Verfahren zur Herstellung des 4'-Hyldroxy-erythromycins A
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Her stellung des neuen, antibiotisch wirkenden 4'-Hydroxy -erythromycins A.
Erythromycin A ist ein bestbekanntes Antibiotikum von breitem Spektrum hinsichtlich seiner antibakteriellen Wirksamkeit, ist wirksam gegen jene Bakterienstämme, denen man bei Infektionen, welche Warmblütler befallen, begegnet. Die vollständige Struktur von Erythromycin A ist in J. Amer. chem. Soc. 79 (1957), 6062 beschrieben. Für die vorliegenden Zwecke scheint es geeignet, die Formel in bezug auf die in der vorgenannten Literaturstelle wiedergegebene Strukturformel in der folgenden Weise abzukürzen
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worin E sowohl den Erythronolid- und den Cladinoseteil wiedergibt, wobei der Desosaminteil in seiner Gesamtheit wiedergegeben worden ist. In sämtlichen nachfolgenden Formeln, in denen der Buchstabe E erscheint, soll er die vorgenannte Bedeutung haben.
Das Derivat, welches erfindungsgemäss erhalten wird, besitzt sowohl in der 3'- als auch in der 4'-Stellung Substituenten. Diese Verbindung hat die folgende Strukturformel
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Das erfindungsgemässe Verfahren besteht darin, dass man 3'-(Dedimethylammo)-A3' 4'-erythromycin A mit einem Epoxydierungsmittel umsetzt,
im erhaltenen 3' -(Dedimethylamino)-3',4'-epoxyerythromycin A den Ep- oxydring mit einem Azid öffnet und das erhaltene 3'-(Dedimethylamino)-3'-azido-4'-hydroxyerythromycin 4 mittels katalytischer Hydrierung in Gegenwart von Formaldehyd direkt in 4'-Hydroxyerythromycin A überführt oder mittels katalytischer Hydrierung zuerst in 3'-(Dedimethylamino)-3'-amino-4'-hydroxyerythromycin A überführt und dieses hierauf in Gegenwart von Formaldehyd zum 4'-Hydroxyerythromycin A weiter hydriert.
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Zur Herstellung des benötigten Ausgangsproduktes (III) behandelt man Erythromycin A (Formel I) mit einem geeigneten Oxydationsmittel, wie z.B. einem Peroxyd, wobei man Wasserstoffperoxyd bevorzugt. Durch die Oxydation erhält man das Aminoxydderivat der Formel II, welches beim Erhitzen auf eine solche Temperatur, welche ausreicht, dass eine Reaktion ohne Zerstörung des hitzeempfindlichen Erythromycins A bewirkt wird (so reagiert, dass ungesättigtes 3',4'-Derivat der Formel III erhalten wird. Zu diesem Zwecke hat sich eine Temperatur von ca. 150 bis 1700C als geeeignet erwiesen.
Dabei erhält man gute Ausbeuten.
Das Pyrolyseprodukt wird nach dem erfindungsgemässen Verfahren mit einem epoxydierenden Mittel, wie z.B. mit organischen Persäuren, behandelt. Hierzu verwendet man vorzugsweise m-Chlorperbenzoesäure, weil sie weniger heikel ist. Hierauf wird das epoxydierte Derivat der Formel IV mit einem Azid, z.B. Natriumazid, umgesetzt, wobei man das 3'-(Dedimethylamino)-3'-azi- do-4'-hydroxyerythromycin A der Formel V erhält. Hydriert man dieses Azid in Gegenwart von Formaldehyd, so erhält man über das 3'-(Dedimethylamino)-3'-amino -4'-hydroxyerythromycin A (Formel VI) das 4'-Hydroxyerythromycin A der Formel VII.
Wie aus den nachstehenden experimentellen Testwerten, wie sie in den Tabellen I bis III zu finden sind, hervorgeht, besitzt das 4'-Hydroxyerythromycin A ein Wirkungsspektrum, welches dem Erythromycin A ähnlich ist. In der Tabelle I wird die Wirkung von 4'-Hydroxyerythromycin A gegenüber einer Anzahl von Bakterien- stämmen und anderen Mikroorganismen gezeigt.
Ebenso wie Erythromycin A vermag die erfindungsgemäss erhältliche Verbindung beständige Säureadditionssalze zu bilden, so z.B. Chlorhydrate, Sulfate und Phosphate, ferner bildet sie Salze mit organischen Säuren, wie z.B. Essigsäure. Die Säureadditionssalze sind geeignete, beständige Medien zum Lagern von Derivaten von deren Verwendung.
Die 4'-Hydroxyerythromycin A-Säureadditionssalze besitzen ebenfalls antiobiotische Wirkungen und, wenn sie therapeutisch Verwendung finden, sollte die gewählte Säure ein Anion aufweisen, das physiologisch annehmbar ist.
TABELLE I
Bakterien
Minimale Organismus Hemmkonzentration mcg/cm2, 24 Stunden Staph. aureus 209P 0,2 Staph. aureus 209PER 6,2 ( > 100- 48 Stdn.) Staph. aureus Smith 0,39' Staph. aureus Smith ER > 100 Staph. aureus 45 0,39 Staph. aureus 45 ER > 100 Staph. aureus 67 0,39 Staph. aureus 67 ER > 100 Staph. aureus Quinones > 100 Staph. aureus Wise 155 > 100 Staph. aureus WEB 0,39 Staph. epidermidis 3519 0,39 Staph. epidermidis 3519 ER > 100 Strep. pyogenes C203 0,05 Strep. faecalis 10541 0,2 Diplococcus pneumoniae Type I 0,05 Haemophilus influenzae 9334 6,2 E. coli Juhl 100 A.
aerogenes 13048 > 100 Kleb. pneumoniae 10031 12,5 Sal. typhimurium Ed. 50 Sal. Typhosa 992 100
TABELLE 1 (Fortsetzung)
Bakterien
Minimale Organismus (MIC) mcg!cm3, 24 Stunden
Hemmkonzentration Shig. sonnei 9290 25 Prot.
Vulgaris JJ > 100 Prot. mirabilis > 100 Pseudo. aeruginosa 9027 > 100 Mycoplasma gallisepticum 0,2* Mycoplasma granularum 0,1 * Mycoplasma hyorhinis 50 * Mycoplasma pneumoniae 0,2* Panagrellus redivivus
Tötungstest > 100
Statischer Test** > 100 Schisto. mansoni 100 Trich. vaginalis > 100 Crithidia fasciculata > 100 T. cruzi > 10 * bedeutet 7tägige Inkubation ** die angegebene minimale Hemmkonzentration führt dazu, dass die Vermehrung der Würmer aufhört.
Die bakterizide Wirkung von 4'-Hydroxyerythromycin A gegenüber einem einzelnen Stamm von Staphylococcus aureus und Streptomyces pyogenes findet sich in der Tabelle II. Als Methode bedient man sich eines üblichen Röhrchen-Reihenverdünnungsversuches mit Plattenkulturen von Röhrchen, bei denen sowohl nach 24 Stunden als auch nach 48 Stunden Inkubationszeit kein Wachstum nachweisbar ist. Die minimale, bakterizide Konzentration (MBC) wird als Konzentration definiert, welche eine 99,9%ige Reduktion von lebensfähigen Zei- len ergibt, wie dies Plattenkulturen zeigen. Die Werte der MIC bzw. MBC wurden durch Zählung der Mikroorganismen auf den Plattenkulturen bestimmt.
TABELLE II Organismus und 4'-Hydroxyerythromycin A Inkubationsdauer MIC mcg/cm3 MBC mcg/cm3 Staph. aureus Smith 24 Stunden 0,39 6,2 48 Stunden 0,39 0,78 Strep. pyogenes C203 24 Stunden 0,05 0,2 48 Stunden 0,05 0,1
In der Tabelle III werden jene Resultate wiedergegeben, welche man erhält, wenn man zwei Präparate von 4'-Hydroxyerythromycin A gegenüber akuter Staphylococcus aureus (Smith)-Infektion von Mäusen testet. Die Behandlung erfolgte sowohl oral als auch intramuskulär.
Für jede Gruppe verwendete man 10 Mäuse und die Antibiotika wurden 1 Stunde, 3 Stunden, 5 Stunden und 7 Stunden nach der Infektion verabreicht. Zu Vergleichszwecken verwendete man Erythromycinlactobionat. Die 4'-Hydroxyerythromycin A-Präparate wurden auf einer Trockengewichtsbasis bezogen. Erythromycin A wurde auf einer Aktivitätsbasis, berechnet auf Erythromycinbasis äquivalent verwendet.
TABELLE III Vergleichsweise Wirkung von 4'-Hydroxyerythromycin A durch Mäuseschutzteste mittels der Staphylococcus aureus (Smith) ungefährer Präparat Verabreichungs- CDso-Wert methode mg/kg/Total- dosis 4'-Hydroxyerythromycin A intramuskulär 20 (Versuch 1)* 4'-Hydroxyerythromycin A oral 100- 200 (Versuch 1)* 4'-Hydroxyerythromycin A intramuskulär 10 - 20 (Versuch 2)* 4'-Hydroxyerythromycin A oral 150 (Versuch 2)* Erythromycinlactobionat intramuskulär 25 - 50 Erythromycinlactobionat oral 50 * Der Unterschied zwischen dem Versuch 1 und dem Versuch 2 bestand darin, dass die Testverbindung beim Versuch 2 einen höheren Reinheitsgrad hatte.
Das 4'-Hydroxyerythromycin A kann in ähnlichen Dosierungen verwendet werden wie Erythromycin. Es kann in einer beliebigen Art und Weise entweder als basische Verbindung oder als Säureadditionssalz verabreicht werden.
3'-(Dedmethylsnino)-3',4'-epoxyerythromycin A
Das 3'-Dedimethylamino-A3'4'-erythromycin A wird dadurch hergestellt, dass man 54,5 g von Erythromycin A-N-oxyd (beschrieben durch Flynn in J.A.C.S. 76, 3126 (1954) bei 165 bis 1700C und einem Vakuum von 0,2 mm Quecksilber während 4 Stunden pyrolysiert. Die Pyrolyseprodukte werden hierauf in Methanol gelöst, mit Tierkohle behandelt, filtriert und aus einer Mischung von Chloroform und Äther umkristallisiert. Dabei erhält man das 3'-Dedimethylamino-A3,'4, in einer Ausbeute von 24,4 g mit einem Schmelzpunkt von 218 bis 2190C. Diese Herstellungsweise wird in Einzelheiten in der amerikanischen Patentschrift Nr. 3 361 737 beschrieben.
14 g (0,02 Mol) 3'-Dedimethylarnino-A3,,4,-erythro- mycin A werden in Chloroform gelöst Chloroform ist das bevorzugte Lösungsmittel. Man kann aber auch andere Lösungsmittel, welche in bezug auf die Reaktion mit Persäuren und 3'-Dedimethylamino-A3' 4'-erythromycin A inert sind, verwenden. Die erzielte Lösung wird langsam innerhalb von einer Periode von ca. 30 Minuten bei Zimmertemperatur mit 20 g m-Chlorperbenzoesäure versetzt. Die Lösung der Reaktionspartner wird hierauf auf 0C gekühlt und während ungefähr 24 Stunden auf dieser Temperatur gehalten. Durch Zugabe der Persäure bei Zimmertemperatur anstatt bei reduzierter Temperatur erhält man bessere Ausbeuten, wobei die Nachbehandlung bei einer niedrigeren Temperatur eine Vervollständigung der gewünschten Reaktion sicherstellt.
Die Oxydation kann aber selbstverständlich auch bei anderen Temperaturen erfolgen, wobei aber die Ausbeute materiell verringert wird.
Die kühle Chloroformlösung wird mit kalten wässrigen Lösungen von Natriumsulfit und hierauf mit kaltem wässrigem Natriumbicarbonat extrahiert. Da diese wässrigen Salze keine sauren Eigenschaften aufweisen, wird die Epoxybindung nicht zerstört.
Der Chloroformrückstand wird hierauf durch schwaches Erwärmen in einem Wasserbade unter vermindertem Druck entfernt.
Das verbleibende rohe Produkt wird in 25 cm3 warmem Aceton von 280C aufgenommen. Nach dem Kühlen auf Zimmertemperatur kristallisiert das Produkt spontan aus Aceton aus, wobei man 10,5 g (74% Ausbeute) an 3'-(Dedimethylamino)-3',4'-epoxyerythromycin A vom Schmelzpunkt 221 bis 2230C erhält.
Herstellung von 3'-Dedimethylamino-3' -azido-4'-hydroxy- erythromycin A
4,2 g (0,006 Mol) 3'-Dedimethylamino-3',4'-epoxyerythromycin A werden in 150 cm3 Dimethylsulfoxyd oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel, wie z.B.
Dimethylformamid oder Dimethylacetamid, und 6 cm3 Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 1,2 g (0,006 Mol) Magnesiumperchlorat und 3,9 g (0,06 Mol) Natriumazid versetzt. Die Lösung wird dann während 16 Stunden auf 800C erhitzt und hierauf mit 300 cm3 Wasser versetzt.
Die Lösung wird mit Chloroform extrahiert und das Chloroform verdampft. Das so erhaltene rohe Produkt enthält eine Mischung von 3'-Dedimethylamino-3'-azido -4'-hydroxyerythromycin A und 3 -Dedimethylamino-3 -hydroxy-4'-azidoerythromycin A. Da lediglich die erstere Verbindung gewünscht wird, trennt man die beiden Produkte durch Extraktion mit Äthyläther, da das 3' Azid darin löslich ist, wogegen das 4'-Azid darin unlöslich ist.
Das 3'-Azid wird in einer Mischung von Äthylacetat und n-Pentan so lange gelöst, bis eine leichte Trübung eintritt. Nach schwachem Abkühlen kristallisiert das gereinigte 3'-Azid. Das Produkt hat einen Schmelzpunkt von 187 bis 1900C und zeigt, was für Azid charakteristisch ist, bei 2116 cm-1 ein stark infrarotes Band.
Herstellung von 4'-Hydroxyerythrortryc7w A
1 g 3'-Dedimethylamino-3'-azido-4'-hydroxyerythromycin A wird in 100 cm3 absolutem Äthanol gelöst. Diese Lösung wird mit 1,2 cm3 37%igem Formaldehyd zusammen mit 0,85 g 5% Pd, auf Kohle niedergeschlagen, versetzt. Diese Mischung wird während 24 Stunden in Gegenwart von Wasserstoff in einer Parr-Schüttelvorrichtung geschüttelt. Reinigt man das rohe Produkt in ähnlicher Weise, wie dies oben beschrieben worden ist, so erhält man 0,6 g (68% Ausbeute) von 4'-Hydroxyerythromycin A mit einem Schmelzpunkt von 148 bis 1500C.
Variante über 3' -(Dedino'thylamino)-3'-amino.4'-hy- droxyerythromycin A
1,0 g 3' - Dedimethylamino-3'-azido-4'-hydroxyery- thromycin A wird in absolutem Äthanol gelöst und während 2 Stunden in Gegenwart von Wasserstoff und PtO- Katalysator in einer Parr-Schüttelvorrichtung geschüttelt.
Die Lösung wird hierauf filtriert und unter vermindertem Druck, eingeleitet durch Aspiration, zur Trockne eingedampft, wobei man 1,0 g eines farblosen Glases erhält.
Das Amin wird hierauf in 100 cm3 absolutem Äthanol gelöst und diese Lösung mit 1,2 cm3 37%igem Formaldehyd zusammen mit 0,85 g Pd, auf Kohle niedergeschlagen, versetzt. Das erzielte Gemisch wird während 24 Stunden in Gegenwart von Wasserstoff in einer Parr Schüttelvorrichtung geschüttelt. Nach der Hydrierung wird das Gemisch filtriert, das Filtrat wird gesammelt und das Äthanol, sowie das überschüssige Formaldehyd durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt.
Der verbleibende, feste Rückstand wird in 300 cm3 kaltem 0,1M KH2PO4 gelöst und zweimal mit Methylenchlorid gewaschen. Der pH-Wert wird mit 5%igem Natriumcarbonat auf ca. 9 eingestellt und die nunmehr alkalische Lösung zweimal mit Methylenchlorid extrahiert.
Die Extrakte werden vereinigt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Trocknen werden die Extrakte bei vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei man 0,7 g eines weissen, amorphen Glases erhält. Das letztere wird aus einer Mischung von Methylenchlorid und Petroläther (Siedepunkt 66 bis 700C) umkristallisiert, wobei man 0,5 g (50% Ausbeute) von farblosen Prismen mit einem Schmelzpunkt von 148 bis 1 500C erhält. Dieses Produkt kann als 4'-Hydroxyerythromycin A charakterisiert werden. Dies wird dadurch bewiesen, dass man das Produkt mit NaBH4 und hierauf mit einer mit Salzsäure angesäuerten Lösung von Methanol reagieren lässt, wobei man zwei Produkte erhält. Eines dieser Produkte wird als Methylcladinosid identifiziert.
Das andere Produkt wird mit 3n-HCl während 6 Stunden unter Rückfluss erhitzt und liefert zwei Produkte, welche als Mycaminose-hydrochlorid bzw. 9,9 Dihydroerythronolid A identifiziert werden können.