Verfahren zur Durchführung der Dünnschicht-Chromatographie mit Gradienten-Elution sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
Komplizierte Naturstoffgemische trennt man säulenchromatographisch schon seit langem mit Hilfe eines Elutionsmittels, dessen Zusammensetzung während der Chromatographie kontinuierlich oder diskontinuierlich geändert wird. Die Anwendung dieses Gradienten-Elutions-Prinzips erlaubt, unpolare und polare Substanzen in nahezu beliebig rascher Folge als schmale Banden durch die Säulen wandern zu lassen. Neben dem Gewinn an Zeit ist eine Qualitätsverbesserung unverkennbar.
Im Gegensatz zur Säulenchromatographie lässt sich in der üblichen Dünnschicht-Chromatographie das Elutionsmittel (=Fliessmittel) während der Chromatographie nicht mehr ändern. In der Regel trennen sich deshalb Naturstoff- oder ähnlich komplizierte Gemische bei eindimensionaler Dünnschicht-Chromatographie recht unvollständig auf; ein grosser Teil der Substanzen bleibt entweder am Startpunkt zurück oder wandert mit der Fliessmittelfront. Es besteht daher ein grosses Bedürfnis zur Übertragung der Gradienten-Elution auf die Dünnschicht-Chromatographie.
Die bisher in dieser Richtung unternommenen Versuche (Th. Wieland und H. Determann, Experientia 18, 431 (1962), S. M. Rybicka, Chemistry and Industry 1962, 308) lassen sich dadurch charakterisieren, dass im Fliessmitteltrog ein bestimmtes Fliessmittel vorgelegt wird, in welches während der Chromatographie ein Elutionsmittel anderer Zusammensetzung einfliesst. Ein Überlauf kann vorgesehen sein. Dabei muss für eine rasche, gleichmässige Vermischung der beiden Elutionsmittel gesorgt werden, z. B. durch Rühren. Bei diesen Verfahren ist aber zu beachten:
1. Die empfindliche Dünnschicht muss gegen die mechanische Beanspruchung des Rührens geschützt werden.
2. Die gleichmässige Vermischung der Lösungsmittel ist bei Anwendung breiter Dünnschicht-Platten nicht immer gewährleistet und kann Störungen verursachen.
3. Das Vorlegen eines Lösungsmittels stellt eine Beschränkung dar, da dessen Konzentration während der Chromatographie nicht auf Null absinken kann, wenn man nicht unwirtschaftlich grosse Fliessmittelmengen während der Chromatographierzeit durchgesetzt werden sollen.
4. Eine Korrelation zwischen Fliessmittelzusammensetzung und Wanderungsstrecke im Chromatogramm ist schwierig oder unmöglich.
Das erfindungsgemässe Verfahren besteht darin, dass das Fliessmittel nach einer bestimmten, vorher festgelegten Laufzeit gegen ein anderes ausgetauscht wird.
Dieser Vorgang kann beliebig oft nach einem vorbestimmten Programm wiederholt werden. Jedes Fliessmittel erzeugt aus dem Chromatogramm eine Bande, deren Länge durch die Verweilzeit des betreffenden Fliessmittels festgelegt wird. Die Zusammensetzung der mobilen Phase in einer Bande ist durch die Zusammensetzung des betreffenden Fliessmittels gegeben. Mehrere in der zu untersuchenden Probe vorhandene Substanzklassen können daher nacheinander mit den aus der Literatur bekannten, optimalen Fliessmitteln chromatographiert werden, wobei die Verweilzeiten nach der Anzahl vorhandener Substanzen und entsprechend dem Trennvermögen des Fliessmittels festgesetzt werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren erlaubt eine grosse Beweglichkeit. Erfahrungen, die in einem Vorversuch gewonnen wurden, können unmittelbar auch von Nichtspezialisten zu einer Verbesserung des Trenneffektes ausgenützt werden, da sich die Form des Elutions-Gradienten bei gleichbleibenden Fliessmitteln sehr weitgehend durch blosse Variation der einzelnen Verweilzeiten ändern lässt und keine Berechnungen erfordert. Obwohl das Verfahren diskontinuierlich arbeitet, kann man im Bedarsfall auch den eventuellen Vorteil eines kontinuierlichen Gradienten ausnützen: Bei Verwendung von mehr als 10 Fliessmitteln auf eine Laufstrecke von 10 cm kann mit guter Näherung ein kontinuierlicher Gradient simuliert werden. Hervorzuheben ist ausserdem, dass eine gute Reproduzierbarkeit gewährleistet ist, da die Dünnschichtplatte immer in völlig homogene Lösungsmittel-Gemische eintaucht.
Die Durchführung des Verfahrens erfolgt zweckmässig so, dass die Dünnschicht durch eine passende Deckplatte und Distanzstücke gegen den umgebenden Raum abgedichtet wird, dass Dünnschicht und Deckplatte etwas in einen mit Elutionsmittel beschickten Fliessmitteltrog eintauchen und man periodisch durch einen Impulsgeber gesteuert, dessen Inhalt ausfliessen und danach dasselbe oder ein anderes Elutionsmittel einfliessen lässt. Man kann auch periodisch den Fliess mitteltrog gegen einen anderen, mit einem anderen Fliessmittel gefüllten Trog austauschen.
Auf der beiliegenden Zeichnung ist ein Ausführungsbeispiel der zur Durchführung des Verfahrens verwendbaren Vorrichtung veranschaulicht.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung einer solchen Vorrichtung,
Fig. 2 zeigt schematisch die zur automatischen Betätigung der Vorrichtung erforderliche Apparatur,
Fig. 3 zeigt im Detail die zur Betätigung eines Einlaufventils verwendbare Apparatur.
In Fig. 1 der Zeichnung ist mit 1 ein Fliessmitteltrog bezeichnet, in welchem sich eine gewisse Menge Fliessmittel 2 befindet. Der Trog 1 weist an seiner Oberseite einen Deckel 3 auf, welcher mehrere, jeweils zum Einführen einer Platteneinheit 4 vorgesehene Schlitze besitzt. Die Platteneinheit 4 besteht aus einer Trägerplatte mit dem zu trennenden Stoffgemisch sowie einer von der Trägerplatte durch Distanzstücke in Abstand gehaltenen Deckplatte. Die Platteneinheit taucht mit ihrem unteren Teil in das Fliessmittel 2 ein.
Am Boden des Fliessmitteltroges 1 ist ein Ablaufrohr 5 angeordnet, in welches ein Ablaufventil 6 eingebaut ist und das in einen Auffangbehälter 7 mündet. In den Trog 1 mündet ein Sammelrohr 8, an welchem verschiedene Fliessmittel-Vorratsgefässe 9a ... 9n angeschlossen sind. In jeder der Verbindungsleitungen zwischen den Fliessmittel-Vorratsgefässen 9a ... 9n und der Sammelleitung 8 ist ein Zulaufventil 10a ... lOn vorgesehen.
Die beschriebene Vorrichtung arbeitet nun wie folgt: Nachdem die Platteneinheiten 4 in den Fliessmitteltrog l eingehängt wurden, werden zunächst sowohl alle Zulaufventile 10a ... 10n als auch das Ablaufventil 6 geschlossen. Anschliessend werden die Fliessmittel-Vorratsgefässe 9a... 9n mit den verschiedenen Fliessmitteln gefüllt und dann zunächst das Zulaufventil 10a geöffnet.
Das im Behälter 9a enthaltene Fliessmittel strömt in den Fliessmitteltrog 1, wo es mit dem zu trennenden Stoffgemisch in Berührung kommt. Nach einer bestimmten Einwirkungsdauer, über welche nachstehend noch Einzelheiten folgen, wird das Ablaufventil 6 geöffnet; das Fliessmittel 2 fliesst aus dem Trog 1 in den Auffangbehälter 7. Sobald der Trog 1 ganz leer ist, kann das Ablaufventil 6 wieder geschlossen werden und der Trog 1 ist zur Aufnahme des zweiten, im Vorratsgefäss 9b enthaltenen Fliessmittels bereit. Das zu trennende Stoffgemisch kann somit auf rasche und einfache Weise mit einer beliebigen Anzahl verschiedener Fliessmittel in Berührung gebracht werden.
In vielen Fällen, in welchen die oben beschriebene Vorrichtung häufig oder gar ständig gebraucht wird, dürfte sich eine mindestens teilweise Automatisierung der beschriebenen Schaltvorgänge als zweckmässig erweisen. Eine solche Anlage, welche beispielshalber in Fig. 2 schematisch dargestellt ist, weist einen in Form einer mit konstanter Drehzahl umlaufenden Wählscheibe Ii ausgebildeten Impulsgeber auf. Die Wählscheibe 11 besitzt an ihrem Umfang mehrere radiale Schlitze, in welche Reiter 12 eingesteckt werden können. Die Reiter 12 sind so bemessen, dass sie nach dem Einstecken in die Schlitze noch teilweise aus diesen herausragen.
In nächster Nähe der Wählscheibe 11 ist ein um einen Festpunkt 13 schwenkbarer Kontakthebel 14 angeordnet, dessen Abstand von dem Umfang der Wählscheibe so gewählt ist, dass die auf der letzteren sitzenden und mit dieser umlaufenden Reiter 12 zwangsläufig auf eine auf der Unterseite des Hebels 14 vorgesehene Erhebung 15 auftreffen. Dadurch wird der Hebel 14 durch jeden der an seiner Unterseite vorbeistreichenden Reiter 12 im Gegenuhrzeigersinn um den Punkt 13 geschwenkt, wodurch sich die Kontakte 16 gegenseitig berühren. Sobald sich der Hebel 14 nicht mehr unter der Einwirkung eines der Reiter 12 befindet, wird er durch eine Feder 17 im Uhrzeigersinn geschwenkt, bis sich der untere der beiden Kontakte 16 gegen einen festen Anschlag 18 anlegt.
Der Hebel 14 ist ein Teil eines in seiner Gesamtheit mit 19 bezeichneten Stromkreises. In diesem Stromkreis befindet sich unter anderem auch eine Spule 20, welche zur Betätigung des Ablaufventiles 6 dient und dieses Ventil, solange sie unter Strom steht, offen hält. In Parallelschaltung zur Spule 20 ist eine Spule 21 vorgesehen, die mit einem Eisenkern 22 in Wirkungsverbindung steht und den letzteren, sobald der Stromkreis geschlossen wird, in sich hineinzieht. Der Eisenkern 22a bildet den Unterteil eines auf einer Spiralfeder 23 montierten Mitnehmers 22. Letzterer greift mit einer an seinem oberen Ende angeordneten Nase 24 in ein Klinkenrad 25. Das Klinkenrad 25 ist über eine Achse starr mit einer Unterbrecherscheibe 26 aus elektrisch leitendem Material verbunden, so dass letztere bei der Drehung des Klinkenrades 25 zwangsläufig mitgenommen wird.
Am Umfang der Unterbrecherscheibe 26 sind mehrere Kontaktstücke 27a ... 27n angeordnet, welche durch bekannte Mittel elastisch gegen den Rand der Unterbrecherscheibe gedrückt werden und auf diesem schleifen können. Die Scheibe 26 weist ausserdem an ihrem Umfang eine Ausnehmung 28 auf, so dass das sich gerade an dieser Stelle befindende Kontaktstück nicht mit der Unterbrecherscheibe in Berührung kommen kann. Ein ebenfalls am Umfang der Scheibe 26 schleifender Kontakt 33 ist über eine Leitung mit dem auf Fig. 2 rechts liegenden Pol der Stromquelle verbunden.
Die Einlaufventile 10a... 10n werden durch Magnetspulen 29a... 29n betätigt, welche über die Kontaktstücke 27, die Scheibe 26 und den Schleifkontakt 33 einerseits und einen Sammelleiter 30 anderseits an die Stromquelle angeschlossen sind.
Die Betätigung der Zulaufventile 10a ... 10n kann beispielsweise wie in Fig. 3 dargestellt, erfolgen. Dabei ist das Verschlussorgan des Ventiles 10a mit einem Eisenkern 31 verbunden und dieser wird von einer Spiralfeder 32 ständig nach links gezogen, d. h. in diejenige Stellung, in welcher das Ventil 10a offen ist. Wird der Stromkreis 19 durch gegenseitige Berührung der Kontakte 16 geschlossen, solange sich das Kontaktstück 27a nicht in der Ausnehmung 28 der Scheibe 26 befindet, so erhält die Magnetspule 29a Strom und zieht den Eisenkern 31 in sich hinein, wobei das Ventil 10a geschlossen wird.
Zur Erläuterung der Arbeitsweise der gesamten oben beschriebenen Vorrichtung sei angenommen, dass sich die Anlage in dem in Fig. 1 dargestellten Zustand befinde. Das Fliessmittel des Vorratsgefässes 9a befindet sich im Fliessmitteltrog 1 kurz vor dem Zeitpunkt, in welchem es abgelassen und ersetzt werden soll. Sobald nun der betreffende, auf die Wählscheibe 11 aufgesteckte Reiter 12 auf die Erhebung 15 des Kontakthebels 14 auftritt, berühren sich die beiden Kontakte 16 und schliessen somit den Stromkreis 19. Damit erhält die Magnetspule 20 des Ablaufventiles 6 Strom und öffnet das Ventil, so dass das Fliessmittel 2 aus dem Trog 1 in den Auffangbehälter 7 ablaufen kann.
Gleichzeitig wird aber auch der Mitnehmer 22 durch die ihm zugeordnete Magnetspule 21 hochgezogen, wobei die Nase 24 an der Aussenseite der direkt über ihr liegenden Klinke des Rades 25 entlanggleitet und sich dann von oben auf diese Klinke aufsetzt. Die noch gefüllten Vorratsgefässe 9b ... 9n bleiben geschlossen, da sie über die mit der Scheibe 26 in leitender Verbindung stehenden Kontaktstücke 27b ... 27n mit Strom versorgt werden. Sobald nun der Reiter 12 der Scheibe 11 an der Erhebung 15 des Hebels 14 vorbei ist und sich wieder abwärts bewegt, werden die beiden Kontakte 16 unter der Einwirkung der Feder 17 wieder voneinander getrennt und der Stromkreis wird unterbrochen.
Damit geht das Ablaufventil wieder in seine Schliessstellung zurück und auch der Mitnehmer 22 wird von der Feder 23 wieder nach unten gezogen, so dass das Klinkenrad 25 um eine Klinkenbreite weitergedreht wird. Die mit dem Klinkenrad 25 über eine Achse starr gekuppelte Unterbrecherscheibe 26 wird somit ebenfalls in Pfeilrichtung (Fig. 2) etwas weiter gedreht und zwar gerade so weit, dass das mit der Magnetspule des Einlassventiles 10b leitend verbundene Kontaktstück 27b in die Ausnehmung 28 gerät. Als Folge hiervon wird das Einlassventil lOb geöffnet und das im Vorratsgefäss 9b enthaltene Fliessmittel strömt in den Trog 1. Das Kontaktstück 27a ist wieder in leitender Verbindung mit der Scheibe 26, so dass das Ventil 10a bereits geschlossen gehalten wird und das Vorratsgefäss 9a wieder aufgefüllt werden kann.
Die an der Wählscheibe des Impulsgebers 11 angebrachte Skala ist zweckmässig so eingestellt, dass damit dem besonderen Gesetz der Fliessmittelbewegung auf dem Chromatogramm Rechnung getragen wird. Dieses Gesetz hat die allgemeine Form (vgl. M. Brenner, A.
Niederwieser, G. Pataki und R. Weber in E. Stahl, Dünnschichtchromatographie, Springer Verlag Heidelberg,
1962, Seite 109) S2 = D t + b wobei S = von der Fliessmittelfront auf dem Chromatogramm zurückgelegter Weg, D: eine Konstante, t: Zeit, b: eine Konstante ist.
Beispielsweise kann folgende Zahlenreihe (Minuten) verwendet werden: 0,6, 1,4, 2,6, 4,0, 5,8, 7,8, 10,2, 13,0, 16,0, 19,4, 23,0, 27,0, 31,4, 36,0, 41,0, 46,2, 51,8, 57,8, 64,0, 70,6, 77,4, 84,6, 92,2, 100,0, 108,2, 116,6.
Der von der Wählscheibe in einem bestimmten Augenblick gegebene Impuls könnte beispielsweise auch über den Anker eines Elektromagneten auf ein Gestänge übertragen werden, das die vorbeschriebenen Vorgänge auf mechanischem Wege einleiten würde. Die Anlage würde in diesem Falle grundsätzlich gleich reagieren, so dass von einer eingehenden Beschreibung der dazu erforderlichen Vorrichtungen Abstand genommen werden kann.
Die Abdichtung der auf dem Dünnschichtträger befindlichen Dünnschicht und/oder des im Trog 1 enthaltenen Fliessmittels, welche einerseits die Berührung der Dünnschicht mit der Umgebungsluft, anderseits das Verdunsten des Fliessmittels verhindern soll, kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden.
So kann man z. B. auf der mit der Dünnschicht behafteten Seite des Dünnschichtträgers eine Deckplatte anordnen, die durch geeignete, ebenfalls dicht anliegende Distanzstücke in einem beliebigen Abstand von der Oberfläche der Dünnschicht gehalten wird.
Falls mehrere, d. h. mindestens zwei Dünnschichtträger verwendet werden, braucht nicht für jeden Dünnschichtträger eine eigene Deckplatte vorgesehen zu sein.
Ordnet man nämlich die Dünnschichtträger in parallelen Ebenen dicht nebeneinander an und zwischen diesen die erforderlichen Distanzstücke, so kann jeweils die der Dünnschicht gegenüberliegende Seite eines Dünnschichtträgers zur Abdeckung der Dünnschicht des benachbarten Dünnschichtträgers dienen und nur die Dünnschicht des letzten Dünnschichtträgers muss mit einer eigenen Deckplatte versehen sein.
Auch wäre es selbstverständlich möglich, auf dem Rand des Deckels 3 (Fig. 1) einen dichten, den ganzen Trog 1 einschliesslich sämtlicher Platten 4 umfassenden Aufsatz anzubringen.
Die Vorrichtung zur Betätigung der Zulaufventile jod... 10n ist in Fig. 3 so dargestellt, dass die Ventile im stromlosen Zustand der dazugehörigen Magnetspulen offen sind und durch Schliessen des Stromkreises geschlossen werden. Es wäre aber ohne weiteres auch möglich, die Betätigungsvorrichtung so auszubilden, dass die Ventile im stromlosen Zustand der Magnetspule geschlossen sind. In diesem Falle wäre die Scheibe 26 beispielsweise aus nichtleitendem Werkstoff herzustellen und müsste an der Stelle der Ausnehmung 28 einen leitenden Einsatz aufweisen, der mit dem Schleifkontakt 33 leitend verbunden sein müsste.
Die auf der Trägerplatte haftende Dünnschicht kann mittels einer Kühlvorrichtung zwecks Zurückdrängung von Verdampfungseffekten gekühlt werden.