CH629512A5

CH629512A5 - Process for the preparation of N-acylamino acid polyethylene glycol esters

Info

Publication number: CH629512A5
Application number: CH563979A
Authority: CH
Inventors: Rainer Dr Uhmann; Rolf Dr Geiger; Wolfgang Dr Koenig
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1974-11-23
Filing date: 1979-06-15
Publication date: 1982-04-30
Also published as: CH616649A5; DE2455623A1; DE2455623B2; DE2455623C3

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von N-Acylaminosäurepolyäthylenglykolestern, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Poiyäthylenglykol in für die Peptidchemie geeigneten Lösungsmitteln mit N-Acyl-aminosäureaktivestern der Formel I

H H O

ili

Ac-N-C-C-O-Y (I),

I

R

in der Ac eine, vorzugsweise in der Peptidchemie übliche, Aminoschutzgruppe, R eine Aminosäureseitenkette und Y einen Di-, Tri-, Tetra- oder Pentachlorphenyl-, Nitrophenyl-oder Chlornitrophenylrest darstellt und Verbindungen der Formel II

, N-OH (II),

i i in der A die Gruppe C=0, C=S oder ein weiteres Stickstoffatom bedeutet und in der A und N Glieder eines gegebenenfalls an einen Benzolkern anellierten und/oder 1 oder 2 weitere Heteroatome enthaltenden 5- bis 6-gliedrigen, gegebenenfalls durch niedere Alkylgruppen oder Halogen substituierten, heterocyclischen Ringes sind, wobei der Benzolkern durch Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Sulfonsäureamid, Carboxamid, Cyano, Alkoxy oder niederes Alkyl substituiert sein kann, und deren pK-Wert in 0,5 m Lösung in einem Gemisch von 6 Teilen Diäthylenglykoldimethyläther und 4 Teilen Wasser bei 30°C zwischen 3,7 und 4,2 liegt, umsetzt.

Die intermediär gebildeten N-Acylaminosäureester mit den verschiedenen N-Hydroxyverbindungen der Formel II können gegebenenfalls isoliert werden.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden N-Acyl-aminosäureaktivester der Formel I, wie z.B. 2,4,5-Trichlor-phenyl- oder p- bzw. o-Nitrophenylester, zusammen mit einer N-Hydroxyverbindung der Formel II und Poiyäthylenglykol zur Reaktion gebracht. Die einzelnen Komponenten werden vorzugsweise im molaren Verhältnis bzw. im Überschuss, bezogen auf Poiyäthylenglykol, eingesetzt.

Zwischen dem Aktivester der Formel I und den N-Hydroxyverbindungen der Formel II stellt sich in polaren Lösungsmitteln wie DMF, DMSO oder DMA ein Gleichgewicht ein. Es entsteht der entsprechende Ester der N-Hydroxyverbin-dungen (Chem. Ber. 106, Seiten 3626 bis 3635 (1973)), der mit dem Poiyäthylenglykol weiterreagiert und dadurch aus dem Gleichgewicht entfernt wird. Es empfiehlt sich, die N-Hydro-xyverbindung mit einer tertiären Base zu neutralisieren, da hierbei das Gleichgewicht zugunsten des Esters der N-Hydroxyverbindung verschoben wird (siehe Tabelle).

Als Verbindungen der Formel II kommen z.B.

l-Hydroxy-6-benzotriazol-sulfonsäurediäthylamid l-Hydroxy-6-benzotriazol-sulfonsäuremethylamid l-Hydroxy-6-benzotriazol-sulfonsäureamid l-Hydroxy-6-trifluormethyl-benzotriazol l-Hydroxy-6-methoxy-benzotriazol l-Hydroxy-5-methoxy-benzotriazol

1 -Hydroxy-4-methyl-benzotriazol

1 -Hydroxy-5-methyl-benzotriazol l-Hydroxy-5,6-dimethyl-benzotriazol

1 -Hydroxy-6-nitro-benzotriazol

6-Chlor-1 -hydroxy-benzotriazol

5-Chlor-1 -hydroxy-benzotriazol 5,6-Dichlor-1 -hydroxy-benzotriazol

6-Brom-1 -hydroxy-benzotriazol 4-Chlor-l-hydroxy-7-methyl-6-nitro-benzotriazoI 6-Chlor-1 -hydroxy-5-methyl-benzotriazol l-Hydroxy-6-methyl-5-benzotriazol-carbonitril l-Hydroxy-4-methyl-6-nitro-benzotriazol 6-Chlor-1 -hydroxy-5-isopropylbenzotriazol und 4,5,6,7-Tetrachlor-1 -hydroxy-benzotriazol

2

s

10

IS

20

25

30

35

40

45

50

SS

60

65

Neben dem 1-Hydroxybenzotriazol und seinen kernsubstituierten Derivaten, wie beispielsweise oben aufgezählt, können auch andere N-Hydroxyverbindungen der Formel II, wie z.B. cyclische Hydroxamsäuren mit N als Heteroatom iß: Ring, eingesetzt werden:

3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazin 3 - Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-chinazolin 3-Hydroxy-2-methyl-4-oxo-3,4-dihydro-chinazolin oder N-Hydroxypyridone:

1 -Hydroxy-2-pyridon,

1 -Hydroxy-4-methyl-pyridon-2, 1 -Hydroxy-4,6-dimethyl-3,5-dichlor-pyridon-2 auch cyclische Thiohydroxamsäuren kommen in Betracht, wie z.B. das3-Hydroxy-4-methyl-2,3-dihydro-thiazol-2-thion.

Als Lösungsmittel kann man polare Lösungsmittel, wie z.B. Dimethylformamid und Tetramethylharnstoff, verwenden. Ein grosser Überschuss an Acylierungsmitteln ist nicht erforderlich, vielmehr reicht ein 100%iger Überschuss im allgemeinen aus, um mindestens 80% Beladung zu erzielen. Falls erforderlich, kann man nach einmaliger Fällung erneut die Reagenzien zugeben und die Reaktion wiederholen.

Die bisher durchgeführte Veresterung von Poiyäthylenglykol mit N-Acylaminosäuren und DCCI bzw. deren symmetrischen Anhydriden verläuft in vielen Fällen entweder mit unbefriedigenden Ausbeuten oder man ist gezwungen, lange Reaktionszeiten bzw. grosse Überschüsse teurer Reagenzien zu verwenden. Bei der Verwendung von symmetrischen Anhydriden gestaltet sich das bisherige Verfahren noch dadurch besonders ungünstig, dass nur 50% des Reagenzes ausgenützt werden können. Beispielsweise kann Boc-Met-OH mit PEG (Molgewicht 15 000) nur dann zu ca. 80% verestert werden, wenn ein lOfacher Überschuss und 7 Tage Reaktionszeit angewandt werden (Chem. Ber. 107, Seiten 1344 bis 1352(1974)).

Die gebildeten Aktivester der Acylaminosäuren und der N-Hydroxy-Verbindungen der Formel II erlauben es das erfindungsgemässe Verfahren bei höheren Temperaturen durchzuführen, da sie keine thermischen Umlagerungspro-dukte liefern, was bei der Umsetzung mit DCCI allein der Fall ist (J. Amer. Chem. Soc. 80,6204 (1958)).

Von Estern des 1-Hydroxybenztriazols war bisher nur bekannt, dass mit ihrer Hilfe die Knüpfung der Peptidbin-dungen spezifischer und mit weniger Nebenreaktionen erfolgt. Eine höhere Spezifität der Reaktion bedeutet eine Bevorzugung der Aminolyse vor der Hydrolyse oder Alkoho-lyse. Es war jedoch nicht zu erwarten, dass in Abwesenheit von Aminen auch die Alkoholyse so stark beschleunigt und verbessert wird, dass die genannten Ester sogar aktivierten Derivaten wie den symmetrischen Anhydriden überlegen sind.

Auch die sterisch stark gehinderten Acylaminosäuren Z-IIe-OH, Z-Pro-OH und Boc-Cys(BZl)-OH können unter etwas schärferen Bedingungen (70°C) ebenfalls in die Poly-äthylengiykolester übergeführt werden, was nach dem bisherigen unkatalysierten Verfahren nicht ohne weiteres möglich war.

629512

Ein weiterer Vorzug des erfindungsgemässen Verfahrens ist das Zurückdrängen von Nebenreaktionen. So unterbleibt ;.B. die aus J. Org. Chem. 26, (1961), Seite 3256 bekannte, durch Dicyclohexycarbodiimid hervorgerufene Nitrilbildung aus Boc-Gln-OH und Boc-Asn-OH unter den erfindungsgemässen Bedingungen.

Die Aktivierung von N-Acylaminosäuren über ihre Aktivester mit 1-Hydroxybenzotriazol und verwandten Verbindungen, schliesst ausserdem eine nennenswerte Racemisie-rung aus, was ein weiterer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens ist.

Schliesslich wird auch die als Nebenreaktion bereits erwähnte Urethanacylierung unterdrückt, die oft beobachtet wird, wenn stark aktivierte Alkyl- oder Aralkyloxycarbonyl-aminosäuren als Acylierungsreagenzien im Überschuss eingesetzt werden müssen (vgl. J. Org. Chem. 39, Seiten 660 bis 668 (1974)). Das erfindungsgemässe Verfahren wirkt sich auch hier besonders günstig aus. Bei gleichzeitiger Ausbeutesteigerung bleibt die Urethanacylierung unter 1%. Selbst bei wiederholter Acylierung steigt die Nebenproduktbildung nicht über 2% an.

Neben diesem grossen Vorteil verläuft die erfindungsgemässe Veresterung rascher und benötigt keine grossen Überschüsse an N-Acylaminosäuren.

Die erfindungsgemäss hergestellten Acylaminosäureester sind Zwischenprodukte bei der Synthese von therapeutisch wertvollen Peptiden.

Es werden folgende Abkürzungen verwendet:

PEG = Poiyäthylenglykol

-OPEG (4), (6), (10), (15)

und (20) = Polyäthylenglykolester vom Molgewicht

4000,6000,10 000,15 000 und 20 000 DMF = Dimethylformamid

DMSO = Dimethylsulfoxid

DMA = Dimethylacetamid

TMH = Tetramethylharnstoff

THF = Tetrahydrofuran

HOBt = 1-Hydroxybenzotriazol

Die Aminosäuren und deren Derivate werden gemäss den JUPAC-JUB-Regeln J. Biol. Chem. 247, Seiten 977 bis 983 (1972) bezeichnet.

Beispiel 1 (siehe Tabelle)

Veresterung von Poiyäthylenglykol mit N-Acylamino-säuren durch Umesterung von N-Acylaminosäureaktiv-estern.

Entsprechende äquivalente Mengen von Z-Gly-OTcp, PEG (6) und N-Hydroxyverbindung werden in DMF bei 55CC gelöst, man lässt mit oder ohne Zusatz von N-Äthyl-morpholin 24 Stunden lang reagieren. Das Lösungsmittel wird verdampft, der Rückstand dreimal mit kaltem Essigester extrahiert, schliesslich in Äthanol gelöst und mit Äther gefällt.

Der Veresterungsgrad wird durch Aminosäureanalyse einer definierten Probe der Substanz nach saurer Hydrolyse bestimmt.

3

io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

629512 4

Tabelle

Veresterung von Poiyäthylenglykol mit Carbobenzoxyglycin-2,4,5-Trichlorphenylester katalisiert durch N-Hydroxyverbindungen

Bedingungen

Produkt

Acylaminos. [Äquiv.]*

Katalysator [Äquiv.]*

Lösungsmittel [g/ml]**

Zeit/Temp.

Base [Äquiv.]*

Veresterungsgrad

Z-Gly-OPEG (6)

20

HOBt/20

DMF/0,15

24h/55°C

67%

Z-Gly-OPEG (6)

20

HOBt/20

DMF/0,15

24h/55°C

-

63%

Z-Gly-OPEG (6)

2

HOBt/2

DMF/0,15

24h/55°C

2

56%

Z-Gly-OPEG (6)

2

1-Hydroxypy-

DMF/0,15

24h/55°C

2

61%

ridon-2/2

* bezogen auf OH-Gruppen des PEG's ** bezogen auf PEG

B

Claims

629512 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von N-Acylaminosäurepoly-äthylenglykolestern, dadurch gekennzeichnet, dass man Poiyäthylenglykol in für die Peptidchemie geeigneten Lösungsmitteln mit N-Acylaminosäureaktivestern der Formel I

H H O

! ! !!

Ac-N-C-C-O-Y (I),

I

R

in der Ac eine Aminoschutzgruppe, R eine Aminosäureseitenkette und Y einen Di-, Tri-, Tetra- oder Pentachlor-phenyl-, Nitrophenyl- oder Chlornitrophenylrest darstellt und Verbindungen der Formel II

,A\

( N-OH (II),

\ /

in der A die Gruppe C=0, C=S oder ein weiteres Stickstoffatom bedeutet und in der A und N Glieder eines gegebenenfalls an einen Benzolring anneliierten und/oder 1 oder 2 weitere Heteroatome enthaltenden 5- bis 6-gliedrigen, gegebenenfalls durch niedere Alkylgruppen oder Halogen substituierten, heterocyclischen Ringes sind, wobei der Benzolkern durch Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Sulfonsäureamid, Carboxamid, Cyano, Alkoxy oder niederes Alkyl substituiert sein kann, und deren pH-Wert in 0,5 m Lösung in einem Gemisch von 6 Teilen Diäthylenglykoldimethyläther und 4 Teilen Wasser bei 30°C zwischen 3,7 und 4,2 liegt, umsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Verbindungen der Formel II verwendet, in denen der Benzolkern mit Sulfonsäuremethylamid oder Sulfonsäu-rediäthylamid substituiert ist.

Poiyäthylenglykol (PEG) findet in der Peptidchemie als Esterkomponente bei der Synthese von Peptiden Verwendung (Nature 273, Seiten 512 bis 513, (1972)).

Aminosäuren und Peptide können als Aminosäure- und Peptidester von PEG sowohl durch Ultrafiltration als auch durch Kristallisation (Angew. Chemie, 86, Seite 101 (1974)) von niedermolekularen Substanzen abgetrennt werden.

Bisher hat man die Esterbindung zwischen Polymer und Acylaminosäure hauptsächlich mit Hilfe von Dicyclohexy-carbodiimid (DCCI) hergestellt. Entweder stellte man die symmetrischen Anhydride von N-Acylaminosäuren mittels DCCI her und Hess diese mit dem Poiyäthylenglykol reagieren, oder man setzte die N-Acylaminosäuren direkt mit dem Poiyäthylenglykol und DCCI um.

Bei dieser Methode, Poiyäthylenglykol zu verestern,

konnte jedoch eine Urethanacylierung und in Folge davon eine Dipeptidbildung beobachtet werden, die in Extremfällen 30% erreichte.