CH630613A5 - Verfahren zur herstellung von neuen, reaktiven unsymmetrischen dicarbonsaeureestern. - Google Patents

Verfahren zur herstellung von neuen, reaktiven unsymmetrischen dicarbonsaeureestern. Download PDF

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CH630613A5 CH1047576A CH1047576A CH630613A5 CH 630613 A5 CH630613 A5 CH 630613A5 CH 1047576 A CH1047576 A CH 1047576A CH 1047576 A CH1047576 A CH 1047576A CH 630613 A5 CH630613 A5 CH 630613A5
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen, reaktiven unsymmetrischen Dicarbonsäureestern, die zur Herstellung von Reagentien zur Untersuchung von Herzglykosiden (Digitalisglykosiden) geeignet sind.
Bei den Methoden zur Untersuchung von Digitalisglykosiden, insbesondere zur Messung des pharmakologischen
Spiegels an solchen Glykosiden, handelt es sich um immunologische Tests in wässriger oder physiologischer Lösung, z.B. im Plasma, Serum und Urin. Solche Immuntests für die Bestimmimg von Digitoxin und Digoxin sind bekannt. So wird nach dem aus G. C. Oliver, B. M. Parker, D. L.
Brasfield und C. W. Parker, «The Measurement of Digitoxin in Human Serum by Radioimmunoassay», J. Clin. Investig. 47, 1035 (1968), bekannten Verfahren eine bestimmte Menge eines mittels immunologischer Standardverfahren hergestellten Antidigitoxinserums mit einer wässrigen oder physiologischen Lösung, deren Digitoxingehalt bestimmt werden soll, also z.B. mit Testplasma, -serum oder -urin,
oder mit einer Standarddigitoxinlösung jeweils zusammen mit einer konstanten Menge Digitoxigenin umgesetzt, das entweder radioaktiv markiert oder an ein Enzym gebunden ist, und zwar jeweils so, dass die antigenen Eigenschaften unverändert erhalten bleiben. Nach der Inkubation des Gemisches wird das mit dem Antikörper verbundene Digitoxin bzw. Digitoxigenin von freiem Digitoxin bzw. Digitoxigenin abgetrennt und die Radioaktivität oder die Enzymaktivität gemessen. Das Reagens, also das radioaktiv markierte oder an ein Enzym gebundene Digitoxigenin, ist ein mit einem Peptid, einer Aminosäure oder einem Aminosäureester kondensiertes 3-O-Succinyl-digitoxigenin, das durch Umsetzung von Digitoxigenin mit Bernsteinsäureanhydrid hergestellt wird.
Aus der DT-OS 2 142 422 ist ein analoges, ebenfalls auf Immuntests beruhendes Verfahren zur Bestimmung von Digoxin bekannt, bei dem das entsprechende Reagens aus Digoxigenin, dem 12-Hydroxy-digitoxigenin, ebenfalls durch Succinylierung, bei der die OH-Gruppe in 12-Stellung geschützt werden muss, und anschliessende Kondensation mit einem Peptid, einer Aminosäure oder einem Aminosäureester hergestellt wird. Es ist auch bekannt, das succinylierte Genin zur Antikörperherstellung als Antigen an ein Protein, z.B. an Rinderserumalbumin (RSA), zu binden.
Da der Komplex des Antikörpers mit dem Genin weniger stabil als der entsprechende Komplex mit dem vollständigen Herzglykosid ist, wurde ebenfalls bereits vorgeschlagen, das Herzglykosid über den endständigen Zuckerrest mit einer Aminosäure oder einem Protein zu kondensieren. So ist es aus V. P. Butler und J. P. Chen, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S., 57, 71 (1966), bekannt, den entständigen Digitoxose-Rest mittels Perjodat zu oxidieren und anschliessend mit einem Protein, wie RSA, zum Immunogen zu kondensieren. Aus der DT-OS 2 331 922 ist dasselbe Verfahren, jedoch zur Herstellung jodierbarer Digoxin-Amino-säure- und -Peptidderivate, bekannt.
Da Digoxin gegenüber Säuren und Laugen ausserordentlich empfindlich ist, entsteht das Digoxin-Aminosäure-Deri-vat unter den drastischen Bedingungen des zuletzt genannten Verfahrens nur in einer Ausbeute von 10% d.Th. Derselbe Nachteil einer geringen Ausbeute entsteht auch bei der Umsetzung mit einem Protein, wobei jedoch noch hinzu kommt, dass eine Reinigung des Digoxin-Protein-Derivates nicht mehr, wie im Falle des niedermoekularen Aminosäure-Derivates, möglich ist, so dass das auf diese Weise erhaltene Immunogen noch Nebenprodukte, wie z.B. isomerisiertes Digoxin, enthält. Ein weiterer Nachteil dieses bekannten Verfahrens zur Herstellung eines Digoxin-Reagens ist die irreversible Veränderung des endständigen Zuckerrestes im Digoxinmolekül sowie dessen direkte Verknüpfung mit dem Protein oder der Aminosäure. Hierdurch werden die steri-schen Verhältnisse innerhalb des Digoxinmoleküls verändert, was wiederum die Genauigkeit des mit diesem Molekül als Reagens durchgeführten Tests beeinflusst, bei dem ja letzten Endes der Antikörperkomplex dieses Moleküls mit dem Antikörperkomplex des freien Digoxins verglichen wird.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese Nachteile zu vermeiden und Verbindungen zu schaffen, die es ermöglichen, Digitalisglykoside, wie z.B. Digoxin oder Digitoxin, ohne deren molekulare Struktur zu verändern, über eine «Brücke» mit mindestens eine Aminogruppe enthaltenden Verbindungen, z.B. Aminen, Aminosäure-Derivaten oder Proteinen, zu kondensieren, also Verbindungen zu schaffen, die zur Herstellung von Reagentien zur Untersuchung von Herzglykosiden geeignet sind.
Diese Aufgabe wird gemäss der Erfindung gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von neuen, reaktiven unsymmetrischen Dicarbonsäureestern der Formel I
I
R2 —C —(CH2)n —COX (I)
I
r3
worin
Ri einen Alkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen;
R2 und R3 j£ einen Alkoxyrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen;
X einen Succinimid-N-oxy-, N-Methyl-pyridiniumoxy-, Piperidyl-N-oxy-, Phthalimid-N-oxy- oder Benz-triazol--N-oxy-Rest; und n die Zahl 2, 3, 4 oder 5
bedeuten, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Monoorthotrimethyl-, Monoorthotriäthyl- oder Monoortho-tripropylester einer Dicarbonsäure der Formel II
O O
5C-(CH2)n-C^ (II)
OH OH
in Form eines Monoalkalisalzes in Gegenwart eines Kronenäthers oder eines Cryptâtes in einem polaren oder unpolaren aprotischen organischen Lösungsmittel mit einer den Rest X abgebenden Verbindung, wie z.B. mit einem Hydroxysuccinimidsulfonat, N-Hydroxybenztriazol-tosylat oder N-Hydroxybenztriazol-trifluormethylsulfonat, umsetzt.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von neuen reaktiven unsymmetrischen Dicarbonsäureestern der Formel Ia
Ri'
I
R2 — c — (CH2)n — COX (Ia)
I
R3
worin Rj' einen Digoxin- oder Digitoxinrest darstellt und die Symbole R2, R3, X und n die oben angegebene Bedeutung haben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 eine Verbindung der Formel I herstellt und diese anschliessend mit Digoxin oder Digitoxin in Gegenwart von p-Toluolsulfonsäure um-estert.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung z.B. folgender reaktiver Dicarbonsäureester der oben genannten Formeln I und Ia:
Glutarsäure-w-orthotrimethylester-w'-hydroxysuccinimid-ester, Adipinsäure-co-orthotripropylester-w'-hydroxysuccin-imidester, Adipinsäure-w-äthylester-w'-hydroxysuccinimid-ester, Digoxin-4"'-glutaryl-hydroxysuccinimidester, Digitoxin--4"'-adipinyl-hydroxysuccinimidester, Bernsteinsäure-w--orthotriäthylester-co'-hydroxybenztriazolester, Glutarsäure--iü-propylester-cü'-hydroxybenztriazolester, Digitoxin-4'"--glutaryl-hydroxybenztriazolester, Adipinsäure-w-methyl-
ester-w'-hydroxybenztriazolester, Pimelin-w-orthotrimethyl-ester-w'-hydroxysuccinimidester, Pimelinsäure-w-orthotrime-thylester-w'-hydroxybenztriazolester, Digoxin-4'"-pimelinyl--hydroxysuccinimidester, Digoxin-4"'-pimelinyl-benztriazol--N-yl-ester.
Die erfindungsgemäss hergestellten reaktiven Dicarbonsäureester sind zur Herstellung von Reagentien zur Untersuchung von Digitalisglykosiden im Rahmen immunologischer Tests der eingangs genannten Gattung hervorragend geeignet. Jeder dieser Carbonsäureester kann entweder mit einer radioaktiv markierbaren, mindestens eine Aminogruppe enthaltenden Verbindung, z.B. mit einer mit 125J jodier-baren aminogruppenhaltigen Verbindungen, wie Tyramin, Histidin, Tyrosin und Tyrosin-äthylester oder einem tyrosin-haltigen Peptid, umgesetzt werden, wobei man einen Tracer erhält, oder mit einem biologisch aktiven Protein zur Herstellung von Antikörpern, z.B. mit Rinderserumalbumin, und jede der erfindungsgemässen Verbindungen kann schliesslich auch mit einem enzymatisch aktiven Protein zu einem Reagens für den ELISA-Test kondensiert werden. Mit der Erfindung werden also Verbindungen zur Verfügung gestellt, die zur Herstellung von in ihrem chemischen Aufbau gleichartigen Reagentien geeignet sind, wobei jedoch mit diesen Reagentien die Messung ganz verschiedener Grössen, nämlich der Antikörperaktivität, der Enzymaktivität und der Radioaktivität, ermöglicht wird.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen besteht darin, dass deren Hydrophilie dem jeweiligen Verwendungszweck durch die Wahl des «'-Esters, also durch die Wahl zwischen Dicarbonsäureestern der angegebenen allgemeinen Formel, in der X entweder einen Succinimid-N-oxy-, den N-Methylpyridiniumoxy-, den Piperidyl-N-oxy-, den Phthalimid-N-oxy- oder den Benztriazol--N-oxy-Rest bedeutet, angepasst werden kann.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen besteht darin, dass sie an Trägersubstanzen, z.B. an Molekularsieben, aber auch auf Polystyrol, fixiert und im Rahmen der Affinitätschromatographie eingesetzt werden können, vor allem an hydrophilen, aminogruppenhaltigen Gelen, Molekularsieben oder dgl. Diese gelgebundenen Substanzen dienen als Immunadsorbentien, also zur Reinigung von Antikörpern.
Weiterbildungen des Verfahrens gemäss der Erfindung zur Herstellung der neuen reaktiven Dicarbonsäureester bestehen darin, dass als polares oder unpolares aprotisches organisches Lösungsmittel bevorzugt Benzol oder Chloroform verwendet wird, und darin, dass als Hydroxysuccinimidsulfonat bevorzugt das Methylsulfonat oder das p-Toluol-sulfonat des Hydroxysuccinimids verwendet wird.
Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beispielsbeschreibung und den Ansprüchen.
Als Ausgangsmaterial zur Herstellung der reaktiven Dicarbonsäureester dient ein Monoorthotrimethyl-, -triäthyl-oder -tripropylester einer Dicarbonsäure mit 4 bis 7 C-Ato-men in Form ihres Alkalisalzes, z.B. Glutarsäure-mono-orthotrimethylester.
Glutarsäure-monoorthotrimethylester wird hergestellt, indem in eine Mischung aus 37,3 g Cyanobuttersäureäthyl-ester und 12 ml absol. Methanol unter Eiskühlung 10,7 g HCl eingeleitet werden. Nach 5tägigem Stehen im Kühlschrank kristallisiert Glutarsäure-w-imido-O-methylester-a)'--äthylester-hydrochlorid langsam aus. Es wird mit absol.
Äther viermal digeriert und unter Luftausschluss abgesaugt und über KOH getrocknet. Zu dem so erhaltenen Imido-estersalz wird unter Luft- und Feuchtigkeitsausschluss ein Überschuss von Methanol gegeben. Zunächst gehen die Kristalle in Lösung, dann, nach 12stündigem Stehen bei Raumtemperatur, beginnt langsam die Ausscheidung von Am-
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moniumchlorid. Man lässt noch weitere 48 Stunden stehen und vervollständigt dann die Ausfällung durch Zusatz der dreifachen Menge Äther. Dann wird abfiltriert, eingeengt und in absol. Äther aufgenommen, erneut abfiltriert und wieder eingeengt. Der zurückbleibende Glutarsäure-w-ortho-trimethylester-co'-äthylester wird anschliessend destilliert (Kp o.o5 = 55 bis 60°C). Die Ausbeute über diese ersten beiden Stufen beträgt 41 % d.Th.
Dieselbe Verbindung, also Glutarsäure-w-orthotrimethyl-ester-w'-äthylester, erhält man — allerdings in geringerer Ausbeute —, indem in entsprechender Weise ein Überschuss von Methanol zu Glutarsäure-co-imido-O-methylester-w'--äthylester-tetrafluoroborat gegeben wird, das durch Umsetzung von Glutarsäureäthylesteramid mit Trimethyloxo-nium-tetrafluoroborat zugänglich ist.
Der Glutarsäure-w-orthotrimethylester-w'-äthylester wird in 50 ml Aceton gelöst und mit der äquivalenten Menge KOH in 10 ml H20 versetzt und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird das Aceton und die Hauptmenge des Wassers abgezogen und mit absol. Methanol versetzt. Beim Einengen fällt das Kaliumsalz des Glutarsäure-mono-orthotrimethylesters aus, das am Hochvakuum getrocknet wird und als Ausgangsmaterial im erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung neuer reaktives Dicarbonsäureester dient.
Beispiel 1
Glutarsäure-u>-orthotrimethylester-u>'-h.ydroxysuccinimidester
In 20 ml Chloroform werden äquivalente Menge des Kaliumsalzes des Glutarsäure-monoorthotrimethylesters mit dem Methylsulfonat oder dem p-Toluolsulfonat des Hydr-oxysuccinimids und einer katalytischen Menge eines Kronenäthers oder eines Kryptates versetzt und 8 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Von ausgefallenem Natriumchlorid wird abgetrennt und die Lösung wird mit Natriumdicar-bonat ausgeschüttelt, getrocknet und eingeengt. Der Hydr-oxysuccinimidester bleibt als farbloses Öl zurück.
Beispiel 2
Digoxin-4'"-glutaryl-hydroxysuccinimidester Zu 2 g des gemäss Beispiel 1 hergestellten Glutarsäure--w-orthotrimethylester-M'-hydroxysuccinimidesters in 20 ml absol. THF werden 100 mg p-Toluolsulfonsäure und 1,5 g Digoxin gegeben. Das Digoxin geht unter Rühren bei Raumtemperatur langsam in Lösung. Nach 6 Stunden wird die Lösung mit 4 ml 0,1 n HCl auf pH 2 gebracht, dann wird eine halbe Stunde weitergerührt und schliesslich mit 0,1 n NaOH auf pH 6 gebracht. Dann wird eingeengt, in absol. Äthanol aufgenommen und wieder eingeengt. Aus dem zurückbleibenden Öl kristallisiert die Verbindung langsam in der Kälte aus. Es wird aus Essigester/Petroläther umkristallisiert. Fp. 125 bis 140°C (Zers.).
Analyse:
berechnet: C 60,5 H 7,35 N 1,4 gefunden: C 59,89 H 7,51 N 1,24
Mit den im folgenden beschriebenen Reaktionen soll — in nur beispielhafter Weise — die vorteilhafte Verwendung der erfindungsgemässen Verbindungen zur Herstellung von Reagentien zur Untersuchung von Digitalisglykosiden näher erläutert werden.
Digoxin-4"'-glutaryl-tyramid
0,5 g eines gemäss Beispiel 2 hergestellten aktiven Di-carbonsäureesters, 0,082 g Tyramin und 0,082 ml Triäthyl-amin werden 4 Tage lang bei Raumtemperatur in 20 ml absol. THF gerührt. Das THF wird abgezogen, der Rückstand in Methylenchlorid aufgenommen und zweimal mit 0,1 n HCl und einmal mit HaO ausgeschüttelt. Die organische Phase wird getrocknet, eingeengt, in Essigester aufgenommen und mit Petroläther gefällt. Das so erhaltene kristalline Produkt wird in Essigester gelöst und an einer Silikagel-Säule chromatographiert. Hierbei läuft eine Verunreinigung durch, das reine Produkt wird mit THF eluiert, das Eluat eingeengt und mit Essigester versetzt. Durch Zugabe von Petroläther kristallisiert reines Digoxin-4"'-glutaryl--tyramid aus [Fp.: 120 bis 160°C (Z.)], das nach radioaktiver Markierung ein ausgezeichnetes Reagens zur Bestimmung von Digoxin in wässriger oder physiologischer Lösung darstellt.
Digoxin-Rinderserumalbumin-Konjugat
Zu einer 5 %igen Lösung von Rinderserumalbumin in einer wässrigen K2C03-Lösung (pH = 8,5) wird eine äthanolische Lösung eines nach Beispiel 2 hergestellten aktiven Dicarbonsäureesters zugetropft. Nach mehrtägigem Rühren bei Raumtemperatur fällt ein weisser Niederschlag aus, der abzentrifugiert und mit Essigester gewaschen wird. Sowohl das Zentrifugat als auch der Rückstand, der in Wasser dis-pergiert wird, werden 1 Tag lang gegen fliessendes Wasser dialysiert. Die Lösung des Rückstandes wird sofort gefriergetrocknet. Die Lösung des Zentrifugats wird mit 0,1 n HCl auf pH 7 gebracht und eingeengt und anschliessend in Äthanol aufgenommen und auf pH 4,5 gebracht. Dabei fällt ein weiterer Teil des Konjugates aus. Dieses wird in 10 ml 0,15 n NaHCOs-Lösung aufgenommen und 3 Tage lang gegen fliessendes Wasser dialysiert und schliesslich gefriergetrocknet.
Analog hierzu werden Edestin- und Polylysin-Digoxin-Konjugate aus den gemäss Beispiel 2 hergestellten aktiven Dicarbonsäureestern hergestellt, die wie das Digoxin-Rinder-serumalbumin-Konjugat, hervorragende Immunogene darstellen.
Auch die Herstellung eines Peroxidase-Digoxin-Deriva-tes erfolgt analog zu der des Digoxin-Rinderserumalbumin-Konjugats, wobei bei einem Äthanolgehalt der Reaktionslösung von weniger als 20% gearbeitet wird und gegen eine 0,1 n Tris-Puffer-Lösung (pH = 6,2) dialysiert wird. Das POD-Digoxin-Derivat stellt ein hervorragenden Enzymtest-Reagens zur Bestimmung von Digoxin dar. Auch die Kondensation an Aminohexyl-Sepharose erfolgt nach analogen Verfahren.
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Claims (5)

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1. Verfahren zur Herstellung von neuen reaktiven unsymmetrischen Dicarbonsäureestern der Formel I
RjO
R2 —C —(CH2)n —COX (I)
I
R3
worin
Ri einen Alkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen;
R2 und R3 je einen Alkoxyrest mit 1 bis 3 Kohlenstoff-atomen;
X einen Succinimid-N-oxy-, N-Methyl-pyridinium-oxy-, Piperidyl-N-oxy-, Phthalimid-N-oxy- oder Benz-triazol--N-oxy-Rest; und n die Zahl 2, 3, 4 oder 5
bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mono-orthotrimethyl-, Monoorthotriäthyl- oder Monoorthotripro-pylester einer Dicarbonsäure der Formel II
O O
^C —(CH2)n —(II) OH OH
in Form eines Monoalkalisalzes in Gegenwart eines Kronenäthers oder eines Cryptâtes in einem polaren oder unpolaren aprotischen organischen Lösungsmittel mit einer den Rest X abgebenden Verbindung umsetzt.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als polares oder unpolares aprotisches organisches Lösungsmittel Benzol oder Chloroform verwendet.
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PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als den Rest X abgebende Verbindung ein Hydroxysuccinimidsulfonat, N-Hydroxybenz-triazol-tosylat oder N-Hydroxybenztriazol-trifluormethyl-sulfonat verwendet.
4. Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Hydroxysuccinimidsulfonat das Me-thylsulfonat oder das p-Toluolsulfonat des Hydroxysuccin-imids verwendet.
5. Verfahren zur Herstellung von neuen reaktiven unsymmetrischen Dicarbonsäureestern der Formel Ia
Ri'
I
R2 — C — (CH2)n — COX (Ia)
r3
worin Rj' einen Digoxin- oder Digitoxinrest darstellt und die Symbole R2, Rs, X und n die in Patentanspruch 1 angegebene Bedeutung haben, dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 eine Verbindung der Formel I herstellt und diese anschliessend mit Digoxin oder Digitoxin in Gegenwart von p-Toluolsul-fonsäure umestert.
CH1047576A 1975-08-20 1976-08-17 Verfahren zur herstellung von neuen, reaktiven unsymmetrischen dicarbonsaeureestern. CH630613A5 (de)

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