, jedoch praktisch keine reduzierenden Zucker mehr. Sie wird nun sterilisiert und dann fermentiert mit einer reinen Mikro-Organismenkultur von Propionsäure produzierendem Bakterium, wodurch im Endprodukt eine hohe Konzentration von Calciumpropionat oder anderen zweiwertigen Metallpropionaten erreicht wird.

Um Calciumpropionat oder andere zweiwertige Metall-Propionate in ein funktionalisiertes Molkenprodukt einzubauen, wird pasteurisierte Molke mit einer Galactose und Glucose aufbrauchenden und Milchsäure produzierenden Bakterienkultur oder mit einer Mischung derartiger Bakterienkulturen fermentiert. Beispiele derartiger Mikro-Organis-men sind Lactobacillus acidophilus und Streptococcus thermophilus. Während der Fermentation wird Lactose in Milchsäure umgewandelt. Der pH-Wert wird dabei auf 5,5 bis 6,0 gehalten und zwar mittels Zugabe von Ca(OH)2 oder M(OH)2 oder Mischungen derselben. Nach etwa 18 Stunden ist die Fermentation abgeschlossen. Die erhaltene Brühe wird nun auf einen pH-Wert von 7 gebracht und zwar mittels Zugabe von Ca(OH)2 oder M(OH)2 oder Mischungen davon. Die Mischung wird nun UHT-sterilisiertund dann zusammen mit einer reinen Kultur von Propionsäure produzierenden Bakterienstämmen fermentiert. Der pH-Wert der

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reinen Kulturfermentation wird durch Zugabe von NaOH kontrolliert. Die vorliegende Milchsäure und alle Restgehalte an reduzierenden Zuckern werden dabei zu Calciumpropionat oder den andern Metallpropionaten umgewandelt. Durch Befolgen dieser Zwei-Fermentationsmethode wird ein Produkt erhalten, das hinsichtlich Propionaten 85% oder mehr Calciumpropionat oder andere zweiwertige Metallpro-pionate enthält.

Die Fermentation eines pasteurisierten Molkensubstrates aus nicht-hydrolysierter Molke (sauer oder süss) und Hefenextrakt, zusammen mit Milchsäure produzierenden Mikroorganismen, führt zur Bildung von Milchsäure. Diese anaerobe Fermentation kann bevorzugterweise in einem pH-Bereich von 4,0 bis 8,5, besser noch innerhalb eines pH-Bereiches von etwa 4,5 bis 6,0 ausgeführt werden. Die Fermentation kann ausgeführt werden bei Temperaturen von etwa 35 bis 60 °C, vorteilhafterweise bei Temperaturen von etwa 40 bis etwa 50 °C.

Eine typische Zusammensetzung von «Teklac» (süsse Molkerei-Molke) ist die folgende:

Chemische und physikalische Spezifikationen: Inhaltsstoffe Bezeichnung: Molke

Typische Gehalte an Hauptkomponenten

Proteine (N x 6.38)% 12,7

Fett % 1,1 (1,25% Maximum)

Feuchtigkeit % 4,5 (5,0% Maximum)

Asche % 8,0

Lactose % 71,3

Kalorien, Cal/100 g 350,0

Typische Gehalte an Vitaminen und Mineralien

Vitamin A I.U./100 g —

Vitamin C mg/ 100 g —

Thiamin mg/100 g 0,40

Riboflavin mg/100 g 1,76

Niacin mg/ 100 g 1,00

Calcium % 0,76

Eisen % —

Vitamin Bi2 ug/100 g 2,12

Phosphor % 0,69

Pantothensäure mg/100 g 4,09

Mikrobiologische Standardwerte Standard-Zählung 10 000/g (Maximum)

Coliformen 9/g (Maximum)

E. coli negativ

Salmonellen negativ

Die oben angegebenen Werte betreffend Nährstoffe liegen innerhalb der 80%-Limite der Werte gemäss Federai Nutritional Régulations 21 CFR§ 1.17(4)(ii), (USA).

Typischer Bereich Grenzwert

Löslichkeitsindex Acidität

Alkalinität der Asche Beschädigte Teilchen Partikelgrösse (durch 40 Mesh-Sieb)

0,1 -0,5 ml 0,10-0,14% 175-200 ml 7,5 ml

99-100%

1,25 ml Max. 0,16 Max. 225 ml Max. 15,0 mg Max.

98% Min.

Die Feststoffgehalte in der Molke liegen von 0,5 bis etwa 18,0 Gew.-%, bevorzugterweise von etwa 6 bis etwa 12 Gew.-%. Die Konzentration des zugegebenen Hefenextraktes in der Fermentations-Brühe liegt innerhalb von etwa 0,5 bis etwa 4,0%, bevorzugterweise innerhalb von etwa 0,3 bis etwa 2,0%. Genügend Hefenextrakt für beide Fermentationsschritte ist vor der ersten Fermentation zuzugeben; dies jedoch lediglich aus Vereinfachungsgründen. Die Zugabe der Hefenextrakte kann jedoch auch getrennt, vor jeder Fermentation, geschehen. Am Ende des ersten Fermentationsschrittes werden, bei Vorlage von etwa 8% Trockensubstanz in s der Molke, üblicherweise 5% Milchsäurekonzentration erhalten. Alle eben angegebenen Prozente sind Gewichte pro Volumen Prozente.

Die gemäss obiger Beschreibung pasteurisierte und dann fermentierte Molke wird nun mittels Zugabe von Ca(OH)2 io oder M(OH)i oder Mischungen davon neutralisiert, normalerweise auf einen pH-Wert von 6,0 bis 7,0. Anschliessend wird die Masse UHT-sterilisiert und dann, zusammen mit einem Propionsäure produzierenden Bakterium, fermentiert. Das bevorzugte, zweiwertige Metall-Hydroxid wird ausge-i5 wählt aus der Gruppe von Calciumhydroxid, Magnesiumhydroxid, Bariumhydroxid, Manganhydroxid oder Mischungen davon. Calciumhydroxid ist das weitaus bevorzugte zweiwertige Metallhydroxid. Diese anaerobe Fermentation kann ausgeführt werden in einem pH-Bereich von 5,5 bis 20 8,5. Bevorzugterweise wird der pH-Bereich jedoch dabei zwischen etwa 6,0 und etwa 7,0 gehalten. Die Fermentation kann ausgeführt werden bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40 C, bevorzugterweise jedoch bei Temperaturen zwischen etwa 35 und 40 CC. Bei Vorlage von etwa 12% Fest-25 stoffgehalt in die Vorfermentationszone werden, innerhalb von etwa 60 Stunden, üblicherweise Propionsäurekonzentra-tionen von etwa 2,6% erreicht.

Die bevorzugten Milchsäure produzierenden Bakterienstämme zur Verwendung als Starterkulturen in der Vorfer-3o mentationsphase sind die folgenden:

(a) Streptococcus thermophilus;

(b) Lactobacillus acidophilus;

(c) Lactobacillus bulgaricus und

(d) Mischungen der oben genannten Organismen.

35 Die obigen Stämme sind aufgrund ihrer Eigenschaft, Galactose und Glucose verwenden zu können, ausgewählt.

Die bevorzugten Propionsäure produzierenden Bakterien zur Verwendung im zweiten Fermentationsprozess sind: (a) Propionibacterium freudenreichii ss. shermanii und 40 (b) Propionibacterium acidi-propionici.

Die im erfindungsgemässen Verfahren angewandte UHT-Sterilisationsmethode ist eine solche, bei der die Molke mittels direkter Injektion von Dampf auf eine mittlere Temperatur von mindestens 140 °C gebracht wird und dort 45 etwa 4 bis etwa 20 Sekunden lang gehalten wird. Es sind verschiedene Ausrüstungen zur Ausführung derartiger Verfahren erhältlich, unter anderem ein Alpha-Laval-Sterilisator (hergestellt durch die Firma Alpha-Laval) oder ein APV-Wärmetauscher (hergestellt durch die Firma APV Company, so Inc. Tonawanda, N.Y.).

Die Präparation und die Herstellung der verschiedenen Milchsäure produzierenden Bakterienstämme:

Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus 55 und Lactobacillus bulgaricus werden in Agarschichten in MRS (Difco) aufbewahrt. Diese Präparate wurden 18 bis 24 Stunden lang bei 43 *C inkubiert und konnten anschliessend bis 6 Monate lang bei 4 ~C gelagert werden. Das Präparat wurde reaktiviert durch Behandeln mit 5 ml MRS-Nährlö-6o sung und durch Inkubieren desselben während 24 Stunden bei 43 "C. Das reaktivierte Präparat wurde anschliessend in einen 1000 ml Erlenmeyerkolben gebracht, in dem 500 ml steriles Medium vorlag. Das Medium enthielt 2% sprühgetrocknete süsse Molke und 1 % Hefeextrakt. Die Kolbén mit 65 Inhalten wurden nun inkubiert und zwar 18 bis 24 Stunden lang und dann bei 4 :C gelagert. Der Inhalt dieser Kolben wurde dann verwendet, um Laboratoriums-Fermentatoren zu inokulieren.

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Herstellung und Aufbewahrung von Propionsäure herstellenden Bakterienstämmen:

Stämme von P. shermanii wurden in Röhrenbehältern, enthaltend Natriumlactat, aufbewahrt (10 g Trypticase, 10 g Hefeextrakt. 10 g Natriumlactat, 0,25 g K2HPO4, 12 g Agar, 1 Liter entionisiertes Wasser; 50 ml/25 mm x 150 mm Schraubverschluss-Rohre). Diese Behälter wurden inokuliert und dann 72 Stunden lang bei 30 C inkubiert. Hierauf konnten sie bis zu 6 Monate lang bei 4 "C gelagert werden. Die Reaktivierung der in den Röhrenbehältern aufbewahrten Kulturen geschah durch Zugabe von 10 ml Hansen's Glucose-Nährlösung (HGB) (20 g Trypticase, 5 g Hefeextrakt, 5 g Glucose, 1 Liter entionisiertes Wasser) und durch Inkubierung der Proben bei 30 "C während 48 Stunden.

Eine Schüttelflasche mit einem 2%-Teklac-Medium wurde mit 10 ml HGB aus einem reaktivierten Röhrenbehälter (P. shermanii) inokuliert. Solche Flaschen wurden nun 24 Stunden lang inkubiert. Diese Kulturen wurden dann verwendet zur Inokulation der Produktions-Fermenter.

Medium zur Präparation von Milchsäure produzierenden Bakterienstämmen und Betrieb des 14-Liter Laboratoriums-Fermenters:

Frisch pasteurisierte Molke mit einem ungefähren Gehalt an Feststoff von 6,5% wurde als Medium für das Biuld-up des Inokulum benutzt. Vor der Verwendung wurde der Mi-krofilm-Glas-Fermenter der New Brunswick Scientific, Edison, N.J., sterilisiert, und zwar durch Behandlung desselben bei 250 F während 30 Minuten in einem Autoklaven. 12 Liter der pasteurisierten Molke wurden dann mit dem Milchsäure produzierenden Organismus inokuliert. Der Fermenter wurde bei 43 C betrieben, wobei kein Gasdurchtritt erfolgte. Das Rührwerk lief mit 120—160 UpM, und der pH wurde mittels Zugabe von konzentrierter NaOH (25%) auf etwa 6,5 gehalten.

Medium für die Präparation von Laboratoriums-Inokulum in 6-Liter Schüttelflaschen:

Die Vorlage an Molkensubstrat enthielt 1% getrocknete süsse Molke, 1 % Hefenextrakt, 0,03% Thioglykolsäure und 0,25% Calciumcarbonat. In jeder Schüttelflasche wurden 4 Liter derartigen Mediums gegeben, zusammen mit 3 Tropfen FG-10 Antifoam (Dow Chemical Corp.). Die Flaschen wurden in einem Autoklaven mit Dampf sterilisiert und zwar 50 Minuten lang bei 250 'F. Nach der Inokulation der Flascheninhalte wurden dieselben in einem G-25 Schüttelap-parat/Inkubator der New Brunswick Scientific, Edison, N.J., 48 Stunden lang bei 30 CC inkubiert.

Gehaltsbestimmungen:

Die Gehalte an Milchsäure und Lactose wurden in einem Hochdruckflüssigchromatographie-Apparat von Water Instruments, New Milford, Mass., ausgeführt. Die Gehalte an Propionsäure (HPr) und Essigsäure (HAc) wurden mittels Gaschromatographie bestimmt. Dazu wurde ein Gaschromatograph, Packard Modell 5880A, mit einer Kapillarkolonne (J & W DX4-Kolonne) und einem Flammenionisationsdetektor verwendet. Die Kolonnentemperatur war programmiert; Beginn 90 C, Ende 250 C, mit einer Temperatursteigerung von 10 "C pro Minute; die Temperaturen des Injektors und des Detektors betrugen 275 ~C. Das Trägergas war Helium; die Durchtrittsgeschwindigkeit betrug 1,5 ml pro Minute. Muster wurden so hergestellt, dass jeweis 5 ml der Fermentations-Brühe zu 45 ml einer 2-%igen Phosphorsäure-Lösung gegeben wurden, welche letztere Lösung einen internen Standard an Valeriansäure enthielt. Zellen und andere suspendierte Feststoffe wurden mittels Filtration abgetrennt; verwendet wurde ein 0,45-um-Arcodisc der Firma Gillman Scientific. 1 ml des angesäuerten Filtrâtes wurde in die Messanlage injiziert, und zwar mittels einer 1,0-ul-Hamilton-N701-Spritze. Die erhaltenen Resultate wurden mit Werten auf einer Standardkurve verglichen.

Beispiel 1

Batsch-Fermentationen von UHT-sterilisierten Molkensubstraten mit 12% Molke plus 1% Hefenextrakt enthielten, bei Zugabe von reinen Kulturen von P. shermanii, nach 70 Stunden 1,6-2,2% Propionsäure. Über 50% der Lactose wurden dabei nicht aufgebraucht. Die Tabelle I zeigt die Resultate einer typischen Fermentationsreaktion:

Tabelle I

Zeit (h) Lactose Propionsäure Essigsäure

0 6,5 -

23 5,4 0,5 0,2

48 5,2 1,2 0,3

66 3,8 1,6 0,4

Beispiel 2

Frische Molke (10% Feststoffgehalt) wurde ohne pH-Ajustierung, im Eingangszustand, pasteurisiert. Dann wurde die Fermentation mittels Zugabe von Galactose und Glucose verwendenden Stämmen von Lactobacillus acidophilus und Streptococcus thermophilus initiiert.

Sobald der pH auf etwa 4,3 abgenommen hat, wurde genügend Kalkaufschlämmung zugegeben, um die entstandene Milchsäure zu neutralisieren und um den pH-Wert wieder auf etwa 6 zu bringen. Dieses Verfahren wurde so oft wiederholt, bis keine pH-Ajustierung mehr notwendig war. Zu diesem Zeitpunkt enthielt die Fermentations-Brühe keine Spur mehr von reduzierenden Zuckern.

Der pH des Mediums wurde nun durch Zugabe von Kalkaufschlämmung auf 7 eingestellt, das Medium UHT-sterilisiert und dann mit P. shermanii inokuliert. Kaustische Soda wurde zugegeben, und zwar während der nächsten 24 Stunden, um in dieser Zeit den pH-Wert auf 7 zu halten. Am Schluss wurde die Zugabe von Soda verringert, sodass der Endwert des pHs der Brühe 6 betrug. Die entsprechenden Messwerte sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt. 56 Stunden nach Beginn der Fermentation betrug die Konzentration an Propionsäure 2,5 Gew.-%.

Tabelle II

P. shermanii-induzierte Fermentation von vorfermentiertem Molken-Medium;

pH-Kontrolle mittels sterilem NaOH aufwerte zwischen 6 und 7 Gewichtsprozente im Fermentationsmedium

Zeit (h)

Lactose

Galactose

Milchsäure

Propionsäure

Essigsäure

0

N.F.

0,1

5,3

-

—

8

0,1

N.F.

3,6

0,7

0,5

16

0,1

3,2

1,0

0,2

24

N.F.

0,1

2,4

1,4

0,8

32

0,1

1,8

1,7

0,9

40

0,1

N.F.

1,0

2,1

1,1

48

0,2

0.1

0,6

2,3

1,1

56

0,1

0,4

2,5

1,2

N.F. = Nicht feststellbar

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Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines Molkenfermentates mit einer Konzentration bis zu 2,6 Gew.-% an zweiwertigen Metallpropionaten durch Sterilisierung und darauf Fermentierung von Molke mit zwischen 0,5 und 18 Gew.-% an Molkenfeststoffen mit einem Propionsäure produzierenden Mi-kro-Organismus, gekennzeichnet durch

(a) Bilden einer Vorfermentations-Brühe aus der Molke und einem Hefenextrakt,

(b) Fermentieren der Vorfermentations-Brühe zusammen mit einem Galactose und Glucose oder einer Mischung aus Galactose und Glucose verbrauchenden und Milchsäure produzierenden Mikro-Organismus, um die Lactose in der Molke zu Milchsäure zu fermentieren,

(c) Neutralisieren der fermentierten Milchsäure enthaltenden Vorfermentierungs-Brühe mittels eines zweiwertigen Metall-Hydroxids und

(d) Einsetzen der neutralisierten, Hefenextrakt und Fermenta tions-Milchsäure enthaltenden Vorfermentierungs-Brühe, vor der Sterilisation, als Molke in der Fermentation mit dem Propionsäure produzierenden Mikro-Organismus.
2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, bei dem das zweiwertige Metall-Hydroxid ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe: Ca-Hydroxid, Mg-Hydroxid, Ba-Hydroxid, Mn-Hydroxid und Mischungen davon.
3. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, bei dem die Sterilisation mittels direkter Dampfinjektion ausgeführt wird, wodurch eine mittlere Molkentemperatur von mindestens 140 °C während 4 bis 20 Stunden erreicht wird.
4. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, bei dem der Milchsäure produzierende Mikro-Organismus ausgewählt ist aus Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophi-lus, Lactobacillus bulgaricus und Mischungen davon und bei dem der Propionsäure produzierende Mikro-Organismus ausgewählt ist aus Propionibacterium freudenreichii ss. sher-manii und Propionibacterium acidi-propionici und Mischungen davon.
5. Verfahren gemäss Patentanspruch 4, bei dem der Milchsäure produzierende Mikro-Organismus eine Mischung von Lactobacillus acidophilus und Streptococcus thermophilus und der Propionsäure produzierende Mikro-Organismus Propionibacterium freudenreichii ss. shermanii ist.
6. Verfahren gemäss Patentanspruch 5, bei dem die Konzentration des Hefeextraktes zwischen 0,3 und 2 Gew.-% liegt.
7. Verfahren gemäss Patentanspruch 6, bei dem die Konzentration der Molkenfeststoffe zwischen 0,6 und 12,0 Gew.-% liegt.