CH397156A

CH397156A - Verfahren zur Herstellung von Penicillinen

Info

Publication number: CH397156A
Application number: CH1302160A
Authority: CH
Inventors: Ernst Dr Brandl; Richard Dr Brunner; Hans Dr Margreiter
Original assignee: Beecham Group Ltd
Priority date: 1959-11-24
Filing date: 1960-11-21
Publication date: 1965-08-15
Also published as: DK119761B; BE597419A; GB958587A

Description

Verfahren zur Herstellung von Penicillinen Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Penicillinen der Formel CsHio0sNS-NH-Z,-R,-(X-Rz)n I worin Z1 eine CO- oder S02-Gruppe, R1 einen zwei wertigen, gegebenenfalls substituierten, aliphatischen Rest, X eine direkte Bindung, Sauerstoff oder Schwe fel und R2 einen organischen Rest, vorzugsweise einen aliphatischen, araliphatischen,

aromatischen oder he- terocyclischen Rest, der gegebenenfalls substituiert sein kann, und n=1 oder 2 bedeuten.

Bei der biosynthetischen Herstellung von Penicil- linen geht man im allgemeinen in der Weise vor, dass man das in der Seitenkette des Penicillinrnoleküls ge wünschte Radikal durch Zusatz chemischer Verbin dungen, sogenannter Precursors, während der Fer- mentationsperiode einführt.

Unter Fermentations- periode ist dabei der Zeitabschnitt zwischen der Zugabe von Pilzmycel zur Nährlösung und Abtren nung des Mycels zu verstehen. Ein solches Verfahren ist z. B. in der britischen Patentschrift Nr. 643 514 beschrieben.

Einzelne Penicilline, wie z. B. (a-Methyl)-phen- oxymethylpenicillin, sind jedoch bisher auf rein bio- synthetischem Wege nicht hergestellt worden.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Fer- mentationsverfahren zu schaffen, bei dem während der Fermentation unter Zusatz einer geeigneten Pre- cursorverbindung nicht nur bereits bekannte Penicil line, wie Phenoxymethylpenicillin, p-Cresoxymethyl- penicillin, Phenylmercaptomethylpenicillin, Benzyl- penicillin und n-Butoxymethylpenicillin, mit verbes serter Ausbeute erhalten werden können,

sondern mit dem man nunmehr überraschend auf fermentativem Wege auch Penicilline herstellen kann, die bisher durch submerse Gärung unter Verwendung von Peni- cillium notatum oder Penicillium chrysogenum bzw.

deren Mutanten, in Gegenwart von üblichen Precur- sorverbindungen nicht erhalten worden konnten. So ist es bekannt, dass Precursorverbindungen, die sich von o-substituierten Phenyl- und Phenoxyessigsäuren, wie 2-Chlorphenoxyessigsäure, 2-Cresoxyessigsäure, 2-Oxyphenylessigsäure, 2-Oxyphenoxyessigsäure und 2-Methoxyphenoxyessigsäure, ableiten,

auf fermen- tativem Wege bisher überhaupt nicht eingebaut wur den; entsprechende, von m-substituierten Phenyl- und Phenoxyessigsäuren, wie 3-Oxyphenoxyessigsäure und 3-Nitrophenoxyessigsäure, abgeleitete Precursorver- bindungen wurden nur schlecht und mit geringer Ausbeute eingebaut.

Gemäss der Erfindung gelingt es nun, bisher auf fermentativem Wege nur schwer bzw. mit nur ge ringer Ausbeute oder überhaupt nicht zugängliche Penicilline, wie Penicilline, die sich von den folgen den Precursorsäuren ableiten:

4-Äthylphenoxyessig- säure, 4-Propylphenoxyessigsäure, 4-tert.-Butylphen- oxyessigsäure, 4-n-Hexylphenoxyessigsäure, 4-Ace- tophenoxyessigsäure, 4 - Acetylaminophenoxyessig- säure, 4-Pentylketophenoxyessigsäure, 4-Oxyphen- oxyessigsäure, 4-Äthoxyphenoxyessigsäure, 4-Formyl- phenoxyessigsäure,

4-Nitrophenoxyessigsäure, 4- Cyanphenoxyessigsäure und 4-Sulfosäurephenoxy- essigsäure, in guter Ausbeute herzustellen, indem man als Precursorverbindungen Säurehalogenide der For mel II (R2-X).-Ri-Z2 , II worin Z2 eine COHal- oder S02Hal-Gruppe symboli siert, verwendet.

Dabei soll sich jedoch der Precursorzusatz in der Regel über einen erheblichen Teil der Fermentations- periode erstrecken. Der aliphatische Rest R1 kann gerade oder ver zweigt sein; er kann in der geraden Kette und bzw.

oder in der Seitenkette eine oder mehrere Doppelbin dungen aufweisen. Ferner kann der Rest R1 einen oder mehrere Substituenten tragen; Beispiele für solche Substituenten sind Alkyl, Alkenyl, Amino- alkyl, N Acylaminoalkyl, gegebenenfalls substituierte Amino- oder Hydroxylgruppen, gegebenenfalls sub stituierte aromatische Reste,

wie Phenyl- und Aralkyl- reste.

Zur Erzielung erhöhter Ausbeuten kann es vorteil haft sein, mit der Zugabe des Precursors erst nach einer kurzen Anlaufzeit der Fermentation, vorzugs weise nach der üblichen Angärzeit, zu beginnen. Fer ner soll die Fermentation nach der letzten Zugabe von Precursor noch zweckmässig 3 bis 5 Stunden weiter geführt werden. Der Zusatz des Precursors kann beim neuen Verfahren intermittierend unter Zusatz kleiner Anteile oder vorzugsweise kontinuierlich er folgen. Sollte es bei der Fermentation, z.

B. infolge Anwendung von überschüssigem Säurehalogenid, zu einem Absinken des pH-Wertes kommen, das sich schädigend auf den weiteren Fermentationsverlauf auswirken würde, so kann diesem Absinken des pH- Wertes durch Zusatz geeigneter Puffersubstanzen zur Nährlösung oder mittels alkalisch reagierender Stoffe entgegengewirkt werden.

Die Puffersubstanzen kön nen bereits von vornherein in der Lösung vorliegen oder gleichzeitig mit dem Precursor, jedoch vorteil haft an einer von der Stelle der Precursorzufuhr ver schiedenen Stelle, zugesetzt werden. Die Zufuhr von neutralisierend wirkenden Stoffen erfolgt in der Re gel in Abhängigkeit von der Zufuhr an Precursor.

Als Puffersubstanzen haben sich Natriumbicar- bonat oder Phosphatgemische besonders zweckmässig erwiesen, während als neutralisierend wirkende Stoffe u. a. Lösungen von Alkalihydroxyden, insbesondere Natriumhydroxyd, in Frage kommen.

Vorzugsweise wird während des Precursorzusat- zes in der Fermentationslösung ein pH-Wert im phy siologischen Bereich eingeregelt.

Während der Fermentation kann es auch zu einem Abbau von überschüssiger Precursorverbin- dung kommen, was einen weiteren Vorteil bei der nachfolgenden Extraktion darstellt.

Werden beim erfindungsgemässen Verfahren als Precursor Säurehalogenide verwendet, welche ein asymmetrisches C-Atom enthalten, so können sie in verschiedenen isomeren Formen eingesetzt werden; meist wird das Racemat zur Acylierung verwendet, in welchem Falle man dann das entsprechende DL- Penicillin bzw. die beiden diastereoisomeren Penicil- line erhält.

Die im Rahmen der Erfindung als Precursors an gewendeten Säurehalogemde führen zu günstigen Ausbeuten an Penicillin. Sie zeichnen sich ferner durch eine selektive Wirksamkeit gegen Bakterien aus; eine Hemmung des Wachstums des Pilzes konnte bei den angewendeten Konzentrationen nicht beob achtet werden. Es wurde auch gefunden, dass Unterschiede in der Eignung von Penicilliumstämmen für die Verwend barkeit beim erfindungsgemässen Verfahren bestehen.

Beispiele für besonders geeignete Penicilliumstämme sind Penicillium chrysogenum WIS Q176 und Peni- cillium chrysogenum 51-20 und deren Mutanten.

Im Rahmen der beim erfindungsgemässen Ver fahren verwendeten Precursorverbindungen nehmen die Halogenide der a-substituierten Essigsäuren, z. B. Phenoxyessigsäuren, und insbesondere solche Essig- säuren, deren a-Kohlenstoffatom tertiären Charakter hat, eine besondere Stellung ein, besonders auch des halb, weil Penicilline mit Resten von solchen Essig bzw. Phenoxyessigsäuren durch die üblichen Fermen tationsmethoden nur schwer oder gar nicht zugänglich waren.

Beispiele für solche am a-Kohlenstoffatom substituierte Essigsäuren sind (a-Methyl)-phenoxy- essigsäure, (a-Phenyl)-phenoxyessigsäure, a-Phenoxy- stearinsäure, N-Acetyltryptophan und Mandelsäure.

Aber auch Penicilline von aromatische Reste enthaltenden Alkan- bzw. Alkencarbonsäuren, die am aromatischen Ring 2 oder 3 Substituenten tragen, sind nunmehr auf. fermentativem Wege bequem zugäng lich.

Beispiele für solche Verbindungen sind di-sub- stituierte Phenoxyessigsäuren, wie 2,4-Dichlorphen- oxyessigsäure, 3,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 3-Chlor- 4-rnethylphenoxyessigsäure, 4-Chlor-3-methylphen- oxyessigsäure, 3-Methyl-6-chlorphenoxyessigsäure, 3,4-Dimethylphenoxyessigsäure, 3,5-Dimethylphen- oxyessigsäure, 2,

4-Dinitrophenoxyessigsäure und tri- substituierte Phenoxyessigsäuren, wie 4-Chlor-3,5-di- methylphenoxyessigsäure.

Weitere Beispiele für Verbindungen, welche nun mehr, in Form ihrer Säurehalogenide angewendet, während der Fermentation in das Penicillinmolekül eingebaut werden, sind Oxyessigsäuren und alipha- tische Carbonsäuren, vorzugsweise Äthoxyessigsäure, (n-Hexyloxy)-essigsäure, (n-Heptyloxy)-essigsäure, Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Laurinsäure,

Adipinsäure; Mercaptoessigsäuren, wie 2-Methyl-4- oxy-phenylmercaptoessigsäure, 3-Methyl-4-oxy-phen- yhnercaptoessigsäure, a-4-Oxyphenylmercaptophenyl- essigsäure und 4-Tolylmercaptoessigsäure, Pyridoxy- essigsäure, ss-Naphthoxyessigsäure, 4-Oxyphenyl-a- thiopropionsäure, Phenylserin,

Benzylsulfonsäure und 4-Oxyzimtsäure.

Es wurde ferner gefunden, dass man die Precur- sorverbindungen vorteilhaft in einem nichttoxischen organischen Lösungsmittel gelöst bei der Fermen tation zusetzen kann. Es gelingt auf diese Weise, die Menge der bei der Fermentation entstehenden Be- gleitprodukte besonders niedrig zu halten. Als orga nische Lösungsmittel kommen für die Precursorver- bindung vorzugsweise Ester, insbesondere Äthyl- acetat oder Amylacetat, aber auch z. B.

Chloroform und Methylisobutylketon, in Betracht. Zweckmässig stellt man das Mischungsverhältnis von Precursor- verbindung zu organischem Lösungsmittel im Bereich von 1:1 bis 1:20 ein.

Der vorliegenden Erfindung liegt ferner die Auf- gabe zugrunde, Gemische von Penicillinen, von wel chen wenigstens eine Komponente ein säurestabiles Penicillin ist, z. B. eines, jener Penicilline, wie sie in der österr. Patentschrift Nr. 178 692 näher definiert sind, in einfacher und wirtschaftlicher Weise herzu stellen. Gemische von Penicillinsalzen, von denen wenigstens ein Salz von einem säurestabilen Penicil lin abgeleitet ist, haben z.

B. wegen ihrer synergisti- schen Wirkung Bedeutung gewonnen.

Es wurde nun gefunden, dass man solche Ge mische von Penicillinen oder deren Salzen nach dem erfindungsgemässen Verfahren dadurch in bequemer, einfacher und wirtschaftlicher Weise mittels Fer mentation erhalten kann, wenn man wenigstens einen Teil der Fermentation in Gegenwart von wenigstens zwei verschiedenen Precursorverbindungen durch führt, von welchen mindestens eine ein Säurehalo genid der Formel II ist.

Bei dieser besonderen Ausführungsform des Ver fahrens gemäss der Erfindung liegen also in ein und demselben Gärbehälter Precursorverbindungen für wenigstens zwei Penicilline gleichzeitig vor. Bei einer solchen Führung der Fermentation erhält man. über raschenderweise eine erhöhte Gesamtausbeute an Pe nicillin, verglichen mit einem gleichen Fermentations- ansatz, bei dem nur eine einzige Precursorverbindung, sei es, wie bisher üblich, z.

B. in Form eines Alkohols oder einer Säure, wie Phenoxyäthanol oder Phenoxy- essigsäure, sei es, in Form eines reaktiven Derivates einer Säure, wie a-Methylphenoxyessigsäurechlorid, zugesetzt wird. Bei einer solchen Fermentation ge- mäss der Erfindung, bei der gleichzeitig z.

B. zwei Precursorverbindungen zugesetzt werden, können diese Precursorverbindungen zwei reaktive Derivate von verschiedenen Carbonsäuren, wie von Phenoxy- essigsäure und von a-Methylphenoxyessigsäure, z. B. Phenoxyessigsäurechlorid und a-Methylphenoxyessig- säurechlorid, sein.

Besonders zweckmässig kann, aber auch bei der Fermentation unter gleichzeitiger An wendung eines Precursors vom Typus der Carbon- säuren und eines Precursors vom Typus der reaktiven Derivate von Carbonsäuren gearbeitet werden. Dabei kann beispielsweise so vorgegangen werden, dass zu erst wenigstens eine Carbonsäure, z.

B. Phenoxyessig- säure, in unterschüssigen Mengen, also in einer die volle Kapazität des Pilzes nicht ausnutzenden Menge, zugesetzt wird. Im weiteren Verlaufe der Fermen tation kann dann kontinuierlich oder absatzweise we nigstens ein reaktives Derivat einer von der zugesetz ten Säure, wie Phenoxyessigsäure, verschiedene Car- bonsäure, wie ein Säurechlorid, z. B. a Methylphen- oxyessigsäurechlorid, hinzugefügt werden.

Beispiele Für die Durchführung der in den Beispielen be schriebenen Fermentation wurde eine Stammnähr lösung folgender Zusammensetzung verwendet:
EMI0003.0064

0,01 <SEP> % <SEP> FCS04 <SEP> . <SEP> 7 <SEP> H.0
<tb> 0,4 <SEP> % <SEP> HgP04
EMI0003.0065

0,025 <SEP> % <SEP> MnS04 <SEP> . <SEP> H20
<tb> 0,01 <SEP> % <SEP> caC12
<tb> 4,0 <SEP> % <SEP> Laktose
<tb> 1,0 <SEP> % <SEP> Glucose. Der pH-Wert der Nährlösung wurde mit NaOH auf 6,0 eingestellt.

Vor der Beimpfung wurde der sterilen Nährlösung 1 % einer 25%igen CaC0g-Sus- pension zugefügt.

Beispiel 1 90 ml Stammnährlösung 10 ml Bierhefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/Liter) 0,1 Vol: % a-Phenoxypropionsäurechlorid (Gesamt- menge) ab der 72. Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt 1 % Sporenimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 351.

Gärgefäss: 21 Erlenmeyerkolben auf Rundschüttel- maschine mit 240 Umdrehungen pro Minute (U/ min) und 30 mm Hub.

Gärzeit: 168 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (Plattentest gegen Staphy- lococcus aureus SG 511): 3200 Einheiten je ml (E/ml).

Im Vergleichskolben wurde ohne Zusatz von a- Phenoxypropionsäurechlorid gearbeitet; nach Beendi gung der Fermentation wurde einem aliquoten Teil das Mycel abgetrennt; die erhaltene Kulturflüssigkeit wurde in Gegenwart von Natriumbicarbonat mit über schüssigem Phenoxypropions,äurechlorid acyliert, wo bei nach der gleichen Testmethode nur 2900 E/ml Penicillin festgestellt wurden.

Beispiel 2 4750 ml Stammnährlösung 250 ml Cornsteepliquor (mit 40 g Stickstoff/Liter) 0,15 Vol: % a-Phenoxypropionsäurechlorid (Gesamt- menge) ab der 36.

Stunde in. Intervallen von 4 Stunden zugesetzt 5 % Mycelimpfb t des Stammes Penicillium chryso- genum 351.

Gärgefäss: 101 Nirostafermenter, Vortex System, 800 U/min, 90 mm Scheibenrührer.

Gärzeit: 108 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 1750 E/ml.

Zur Aufarbeitung wurde die Fermentationsflüssig- keit filtriert, wobei ein Flüssigkeitsvolumen von 4,21 anfiel. Dieses Kulturfiltrat wurde mit 1,51 Butylacetat bei einem pH-Wert von 2,0 extrahiert und das Peni- cillin aus der Butylacetatphase mit Puffer pH 7,

0 rückextrahiert. Nach erneuter Überführung in 50 ml Butylacetat erhielt man eine Lösung mit einem Peni- cillingehalt von 119 000 E/ml. Das Penicillin wurde durch Zusatz von in Methanol gelöstem Kaliumacetat ausgefällt. Ausbeute: 3,3 g a-Phenoxyäthylpenicillin-Kaliumsalz ä 1480 E/mg (jodometrischer Test).

Das ausgeschiedene Kaliumsalz zeigte nach ein stündigem Stehen bei pH 2 eine Aktivitätsabnahme von 10 %.

Im Vergleichsfermenter wurde ohne Zugabe von a-Phenoxypropionsäurechlorid fermentiert; nach Be endigung der Fermentation wurde aus einem aliquo- ten Teil das Mycel abfiltriert; das Filtrat wurde in Gegenwart von Natriumbicarbonat mit überschüs sigem Phenoxypropionsäurechlorid acyliert, wobei nach der gleichen Testmethode nur 1500 E/ml Peni- cillin festgestellt wurden.

Beispiel 3 4250 ml Stammnährlösung 750 ml Bierhefeautolysat (mit 15 g Stickstoff/Liter) 0,12 Vol. -% a-Phenoxypropionsäurechlorid (Gesamt- menge)

von Beginn der Fermentation an konti nuierlich zugesetzt 7 % Mycelimpfgut des Stammes Penicillium chryso- genum 1014.

Gärgefäss: 101 Nitrostafermenter, Vortex System, 800 U/min, 90 mm Scheibenrührer.

Gärzeit: 96 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 2000 E/ml.

Zur Aufarbeitung wurde die Kulturlösung filtriert und das Filtrat zur Inaktivierung der natürlichen Pe nicilline auf pH 2,5 angesäuert und 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach dieser Zeit betrug der Penicillingehalt der Lösung 1700 E/ml. 4 Liter dieses so vorbehandelten Kulturfiltrates wur den nun mit 2 Liter Butylacetat extrahiert. Aus der Butylacetatphase wurde das Penicillin mit 500 ml Bicarbonatlösung in die wässerige Phase überführt.

Diese Bicarbonatlösung wurde nach Ansäuerung auf pH 2 mit 70 ml Butylacetat extrahiert. Aus der Butyl- acetatphase wurde das Penicillin mit einer 0,5-mola- ren Lösung von Kaliumacetat in Butanol ausgefällt. Es wurden 3,34 g a-Phenoxyäthylpenicillin-Kalium- salz ä 1470 E/mg erhalten (jodometrischer Test).

Zur Identifizierung des Penicillins wurde 1 g des erhaltenen Kaliumsalzes mit 5 rnolarer Salzsäure hy- drolysiert. Die ausgeschiedene a-Phenoxypropionsäure wies einen Schmelzpunkt von 116 bis 117 C auf;

beim Schmelzen eines Gemisches des ausgeschiede nen Produktes mit synthetischer a-Phenoxypropion- säure (Mischschmelzpunkt) zeigte sich keine Depres sion.

Im Vergleichsfermenter wurde ohne Zugabe von a-Phenoxypropionsäurechlorid fermentiert; nach Be endigung der Fermentation wurde von einem aliquo- ten Teil der Fermentationsflüssigkeit das Mycel ab getrennt, worauf in Gegenwart von Natriumbicarbonat mit überschüssigem Phenoxypropionsäurechlorid acy- liert wurde; dabei wurden nach der gleichen Test methode nur 1500 E/ml Penicillin festgestellt.

Beispiel 4 4950 ml Stammnährlösung 150 g Erdnusspresskuchen (mit 7 % Stickstoff) 0,2 Vol.-% a-Phenoxypropionsäurechlorid (Gesamt- menge) ab der 24.

Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt, wobei die Zugabemenge bei den beiden letzten Einspritzungen je 0,05 Vol. -1/o beträgt 5 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 347.

Gärgefäss: 101 Nirostafermenter, Vortex System, 650 U/min, 90 mm Scheibenrührer.

Gärzeit: 90 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 1650 E/ml.

Die Fermentationslösung wurde abfiltriert, wobei ein Flüssigkeitsvolumen von 4,1 Liter erhalten wurde. Daraus wurde das Penicillin mit 11 Methylisobutyl- keton bei pH 2,0 extrahiert;

sodann wurde das Peni- cillin in eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 überführt. Aus der Pufferlösung wurde das Peni cillin mit 40 ml Butylacetat rückextrahiert, wobei eine Lösung mit 120 000 E/ml erhalten wurde, aus der das Penicillin mit einer 0,7-molaren Kaliumacetatlösung in Äthanol als Kaliumsalz abgeschieden wurde.

Es wurden 2,86 g a-Phenoxyäthylpenicillin-Kaliumsalz mit einer jodometrisch getesteten Milligrammaktivität von 1450 Einheiten isoliert.

Im Vergleichsfermenter wurde ohne Zugabe von a-Phenoxypropionsäurechlorid fermentiert; nach Be endigung der Fermentation wurde von einem aliquo- ten Teil der Fermentationsflüssigkeit das Mycel ab getrennt;

dann wurde in Gegenwart von Natrium- bicarbonat mit überschüssigem Phenoxypropionsäure- chlorid acyliert, wobei nach der gleichen Testmethode nur 1350 E/ml Penicillin festgestellt wurden.

Beispiel 5 9001 Stammnährlösung 1001 Hefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/Liter) 0,1 Vol. -11/9 a-Phenoxypropionsäurechlorid (Gesamt menge) ab der 48. Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt 10 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014 0,2 % Spermöl.

Gärgefäss: 15001 Nirostafermenter, Schikanen System, 450 U/min, 0,6 Liter Luft pro Liter Nährlösung je Minute.

Gärzeit: 96 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 2200 E/ml.

Zur weiteren Verarbeitung wurde die Rohlösung filtriert und die erhaltenen 9001 Flüssigkeit in 5 Stu fen in üblicher Weise extrahiert. Nach der 5. Ex traktionsstufe fielen. 17,61 Butylacetatphase mit 90 000 E/ml an. Es wurde mit 2,5-molarer Kalium acetatlösung in Methanol gefällt, wobei 805g Kalium- a-phenoxYäthylpenicillinsalz.niit einer Aktivität (jodo- metrischer Test) von 1470 E/mg erhalten wurden.

Das Kaliumsalz wies nach 1stündiger Inkubation bei pH 2 und Zimmertemperatur noch 90 % der ur- sprünglichen Aktivität auf.

Im Vergleichsfermenter wurde ohne Zugabe von a-Phenoxypropionsäurechlorid fermentiert; nach Be endigung der Fermentation wurde von einem ali- quoten Teil das Mycel abgetrennt; die vom Mycel be freite Flüssigkeit wurde in Gegenwart von Natrium- bicarbonat mit überschüssigem Phenoxypropionsäure- chlorid acyliert, wobei nach der gleichen Testmethode nur 1650 E/ml Penicillin festgestellt wurden.

Beispiel 6 90 ml Stammnährlösung 10 ml Bierhefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/Liter) 0,15 % Phenoxyessigsäurechlorid (Gesamtmenge) ab der 24. Stunde in Intervallen von 12 Stunden zu gesetzt 1 % Sporenimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 351.

Gärgefäss: 21 Erlenmeyerkolben auf Rundschüttel- maschine mit 240 U/min und 30 mm Hub. Gärzeit: 170 Stunden.

Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (Plattentest gegen Staphy- lococcus aureus SG 511): 4600 E/ml. Beispiel 7 95 ml Stammnährlösung 5 ml Cornsteepliquor (mit 40 g Stickstoff/ 0,12 % a-Äthylphenoxyessigsäurechlorid (Gesamt- menge) ab der 48.

Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt 2 % Sporenimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 351.

Gärgefäss: 21 Erlenmeyerkolben auf Rundschüttel- maschine mit 260 U/min und 20 mm Hub. Gärzeit: 166 Stunden.

Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (Plattentest gegen Staphy- lococcus aureus SG 511): 2200 E/ml.

Beispiel 8 4250 ml Stammnährlösung 750 ml Bierhefeautolysat (mit 15 g Stickstoff/1) 0,14 % a-Dimethylphenoxyessigsäurechlorid (Ge- samtmenge) ab der 36. Stunde in Intervallen von 6 Stunden zugesetzt 5 % Mycelimpfgat des Stammes 351. Gärgefäss: 101 Nirostafermenter, Vortex System, 800 U/min, 90 mm Scheibenrührer.

Gärzeit: 96 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 2000 E/ml. Beispiel 9 - 4950 ml Stammnährlösung 150 g Erdnusspresskuchen (mit 7 % Stickstoff) 0,16 0/0 o4Cresoxyessigsäurechlorid (Gesamtmenge)

ab Beginn der Fermentation kontinuierlich zu gesetzt 10 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 347.

Gärgefäss: 101 Nirostafermenter, Vortex System, 900 U/min, 70 mm Scheibenrührer.

Gärzeit: 100 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 1850 E/ml. Beispiel10 4750 ml Stammnährlösung 250 ml Cornsteepliquor (mit 40 g Stickstoff/1) 0,10 0/0 o-Methoxyphenoxyessigsäurechlorid (Ge samtmenge) ab der 48. Stunde in Intervallen von 4 Stunden zugesetzt 7 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014.

Gärgefäss: 101 Nirostafermenter, Vortex System, 800 U/min, 80 mm Scheibenrührer.

Gärzeit: 90 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 2800 E/ml.

Beispiel 11 4500 ml Stammnährlösung 500m1 Bierhefeautolysat (mit 20g Stickstoff/1) 0,12 % o-Chlorphenoxyessigsäurechlorid (Gesamt- menge) ab der 24. Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt 15 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014.

Gärgefäss: 101 Nirostafermenter, Vortex System, 700 U/min, 90 mm Scheibenrührer.

Gärzeit: 108 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 1900 E/ml. Beispiel 12 4500 ml Stammnährlösung 500 ml Bierhefeautolysat (mit 18 g Stickstoff/ 0,15 0/0 o-Nitrophenoxyessigsäurechlorid (Gesamt menge) ab der 36. Stunde in Intervallen von Stunden zugesetzt 10 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014.

Gärzeit: 96 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 2100 E/ml. Beispiel 13 l61 Stammnährlösung 500 g Erdnusspresskuchen (mit 7 % Stickstoff) 0,13 % Isopropylidenaminoxyessigsäurechlorid
EMI0006.0010
(Gesamtmenge) ab der 48.

Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt 5 % Mycelimpfgut des Stammes 347 0,1 % Spermöl.

Gärgefäss: 201 Nirostafermenter, Schikanensystem, 400 U/min, 0,51 Luft/1 Nährlösung/min. Gärzeit: 90 Stunden.

Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 1600 E/ml.

Beispiel 14 14,31 Stammnährlösung 700 ml Cornsteepliquor (mit 45 g Stickstoff/1) 0,15 0,'o p-Cresoxyessigs.äurechlorid (Gesamtmenge) ab der 48. Stunde in Intervallen von 6 Stunden zugesetzt 10 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014 0,2 % Spermöl.

Gärgefäss: 201 Nirostafermenter, Schikanensystem, 350 U/min, 0,71 Luft/1 Nährlösung/min. Gärzeit: 96 Stunden.

Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 3600 E/ml.

Beispiel 15 151 Stammnährlösung 1500 ml Bierhefeautolysat (mit 22 g Stickstoff/ 0,16 % Phenylmercaptoessigsäurechlorid (Gesamt- menge) ab Beginn der Fermentation kontinuier lich zugesetzt 7 % Mycelimpfgut des Stammes 1014 0,3 % Spermöl.

Gärgefäss: 201 Nirostafermenter, Schikanensystem, 450 U/min, 0,61 Luft/1 Nährlösung/min. Gärzeit: 96 Stunden.

Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 4000 E/ml.

Beispiel 16 900l Stammnährlösung l001 Bierhefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/1) 0,2 % Phenylessigsäurechlorid (Gesamtmenge) ab der 24.

Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt 10 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 351 0,2 % Spermöl Gärgefäss: l5001 Nirostafermenter, Schikanensystem, 400 U/min, 0,61 Luft/1 Nährlösung/min.

Gärzeit:100 Stunden. Gärtemperatur: 24 C. Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 4500 E/ml.

Beispiel 17 7501 Stammnährlösung 1501 Presshefeautolysat (mit 15 g Stickstoff/ 0,18 % n-Butoxyessigsäurechlorid (Gesamtmenge) ab der 48. Stunde in Intervallen von 6 Stunden zu gesetzt 7 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014 0,3 % Spermöl.

Gärgefäss: 15001 Nirostafermenter, Schikanensystem, 400 U/min, 0,51 Luft/1 Nährlösung/min.

Gärzeit: 96 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 3800 E/ml.

Beispiel 18 1800 Liter Stammnährlösung 200 Liter Hefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/ 0,15 Vol.-% a-Phenoxypropionsäurechlorid (Ge- gesamtmenge)gelöst in der vierfachen Volums- menge Äthylacetat, zugegeben von der 48.

Stunde in Intervallen von 12 Stunden 10 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014 0,2 % Spermöl.

Gärgefäss: 3000 Liter Flussstahl, Schikanensystem, 400 U/min, 0,751 Luft/1 Nährlösung/min. Gärzeit: 90 Stunden.

Gärtemperatur: 25 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 2500 E/ml.

Die weitere Aufarbeitung erfolgt analog Beispiel 5. Beispiel 19 9501 Stammnährlösung 501 Cornsteepliquor (mit 40 g Stickstoff/1) 0,22% Phenylmercaptoessigsäurechlorid (Gesamt- menge) ab der 36.

Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt 5 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 351 0,25 % Spermöl.

Gärgefäss: 15001 Nirostafermenter, Schikanensystem, 450 U/min, 0,51 Luft/1 Nährlösung/min.

Gärzeit: 104 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 4000 E/ml.

Beispiel 20 9001 Stammnährlösung 1001 Brauereihefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/l) 0,18% a-Methylphenylessigsäurechlorid (Gesamt- menge) ab der 12.

Stunde in Intervallen von 10 Stunden zugesetzt 7,5 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014 0,3 % Spermöl.

Gärgefäss: 15001 Nirostafermenter, Schikanensystem, 350 U/min, 0,71 Luft/1 Nährlösung/min. Gärzeit: 115 Stunden.

Gärtemperatur: 27 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 3500 E/ml.

Beispiel 21 1000 Liter Stammnährlösung 200 Liter Presshefeautolysat (mit 16 g Stickstoff/1) 0,25 % Cyclohexylessigsäurechlorid (Gesamtmenge) ab der 30. Stunde in Intervallen von 8 Stunden zugesetzt 10 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014 0,4 % Spermöl.

Gärgefäss: 15001 Nirostafermenter, Schikanensystem, 300 U/min, 0,81 Luft/1 Nährlösung/min.

Gärzeit: 90 Stunden. Gärtemperatur: 26 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 3200 E/ml.

Beispiel 22 (Mischfermentation) 18001 Stammnährlösung 2501 Bierhefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/ 0,065 % Natriumphenoxyacetat (zusammen mit der Nährlösung sterilisiert) 0,18 % a-Methylphenoxyessigsäurechlorid (Gesamt- menge) ab der 48.

Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt 10 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014 0,25 % Spermöl.

Gärgefäss: 25001 Nirostafermenter, Schikanensystem, 300 U/min, 1,01 Luft/1 Nährlösung/min. Gärzeit: 105 Stunden.

Gärtemperatur: 24 C.

Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 4000 E/ml.

Von der ermittelten Gesamtmenge an Penicillin von 4000 E/ml entfielen, wie analytisch festgestellt wurde, auf Phenoxymethylpenicillin 2400 E/ml und auf a-Methylphenoxymethylpenicillin 1600 E/ml.

Gleichzeitig mit dem vorstehenden Ansatz wur den unter den gleichen Bedingungen zwei Fermen tationen durchgeführt, wobei in dem einen Fall die 0,065 % Natriumphenoxyacetat weggelassen wurden, während im zweiten Falle die 0,18 % a-Methylphen- oxyessigsäurechlorid weggelassen wurden.

Dabei wurden beim ersten Fermentationsansatz 1800 E/ml a-Methylphenoxymethylpenicillin erhalten, während beim zweiten Ansatz eine Ausbeute von 5000 E/ml Phenoxymethylpenicillin erzielt werden konnte.

Die Gesamtausbeute von zwei Ansätzen nach dem Verfahren des Beispiels 22 beträgt somit 8000 E/ml, während gesonderte Ansätze zur Gewinnung von Phenoxymethylpenicillin einerseits und a-Methyl- phenoxymethylpenicillin anderseits unter gleichen Fer- mentationsbedingungen 5000 E/ml bzw. 1800 E/ml, zusammen also 6800 E/ml, ergeben.

Die Fermen- tation unter Verwendung von zwei Precursorverbin- dungen bei einem Fermentationsansatz führt also pro zwei Ansätzen zu einer Ausbeuteerhöhung um 1200 E/ml.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Penicillinen der Formel I CsHio0sNS-NH-Zi-R1-(X-P'2). I worin Z1 eine CO- oder S02-Gruppe, R1 einen zwei wertigen, gegebenenfalls substituierten aliphatischen Rest, X eine direkte Bindung, Sauerstoff oder Schwe fel, R2 einen organischen Rest und n = 1 oder 2 be deuten, durch Fermentation, dadurch gekennzeich- net,

dass man die Fermentation in Gegenwart von Precursorverbindungen der Formel II (R2-X).-R1-Z2 , 1I worin Z2 eine COHal- oder S02Ha1-Gruppe sym bolisiert, durchführt. UNTERANSPRÜCHE 1.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man als Säurehalogenid der For mel II ein Halogenid von a-substituierten Essigsäuren, insbesondere von solchen, die in. a-Stellung ein ter tiäres Kohlenstoffatom enthalten, verwendet. 2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, dass man als Säurehalogenid der For mel II ein Halogenid der a-Methylphenoxyessigsäure verwendet.

3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man den letzten Anteil der Pre^ cursorverbindung 3 bis 5 Stunden vor der Beendi gung der Fermentation zusetzt. 4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge- kennzeichnet, dass man mit der Zugabe der Precur- sorverbindung erst nach einer kurzen Anlaufzeit der Fermentation beginnt. 5.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge- kennzeichnet, dass man den Precursor der Fermenta- tionslösung in kleinen Anteilen zuführt. 6. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man der Fermentationslösung neu tralisierend wirkende Stoffe oder Puffersubstanzen zusetzt. 7. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man die Precursorverbindung in einem organischen Lösungsmittel gelöst zusetzt. B.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man einen Teil der Precursorver- bindung in 1 bis 20 Teilen des organischen Lösungs mittels gelöst zusetzt. 9. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge- kennzeichnet, dass man als organisches Lösungsmittel Ester, insbesondere Äthylacetat, Butylacetat oder Amylacetat, verwendet.

10. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man wenigstens einen Teil der Fermentation in Gegenwart von wenigstens zwei verschiedenen Precursorverbindungen durchführt, von welchen mindestens eine ein Säurehalogenid der For mel II ist. 11.

Verfahren nach Unteranspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fermentation in Gegen- wart von wenigstens einer Precursorsäure, wie Phen- oxyessigsäure, unter Zusatz wenigstens eines Säure halogenids der Formel 1I, insbesondere c.-Methyl- phenoxyessigsäurechlorid, durchführt. 12. Verfahren nach Unteranspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fermentation unter Zusatz von wenigstens zwei verschiedenen Säure halogeniden der Formel11 durchführt.