CH636595A5 - Procede de preparation de derives de l'acide n-(phosphonoacetyl)-l-aspartique et derives nouveaux ainsi obtenus. - Google Patents

Description

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REVENDICATIONS

1. Composé, caractérisé par son appartenance au groupe suivant: sel disodique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique et les esters P-éthylique et dibenzylique correspondants; l'ester di-benzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique et les sels de N.N'-dibenzyléthylènediamine et de cyclohexylamine correspondants; l'ester tétraéthylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique et l'ester diméthyl-P,P-diéthylique correspondant; les sels de calcium, de pipérazine et de cyclohexylamine de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique.

2. Composé selon la revendication 1, qui est le sel disodique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique.

3. Composé selon la revendication 1, qui est le sel disodique de l'ester P-éthylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique.

4. Composé selon la revendication 1, qui est le sel disodique de l'ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique.

5. Composé selon la revendication 1, qui est l'ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique.

6. Composé selon la revendication 1, qui est le sel de N,N'-dibenzylêthylènediamine de l'ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique.

7. Composé selon la revendication 1, qui est le sel de cyclohexylamine de l'ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique.

8. Composé selon la revendication 1, qui est l'ester tétraéthylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique.

9. Composé selon la revendication 1, qui est l'ester diméthyl-P,P-diéthylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique.

10. Composé selon la revendication 1, qui est le sel de calcium de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique.

11. Composé selon la revendication 1, qui est le sel de pipérazine de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique.

12. Composé selon la revendication 1, qui est le sel de cyclohexylamine de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique.

13. Procédé de préparation de l'ester dibenzylique de PALA, caractérisé par le fait que l'on fait réagir l'acide L-aspartique avec l'alcool benzylique et l'acide p-toluènesulfonique pour obtenir l'ester dibenzylique du p-toluènesulfonate de l'acide L-aspartique, puis on fait réagir l'ester dibenzylique du p-toluènesulfonate de l'acide L-aspartique avec de la triéthylamine, on ajoute du chlorure de l'acide phosphonoacétique pour produire l'ester dibenzylique de PALA et finalement on sépare ledit ester du chlorure de l'acide phosphonoacétique qui n'a pas réagi.

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait que l'on sépare l'ester dibenzylique de PALA du chlorure de l'acide phosphonoacétique qui n'a pas réagi par lavage à l'eau, pour éliminer le chlorure de l'acide phosphonoacétique.

15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé par l'utilisation de perchloréthylène comme milieu d'estérification de la réaction de l'acide L-aspartique avec l'alcool benzylique et l'acide p-toluène-sulfonique.

16. Procédé de préparation du sel tétrasodique de PALA, caractérisé par le fait que l'on prépare l'ester dibenzylique de PALA selon le procédé de la revendication 13, que l'on hydrolyse l'ester dibenzylique de PALA par une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium pour obtenir un mélange contenant le sel tétrasodique de PALA.

17. Procédé de préparation du sel tétrasodique de PALA, caractérisé par le fait que l'on prépare un mélange contenant le sel tétrasodique de PALA selon le procédé de la revendication 16, on soumet ledit mélange à un procédé d'échange d'ions pour obtenir l'acide PALA libre, on titre l'acide libre avec de l'hydroxyde de sodium jusqu'à un pH de 9,2 pour former le sel tétrasodique de PALA et on récupère le sel.

18. Procédé pour la préparation du sel disodique de PALA, caractérisé en ce qu'on prépare un mélange contenant le sel tétrasodique de PALA selon le procédé de la revendication 16, on dissout ledit mélange dans de l'acide acétique glacial, on dilue la solution obtenue avec de l'éthanol pour faire précipiter le sel disodique de PALA et que l'on récupère ledit sel disodique de PALA.

19. Procédé de préparation du sel disodique de PALA, caractérisé par le fait que l'on prépare l'ester dibenzylique de PALA selon le procédé de la revendication 13, on fait réagir ledit ester avec de la N,N'-dibenzyléthylènediamine pour produire le sel de N,N'-dibenzyléthylènediamine de l'ester dibenzylique de PALA et que l'on soumet ledit sel à une hydrolyse pour produire un mélange contenant le sel tétrasodique de PALA, on dissout ledit mélange dans de l'acide acétique glacial, on dilue la solution obtenue avec de l'éthanol pour faire précipiter le sel disodique de PALA et l'on récupère ledit sel disodique de PALA.

20. Procédé de préparation du sel disodique de PALA, caractérisé par le fait que l'on fait réagir l'acide L-aspartique avec l'alcool benzylique et l'acide p-toluènesulfonique pour obtenir l'ester dibenzylique du p-toluènesulfonate de l'acide L-aspartique, on fait réagir ledit ester avec de la triéthylamine, on ajoute du chlorure de l'acide phosphonoacétique pour produire l'ester dibenzylique de PALA, on ajoute de la cyclohexylamine pour produire le sel de cyclohexylamine dudit ester dibenzylique de PALA, puis on fait réagir ledit sel de cyclohexylamine avec de l'hydroxyde de sodium pour produire le sel tétrasodique de PALA, on fait réagir le sel tétrasodique de PALA avec de l'acide acétique pour produire le sel disodique de PALA, et on fait précipiter le sel disodique obtenu, deux fois dans l'eau, la seconde précipitation incluant l'addition goutte à goutte d'une solution aqueuse dudit sel disodique à un tourbillon d'éthanol brassé vigoureusement, ce qui provoque l'élimination des impuretés sous forme d'acide acétique et d'acétate de sodium.

21. Procédé de préparation du sel de cyclohexylamine de l'ester dibenzylique de PALA, caractérisé par le fait que l'on fait réagir l'acide L-aspartique avec l'alcool benzylique et l'acide p-toluène/sulfonique pour obtenir l'ester dibenzylique du p-toluène-sulfonate de l'acide L-aspartique, on ajoute du chlorure de l'acide phosphonoacétique pour produire l'ester dibenzylique de PALA et on fait réagir ledit ester avec la cyclohexylamine.

Le tétraacide libre, l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (désigné dans cette description par l'abréviation PALA) est un produit connu. La présente invention se rapporte à de nouveaux composés de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (PALA), spécialement le sel disodique de PALA et aux procédés de préparation des composés de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique. Un aspect particulier de cette invention se réfère à la préparation sur grande échelle du sel tétrasodique connu et du nouveau sel disodique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique. Le tétraacide connu, l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (PALA), a été préparé pour la première fois par Stark et al., «J. Biol. Chem.», 246, 6599 (1971). Le sel tétrasodique de PALA est connu comme agent antitumeur, d'après la littérature et particulièrement d'après «Cancer Research», 36, 2720 (1976), mentionné ici comme référence. Par exemple, la durée de survie de souris portant une leucémie intrapéri-tonéale de type P388 a été prolongée jusqu'à 64% (lors de traitement avec le sel tétrasodique de PALA dans un domaine de 188 à 750 mg/kg, i.p.). Le sarcome de Lewis du poumon chez les souris est très sensible à l'action du sel tétrasodique de PALA lors d'applications i.p. de doses de 240 à 490 mg/kg. Des souris porteuses de méla-nomes B16 survécurent de 77 à 86% plus longtemps que les témoins quand elles avaient été traitées avec du sel tétrasodique de PALA (490 mg/kg, i.p.).

Alors que la synthèse du tétraacide PALA est directe, la préparation du sel tétrasodique, spécialement en quantités de l'ordre de 1 kg, s'est révélée être un problème majeur. Les procédés de cette invention sont particulièrement bien adaptés à la production de telles quantités.

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Les nouveaux composés de PALA sont le sel disodique de l'acide N-(phosphonoacètyl)-L-aspartique et les esters P-éthylique et dibenzylique correspondants; l'ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacêtyl)-L-aspartique et les sels de N,N'-dibenzyl-éthylènediamine et de cyclohexylamine correspondants; l'ester tétra-éthylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique et l'ester diméthyl-(P,P-diêthylique) correspondant; le sel de calcium de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique et les sels de pipérazine et de cyclohexylamine de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique.

Les nouveaux produits de cette invention possèdent une activité antitumeur in vivo ou sont des intermédiaires dans la fabrication de composés de PALA actifs contre les tumeurs et qui, contrairement au sel tétrasodique de PALA connu, ne sont pas hygroscopiques ou sont des poudres mobiles et non adhérentes.

Certains de ces composés de PALA existent sous forme anhydre et certains existent sous forme solvatée (y compris les formes hydratées). Les deux formes sont appropriées aux applications de cette invention. Le sel disodique de PALA, produit par les procédés de cette invention, est un hydrate dont la teneur en eau d'hydratation diffère d'une préparation à l'autre entre environ 0,2 à 2 mol d'eau. Le produit peut contenir certains solvants comme l'éthanol (entre 0,1 et 0,5 mol environ), l'acide acétique (entre 0,03 et 0,4 mol environ) et l'acétate de sodium (environ 0,2 mol). L'acide acétique et l'éthanol peuvent être éliminés par lyophilisation. Deux ou trois lyophilisations permettent l'élimination totale des solvants. Le sel disodique de PALA obtenu par ces méthodes peut aussi contenir des quantités importantes de sel trisodique, cela jusqu'à environ 30 à 40% de sel trisodique. Tous les solvatés du sel disodique de PALA, dé même que les mélanges de sel disodique et trisodique de PALA, doivent être compris comme inclus dans le terme sel disodique de PALA (terme équivalent) utilisé ici, étant donné que les formes de ce produit sont interchangeables dans leur utilisation comme agent antitumeur dont les formulations sont recouvertes par cette invention. Dans son utilisation comme agent antitumeur, le sel disodique de PALA présente une activité et une toxicité équivalentes à celles du sel tétrasodique de PALA connu. Le sel disodique de PALA peut être utilisé pour son activité antitumeur, comme décrit dans cette présentation, sous forme de compositions pharmaceutiques et d'un support pharmaceutique convenable. Les compositions peuvent aussi contenir des agents antimicrobiens ou d'autres agents antitumeur. Les compositions peuvent être faites sous n'importe quelle forme pharmaceutique appropriée à la voie d'administration considérée. Des exemples de telles compositions comprennent les formes solides pour l'administration par voie orale telles que tablettes, capsules, pilules, poudres et granulés, les formes liquides pour l'administration topique ou orale telles que solutions, suspensions, sirops et êlixirs et les préparations pour administration parentérale telles que solutions stériles, suspensions ou émulsions. Pour l'utilisation comme agent antitumeur, les compositions sont administrées en doses telles que la croissance de la tumeur est arrêtée. Un traitement suggéré dans l'utilisation comme agent antitumeur chez les mammifères consiste en l'administration parentérale unique, journalière, de 50 à 500 mg de sel disodique de PALA par kilo (injection intraveineuse d'une solution aqueuse à 2%). Le nouveau sel de calcium de PALA est équivalent au point de vue pharmaceutique, pour les applications de cette invention, au sel disodique de PALA et peut donc être utilisé au lieu de ou en combinaison avec le sel disodique de PALA dans les combinaisons mentionnées ci-dessus. Le sel de calcium de PALA présente des propriétés de solubilité intéressantes, il se dissout dans l'eau, ce qui permet de concevoir une formulation directe; cependant, il se dissout relativement lentement, ce qui permet l'élimination des impuretés inorganiques par lavage à l'eau.

Le nouveau sel disodique de PALA est une poudre mobile et non adhérente qui peut être directement manipulée, analysée et pesée pour la préparation des compositions désirées. A l'opposé du sel tétrasodique de PALA connu, il est relativement non hygroscopique. Le sel tétrasodique de PALA absorbe l'humidité atmosphérique 1,5 fois plus rapidement que le sel disodique de PALA et est difficile

à manipuler et à analyser. Alors que le sel tétrasodique de PALA est soluble dans l'eau, le sel disodique a une solubilité dans l'eau plus grande que 950 mg/ml. Une solution à 2% (poids/volume) dans l'eau de sel disodique de PALA présente un pH caractéristique d'environ 4; des solutions semblables de sel trisodique et tétrasodique de PALA ont des pH d'environ 6 respectivement 9.

On peut aussi caractériser le sel disodique de PALA par son spectre de résonance magnétique nucléaire (RMN) à 60 MHz qui montre typiquement un doublet correspondant au groupe méthylène (—CH2) qui est en position a par rapport au groupe —CH, alors que le sel tétrasodique de PALA a un spectre RMN caractéristique qui montre un multiplet de trois lignes correspondant au groupe méthylène mentionné.

Les esters tétraéthylique et diméthyl-P,P-diéthylique de PALA sont obtenus directement sous forme anhydre et leur analyse élémentaire présente une concordance excellente entre les valeurs obtenues et les valeurs calculées. Par exemple, la différence maximale entre les valeurs obtenues et calculées pour l'hydrogène pour ces tétraesters est de 0,03%, comparée à une différence maximale de 1,27% pour le sel tétrasodique de PALA.

La cyclohexylamine et la pipérazine forment des sels solides de PALA. De plus, le sel de la cyclohexylamine est complètement non hygroscopique.

Selon une mise en œuvre de l'invention, un procédé de préparation des composés de PALA comprend l'étape qui consiste à faire réagir l'acide L-aspartique avec l'alcool benzylique et l'acide p-toluènesulfonique pour obtenir l'ester dibenzylique p-toluènesulfonate de l'acide L-aspartique. On fait ensuite réagir l'ester dibenzylique p-toluènesulfonate de l'acide L-aspartique avec la triéthylamine, on ajoute du chlorure de l'acide phosphonoacétique pour produire l'ester dibenzylique de PALA et on sépare l'ester dibenzylique de PALA du chlorure de l'acide phosphonoacétique qui n'a pas réagi. Le dibenzylester de PALA est isolé de manière appropriée. Etant donné qu'il est insoluble dans l'eau, l'ester dibenzylique de PALA et le chlorure de l'acide phosphonoacétique qui n'a pas réagi sont séparés de préférence en lavant le mélange avec de l'eau de manière à éliminer le chlorure de l'acide phosphonoacétique.

Suivant une autre mise en œuvre, l'ester dibenzylique est soumis à une hydrolyse par de l'hydroxyde de sodium pour obtenir un mélange contenant du sel tétrasodique de PALA, décrit par la suite par le terme de mélange.

Une autre mise en œuvre comprend l'étape qui consiste à soumettre le mélange à un procédé d'échange d'ions pour obtenir l'acide N-phosphonoacétyle-L-aspartique sous forme libre, puis on titre l'acide libre jusqu'à un pH de 9,2 et on récupère le sel tétrasodique de PALA ainsi purifié.

Une autre mise en œuvre comprend l'étape qui consiste à dissoudre ledit mélange dans de l'acide glacial, puis on dilue la solution obtenue avec de l'éthanol pour faire précipiter le sel disodique de PALA et récupérer ainsi ledit sel disodique de PALA.

Une autre mise en œuvre comprend l'étape qui consiste à faire réagir l'ester dibenzylique de PALA avec la N,N'-dibenzyléthylène-diamine pour produire le sel de N,N'-dibenzyléthylènediamine de l'ester dibenzylique de PALA, puis on soumet ledit sel à une hydrolyse pour produire un mélange contenant le sel tétrasodique de PALA, on dissout ensuite le mélange dans de l'acide acétique glacial, puis on dilue la solution obtenue avec de l'éthanol pour faire précipiter le sel disodique de PALA et récupérer ainsi ledit sel disodique de PALA.

Une autre mise en œuvre comprend l'utilisation de perchlor-éthylène comme milieu d'estérification dans la réaction de l'acide L-aspartique avec l'alcool benzylique et l'acide p-toluènesulfonique monohydraté. Dans la préparation du dibenzylaspartate, le perchloréthylène est le solvant préféré. Il forme un excellent azéo-trope avec l'eau, son point d'ébullition est assez haut, de sorte qu'une estérification sur grande échelle est rapidement obtenue (dans les 3 h) et, en même temps, la stabilité du produit n'est pas

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affectée par la température, du moins pendant le court temps de contact thermique.

Une autre mise en œuvre comprend l'étape qui consiste à faire réagir le sel de cyclohexylamine de l'ester dibenzylique de PALA avec de l'hydroxyde de sodium pour produire le sel tétrasodique de l'acide N-phosphonoacétyl-L-aspartique, puis on fait réagir ledit sel tétrasodique avec de l'acide acétique pour produire le sel disodique de PALA, et on reprécipite deux fois dans l'eau le sel disodique obtenu, la seconde précipitation comprenant l'addition goutte à goutte d'une solution aqueuse de sel disodique à de l'éthanol agité vigoureusement, permettant ainsi l'élimination des impuretés qui consistent en acide acétique et en acétate de sodium.

La production de sel disodique de PALA selon cette invention offre les avantages suivants: 1) un temps plus court est requis pour la synthèse du produit, cela étant dû à: a) l'élimination totale des colonnes échangeuses d'ions, et b) à une réduction substantielle du volume d'eau à évaporer; 2) le coût prévu pour une quantité de 5 kg de produit est au moins de 30% inférieur au coût de 5 kg de sel tétrasodique de PALA; 3) les analyses cohérentes de basse teneur en hydrogène associées au sel tétrasodique de sodium ne sont plus un problème; 4) la synthèse est directement applicable sur une grande échelle; 5) le produit obtenu est moins hygroscopique que le sel tétrasodique de PALA et, à l'opposé du sel tétrasodique, c'est une poudre fluide et non adhérente qui peut être directement manipulée et pesée pour la préparation de compositions, et 6) le produit est très soluble dans l'eau.

Une autre mise en œuvre comprend l'étape qui consiste à faire réagir l'ester dibenzyl-p-toluènesulfonate de l'acide L-aspartique avec la triéthylamine, puis on ajoute du chlorure de l'acide phosphonoacétique pour produire l'ester dibenzylique de PALA et on fait réagir ledit ester avec de la cyclohexylamine pour produire le sel de cyclohexylamine dudit ester dibenzylique.

Les exemples suivants illustrent la présente invention.

Exemple 1:

Ester dibenzyl-p-toluènesulfonate de l'acide L-aspartique (I)

Un mélange d'acide L-aspartique (399 g; 3,00 mol), d'alcool benzylique (1,95 kg; 18,0 mol), d'acide p-toluènesulfonique mono-hydraté (582 g; 3,06 mol) et de benzène anhydre (1,21) est agité et chauffé sous reflux pendant 16 h. L'eau formée pendant la réaction (145 ml) est éliminée par un appareil de Dean-Stark. La solution résultante est refroidie à température ambiante, puis diluée avec du benzène (1,2 1) et de l'éther (3,61). Le solide obtenu est recueilli sur un filtre, lavé à l'éther (7,01) et séché; rendement 1195 g (82%).

Le produit brut est recristallisé dans le méthanol (1720 ml) pour donner 959 g (80% de récupération) de produit (I) purifié; P.F. 158-159,5 ; P.F. 158-160° donné dans la littérature.

D'autres synthèses similaires ont été effectuées pour obtenir une quantité totale de 4,27 kg de produit prêt à être transformé ultérieurement.

Acide phosphonoacétique (II)

Une solution de triéthylphosphonoacétate (900 g; 4,01 mol) dans de l'acide chlorhydrique 6M (6,11) est agitée et chauffée sous reflux pendant 6,5 h. La solution est ensuite concentrée sous vide, puis les dernières traces d'eau sont éliminées par coévaporation avec du benzène (2 x 300 ml). Le résidu solide est recristallisé deux fois dans 1,01 d'acide acétique glacial pour donner 342 g (60,8%) d'acide (II); P.F. 140-141 ; P.F. de la littérature: 143°.

D'autres synthèses similaires ont été effectuées pour obtenir une quantité totale de 1020 g de produit prêt à être transformé ultérieurement.

Chlorure de l'acide phosphonoacétique (III)

Un mélange d'acide phosphonoacétique (II) (355 g; 2,54 mol) et de chlorure de thionyle (1770 ml) est agité et chauffé pendant 4,5 h entre 50 et 55 ". La solution résultante est concentrée sous vide

( < 35 ; pression de la trompe 1 mmHg) pour donner 395,7 g (98,3%) de produit. Le matériel jaune huileux est utilisé dans les réactions suivantes sans autres caractérisations.

Ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (IV) A une suspension froide (15 ) d'ester dibenzyl-p-toluènesulfonate d'acide L-aspartique (I) (812 g; 1,67 mol) dans du dioxanne anhydre (5,21), on ajoute goutte à goutte pendant 30 min de la triéthylamine (486 g; 4,80 mol). La solution résultante est brassée pendant 30 min à 15 , puis on ajoute du chlorure de l'acide phosphonoacétique (III) (395,7 g; 2,500 mol) dissous dans du dioxanne anhydre (600 ml), goutte à goutte, pendant 1 h. La température est maintenue en dessous de 15' pendant l'addition. Le bain réfrigérant est enlevé et le mélange réactionnel est alors brassé pendant 1 h. Les produits insolubles sont ensuite éliminés par filtration et lavés avec du dioxanne (2,0 1). Le filtrat est concentré sous vide et le résidu huileux est dissous dans du benzène (10,1 1). La solution organique est lavée avec de l'eau (6 x 4,01), séchée sur du sulfate de magnésium, puis évaporée sous vide pour donner 568 g (78,1 %) d'un produit solide jaune prêt à subir d'autres transformations.

Sel tétrasodique de l'acide N-phosphonoacétyl-L-aspartique-4,5H20 (PALA) (VII).

A une solution froide (10°) d'hydroxyde de sodium (312 g; 7,80 mol) dans 101 d'eau, on ajoute en une fois de l'ester dibenzylique de l'acide N-phosphonoacétyl-L-aspartique (IV) (568 g; 1,30 mol) en remuant. Le mélange est brassé à 10-15° pendant 6 h, puis les parties insolubles sont éliminées par filtration. Le filtrat est concentré sous vide jusqu'à un volume de 3,0 1 qui est alors extrait par du chlorure de méthylène (1 x 1,3 1) et de l'éther (1 x 1,3 1). La solution aqueuse est versée dans 12,01 d'éthanol, ce qui provoque la précipitation d'un semi-solide. Après décantation, le produit est dissous dans l'eau (680 ml) et des portions égales de solution sont versées dans deux colonnes échangeuses d'ions, remplies de résine cationique AG 50W-X8 (forme hydrogène) de 9,6 x 25 cm. Chaque colonne est éluée par 2,01 d'eau (20 portions de 100 ml). Le fractions 7-14 de chaque colonne, qui contiennent le produit désiré comme déterminé par CCM, sont combinées et évaporées, sous vide (température du bain <30°). Le résidu huileux est dissous dans l'acétone (2,0 1), on ajoute du charbon actif (50 g) et on brasse pendant 18 h à température ambiante. Les parties insolubles sont éliminées par filtration puis le filtrat est évaporé à sec sous vide. Le résidu semi-solide (tétraacide; 227,1 g) est dissous dans 2,01 d'eau. On refroidit la solution, en remuant, jusqu'à 10°, puis on titre par une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium IN jusqu'à un pH de 9,2 (3123 ml). La solution de base est évaporée sous pression réduite (1-2 mmHg; <30°) et le résidu huileux est trituré avec de l'acétone (5,8 1). Le matériel solide est séché en partie sous vide, puis trituré avec de l'acétone (2,0 1) et de l'éther (2,01). La poudre résultante est séchée sous pression réduite sur du pentoxyde de phosphore pendant 9 d à température ambiante pour donner 272,2 g du produit désiré.

Analyse pour C6H6N08P-4Na-4,5H20:

Calculé: C 16,99 H 3,56 N3,30 P7,30 Na 21,68%

Trouvé: C 16,76 H 2,29 N 3,46 P7,31 Na 21,61%

Données spectrales:

Résonance magnétique nucléaire (D20)

82,29 (m, 4, — CH2 en a de P H—CH2 en a de — CH); 4,13 (m, 1, -CH)

Rotation optique

Observée Littérature

[a]y + 9,44 (c, 3,743 dans l'eau) [a]^f + 10,30 (c, 3,798 dans l'eau)

Chromatographie :

Chromatographie sur couche mince ( CCM)

(Cellulose, plaques de verre Quanta/Gram Q2F)

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Phases mobiles Valeurs de R/

1. Ethanol/hydroxyde d'ammonium/eau (6/1 /3) 0,13

2. n-Butanol/acide acétique/eau (5/2/3) 0,30

(traînées)

3. Chlorure de lithium (0,6M)/éthanol/hydrate d'ammonium (5/5/1 ) 0,61

4. Ethanol/eau (2/3) 0,81

Quantité appliquée: 112 |xg.

Détection : Phospray (réactif du commerce pour la visualisation des composés contenant du phosphore).

Résultats: Le produit migre en une seule tache dans chaque essai de phases mobiles différentes. La CCM de l'acide libre libéré à partir du sel tétrasodique par de l'acide chlorhydrique donne un test négatif pour l'acide aspartique lorsqu'on le pulvérise avec de la nin-hydrine.

Exemple 2:

Sel disodique de l'acide N-phosphonoacétyl-L-aspartique-1,1 H20.

Du sel tétrasodique de l'acide N-phosphonoacétyl-L-aspar-tique'4,5H20 (VII) (10,0 g; 0,236 mol) est dissous dans de l'acide acétique glacial (125 ml) bouillant (90°). De la célite est ajoutée à la solution trouble bouillante (5 g), puis les parties insolubles sont éliminées par filtration. Le filtrat éclairci, jaune foncé, est refroidi puis dilué dans l'éthanol (300 ml) et le mélange résultant est brassé à température ambiante pendant 30 min. Le solide qui a précipité est recueilli sur un filtre, lavé par remise en suspension dans l'éthanol (3 x 300 ml) et l'éther (1 x 300 ml), puis séché pour donner 5,7 g (80,8%) de sel disodique sous forme de poudre blanche. On prépare de manière similaire 5,0 g supplémentaires de produit. Les produits rassemblés (10,7 g) qui sont contaminés par de l'acide acétique et de l'éthanol (déterminés par RMN) sont dissous dans de l'eau (250 ml). La solution est clarifiée par filtration puis lyophilisée. Le procédé de lyophilisation est répété deux fois de plus, puis le produit est séché jusqu'à poids constant sous vide à 40° sur du pentoxyde de phosphore; rendement du produit analytiquement pur: 9,0 g (84,1% de récupération).

Analyse pour C6H8N08P-2Na-l,lH20:

Calculé: C 22,60 H 3,22 N4,39 P 9,71 Na 14,42%

Trouvé: C 22,68 H 3,21 N4,36 P 9,62 Na 14,37%

Données spectrales:

Résonance magnétique nucléaire (D20)

52,75 (d, 2, J=20 Hz, -CH2 en a de P); 2,80 (d, 2, -CH2 en a de -CH)4,53(t, 1, -CH)

Rotation optique

Observée [ol]d + 15,95 (c, 2,000 dans l'eau)

Chromatographie :

Chromatographie sur couche mince (Cellulose, plaques de verre Quanta/Gram Q2F)

Phases mobiles Valeurs de Rf

1. Chlorure de lithium (0,6M)/éthanol/hydroxyde d'ammonium (5/5/1) 0,47

2. Ethanol/eau (2/3) 0,75

3. n-Butanol/acide acétique/eau (5/2/3) 0,19

Détection: Phospray (réactif du commerce pour là visualisation de composés contenant du phosphore).

Résultats: Le corps migre en une seule tache dans chacun des systèmes de phases mobiles différentes.

Exemple 3:

Sel disodique de l'acide N-phosphonoacétyl-L-aspartique monohydraté'0,3 acide acétique'0,1 éthanol.

A 2,01 d'acide acétique glacial bouillant (85°), on ajoute en une fois du sel tétrasodique de l'acide N-phosphonoacétyl-L-aspartique tétrahydraté (VII) (214 g; 0,516 mol). Après avoir brassé le mélange pendant 30 min à 85-90 , on ajoute de la célite (50 g), puis les parties insolubles sont éliminées par filtration. Le filtrat éclairci jaune foncé est refroidi à température ambiante et dilué par de l'éthanol (4,5 1). Le mélange résultant est brassé pendant 30 min, puis le solide précipité est repueilli sur un filtre. Le produit est lavé par remise en suspension dans l'éthanol (2 x 3,5 1) et l'éther (1 x 1,2 1) puis séché sous vide à 55 sur du pentoxyde de phosphore pour donner 111,8 g (63,8%) de sel disodique analytiquement pur.

Analyse pour C6H8N08P-2Na\0,3C2H402-0,lC2H6:

Calculé: C 24,04 H 3,50 N4,12 P9,12 Na 13,53% Trouvé: C 24,19 H 3,56 N4,14 P 8,96 Na 13,48%

Données spectrales:

Résonance magnétique nucléaire

30,92 (t, 0,3, — CH3 de l'éthanol); 1,83 (s, 0,9, — CH3 de l'acide acétique); 2,55 (d, 2, J =20 Hz, -CH2 en a de P) 2,58 (d, 2, -CH2 en a de -CH); 3,33 (q, 0,2, -CH2 de l'éthanol) 4,32 (t, 1, -CH).

Rotation optique

Observée [a]2ß + 15,31 (c, 2,103 dans l'eau)

Chromatographie :

Chromatographie sur couche mince (Cellulose, plaques de verre Quanta/Gram Q2F)

Phases mobiles Valeurs de Rj

1. Chlorure de lithium (0,6M)/éthanol/hydroxyde d'ammonium (5/5/1) 0,54

2. Ethanol/eau (2/3) 0,69

3. Ethanol/hydroxyde d'ammonium/eau (6/1/3) 0,18

(allongée)

4. n-Butanol/acide acétique/eau (5/2/3) 0,20

(traînées)

Détection: Phospray (réactif du commerce pour la visualisation des composés contenant du phosphore).

Résultats: Le corps migre en une seule tache dans chacun des systèmes.

Exemple 4:

Sel disodique de l'acide N-phosphonoacétyl-L-aspartique monohydraté-0,3 acide acétique'0,1 éthanol

Du sel tétrasodique de l'acide N-phosphonoacétyl-L-aspartique-4,5H20 (VII) (716,8 g; 1,690 mol) est ajouté en une seule portion à de l'acide acétique glacial bouillant (95°) (7,01). Le mélange est brassé à 90-95° pendant 45 min, puis on ajoute de la célite (250 g). Après avoir remué le mélange pendant 20 min à 90-95", on récolte les parties insolubles sur un filtre et on les lave avec de l'acide acétique (0,51). Le filtrat éclairci orange foncé est refroidi à température ambiante et dilué par de l'éthanol (16,1 1). Le mélange résultant est brassé pendant une heure puis le précipité est recueilli sur un filtre. Le produit est mis en suspension dans l'éthanol (7,5 1) et la suspension est brassée vigoureusement pendant 3 h. Le solide est recueilli sur un filtre, puis lavé comme ci-dessus avec de l'éthanol (2 x 7,5 1) et de l'éther (1 x 7,51). Le produit est séché sous vide à 50-55 sur du pentoxyde de phosphore pour donner 426,5 g (74,3%) de sel disodique analytiquement pur.

Analyse pour C6H8N08P-2NaH200,3C2H4020,IC2H60:

Calculé: C 24,04 H 3,50 N4,12 P9,12 Na 13,53%

Trouvé: C 24,35 H 3,46 N4,19 P8,78 Na 13,44%

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Données spectrales:

Résonance magnétique nucléaire (D20)

80,98 (t, 0,3, -CH3 de l'éthanol); 1,88 (s, 0,9, -CH3 de l'acide acétique); 2,61 (d, 2, J=20 Hz, — CH2 en a de P); 2,63 (d, 2, — CH2 en a de -CH); 3,44 (q, 0,2, -CH2 de l'éthanol); 4,36 (t, 1, -CH).

Rotation optique

Observée Md + (c' 1,998 dans l'eau)

Chromatographie:

Chromatographie sur couche mince (Cellulose, plaques de verre Quanta/Gram Q2F)

Phases mobiles

Valeurs de Rf

I.

Chlorure de lithium (0,6M)/éthanol/hydroxyde

d'ammonium (5/5/1)

0,60

2.

Ethanol/eau (2/3)

0,78

3.

Ethanol/hydroxyde d'ammonium/eau (6/1/3)

0,19

4.

n-Butanol/acide acétique/eau (5/2/3)

0,22

(allongée)

Quantité appliquée: 80 (ig.

Détection: Phospray (réactif du commerce utilisé pour la visualisation de composés contenant du phosphore).

Résultats: Le produit migre en une seule tache dans les systèmes considérés.

Exemple 5:

Sel de N,N'-dibenzyléthylènediamine de l'ester dibenzylique de l'acide N-phosphonoacétyl-L-aspartique (XII).

A une solution froide (5°) d'ester dibenzylique de l'acide N-phosphonoacétyl-L-aspartique (IV) (2449 g; 5,625 mol) dans du chlorure de méthylène (9,5 i), on ajoute goutte à goutte en remuant une solution de N,N'-dibenzyléthylènediamine (1488 g; 6,191 mol) dans du chlorure de méthylène (1,651) pendant 3,0 h. La température est maintenue en dessous de 15° pendant l'addition. Après avoir enlevé le bain de refroidissement, la solution réactionnelle est brassée à température ambiante pendant 16 h, puis on la concentre sous vide jusqu'à l'obtention d'une huile. Le résidu est dissous dans l'acétone (5,01) et on laisse reposer la solution pendant la nuit à température ambiante (18 h). Un solide finement divisé, qui a précipité pendant la nuit, est éliminé par filtration, puis on évapore le filtrat sous pression réduite. La matière brute est dissoute dans de l'acétate d'éthyle (12,01). La solution organique est lavée avec de l'eau (3 x 3,5 1), séchée sur du sulfate de magnésium, remuée avec du Norit A (125 g) pendant 45 min, puis évaporée avec rotation sous vide. Le résidu vitreux est trituré jusqu'à l'obtention d'une poudre par mélange vigoureux avec un mélange éther/éther de pétrole (P.E. 30-60°) (5,01/7,01). Le produit solide est recueilli sur un filtre puis séché pour donner 1609 g d'un sel brun clair; P.F. >300°.

Une réaction similaire supplémentaire a été effectuée pour donner un total de 2308,5 g de (XII) prêt à être transformé ultérieurement.

Sel tétrasodique de l'acide N-phosphonoacétyl-L-aspartique (V).

A une solution froide (14°) d'hydroxyde de sodium (240 g; 6,00 mol) dans l'eau (7,8 1), on ajoute en plusieurs portions du sel de N,N'-dibenzyléthylènediamine de l'ester dibenzylique de l'acide N-phosphonoacétyl-L-aspartique (XII) (675,7 g) qui a été finement pulvérisé, pendant 5 min. Le mélange réactionnel est remué pendant 6 h à 10-15', on ajoute de la célite (250 g), puis les parties insolubles sont éliminées par filtration. Le filtrat est extrait par du chlorure de méthylène (2 x 1,5 1) et de l'éther (1 x 1,5 1) puis concentré sous vide (<40 ; 3-5 mmHg). La solution aqueuse (volume: 3,81) est clarifiée par filtration et diluée avec de l'éthanol (13,51), ce qui provoque la précipitation d'une huile. Après un repos de 18 h à température ambiante, la solution aqueuse d'éthanol est éliminée, laissant 600 ml de produit (V) brut sous la forme d'une huile orange. Des hydrolyses supplémentaires ont été effectuées de manière similaire pour donner un total de 1350 ml d'huile prête à être transformée ultérieurement.

Sel disodique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique-0,2H2 0-0,2 acétate de sodium-0,4 acide acétique-0,15 éthanol

Du sel tétrasodique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (V) (1350 ml d'huile) est dissous dans de l'acide acétique glacial (6,5 1) à température ambiante. La solution orange est brassée pendant 30 min, clarifiée par filtration, puis diluée avec de l'éthanol (18,0 1). Le mélange résultant est brassé pendant 1 h, puis le solvant est éliminé par des bougies filtrantes. Le solide est mis en suspension dans l'éthanol (10,5 1) et le mélange est brassé vigoureusement pendant 1 h. L'éthanol est retiré comme ci-dessus, puis le produit est lavé deux fois de plus avec de l'éthanol (10,51, puis 6,01). Le solide est recueilli sur trois filtres, sous atmosphère d'azote, lavé avec de l'éther (2 x 1,0 1 par filtre), puis séché partiellement par évaporation sous rotation à pression réduite (30-45°; réglage de la trompe 3-5 mmHg). Le solide en morceaux est finement pulvérisé sous azote, puis séché sous vide sur du pentoxyde de phosphore (33,5 h à température ambiante, puis 12,5 h à 50°) pour donner 945,1 g du produit désiré analytiquement pur.

Analyse pour C6H8N08P-2Na-0,2H20 •0,2C2H302Na-0,4C2H402-0,15C2H60 :

Calculé: C 25,74 H 3,31 N4,00 P 8,85 Na 14,45%

Trouvé: C 25,55 H 3,35 N4,06 P9,19 Na 14,30%

Données spectrales:

Résonance magnétique nucléaire (D20)

50,89 (t, 0,45, -CH3 de l'éthanol); 1,78 (s, 1,8, -CH3 de l'acétate-1-acide acétique); 2,54 (d, 2, — CH2 en a de — CH); 2,54 (d, 2, J=20,3 Hz -CH2 en a de P); 3,36 (q, 0,30, -CH2 de l'éthanol); 4,28 (, 1, -CH).

Rotation optique

Observée MB + 16,39 (c, 1,885 dans l'eau)

Chromatographie:

Chromatographie sur couche mince (Cellulose, plaques de verre Quanta/Gram Q2F)

Phases mobiles Valeurs de Rf

1. Chlorure de lithium (0,6M)/éthanol/hydroxyde d'ammonium (5/5/1) 0,64

2. Ethanol/eau (2/3) 0,78

3. Ethanol/hydroxyde d'ammonium/eau (6/1/3) 0,24

(allongée)

4. n-Butanol/acide acétique/eau (5/2/3) 0,28

(traînées)

Détection: Phospray (réactif commercial pour la visualisation de composés contenant du phosphore).

Résultats: Le composé migre en une seule tache dans les systèmes considérés.

Exemple 6:

Ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (IV)

A une suspension froide (10°) d'ester dibenzylique de p-toluènesulfonate de l'acide L-aspartique (I) (5785 g; 11,91 mol) dans du dioxanne anhydre (30,01), on ajoute en une seule portion de la triéthylamine (3238 g; 32,00 mol). La solution résultante est brassée pendant 1 h, puis du chlorure de l'acide phosphonoacétique (III) (2236 g; 14,11 mol) dans du dioxanne anhydre (5,51 est ajouté goutte à goutte pendant 3 h. La température est maintenue en dessous de 30° pendant l'addition. Le bain de refroidissement est ôté et le mélange réactionnel est remué pendant 1 h. Les parties insolu5

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bles sont éliminées par filtration et lavées par du dioxanne (12,0 1). Le filtrat est concentré sous vide, puis le résidu huileux est dissous dans du chlorure de méthylène (64,0 1). La solution organique est lavée par de l'eau (6 x 19,01), séchée sur du sulfate de sodium, puis évaporée sous pression réduite jusqu'à un volume de 5,01.

Sel tétrasodique de l'acide N-(phosphonoacêtyl)-L-aspartique (V)

A une solution froide (15 ) d'hydroxyde de sodium (1323 g; 33,08 mol) dans l'eau (43,0 1), on ajoute en une fois 2,41 de la solution préparée ci-dessus d'ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (IV) (2,41 = 2400 g; 5,512 mol). Le mélange réactionnel est brassé pendant 8 h à 10-15', puis on ajoute de la célite (825 g) et les parties insolubles sont éliminées par filtration (600 g de pelote de célite). Le filtrat est extrait par du chlorure de méthylène (2 x 9,01) et de l'éther (1 x 9,01). La solution aqueuse est réunie avec celle venant d'une préparation identique et le tout est concentré sous vide (865J; 3-5 mmHg). La solution (volume: 25,01) est clarifiée par filtration (400 g de pelote de célite) et diluée avec de l'éthanol (88,01), ce qui provoque la précipitation d'une huile. Après un repos de 7,5 h à température ambiante, la solution aqueuse d'éthanol est enlevée, laissant 4,41 de produit (V) brut sous la forme d'une huile orange. On prépare de manière similaire une quantité supplémentaire de produit à partir de l'hydrolyse de 6695 g de (IV) pour obtenir un total de 9,98 1 d'huile prête à être transformée ultérieurement.

Sel disodique de l'acide N-(phosphonoacêtyl)-L-aspartique

Du sel tétrasodique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (V) (4,41 d'huile) est dissous dans de l'acide acétique glacial (14,01) à température ambiante. La solution orange est brassée pendant 1 h, clarifiée par filtration, puis diluée par de l'éthanol (44,01). Le mélange résultant est brassé pendant 1,5 h, puis le solvant est éliminé par l'utilisation de bougies filtrantes. Le solide est mis en suspension dans l'éthanol (30,01) et le mélange est remué vigoureusement pendant 2 h. L'éthanol est éliminé comme ci-dessus, puis le produit est lavé par une nouvelle mise en suspension dans l'éthanol (2 x 30,01) et l'éther (1 x 14,01). Le solide est recueilli sur deux filtres, sous atmosphère d'azote, puis partiellement séché par évapo-ration avec rotation sous vide (30-45°; pression de la trompe 3-5 mmHg). Une quantité supplémentaire de 2,93 1 d'huile (V) est transformée de manière similaire. La totalité du produit en morceaux est finement broyée, sous azote, puis séchée sous vide sur du pentoxyde de phosphore (40 h à température ambiante et 17 h à 45-50°) pour donner 4562,5 g d'une poudre jaune légère. Le spectre de résonance magnétique nucléaire et l'analyse élémentaire révèlent la présence d'acétate de sodium (0,1 mol), d'acide acétique (0,5 mol) et d'éthanol (0,15 mol). Une quantité de 2000 g du produit est versée en plusieurs portions dans 11,5 1 d'acide acétique glacial en agitant vigoureusement, pendant 20 min. Le mélange est brassé à température ambiante pendant 1 h, puis la solution est clarifiée par filtration. Le filtrat est dilué avec de l'éthanol (26,01) et le mélange résultant est brassé pendant 2 h. Le, solvant est éliminé (bougies filtrantes), puis le produit est lavé deux fois par mise en suspension dans l'éthanol (7,01 puis 15,01), recueilli sur un filtre et séché partiellement par évaporation avec rotation sous pression réduite. Le solide blanc (1989 g) contient de l'acide acétique (1,25 mol) et de l'éthanol (0,24 mol) comme déterminé par l'analyse de résonance magnétique nucléaire. Une quantité de 1974 g est dissoute dans l'eau (4,01) et la solution aqueuse est diluée avec de l'éthanol (16,01). Le mélange résultant est brassé pendant 30 min, puis on laisse au précipité huileux le temps de se déposer. On enlève la solution aqueuse d'éthanol et l'huile est lavée une fois avec de l'éthanol (3,5 1). Ce produit qui contient de l'acide acétique (0,03 mol) et de l'éthanol (0,8 mol), comme déterminé par résonance magnétique nucléaire, est dissous dans de l'eau (32,01). La solution aqueuse est clarifiée par filtration puis lyophilisée pour donner 1512,4 g d'un solide jaune floconneux.

Analyse pour C6H8N08P-2Na-H20-0,03 C2H402-0,35 C2HsO

Calculé: C 24,23 H 3,68 N4,18 P9,24 Na 13,72% Trouvé: C 24,39 H 3,56 N4,15 P 9,03 Na 13,44%

Données spectrales:

Résonance magnétique nucléaire (D20)

81,19 (t, — CH3 de l'éthanol); 2,11 (s, — CH3 de l'acide acétique); 2,83 (d, 2, J = 20 Hz, -CH2 en a de P); 2,87 (d, 2, -CH2 en a de -CH); 3,67 (q, -CH2 de l'éthanol); 4,61 (t, 1, -CH)

Rotation optique

Observée Md + 14,68 (c, 1,873 dans l'eau)

Chromatographie:

Chromatographie sur couche mince (Cellulose, plaques de verre Quanta/Gram Q2F)

Phases mobiles Valeurs de Rj-

1. Chlorure de lithium (0,6M)/éthanol/hydroxyde d'ammonium (5/5/1) 0,66

2. Ethanol/eau (2/3) 0,83

3. Ethanol/hydroxyde d'ammonium/eau (6/1/3) 0,31

(allongée)

4. n-Butanol/acide acétique/eau (5/2/3) 0,28

Détection: Phospray (réactif du commerce utilisé pour la visualisation des composés contenant du phosphore).

Résultat: Le produit migre en une seule tache dans les systèmes considérés.

Le développement sur grande échelle des procédés de préparation du sel pur a surmonté des problèmes de manipulation potentiellement graves. Le sel de cyclohexylamine du dibenzyl-PALA est préparé par l'addition d'environ 0,9 à 1,0 Eq de cyclohexylamine à une solution de dibenzyl-PALA dans l'acétone. Le produit est insoluble dans l'acétone alors qu'un grand pourcentage des impuretés reste en solution. On améliore la pureté du produit jusqu'à un niveau acceptable par recristallisation dans du méthanol absolu.

On rencontre des difficultés dans l'utilisation du dioxanne pour préparer le dibenzyl-PALA. Le chlorhydrate de triéthylamine est un sous-produit insoluble de la réaction et il faut de grands volumes de solvants pour assurer une agitation convenable. De plus, la réaction est exothermique et l'utilisation du dioxanne limite le domaine possible de refroidissement à environ 12°, température à laquelle le dioxanne gèle.

Le solvant utilisé dans cette réaction à la place de dioxanne est le chlorure de méthylène. Ce solvant offre les avantages suivants: a) il est ininflammable; b) il permet d'atteindre une température de refroidissement plus basse; c) le volume de solvant est réduit de moitié; d) l'élimination de chlorhydrate de triéthylamine par filtration est supprimée du fait que ce produit est soluble dans la solution du mélange réactionnel, et e) l'évaporation du solvant avant l'analyse n'est plus nécessaire.

D'autres améliorations du procédé comprennent le fait que le sel de cyclohexylammonium est hydrolysé directement en sel tétrasodique de PALA. Cela élimine la manipulation supplémentaire qui consiste à libérer le dibenzyl-PALA à partir du sel aminé, avant l'hydrolyse.

Un dernier point est le fait que le volume d'eau nécessaire à l'hydrolyse a été réduit de 63% par rapport à celui des synthèses initiales. Cela, évidemment, autorise de plus grandés productions à partir du même appareillage. Au banc d'essai, ce procédé a permis d'obtenir des lots de sel disodique de PALA de 2 kg environ en utilisant des récipients de 501 au maximum. En incorporant toutes les modifications décrites, on a effectué une préparation dans des pfaudlers de 50 et 100 gallons (189-3781) avec succès.

A grande échelle, on peut produire environ 15 kg du produit désiré par essai en utilisant un équipement de cette taille.

Le procédé, tel qu'il a été développé, est limité seulement par la taille de l'équipement.

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Par les méthodes mentionnées ici, la pureté du sel disodique de PALA a été améliorée jusqu'à un niveau satisfaisant pour l'administration par voie parentérale dans un milieu approprié au traitement du cancer humain, particulièrement pour des buts d'investigations sur grande échelle.

Cela a été réalisé par: 1) l'élimination complète de l'acide acétique et de l'acétate de sodium par précipitation tourbillonnante, et 2) l'isolation du dibenzyl-PALA sous la forme de son sel de cyclohexyl-ammonium.

En outre, le procédé a été optimisé de manière à faciliter l'application sur une plus grande échelle et les problèmes de manipulation ont été résolus.

Exemple 7:

Chlorure de l'acide phosphonoacétique (III)

A un mélange d'acide phosphonoacétique (II) (2000 g; 14,28 mol), de N,N-diméthylformamide (208,8 g; 2,856 mol) et de dioxanne (7,15 1), on ajoute goutte à goutte, en remuant, du chlorure de thionyle (3568 g; 29,99 mol) pendant 1,5 h. La température est maintenue en dessous de 30° pendant l'addition. La solution résultante est chauffée à 45" pendant 2,5 h, puis refroidie à 5°. De l'eau (283 ml; 15,7 mol) dissoute dans du dioxanne (2,5 1) est alors ajoutée goutte à goutte, sur une période de 2 h. La température est maintenue en dessous de 10 pendant l'addition. Cette solution du chlorure d'acide (III) est brassée à 5-10 pendant 40 min, puis utilisée dans la réaction suivante sans autre caractérisation. Une seconde chloration est effectuée en parallèle, dans les mêmes conditions et en employant la même quantité de réactifs.

Ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (IV)

Une suspension d'ester dibenzylique de p-toluènesulfonate de l'acide L-aspartique (I) (4625 g; 9,525 mol) dans du dioxanne (20,0 1) est refroidie sous agitation jusqu'à 15°, puis on ajoute de la triéthylamine (4820 g; 47,63 mol) en un mince filet, pendant 1 h. La solution résultante est brassée pendant 20 min, puis la solution de chlorure de l'acide phosphonoacétique (III), préparée ci-dessus à partir de 14,28 mol de l'acide correspondant, est ajoutée goutte à goutte sur une période de 5 h. La température est maintenue en dessous de 20° pendant l'addition. Une portion supplémentaire de triéthylamine (1162 g; 11,48 mol) est ajoutée et le mélange réactionnel est brassé pendant 1 h. Après un repos de 8 h à température ambiante, le mélange est dilué avec de l'acétone (5,5 1), brassé pendant 15 min, puis les parties insolubles sont recueillies sur un filtre et lavées avec du dioxanne (10,01). Une deuxième réaction est effectuée en parallèle, dans les mêmes conditions et en employant la même quantité de réactifs. Les filtrats des deux réactions sont rassemblés et évaporés par rotation sous vide. Le résidu (huile orange visqueuse) est dissous dans du chlorure de méthylène (110,01), puis la solution organique est doucement lavée avec de l'eau (6 x 30,01). Après avoir fait sécher la solution sur du sulfate de sodium (11,3 kg) et de magnésium (2,3 kg), les parties insolubles sont éliminées par filtration (pelote de célite) et le filtrat est évaporé sous vide jusqu'à poids constant; rendement de dibenzyl-PALA (IV): 7970 g (96,1%). Cette huile visqueuse jaune est prête à subir d'autres transformations.

Sel de cyclohexylamine de l'ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique

De la cyclohexylamine (1815 g; 18,30 mol) est ajoutée goutte à goutte à une solution froide (7°) d'ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (7970 g; 18,30 mol) dans l'acétone (24,01) en agitant, cela pendant 1,25 h. La température est maintenue en dessous de 15" pendant l'addition. Le bain réfrigérant est enlevé et le mélange résultant est brassé pendant 1 h. On abandonne le mélange à température ambiante pendant 6 h, puis le solide qui a précipité est recueilli sur un filtre, lavé avec de l'acétone (15,01) et séché; rendement 4932 g; P.F. 176,5-177,5°. Ce produit est recristallisé dans l'éthanol bouillant (35,0 1), puis séché pour donner 1663 g de sel purifié; P.F. 178-181°.

La liqueur mère est concentrée sous vide jusqu'à un volume de 20,0 1. La solution est diluée avec de l'acétone (16,0 1) et refroidie (—10 ) pour donner 967 g supplémentaires de produit; P.F. 178-180 . Une troisième récolte de produit (429 g) est obtenue en évapo-5 rant le filtrat méthanol/acétone ci-dessus presqu'à sec et en mettant en suspension le résidu dans l'acétone (5,01); poids total du sel aminé prêt à être transformé: 3059 g (62,0% de récupération).

Sel tétrasodique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (V) io A une solution froide (5 ) d'hydroxyde de sodium (1291 g; 32,28 mol) dans l'eau (20,5 1), on ajoute en agitant du sel de cyclohexylamine de l'ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (3059 g; 5,378 mol) par portions, cela en 30 min. Le mélange réactionnel est brassé à 5-15 pendant 3,5 h, puis est extrait 15 avec du chlorure de méthylène (2 x 8,51) et de l'éther (1 x 8,51). La solution aqueuse est clarifiée par filtration, concentrée sous vide ( < 35' ; 3-5 mmHg) jusqu'à un volume de 14,6 1 puis diluée avec de l'éthanol (51,4 1). Le mélange résultant est brassé pendant 1 h, puis on le laisse reposer à température ambiante pendant 12 h. La solu-20 tion aqueuse d'éthanol est éliminée, donnant du produit (V) brut sous la forme d'une légère huile jaune, prête à être transformée ultérieurement.

Sel disodique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique

25 De l'acide acétique glacial (8,0 1) est ajouté à l'huile précipitée ci-dessus (sel tétrasodique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (V) brut, préparé à partir de 3059 g du sel aminé). Le mélange est brassé à température ambiante pendant 30 min, puis une partie insoluble gélatineuse est éliminée par filtration. Le filtrat 30 clarifié, jaune clair, est dilué avec de l'éthanol (24,01). Le mélange résultant est brassé pendant 1,75 h puis le précipité est recueilli sur un filtre. Le solide est mis en suspension dans l'éthanol (14,5 1) et le mélange est agité vigoureusement pendant 1 h. Le produit est recueilli sur quatre filtres, puis séché partiellement sous vide (30-45°; 35 vide: 3-5 mmHg) par évaporation rotative. Le produit en morceaux (2870 g) est dissous dans l'eau (5,251), la solution est clarifiée par filtration, puis le filtrat (environ 6,91) est dilué avec de l'éthanol (21,01). Le mélange résultant est brassé pendant 30 min, puis on laisse se déposer l'huile qui a précipité (1 h). La solution aqueuse 40 d'éthanol est enlevée et l'huile est lavée par de l'éthanol (1 x 4,31). Ce produit est dissous dans l'eau (8,15 1) et la solution (9,81) est divisée en trois portions (deux de 4,0 1 et une de 1,8 1). On verse chaque portion pendant 13 h dans un tourbillon d'éthanol brassé vigoureusement (10 x le volume aqueux: 2 x 40,01; 1 x 18,01). Après 45 avoir vigoureusement brassé les mélanges pendant 2 h, les solutions eau/éthanol sont éliminées par siphonnement et le solide provenant des trois précipitations est rassemblé. Le produit est brassé pendant 30 min dans l'éthanol (10,01), recueilli sur un filtre, puis séché à poids constant sous vide à température ambiante sur du pentoxyde 50 de phosphore. Le produit sec (1748,0 g) est passé sur un tamis de 150 en acier inox et soigneusement mélangé pour donner le sel disodique de PALA sous la forme d'une poudre blanche.

Analyse pour C6H7 6NO8P'2,4Na-2H2O 0,5C2H<sO : 55 Calculé: C 22,91 H 4,01 N 3,82 P 8,44 Na 15,04% Trouvé: C 23,16 H 3,76 N 3,79 P 8,57 Na 15,18%

L'analyse du sodium indique une composition de:

60% di-Na PALA 40% tri-Na PALA Fondé sur la formule empirique:

H20 = 9,8%

Et0H = 6,3%

Données spectrales:

65 Résonance magnétique nucléaire (D20)

SI,17 (t, 1,5, -CH3 de l'éthanol); 2,74 (d, 2, -CH2 en a de -CH); 2,77 (d, 2, J = 20 Hz, -CH2 en a de P); 3,63 (q, 1, -CH2 de l'éthanol); 4,48 (t, 1, -CH)

9

636 595

Rotation optique

Observée [a]2è5 + 14,73 (c, 2,098 dans l'eau)

Chromatographie :

Chromatographie sur couche mince (Cellulose, plaques de verre Quanta/Gram Q2F)

Phases mobiles Valeurs de Rf

1. Chlorure de lithium (0,6M)/éthanol/hydroxyde d'ammonium (5/5/1) 0,52

2. Ethanol/eau (2/3) 0,72

3. Ethanol/hydroxyde d'ammonium/eau (6/1/3) 0,16

(allongée)

4. n-Butanol/acide acétique/eau (5/2/3) 0,22

(traînées)

Détection: a) Ninhydrine;

b) Phospray.

Résultats: Le corps migre en une seule tache, révélée par le Phospray, dans chaque système considéré. On n'observe pas de tache due à l'acide aspartique lors de la révélation à la ninhydrine.

Exemple 8:

Ester P,P-diêthylique de l'acide phosphonoacétique

On ajoute en une fois du phosphonoacétate de triéthyle (89,7 g; 0,400 mol) à une solution d'hydroxyde de potassium (0,408 mol, 26,1 g de produit pur à 87,6%) dans l'éthanol (450 ml) et l'eau (150 ml). La solution est brassée pendant 22 h à température ambiante, puis évaporée avec rotation sous vide (température du bain <25°; 3-5 mmHg). Le résidu est mis en suspension dans l'éther (400 ml). Le produit cristallin, sel de potassium, est recueilli sur un filtre puis dissous dans l'eau (300 ml).

La solution est refroidie en agitant, jusqu'à 5°, puis on ajoute de l'acide chlorhydrique concentré (33 ml), goutte à goutte, pendant 15 min. La température est maintenue en dessous de 10° pendant l'addition. La solution est brassée à 5-10° pendant 30 min, puis concentrée sous vide (température du bain <25 ; 3-5 mmHg). Le résidu est mis en suspension dans l'acétone (350 ml). Le chlorure de potassium insoluble est éliminé par filtration et le filtrat est évaporé sous pression réduite. On ajoute de l'éther (500 ml) à l'huile résiduaire. Le mélange résultant est refroidi à 10° et les parties insolubles sont éliminées par filtration. On décolore le filtrat par passage sur du charbon actif, on le sèche sur du sulfate de magnésium puis on le concentre sous vide pour obtenir 69,3 g d'un produit huileux jaune pâle (88,2%). Le produit est prêt à subir d'autres transformations.

Chlorure de l'ester P,P-diéthylique de l'acide phosphonoacétique

Du chlorure d'oxalyle (63,5 g; 0,500 mol) est dissous dans du benzène anhydre (100 ml), puis versé goutte à goutte en agitant dans une solution froide (10 ) d'ester P,P-diéthylique de l'acide phosphonoacétique (19,6 g: 0,100 mol) dans du benzène anhydre (350 ml) pendant 45 min. La température est maintenue entre 5 et 10 pendant l'addition. Le bain de réfrigération est enlevé et la solution est brassée pendant 2 h. Les produits volatiles sont éliminés sous vide, puis le résidu est coévaporé avec du benzène (2 x 50 ml) pour donner le chlorure d'acide sous la forme d'un liquide jaune. Ce produit est utilisé dans la réaction suivante sans autre caractérisation.

Ester P,P-diéthylique de l'ester dibenzylique de l'acide N-phosphono-acétyl-L-aspartique

A une suspension froide (15 ) d'ester dibenzylique de p-toluène-sulfonate de l'acide L-aspartique (53,4 g; 0,110 mol) dans du dioxanne (325 ml), on ajoute goutte à goutte en agitant de la triéthylamine (21,3 g; 0,210 mol) pendant 10 min. La solution résultante est brassée à 10-15 pendant 15 min, puis une solution de chlorure d'acide, préparée à partir de 0,100 mol d'acide dans du dioxanne (100 ml) est versée goutte à goutte pendant 50 min. La température est maintenue en dessous de 15 pendant l'addition. Le bain de réfrigération est enlevé et le mélange réactionnel est brassé pendant 2 h. Les parties insolubles sont recueillies sur un filtre, puis lavées avec du dioxanne (50 ml) et de l'éther (100 ml). Le filtrat est évaporé par rotation sous vide et le résidu est repris dans du benzène (500 ml). La solution organique est lavée par de l'eau (4 x 150 ml), décolorée par passage sur du charbon actif (10 g), séchée sur du sulfate de magnésium, puis concentrée sous vide jusqu'à l'obtention d'une huile; rendement 51,6 g (> 100%). Une portion de 22,8 g du produit brut est dissoute dans l'éthanol (80 ml). La solution est ajoutée en une fois à une suspension de résine échangeuse cationique AG50W-X8 (forme H+) (550 ml) dans l'éthanol (200 ml) et le mélange est brassé à température ambiante pendant 9 h. La résine est recueillie sur un filtre et lavée avec de l'éthanol (250 ml), puis le filtrat est évaporé sous vide.

Le résidu huileux est dissous dans du benzène (400 ml) et la solution est séchée sur du sulfate de magnésium et évaporée par rotation sous pression réduite. Le produit est séché à poids constant sous vide pour donner 19,7 g (86,5% de récupération) d'un produit homogène, par contrôle à la Chromatographie sur couche mince (gel de silice; acétone/éther de pétrole (P.E. 30-60 ) (2/3) ou acétate d'éthyle. Cette huile jaune visqueuse est prête à subir d'autres transformations.

Sel disodique de l'ester P-éthylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique, monohydraté

A une solution froide (10 ) d'ester P,P-diéthylique de l'ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (19,7 g; 0,0400 mol) dans l'éthanol absolu (100 ml), on ajoute en remuant, goutte à goutte, de l'hydroxyde de sodium (5,00 g; 0,125 mol)

dissous dans l'éthanol absolu (60 ml), cela pendant 20 min. La température est maintenue en dessous de 15 pendant l'addition. La solution est brassée à 10-15 pendant 45 min, puis est chauffée avec reflux pendant 30 min. Une quantité supplémentaire de 3,2 g (0,080 mol) d'hydroxyde de sodium dissoute dans l'éthanol (200 ml) est ajoutée et le mélange est chauffé à reflux pendant 2,5 h. Le solide obtenu est recueilli sur un filtre, lavé par mise en suspension dans l'éthanol (70 ml) et l'éther ( 150 ml), puis est séché. Cette poudre brun clair (16,4 g) est dissoute dans de l'acide acétique glacial bouillant (75 ) (30 ml). La solution est refroidie à température ambiante, diluée avec de l'éthanol (50 ml), puis clarifiée par filtration. De l'éthanol (300 ml) est ajouté au filtrat et le mélange obtenu est refroidi. Le solide qui a précipité est recueilli sur un filtre, lavé successivement par mise en suspension dans l'éthanol (350 ml), l'acétone (250 ml) et l'éther (250 ml) puis séché; rendement: 9,2 g (66,6%). Une portion de 8,3 g de ce produit, qui est contaminé par de l'acide acétique (cela ayant été déterminé par RMN), est mis en suspension dans l'éthanol (200 ml). La suspension est brassée et chauffée à reflux pendant 15 min, puis refroidie à température ambiante. Cette méthode de cycle chauffage/refroidissement est répétée deux autres fois et le solide est recueilli sur un filtre. Le procédé de lavage décrit ci-dessus est effectué trois fois en tout. Le solide blanc est séché à poids constant sous vide à 40 sur du pentoxyde de phosphore pour donner 7,2 g (86,7% de récupération) du produit analytiquement pur, le sel disodique de l'ester P-éthylique de PALA.H20. Le corps migre en une seule tache sur de la cellulose (plaques de verre Quanta/Gram Q2F) développée avec des phases mobiles éthanol/eau (2/3) (Rf=0,80), éthanol/hydroxyde d'ammonium/eau (6/1/3) (Rf=0,42) ou n-butanol/acide acétique/eau (5/2/3) (Rf=0,40); détection par Phospray.

Analyse pour C8H,2N08P-2Na-H20:

Calculé: C 27,84 H 4,09 N 4,06 P 8,97 Na 13,32%

Trouvé: C 27,71 H 4,13 N 4,07 P 8,86 Na 13,45% Données spectrales:

Infrarouge (Nujol)

Bandes principales: 3300, 2950,2920, 2860, 1700, 1640, 1600, 1455, 1405, 1375, 1215, 1045, 935, 760cm-i

5

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25

30

35

40

45

50

55

60

65

636 595

10

Résonance magnétique nucléaire (DzO)

51,28 (t, 3, — CH3 du groupe éthyle); 2,82 (d, 2, — CH2 en a de -CH); 2,85 (d, 2, J = 20,0 Hz, -CH2 en a de P), 4,00 (5 lignes m, 2, —CH2 du groupe éthyle); 4,57 (t, 1, — CH).

Exemple 9:

Sel disodique de l'ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl) -L-aspartique, tétrahydraté

Une solution d'ester dibenzylique de l'acide N-(phosphono-acêtyl)-L-aspartique (26,7 g; 0,610 mol) et de triéthylamine (25,2 ml; 0,180 mol) dans l'acétone (180 ml) est brassée à température ambiante pendant 1 h. Les parties volatiles sont éliminées sous vide et le résidu semi-solide est dissous dans l'acétone (300 ml). On ajoute alors de l'iodure de sodium (27,0 g; 0,180 mol) dissous dans l'acétone (150 ml) et le mélange réactionnel est chauffé à reflux pendant 3 h.

Le solvant est éliminé par évaporation avec rotation sous pression réduite, puis le résidu est remis en suspension dans l'eau (300 ml). Le produit solide est recueilli sur un filtre, lavé avec du mé-thanol (200 ml) et de l'acétone (100 ml), puis il est séché à poids constant pour donner 7,7 g (26%) de produit analytiquement pur; P.F. > 300 \ Le corps soit fait des traînées soit reste sur la ligne de base dans une analyse par CCM. On a donc transformé une partie du produit en acide libre au moyen d'acide chlorhydrique. Ce produit migre en une seule tache sur la cellulose (plaques de verre Quanta/Gram Q2F) développé par des phases méthanol/eau (9/1), éthanol/acétone/eau (5/4/1) ou éthanol/éther (1/1).

Analyse pour C20H20NO8P-2Na-4H2O:

Calculé: C 43,57 H 5,12 N 2,54 P 5,62 Na 8,34%

Trouvé: C 43,95 H 4,69 N2,50 P 5,57 Na8,31%

Données spectrales:

Infrarouge (Nujol)

Bandes principales: 3600, 3360, 2960, 2920, 2860, 1740,1720, 1635, 1540, 1450, 1375, 1340, 1280, 1200, 1130,1045, 965,

725 cm~'.

Exemple 10:

Chlorhydrate de l'ester dibenzylique de l'acide L-aspartique

On fait barboter de l'acide chlorhydrique dans une suspension d'acide L-aspartique (133 g; 1,00 mol) dans l'éthanol absolu (1,95 1) en remuant à température ambiante, cela pendant 2 h. La solution obtenue est chauffée à reflux pendant 5 h, refroidie à température ambiante puis évaporée sous vide. Le résidu est dissous dans du benzène (500 ml). La solution est chauffée à reflux et l'eau présente est éliminée par un appareil de Dean-Stark.

La solution est concentrée sous pression réduite jusqu'à l'obtention d'une huile qu'on laisse lentement cristalliser. Le solide est mis en suspension dans l'éther (1,3 1), recueilli sur un filtre, lavé à l'éther (800 ml) puis séché; rendement en chlorhydrate de l'ester dibenzylique de l'acide L-aspartique: 216 g (95,7%); P.F. 99-103°. Le produit est recristallisé dans 1,25 1 de mélange acétone/éther (4/1) pour donner 164,6 g; (76,2% de récupération) d'un produit prêt à être transformé ultérieurement; P.F. 106,5-107,5\

Ester tétraéthylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique

A une suspension froide (10 ) de chlorhydrate de l'ester dibenzylique de l'acide L-aspartique (19,2 g; 0,0850 mol) dans du dioxanne (350 ml), on ajoute goutte à goutte de la triéthylamine (18,2 g; 0,180 mol) pendant 20 min. Le mélange est brassé à 10° pendant 15 min, puis une solution de chlorure de l'ester P,P-diéthylique de l'acide phosphonoacétique, préparée à partir de 0,090 mol d'acide, dans du dioxanne (90 ml) est ajoutée goutte à goutte pendant 1 h. La température est maintenue entre 8 et 10° pendant l'addition. Le bain de refroidissement est enlevé et le mélange réactionnel est brassé pendant 3,5 h. Le produit insoluble est recueilli sur un filtre, puis lavé avec du dioxanne (100 ml) et de l'éther (200 ml). Le filtrat est évaporé par rotation sous vide et le résidu est dissous dans de l'acétate d'éthyle (300 ml).

La solution organique est lavée par de l'eau (3 x 100 ml), séchée sur du sulfate de magnésium, puis concentrée sous vide jusqu'à l'obtention d'une huile; rendement en ester tétraéthylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique: 31,1g (99,6%). Une portion de 25,9 g du produit est dissoute dans de l'éther (500 ml) et la solution est extraite avec de l'eau (5 x 150 ml). Les extraits aqueux sont rassemblés et concentrés sous pression réduite jusqu'à l'obtention d'une huile. Ce produit jaune pâle est séché sous vide sur du pentoxyde de phosphore pour donner 20,1 g (77,6% de récupération) de produit analytiquement pur. Le corps migre en une seule tache sur du gel de silice (Eastman Chromagram Sheet 13181) développé avec de l'acétone, du chloroforme ou de l'acétate d'éthyle; détection par des vapeurs d'iode.

Analyse pour C14H26N08P:

Calculé: C 45,77 H 7,13 N3,81 P8,43%

Trouvé: C 45,88 H 7,11 N3,81 P 8,50%

Données spectrales:

Infrarouge (Nujol)

Bandes principales: 3260, 2980,2920,2900, 1730,1670, 1545, 1525, 1440, 1390, 1365, 1335, 1230, 1200,1090, 1040, 1015, 955, 850 cm-1.

Résonance magnétique nucléaire (CDC13)

31,23 (m, 12, —CH3 des groupes éthyles); 2,83 (d de d, 2, —CH2 en a de -CH); 2,85 (d, 2, J=20,0 Hz, -CH2 en a de P); 4,08 (m, 8,' —CH2 des groupes éthyles); A,11 (large m, 1, — CH); 7,37 (large d, 1, -NH)

Rotation optique:

Observée Mo"—6,05 (c, 3849 dans l'eau)

Exemple II:

Chlorhydrate du diméthylester de l'acide L-aspartique

A du méthanol absolu (1,901; 1,50 kg; 46,8 mol) agité à —5°, on ajoute goutte à goutte du chlorure de thionyle (357 g; 3,00 mol) pendant 2 h. La température est maintenue entre 0 et —5° durant l'addition. La solution est brassée entre 0 et —5° pendant 1,5 h, puis on ajoute l'acide L-aspartique (133 g; 1,00 mol) en portions, cela pendant 35 min. La solution est brassée à — 5' pendant 2,5 h et à température ambiante pendant 16 h. Les parties volatiles sont éliminées sous vide, puis le résidu huileux est évaporé à pression réduite avec du benzène (4 x 175 ml). Le solide obtenu est recueilli sur un filtre, lavé avec de l'éther (400 ml), et séché. Le produit brut (190,4 g) est recristallisé dans 3,51 d'acétone bouillante pour donner 135 g (68,3%) de produit apte à être transformé ultérieurement; P.F. 117-119".

Ester diméthylique du P,P-diéthylester de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique

A une suspension froide (10°) de chlorhydrate de diméthylester de l'acide L-aspartique (18,8 g; 0,0950 mol) dans du dioxanne (350 ml) on ajoute goutte à goutte, en remuant, de la triéthylamine (20,2 g; 0,200 mol) pendant 15 min. Le mélange est brassé à 10' pendant 15 min, puis on ajoute du chlorure de P,P-diéthylester de l'acide phosphonoacétique, préparé à partir de 0,100 mol d'acide, dissous dans du dioxanne (100 ml), goutte à goutte durant 1 h. La température est maintenue à 5-10° pendant l'addition.

Le bain de refroidissement est enlevé et le mélange réactionnel est brassé pendant 1,25 h. Les parties insolubles sont recueillies sur un filtre, lavées par du dioxanne (100 ml) et de l'éther (200 ml) et le filtrat est concentré sous vide. Le résidu huileux est dissous dans du benzène (100 ml) et de l'éther (400 ml), puis la solution organique est lavée avec de l'eau (4 x 150 ml). Les solutions aqueuses sont rassem5

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636 595

blées, saturées par du chlorure de sodium, et extraites à l'acétate d'éthyle (3 x 500 ml).

Les extraits combinés sont séchés sur du sulfate de magnésium, puis évaporés sous vide pour donner 33,2 g (103%) de produit brut sous la forme d'une huile jaune. Une portion de 18,0 g du produit est dissoute dans l'eau (50 ml) et la solution est passée sur une colonne contenant de la résine échangeuse cationique AG50W-X8 (forme hydrogène). La colonne (3,8 x 15 cm) est éluée avec 500 ml d'eau. Les fractions contenant le produit désiré, cela étant déterminé par CCM, sont rassemblées et évaporées par rotation sous vide. Le résidu est dissous dans du chloroforme (120 ml) et la solution est séchée sur du sulfate de magnésium. Le solvant est éliminé sous pression réduite, puis l'huile jaune pâle est séchée sous vide sur du pentoxyde de phosphore pour donner 14,4 g (80% de récupération) d'ester diméthylique du P,P-diéthylester de l'acide N-phosphonoacétyl-L-aspartique analytiquement pur.

Le composé migre en une seule tache sur du gel de silice (Eastman Chromagram Sheet 13181) développé avec de l'acétone, du chloroforme ou de l'acétate d'éthyle; détection par des vapeurs d'iode.

Analyse pour C12H22N08P:

Calculé: C 42,48 H 6,54 N4,12 P9,13%

Trouvé: C 42,50 H 6,51 N4,09 P 9,06%

Données spectrales:

Infrarouge (pur)

Bandes principales: 3260, 2980, 2950,1735, 1665, 1530, 1435, 1365, 1220, 1160, 1040, 1015, 955 cm-'.

Résonance magnétique nucléaire (CDC13)

81,35 (t, 6, — CH3 des groupes éthyles); 2,88 (d, 2, — CH2 en a de CH); 2,90 (d, 2, J=21,5 Hz, -CH2 en a de P); 3,65 (s, 3, — CH3); 3,70 (s, 3, — CH3); 4,08 (5 lignes m, 4, — CH2 des groupes éthyles); 4,80 (large m, 1, — CH); 7,47 (large d, 1, — NH)

Rotation optique:

Observée [a]fj—6,89 (c, 3,183 dans l'eau)

Exemple 12:

Sel de pipérazine de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L~aspartique, tétrahydraté-0,5 C2H5 OH

A une solution froide (10 ) d'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (10,2 g; 0,0400 mol) dans l'eau (60 ml), on ajoute goutte, à goutte en agitant, de la pipérazine (15,2 g; 0,176 mol) dissoute dans l'eau (100 ml) pendant 35 min. La température est maintenue en dessous de 15 pendant l'addition. La solution est brassée à 10-15 durant 1 h, puis évaporée par rotation sous vide ( < 35 ; 2-5 mmHg). Le résidu semi-solide est trituré avec de l'éthanol (2 x 200 ml), puis dissous dans l'eau (60 ml). On ajoute du charbon actif (1 g) et le mélange est agité à température ambiante pendant 25 min. Les parties insolubles sont éliminées par filtration, puis le filtrat est versé goutte à goutte dans un tourbillon d'éthanol brassé vigoureusement (2,0 1), cela durant 40 min. Le solide obtenu est recueilli sur un filtre, lavé avec de l'acétone (200 ml) et séché pour donner 5,8 g (25,6%) de sel de pipérazine de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique, tétrahydraté-0,5C2H5OH; P.F. 92-95 ; 111-115 (capillaire scellé). Le composé migre en une grande tache sur la cellulose (plaques de verre Quanta/Gram Q2F) développée avec les phases éthanol/hy-droxyde d'ammonium/eau (6/1/3) (Rf=0,34), n-butanol/acide acétique eau (5/2/3) (Rf=0,25) ou éthanol/eau (2/3) (Rf=0,79); détection par Phospray.

Analyse pour C6HION08P-2,5C4HION2'4H20-0,5C2H50H

Calculé: C 36,10 H 8,20 N 14,86 P 5,48%

Trouvé: C 35,74 H 7,20 N 14,62 P 5,48%

Données spectrales:

Infrarouge (Nujol)

Bandes principales: 3340, 3270, 2950, 2920, 2850, 2720, 1645, 1625, 1580, 1460, 1380, 1295, 1050, 950 cm-'.

Résonance magnétique nucléaire (D20)

80,88 (t, 1,5, -CH3 de l'EtOH); 2,40 (m à 3 lignes, 4, -CH2 en a de P+ —CH2 de l'aspartate); 3,12 (s, 20, —CH2 du cycle de la pipérazine); 3,33 (q, 1, -CH2 de l'EtOH); 4,10 (large t, 1, -CH de l'aspartate).

Exemple 13:

Acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique

A une solution froide (10;) d'hydroxyde de sodium (289 g; 7,23 mol) dans 9,3,5 1 d'eau, on ajoute en une fois de l'ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (523 g; 1,20 mol). Le mélange est brassé à 10-15° pendant 7 h, puis les parties insolubles sont éliminées par filtration. Le filtrat est concentré sous vide jusqu'à un volume de 3,01 et on l'extrait par du chlorure de méthylène (1 x 1,361) et de l'éther (1 x 1,361). La solution aqueuse est versée dans 12,0 1 d'éthanol, ce qui provoque la précipitation d'un produit semi-solide. Après décantation, le produit est dissous dans l'eau (680 ml), et la solution est passée sur une colonne (8 x 46 cm) contenant une résine échangeuse cationique AG50W-X8 (forme H+). La colonne est éluée par 2,7 1 d'eau (18 fractions de 150 ml chacune). Les fractions 8-16, qui contiennent le produit comme déterminé par CCM, sont rassemblées et évaporées sous vide (température du bain < 30 ). Le résidu huileux est dissous dans l'acétone (2,0 1) et on ajoute du charbon actif (50 g), puis le mélange est agité à température ambiante pendant 18 h. Les parties insolubles sont éliminées par filtration et le filtrat est évaporé par rotation sous pression réduite. Le résidu est séché sous vide à température ambiante sur du pentoxyde de phosphore pendant 18 h pour donner 220 g (71,8%) du tétraacide. Ce produit semi-solide est apte à être transformé ultérieurement.

Sel de calcium de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique-2,5H20

A une solution froide (10 ) d'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (20,4 g; 0,0800 mol) dans l'eau (300 ml), on ajoute en remuant, par portions, du carbonate de calcium (17,6 g; 0,176 mol) durant 30 min. Le mélange réactionnel est brassé à température ambiante pendant 21 h, puis la partie insoluble (7,2 g) est recueillie sur un filtre et lavée avec de l'eau (50 ml). On ajoute du charbon actif (5 g) au filtrat aqueux et le mélange est remué à température ambiante durant 35 min. Les parties insolubles sont éliminées par filtration et le filtrat est dilué avec de l'acétone (600 ml). Le solide obtenu est recueilli sur un filtre, lavé à l'acétone (200 ml) et à l'éther (200 ml) puis est séché. Ce produit (24,7 g) est mis en suspension dans l'eau (125 ml) et le mélange est brassé vigoureusement pendant 10 min. On élimine les parties insolubles par filtration et le filtrat est ajouté à de l'acétone (350 ml). Le solide qui précipite est recueilli sur un filtre, lavé avec de l'acétone (200 ml), puis séché pour donner 10,8 g (37,8%) de sel de calcium de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique-2,5H20, analytiquement pur; P.F. >280 .

Analyse pour C6H-,N08P'l,5Ca-2,5H20:

Calculé: C 20,17 H 3,39 N 3,92 P 8,67 Ca 16,86%

Trouvé: C 20,28 H 3,09 N 3,88 P 8,63 Ca 16,85%

Données spectrales:

Infrarouge (Nujol)

Bandes principales: 3530, 3380, 2950, 2920, 2850, 1590, 1455, 1375, 1140, 1110, 1070,945 cm-1.

Résonance magnétique nucléaire (D20)

82,62 (m à 3 lignes, 4, —CH2 en a de P-l—CH2 en a de —CH); 4,35 (t, 1, -CH)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

636 595

12

Rotation optique:

Observée [a] la + 8,38 (c, 3,113 dans l'eau)

Chromatographie: . ' 5

Chromatographie sur couche mince (CCM)

(Cellulose, plaques de verre Quanta/Gram Q2F)

Phases mobiles Valeurs de Rj- Valeurs de Rj-

sel de calcium acide libre 10

1. n-Butanol/acide acétique/eau

(5/2/3) 0,18 0,29

2. Ethanol/hydroxyde d'ammonium/eau (6/1/3) 0,00 0,13

3. Ethanol/eau (2/3) 0,84 0,75 15

Détection : Phospray (réactif commercial pour la visualisation de composés contenant du phosphore).

Résultats: l'acide libre a été obtenu à partir du sel de calcium acidifié avec de l'acide chlorhydrique. Une tache sur la ligne de base a 20 été observée pour l'acide libre dans chaque système considéré et pour le sel de calcium dans le système 3.

Exemple 14:

Sel de cyclohexylamine de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique 25 dihydraté

A une solution froide (15 ) d'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique (5,1 g; 0,020 mol) dans l'eau (50 ml), on ajoute goutte à goutte, en remuant, de la cyclohexylamine (8,7 g; 0,088 mol) dissoute dans l'eau (15 ml) durant 15 min. La température est mainte- 30 nue en dessous de 20 pendant l'addition. La solution est brassée à température ambiante pendant 30 min, puis est diluée avec de l'acétone (850 ml). Le solide obtenu est recueilli sur un filtre, lavé à l'acétone (200 ml) et séché à l'air. Le produit brut est dissous dans l'eau (100 ml) et séché à l'air. Le produit brut est dissous dans l'eau 35 (100 ml), on ajoute du charbon actif (5 g) et le mélange est remué à température ambiante pendant 1,5 h. Les parties insolubles sont éliminées par filtration et le filtrat est versé dans de l'acétone brassée vigoureusement (1,3 1). Le précipité est recueilli sur un filtre, lavé avec de l'acétone (400 ml), puis séché pour donner 8,0 g (65,7%) de sel de cyclohexylamine de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique, dihydraté; P.F. 167,5-170,5°. Le composé migre en une seule tache sur de la cellulose (plaques de verre Quanta/Gram Q2F) développée avec des phases éthanol/hydroxyde d'ammonium/eau (6/1/3) (Rf=0,38), n-butanol/acide acétique/eau (5/2/3) (Rf=0,33) et éthanol/eau (2/3) (Rf=0,82); détection: Phospray.

Analyse pour C6H10NO8P-3,2C6Hi1NH2-2H2O:

Calculé: C 49,74 H 9,21 N9,67 P 5,09%

Trouvé: C 50,12 H 8,37 N 9,44 P 5,07%

Données spectrales:

Infrarouge (Nujol)

Bandes principales: 3210, 3050, 2950, 2920, 2860, 2670, 2620, 1640, 1575, 1545, 1460, 1450,1400, 1380, 1300, 1145,1115,1040 cm"1. Résonance magnétique nucléaire (D20)

51,50 (m, 32, — CH2 du cycle du cyclohexane); 2,57 (m à 3 lignes, 4, — CH2 en a de P+ — CH2 de l'aspartate); 2,97 (large s, 3,2, —CH du cycle du cyclohexane); 4,22 (d de d, 1, —CH de l'aspartate)

Exemple 15:

Sel de cyclohexylamine de l'ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl) -L-aspartique

138 g (0,317 mol) d'ester dibenzylique de l'acide N-(phosphono-acétyl)-L-aspartique sont dissous dans de l'acétone (500 ml). La solution est agitée et refroidie à 10°, puis on ajoute de la cyclohexylamine (69,2 g; 0,700 mol), goutte à goutte, durant 30 min. La suspension résultante est remuée à température ambiante pendant 18 h. Le solide qui a précipité est recueilli sur un filtre, lavé par de l'acétone (500 ml) et de l'éther (400 ml), puis est séché pour donner

47.2 g de sel de cyclohexylamine de l'ester dibenzylique de l'acide N-(phosphonoacétyl)-L-aspartique. Une portion de 24,8 g du produit est recristallisée dans le méthanol bouillant (500 ml) pour donner

18.3 g (73,8% de récupération) du sel de cyclohexylamine purifié; P.F. 186-188°.

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