Vorrichtung zur Erzielung eines feinkristallinen oder amorphen festen Zustandes beim Gefrieren wasserhaltiger Substanzen, insbesondere von biologischen Objekten
Bei der Herstellung von Präparaten, z.B. für die Elektronenmikroskopie, kommt es entscheidend darauf an, dass die Struktur der untersuchten Objekte durch den Präparationsvorgang nicht verändert oder gar zerstört wird. Wasserhaltige Substanzen, z.B. biologische Gewebe, werden üblicherweise zuerst durch Einfrieren fixiert, sodann wird mittels eines Mikrotoms die zu untersuchende Fläche freigelegt, gegebenenfalls zwecks Kontrasterhöhung mit einem Metall im Vakuum bedampft und anschliessend im Licht- oder Elektronenmikroskop untersucht.
Die Fixierung durch Gefrieren hat den Nachteil, dass die Struktur der untersuchten Objekte durch Eiskristallbildung gestört wird und zwar um so mehr, je grösser die sich bildenden Eiskristalle sind. Um beim Einfrieren einen feinkristallinen oder wenn möglich sogar amorphen festen Zustand des gefrorenen Wassers zu erreichen, wurde schon vorgeschlagen, die Abkühlung möglichst schlagartig durchzuführen, beispielsweise durch Eintauchen der zu gefrierenden Substanzen oder eines Behälters mit dieser Substanz in ein verflüssigtes Gas, etwa flüssigen Stickstoff, als Kältemittel. Auf diese Weise gelingt es, einen amorphen oder genügend fein kristallinen (sogenannten vitrifizierten) Zustand in einer äusseren Randzone der zu gefrierenden Substanz zu erreichen, deren Dicke im wesentlichen von der Art der Substanz, ihrem Wassergehalt und der angewendeten Abkühlgeschwindigkeit abhängt.
Es ist bekannt, dass durch Anwendung eines hohen Druckes von etwa 2000 at beim Abkühlen infolge Gefrierpunktserniedrigung das Einfrieren der zu gefrierenden Substanz zunächst verhindert und anschliessend durch plötzliche Druckentlastung eingeleitet werden kann. Leider hat sich gezeigt, dass auch dieses bekannte Verfahren des Schnellgefrierens meist zu einem grobkristallinen Eisgefüge führt und schwer so zu handhaben ist, dass der gewünschte Vitrifizierungszustand erreicht wird.
Diese Grobkristallbildung kann vielleicht dadurch erklärt werden, dass die Temperatur der zu gefrierenden Substanz im Augenblick des Gefrierens infolge der dabei freiwerdenden Kristallisationswärme und wegen unzureichender Wäremableitung kurzzeitig auf einen Wert ansteigt, bei welchem die Geschwindigkeit des Kristallwachstums stark erhöht ist. Ein anderer Grund für das unbefriedigende Ergebnis mag sein, dass, wie die Erfahrung lehrt, die meisten biologischen Zellsysteme zu einem mehr oder weniger grossen Grad der Unterkühlbarkeit vor dem Einfrieren neigen.
Wird das die Zellen umgebende Wasser durch eine plötzliche Druckabsenkung nahe seiner normalen Gefriertemperatur zu spontaner Kristallbildung angeregt, so ergibt sich die Möglichkeit, dass die extrazellulär entstehenden Eiskristalle die Zellwände durchdringen und so das intrazelluläre Wasser durch heterogene Bekeimung zur Bildung grosser Kristalle anregen.
Beim Gefrieren unter Anwendung von Druck ist es von entscheidender Bedeutung, dass der Druck im richtigen Augenblick auf das Gefriergut einwirkt. Bekannte Untersuchungen haben nämlich ergeben, dass z.B. biologische Präparate, wie Zellen, durch die hohen anzuwendenden Drücke, wenn diese zulange anhalten, beschädigt werden können. Es kommt also darauf an, die Druckanwendung auf eine möglichst kurze Zeit zu beschränken. Der Augenblick des Beginns der Druckeinwirkung muss genau abgestimmt sein auf die Kühlung, welche, wie erwähnt, meist schlagartig mittels flüssiger oder gasförmiger Kältemittel durchgeführt wird. Der maximale Druck sollte im Augenblick der Erstarrungstemperatur erreicht sein, wobei zu berücksichtigen ist, dass beim raschen Abkühlen die Temperatur der Probe mit einer Geschwindigkeit bis zu 100000C/sek. abfällt.
Die Druckanwendung muss bis auf mindestens 1/100 Sekunde genau erfolgen.
Die vorliegende Erfindung hat sich dementsprechend eine Vorrichtung zum Ziel gesetzt, mit welcher die eingangs beschriebenen Methoden des Gefrierens unter Druckanwendung zuverlässig durchgeführt werden können. Diese erfindungsgemässe Vorrichtung zum Einfrieren von wasserhaltigen Substanzen, insbesondere von biologischen Objekten, welche einen mit Mitteln zur Abkühlung versehenen Träger für die zu gefrierende Substanz aufweist, ist dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Träger als Teil einer Wand eines beim Betrieb geschlossenen Gefässes ausgebildet ist und dass Mittel zur Erzeugung eines hohen Druckes in dem geschlosse nen Gefäss mittels einer Sprengladung vorgesehen sind.
Der Beginn der Druckeinwirkung ist dabei durch die Zündung der Sprengladung sehr genau festlegbar und wird vorteilhafterweise so gewählt, dass der im geschlossenen Gefäss später auftretende Maximaldruck zeitlich mit dem Erreichen einer vorgewählten Temperatur des Gefriergutes beim Abkühlen übereinstimmt.
Die Auslösung der Zündung erfolgt zweckmässigerweise elektrisch durch ein automatisches Steuergerät, welches gleichzeitig auch die Kühlung regelt.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemässen Einrichtung liegt darin, dass man bei Druckerzeugung mittels Spengladung keine so schwierigen Abdichtungsprobleme zu lösen hat wie bei rein hydraulisch-pneumatischen Einrichtungen. Die erfindungsgemässe Vorrichtung ist deshalb mit einem bedeutend geringeren technischen Aufwand verwirklichbar als bekannte Vorschläge für Druckgefrierapparaturen.
Im nachfolgenden wird ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemässen Vorrichtung anhand der Zeichnung näher erläutert.
In Fig. 1, welche zunächst nur die für den Gefriervorgang wesentlichen Teile zeigt, bedeutet 1 einen röhrenförmigen, einseitig geschlossenen, dünnwandigen Behälter aus einem gut wärmeleitenden Material, z.B. Kupfer, welcher die zu gefrierende Probe 2 aufnimmt. An seinem oberen Ende 3 ist dieser Behälter trichterförmig erweitert und zwischen dem vorzugsweise aus schlecht wärmeleitendem Material bestehenden Kühlteil 4 und dem Druckteil 5 der Anordnung eingespannt. Über die zentrale Bohrung 6 des Teiles 5 kann mittels einer Übertragerflüssigkeit - am einfachsten Wasserder erforderliche Druck von beispielsweise 1000 at auf das Gefriergut ausgeübt werden. Der Behälter 1 ragt in einen Raum 7 hinein, der eine Zuführungsleitung für das Kühlmittel aufweist, welche aus den Leitungswegen 8, 9 und 10 gebildet wird.
Bei Kühlung umspült das Kühlmittel die Aussenwandung des Behälters 1, wobei es, wenn es flüssig ist, im Raum 7 hochsteigt, bis es in den als Auffangrinne ausgebildeten Hohlraum 11 des Teiles 4 überläuft und schliesslich durch die Öffnungen 12 entweicht. Man kann auch ein tiefgekühltes nichtverflüssig tes Gas als Kühlmittel verwenden.
In Durchführung der Erfindung wird die beschriebene Vorrichtung so ausgebildet, dass in dem Behälter 1 oder in einem mit diesem über die Bohrung 6 in Verbindung stehenden Raum eine Sprengladung eingebracht und zwecks Erzeugung des nötigen Druckes beim Abkühlen zur Explosion gebracht werden kann. Die Einzelheiten dieses Teiles der Vorrichtung zeigt die Fig. 2, aus welcher gleichzeitig die Gesamtanordnung ersichtlich wird.
In der Darstellung der Fig. 2 befinden sich die in Fig. 1 gezeigten Teile innerhalb des gestrichelt gezeichneten Kreises 13. Mit der Bohrung 6 ist der Druckerzeugungsraum 14 verbunden, in welchem eine Halterung 15 für eine Sprengladung 16 vorgesehen ist, welche durch eine Zündvorrichtung 17 zur Explosion gebracht werden kann.
Der Druckerzeugungsraum 14 stellt den Innenraum eines Zylinders 18 dar und ist durch die als überwurfmutter ausgebildete Kappe 19 verschliessbar.
Der Druckteil 5, der Zylinder 19 und die Zündvorrichtung 17 werden von einer Platte 20, wie die Fig. 2 zeigt, getragen, die ihrerseits von den beiden Säulen 21 und 22 gehalten wird. Diese führen auch die Halteplatte 23 des Kühlteils 4 der Vorrichtung, welche mittels einer Spindel 24 und Handrad 25 in vertikaler Richtung verschoben werden kann. Die Säulen 21 und 22 und die Spindel 24 sind mit dem Tisch 26 verbunden. 27 bezeichnet ein Gerät zur Messung der auf das Gefriergut angewendeten Drücke.
Bei Benützung der beschriebenen Vorrichtung wird das Gefriergut 2 bei abgesenktem Kühlteil 4 in den Behälter 1 eingebracht, dieser sodann durch Betätigen des Handrades 25 gegen den Druckteil 5 gedrückt, worauf durch Zündung der Sprengladung 16 das Gefriergut mit dem gewünschten Druck beaufschlagt wird. Zur Kühlung wird durch die Leitungswege 8, 9, 10 das Kühlmedium, z.B. flüssiger Stickstoff oder ein tiefgekühltes, bei der gewünschten Temperatur noch nicht kondensiertes Gas eingeführt, wodurch das Gefriergut mit grosser Geschwindigkeit abgekühlt wird.
Wenn die Abkühlung des Gefriergutes verhältnismässig langsam erfolgt, wird die Explosion erst nach Beginn der Kühlung ausgelöst, bei sehr rascher Abkühlung dagegen, bei welcher die Temperatur innerhalb weniger tausendstel Sekunden auf tiefe Werte abfällt und der maximale Druck der Explosion sich demgegenüber langsam aufbaut, kann der optimale Zeitpunkt der Zündung sogar vor dem Zeitpunkt des Beginns der Kühlung liegen.
Die optimalen Verhältnisse im Einzelfalle können durch Vorversuche leicht ermittelt werden. Die Zündung kann durch einen am Gefriergut angebrachten Temperaturfüh ler über das Steuergerät ausgelöst werden.
Es empfiehlt sich, den Druck beim Abkühlen solange aufrechtzuerhalten, bis die Oberflächentemperatur der zu gefrierenden Substanz einen vorbestimmten Wert, z.B.
- 500C, unterschritten hat und wenigstens eine äussere Randzone der wasserhaltigen Substanz eingefroren ist.
Zweckmässigerweise wird mit der Aufhebung des Drukkes zugewartet, bis ein praktisch vollständiger Temperaturausgleich zwischen dem angewendeten Kühlmittel und dem Gefriergut eingetreten ist.
Die Grösse der nützlichen Drücke liegt zwischen etwa 100 und einigen 1000 at. Es soll ein so hoher Druck angewendet werden, dass sich eine Gefrierpunkterniedrigung der zu gefrierenden wasserhaltigen Substanz um wenigstens 50OC ergibt.
Um eine hinreichend schnelle Temperaturabsenkung zu erreichen, empfiehlt es sich, den Träger für die zu gefrierende Substanz als gut wärmeleitende dünne Trennwand zwischen dem Druckraum und dem Kühlraum auszubilden und das Kühlmittel in den Kühlraum beim Abkühlen mit möglichst hoher Geschwindigkeit einströmen zu lassen.
Da die Abkühlung der Probe und die Anwendung des Druckes zeitlich genau aufeinander abgestimmt werden müssen, ist es zweckmässig, für das Steuern dieser beiden Vorgänge ein automatisches Schaltgerät zu benutzen, welches das zeitliche Verhältnis zwischen dem Einströmen des Kühlmittels und der Explosionsauslösung genau regelbar einzustellen gestattet. Ohne jedesmal die schwierige Messung der Temperatur der Probe durchführen zu müssen, kann dann dieser zeitliche Abstand aufgrund von Vorversuchen so gewählt werden, dass eine optimale Vitrifizierung der Probe erreicht wird. Die Ausbildung des Steuergerätes bildet nicht den Gegenstand vorliegender Erfindung.
Der Anwendungsbereich der Erfindung beschränkt sich nicht auf den oben erwähnten Zweck der strukturerhaltenden Fixierung biologischer Untersuchungsobjekte, sondern umfasst ebenso die Konservierung hochwertiger biologischer Stoffe, z.B. von Blutplasma. Auch für die strukturerhaltende Fixierung anorganischer Stoffe kann die beschriebene Vorrichtung mit Vorteil eingesetzt werden, z.B. um die Stoffverteilung in Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Gelen oder dgl. Mischphasen zu studieren bzw. solche Mischphasen für spätere Anwendungen durch Gefrieren zu fixieren. In Fällen, in denen eine gewisse Strukturveränderung in Kauf genommen werden kann, kann die Vorrichtung ebenfalls von Vorteil sein, indem man schon mit wesentlich geringeren Abkühlgeschwindigkeiten und damit wirtschaftlicher zum gleichen Ziele kommt.