Verfahren zur Herstellung von Penicillinen Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Penicillinen der Formel CsHio0sNS-NH-Z,-R,-(X-Rz)n I worin Z1 eine CO- oder S02-Gruppe, R1 einen zwei wertigen, gegebenenfalls substituierten, aliphatischen Rest, X eine direkte Bindung, Sauerstoff oder Schwe fel und R2 einen organischen Rest, vorzugsweise einen aliphatischen, araliphatischen,
aromatischen oder he- terocyclischen Rest, der gegebenenfalls substituiert sein kann, und n=1 oder 2 bedeuten.
Bei der biosynthetischen Herstellung von Penicil- linen geht man im allgemeinen in der Weise vor, dass man das in der Seitenkette des Penicillinrnoleküls ge wünschte Radikal durch Zusatz chemischer Verbin dungen, sogenannter Precursors, während der Fer- mentationsperiode einführt.
Unter Fermentations- periode ist dabei der Zeitabschnitt zwischen der Zugabe von Pilzmycel zur Nährlösung und Abtren nung des Mycels zu verstehen. Ein solches Verfahren ist z. B. in der britischen Patentschrift Nr. 643 514 beschrieben.
Einzelne Penicilline, wie z. B. (a-Methyl)-phen- oxymethylpenicillin, sind jedoch bisher auf rein bio- synthetischem Wege nicht hergestellt worden.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Fer- mentationsverfahren zu schaffen, bei dem während der Fermentation unter Zusatz einer geeigneten Pre- cursorverbindung nicht nur bereits bekannte Penicil line, wie Phenoxymethylpenicillin, p-Cresoxymethyl- penicillin, Phenylmercaptomethylpenicillin, Benzyl- penicillin und n-Butoxymethylpenicillin, mit verbes serter Ausbeute erhalten werden können,
sondern mit dem man nunmehr überraschend auf fermentativem Wege auch Penicilline herstellen kann, die bisher durch submerse Gärung unter Verwendung von Peni- cillium notatum oder Penicillium chrysogenum bzw.
deren Mutanten, in Gegenwart von üblichen Precur- sorverbindungen nicht erhalten worden konnten. So ist es bekannt, dass Precursorverbindungen, die sich von o-substituierten Phenyl- und Phenoxyessigsäuren, wie 2-Chlorphenoxyessigsäure, 2-Cresoxyessigsäure, 2-Oxyphenylessigsäure, 2-Oxyphenoxyessigsäure und 2-Methoxyphenoxyessigsäure, ableiten,
auf fermen- tativem Wege bisher überhaupt nicht eingebaut wur den; entsprechende, von m-substituierten Phenyl- und Phenoxyessigsäuren, wie 3-Oxyphenoxyessigsäure und 3-Nitrophenoxyessigsäure, abgeleitete Precursorver- bindungen wurden nur schlecht und mit geringer Ausbeute eingebaut.
Gemäss der Erfindung gelingt es nun, bisher auf fermentativem Wege nur schwer bzw. mit nur ge ringer Ausbeute oder überhaupt nicht zugängliche Penicilline, wie Penicilline, die sich von den folgen den Precursorsäuren ableiten:
4-Äthylphenoxyessig- säure, 4-Propylphenoxyessigsäure, 4-tert.-Butylphen- oxyessigsäure, 4-n-Hexylphenoxyessigsäure, 4-Ace- tophenoxyessigsäure, 4 - Acetylaminophenoxyessig- säure, 4-Pentylketophenoxyessigsäure, 4-Oxyphen- oxyessigsäure, 4-Äthoxyphenoxyessigsäure, 4-Formyl- phenoxyessigsäure,
4-Nitrophenoxyessigsäure, 4- Cyanphenoxyessigsäure und 4-Sulfosäurephenoxy- essigsäure, in guter Ausbeute herzustellen, indem man als Precursorverbindungen Säurehalogenide der For mel II (R2-X).-Ri-Z2 , II worin Z2 eine COHal- oder S02Hal-Gruppe symboli siert, verwendet.
Dabei soll sich jedoch der Precursorzusatz in der Regel über einen erheblichen Teil der Fermentations- periode erstrecken. Der aliphatische Rest R1 kann gerade oder ver zweigt sein; er kann in der geraden Kette und bzw.
oder in der Seitenkette eine oder mehrere Doppelbin dungen aufweisen. Ferner kann der Rest R1 einen oder mehrere Substituenten tragen; Beispiele für solche Substituenten sind Alkyl, Alkenyl, Amino- alkyl, N Acylaminoalkyl, gegebenenfalls substituierte Amino- oder Hydroxylgruppen, gegebenenfalls sub stituierte aromatische Reste,
wie Phenyl- und Aralkyl- reste.
Zur Erzielung erhöhter Ausbeuten kann es vorteil haft sein, mit der Zugabe des Precursors erst nach einer kurzen Anlaufzeit der Fermentation, vorzugs weise nach der üblichen Angärzeit, zu beginnen. Fer ner soll die Fermentation nach der letzten Zugabe von Precursor noch zweckmässig 3 bis 5 Stunden weiter geführt werden. Der Zusatz des Precursors kann beim neuen Verfahren intermittierend unter Zusatz kleiner Anteile oder vorzugsweise kontinuierlich er folgen. Sollte es bei der Fermentation, z.
B. infolge Anwendung von überschüssigem Säurehalogenid, zu einem Absinken des pH-Wertes kommen, das sich schädigend auf den weiteren Fermentationsverlauf auswirken würde, so kann diesem Absinken des pH- Wertes durch Zusatz geeigneter Puffersubstanzen zur Nährlösung oder mittels alkalisch reagierender Stoffe entgegengewirkt werden.
Die Puffersubstanzen kön nen bereits von vornherein in der Lösung vorliegen oder gleichzeitig mit dem Precursor, jedoch vorteil haft an einer von der Stelle der Precursorzufuhr ver schiedenen Stelle, zugesetzt werden. Die Zufuhr von neutralisierend wirkenden Stoffen erfolgt in der Re gel in Abhängigkeit von der Zufuhr an Precursor.
Als Puffersubstanzen haben sich Natriumbicar- bonat oder Phosphatgemische besonders zweckmässig erwiesen, während als neutralisierend wirkende Stoffe u. a. Lösungen von Alkalihydroxyden, insbesondere Natriumhydroxyd, in Frage kommen.
Vorzugsweise wird während des Precursorzusat- zes in der Fermentationslösung ein pH-Wert im phy siologischen Bereich eingeregelt.
Während der Fermentation kann es auch zu einem Abbau von überschüssiger Precursorverbin- dung kommen, was einen weiteren Vorteil bei der nachfolgenden Extraktion darstellt.
Werden beim erfindungsgemässen Verfahren als Precursor Säurehalogenide verwendet, welche ein asymmetrisches C-Atom enthalten, so können sie in verschiedenen isomeren Formen eingesetzt werden; meist wird das Racemat zur Acylierung verwendet, in welchem Falle man dann das entsprechende DL- Penicillin bzw. die beiden diastereoisomeren Penicil- line erhält.
Die im Rahmen der Erfindung als Precursors an gewendeten Säurehalogemde führen zu günstigen Ausbeuten an Penicillin. Sie zeichnen sich ferner durch eine selektive Wirksamkeit gegen Bakterien aus; eine Hemmung des Wachstums des Pilzes konnte bei den angewendeten Konzentrationen nicht beob achtet werden. Es wurde auch gefunden, dass Unterschiede in der Eignung von Penicilliumstämmen für die Verwend barkeit beim erfindungsgemässen Verfahren bestehen.
Beispiele für besonders geeignete Penicilliumstämme sind Penicillium chrysogenum WIS Q<B>176</B> und Peni- cillium chrysogenum 51-20 und deren Mutanten.
Im Rahmen der beim erfindungsgemässen Ver fahren verwendeten Precursorverbindungen nehmen die Halogenide der a-substituierten Essigsäuren, z. B. Phenoxyessigsäuren, und insbesondere solche Essig- säuren, deren a-Kohlenstoffatom tertiären Charakter hat, eine besondere Stellung ein, besonders auch des halb, weil Penicilline mit Resten von solchen Essig bzw. Phenoxyessigsäuren durch die üblichen Fermen tationsmethoden nur schwer oder gar nicht zugänglich waren.
Beispiele für solche am a-Kohlenstoffatom substituierte Essigsäuren sind (a-Methyl)-phenoxy- essigsäure, (a-Phenyl)-phenoxyessigsäure, a-Phenoxy- stearinsäure, N-Acetyltryptophan und Mandelsäure.
Aber auch Penicilline von aromatische Reste enthaltenden Alkan- bzw. Alkencarbonsäuren, die am aromatischen Ring 2 oder 3 Substituenten tragen, sind nunmehr auf. fermentativem Wege bequem zugäng lich.
Beispiele für solche Verbindungen sind di-sub- stituierte Phenoxyessigsäuren, wie 2,4-Dichlorphen- oxyessigsäure, 3,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 3-Chlor- 4-rnethylphenoxyessigsäure, 4-Chlor-3-methylphen- oxyessigsäure, 3-Methyl-6-chlorphenoxyessigsäure, 3,4-Dimethylphenoxyessigsäure, 3,5-Dimethylphen- oxyessigsäure, 2,
4-Dinitrophenoxyessigsäure und tri- substituierte Phenoxyessigsäuren, wie 4-Chlor-3,5-di- methylphenoxyessigsäure.
Weitere Beispiele für Verbindungen, welche nun mehr, in Form ihrer Säurehalogenide angewendet, während der Fermentation in das Penicillinmolekül eingebaut werden, sind Oxyessigsäuren und alipha- tische Carbonsäuren, vorzugsweise Äthoxyessigsäure, (n-Hexyloxy)-essigsäure, (n-Heptyloxy)-essigsäure, Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Laurinsäure,
Adipinsäure; Mercaptoessigsäuren, wie 2-Methyl-4- oxy-phenylmercaptoessigsäure, 3-Methyl-4-oxy-phen- yhnercaptoessigsäure, a-4-Oxyphenylmercaptophenyl- essigsäure und 4-Tolylmercaptoessigsäure, Pyridoxy- essigsäure, ss-Naphthoxyessigsäure, 4-Oxyphenyl-a- thiopropionsäure, Phenylserin,
Benzylsulfonsäure und 4-Oxyzimtsäure.
Es wurde ferner gefunden, dass man die Precur- sorverbindungen vorteilhaft in einem nichttoxischen organischen Lösungsmittel gelöst bei der Fermen tation zusetzen kann. Es gelingt auf diese Weise, die Menge der bei der Fermentation entstehenden Be- gleitprodukte besonders niedrig zu halten. Als orga nische Lösungsmittel kommen für die Precursorver- bindung vorzugsweise Ester, insbesondere Äthyl- acetat oder Amylacetat, aber auch z. B.
Chloroform und Methylisobutylketon, in Betracht. Zweckmässig stellt man das Mischungsverhältnis von Precursor- verbindung zu organischem Lösungsmittel im Bereich von 1:1 bis 1:20 ein.
Der vorliegenden Erfindung liegt ferner die Auf- gabe zugrunde, Gemische von Penicillinen, von wel chen wenigstens eine Komponente ein säurestabiles Penicillin ist, z. B. eines, jener Penicilline, wie sie in der österr. Patentschrift Nr. 178 692 näher definiert sind, in einfacher und wirtschaftlicher Weise herzu stellen. Gemische von Penicillinsalzen, von denen wenigstens ein Salz von einem säurestabilen Penicil lin abgeleitet ist, haben z.
B. wegen ihrer synergisti- schen Wirkung Bedeutung gewonnen.
Es wurde nun gefunden, dass man solche Ge mische von Penicillinen oder deren Salzen nach dem erfindungsgemässen Verfahren dadurch in bequemer, einfacher und wirtschaftlicher Weise mittels Fer mentation erhalten kann, wenn man wenigstens einen Teil der Fermentation in Gegenwart von wenigstens zwei verschiedenen Precursorverbindungen durch führt, von welchen mindestens eine ein Säurehalo genid der Formel II ist.
Bei dieser besonderen Ausführungsform des Ver fahrens gemäss der Erfindung liegen also in ein und demselben Gärbehälter Precursorverbindungen für wenigstens zwei Penicilline gleichzeitig vor. Bei einer solchen Führung der Fermentation erhält man. über raschenderweise eine erhöhte Gesamtausbeute an Pe nicillin, verglichen mit einem gleichen Fermentations- ansatz, bei dem nur eine einzige Precursorverbindung, sei es, wie bisher üblich, z.
B. in Form eines Alkohols oder einer Säure, wie Phenoxyäthanol oder Phenoxy- essigsäure, sei es, in Form eines reaktiven Derivates einer Säure, wie a-Methylphenoxyessigsäurechlorid, zugesetzt wird. Bei einer solchen Fermentation ge- mäss der Erfindung, bei der gleichzeitig z.
B. zwei Precursorverbindungen zugesetzt werden, können diese Precursorverbindungen zwei reaktive Derivate von verschiedenen Carbonsäuren, wie von Phenoxy- essigsäure und von a-Methylphenoxyessigsäure, z. B. Phenoxyessigsäurechlorid und a-Methylphenoxyessig- säurechlorid, sein.
Besonders zweckmässig kann, aber auch bei der Fermentation unter gleichzeitiger An wendung eines Precursors vom Typus der Carbon- säuren und eines Precursors vom Typus der reaktiven Derivate von Carbonsäuren gearbeitet werden. Dabei kann beispielsweise so vorgegangen werden, dass zu erst wenigstens eine Carbonsäure, z.
B. Phenoxyessig- säure, in unterschüssigen Mengen, also in einer die volle Kapazität des Pilzes nicht ausnutzenden Menge, zugesetzt wird. Im weiteren Verlaufe der Fermen tation kann dann kontinuierlich oder absatzweise we nigstens ein reaktives Derivat einer von der zugesetz ten Säure, wie Phenoxyessigsäure, verschiedene Car- bonsäure, wie ein Säurechlorid, z. B. a Methylphen- oxyessigsäurechlorid, hinzugefügt werden.
<I>Beispiele</I> Für die Durchführung der in den Beispielen be schriebenen Fermentation wurde eine Stammnähr lösung folgender Zusammensetzung verwendet:
EMI0003.0064
0,0<B>1</B> <SEP> % <SEP> FCS04 <SEP> . <SEP> 7 <SEP> H.<U>0</U>
<tb> 0,4 <SEP> % <SEP> HgP04
EMI0003.0065
0,025 <SEP> % <SEP> MnS04 <SEP> . <SEP> H20
<tb> 0,01 <SEP> % <SEP> caC12
<tb> 4,0 <SEP> % <SEP> Laktose
<tb> 1,0 <SEP> % <SEP> Glucose. Der pH-Wert der Nährlösung wurde mit NaOH auf 6,0 eingestellt.
Vor der Beimpfung wurde der sterilen Nährlösung 1 % einer 25%igen CaC0g-Sus- pension zugefügt.
<I>Beispiel 1</I> 90 ml Stammnährlösung 10 ml Bierhefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/Liter) 0,1 Vol: % a-Phenoxypropionsäurechlorid (Gesamt- menge) ab der 72. Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt 1 % Sporenimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 351.
Gärgefäss: 21 Erlenmeyerkolben auf Rundschüttel- maschine mit 240 Umdrehungen pro Minute (U/ min) und 30 mm Hub.
Gärzeit: 168 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (Plattentest gegen Staphy- lococcus aureus SG 511): 3200 Einheiten je ml (E/ml).
Im Vergleichskolben wurde ohne Zusatz von a- Phenoxypropionsäurechlorid gearbeitet; nach Beendi gung der Fermentation wurde einem aliquoten Teil das Mycel abgetrennt; die erhaltene Kulturflüssigkeit wurde in Gegenwart von Natriumbicarbonat mit über schüssigem Phenoxypropions,äurechlorid acyliert, wo bei nach der gleichen Testmethode nur 2900 E/ml Penicillin festgestellt wurden.
<I>Beispiel 2</I> 4750 ml Stammnährlösung 250 ml Cornsteepliquor (mit 40 g Stickstoff/Liter) 0,15 Vol: % a-Phenoxypropionsäurechlorid (Gesamt- menge) ab der 36.
Stunde in. Intervallen von 4 Stunden zugesetzt 5 % Mycelimpfb t des Stammes Penicillium chryso- genum 351.
Gärgefäss: 101 Nirostafermenter, Vortex System, 800 U/min, 90 mm Scheibenrührer.
Gärzeit: 108 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 1750 E/ml.
Zur Aufarbeitung wurde die Fermentationsflüssig- keit filtriert, wobei ein Flüssigkeitsvolumen von 4,21 anfiel. Dieses Kulturfiltrat wurde mit 1,51 Butylacetat bei einem pH-Wert von 2,0 extrahiert und das Peni- cillin aus der Butylacetatphase mit Puffer pH 7,
0 rückextrahiert. Nach erneuter Überführung in 50 ml Butylacetat erhielt man eine Lösung mit einem Peni- cillingehalt von 119 000 E/ml. Das Penicillin wurde durch Zusatz von in Methanol gelöstem Kaliumacetat ausgefällt. Ausbeute: 3,3 g a-Phenoxyäthylpenicillin-Kaliumsalz ä 1480 E/mg (jodometrischer Test).
Das ausgeschiedene Kaliumsalz zeigte nach ein stündigem Stehen bei pH 2 eine Aktivitätsabnahme von 10 %.
Im Vergleichsfermenter wurde ohne Zugabe von a-Phenoxypropionsäurechlorid fermentiert; nach Be endigung der Fermentation wurde aus einem aliquo- ten Teil das Mycel abfiltriert; das Filtrat wurde in Gegenwart von Natriumbicarbonat mit überschüs sigem Phenoxypropionsäurechlorid acyliert, wobei nach der gleichen Testmethode nur 1500 E/ml Peni- cillin festgestellt wurden.
<I>Beispiel 3</I> 4250 ml Stammnährlösung 750 ml Bierhefeautolysat (mit 15 g Stickstoff/Liter) 0,12 Vol. -% a-Phenoxypropionsäurechlorid (Gesamt- menge)
von Beginn der Fermentation an konti nuierlich zugesetzt 7 % Mycelimpfgut des Stammes Penicillium chryso- genum 1014.
Gärgefäss: 101 Nitrostafermenter, Vortex System, 800 U/min, 90 mm Scheibenrührer.
Gärzeit: 96 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 2000 E/ml.
Zur Aufarbeitung wurde die Kulturlösung filtriert und das Filtrat zur Inaktivierung der natürlichen Pe nicilline auf pH 2,5 angesäuert und 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach dieser Zeit betrug der Penicillingehalt der Lösung 1700 E/ml. 4 Liter dieses so vorbehandelten Kulturfiltrates wur den nun mit 2 Liter Butylacetat extrahiert. Aus der Butylacetatphase wurde das Penicillin mit 500 ml Bicarbonatlösung in die wässerige Phase überführt.
Diese Bicarbonatlösung wurde nach Ansäuerung auf pH 2 mit 70 ml Butylacetat extrahiert. Aus der Butyl- acetatphase wurde das Penicillin mit einer 0,5-mola- ren Lösung von Kaliumacetat in Butanol ausgefällt. Es wurden 3,34 g a-Phenoxyäthylpenicillin-Kalium- salz ä 1470 E/mg erhalten (jodometrischer Test).
Zur Identifizierung des Penicillins wurde 1 g des erhaltenen Kaliumsalzes mit 5 rnolarer Salzsäure hy- drolysiert. Die ausgeschiedene a-Phenoxypropionsäure wies einen Schmelzpunkt von 116 bis 117 C auf;
beim Schmelzen eines Gemisches des ausgeschiede nen Produktes mit synthetischer a-Phenoxypropion- säure (Mischschmelzpunkt) zeigte sich keine Depres sion.
Im Vergleichsfermenter wurde ohne Zugabe von a-Phenoxypropionsäurechlorid fermentiert; nach Be endigung der Fermentation wurde von einem aliquo- ten Teil der Fermentationsflüssigkeit das Mycel ab getrennt, worauf in Gegenwart von Natriumbicarbonat mit überschüssigem Phenoxypropionsäurechlorid acy- liert wurde; dabei wurden nach der gleichen Test methode nur 1500 E/ml Penicillin festgestellt.
<I>Beispiel 4</I> 4950 ml Stammnährlösung 150 g Erdnusspresskuchen (mit 7 % Stickstoff) 0,2 Vol.-% a-Phenoxypropionsäurechlorid (Gesamt- menge) ab der 24.
Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt, wobei die Zugabemenge bei den beiden letzten Einspritzungen je 0,05 Vol. -1/o beträgt 5 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 347.
Gärgefäss: 101 Nirostafermenter, Vortex System, 650 U/min, 90 mm Scheibenrührer.
Gärzeit: 90 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 1650 E/ml.
Die Fermentationslösung wurde abfiltriert, wobei ein Flüssigkeitsvolumen von 4,1 Liter erhalten wurde. Daraus wurde das Penicillin mit 11 Methylisobutyl- keton bei pH 2,0 extrahiert;
sodann wurde das Peni- cillin in eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 überführt. Aus der Pufferlösung wurde das Peni cillin mit 40 ml Butylacetat rückextrahiert, wobei eine Lösung mit 120 000 E/ml erhalten wurde, aus der das Penicillin mit einer 0,7-molaren Kaliumacetatlösung in Äthanol als Kaliumsalz abgeschieden wurde.
Es wurden 2,86 g a-Phenoxyäthylpenicillin-Kaliumsalz mit einer jodometrisch getesteten Milligrammaktivität von 1450 Einheiten isoliert.
Im Vergleichsfermenter wurde ohne Zugabe von a-Phenoxypropionsäurechlorid fermentiert; nach Be endigung der Fermentation wurde von einem aliquo- ten Teil der Fermentationsflüssigkeit das Mycel ab getrennt;
dann wurde in Gegenwart von Natrium- bicarbonat mit überschüssigem Phenoxypropionsäure- chlorid acyliert, wobei nach der gleichen Testmethode nur 1350 E/ml Penicillin festgestellt wurden.
<I>Beispiel 5</I> 9001 Stammnährlösung 1001 Hefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/Liter) 0,1 Vol. -11/9 a-Phenoxypropionsäurechlorid (Gesamt menge) ab der 48. Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt 10 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014 0,2 % Spermöl.
Gärgefäss: 15001 Nirostafermenter, Schikanen System, 450 U/min, 0,6 Liter Luft pro Liter Nährlösung je Minute.
Gärzeit: 96 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 2200 E/ml.
Zur weiteren Verarbeitung wurde die Rohlösung filtriert und die erhaltenen 9001 Flüssigkeit in 5 Stu fen in üblicher Weise extrahiert. Nach der 5. Ex traktionsstufe fielen. 17,61 Butylacetatphase mit 90 000 E/ml an. Es wurde mit 2,5-molarer Kalium acetatlösung in Methanol gefällt, wobei 805g Kalium- a-phenoxYäthylpenicillinsalz.niit einer Aktivität (jodo- metrischer Test) von 1470 E/mg erhalten wurden.
Das Kaliumsalz wies nach 1stündiger Inkubation bei pH 2 und Zimmertemperatur noch 90 % der ur- sprünglichen Aktivität auf.
Im Vergleichsfermenter wurde ohne Zugabe von a-Phenoxypropionsäurechlorid fermentiert; nach Be endigung der Fermentation wurde von einem ali- quoten Teil das Mycel abgetrennt; die vom Mycel be freite Flüssigkeit wurde in Gegenwart von Natrium- bicarbonat mit überschüssigem Phenoxypropionsäure- chlorid acyliert, wobei nach der gleichen Testmethode nur 1650 E/ml Penicillin festgestellt wurden.
<I>Beispiel 6</I> 90 ml Stammnährlösung 10 ml Bierhefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/Liter) 0,15 % Phenoxyessigsäurechlorid (Gesamtmenge) ab der 24. Stunde in Intervallen von 12 Stunden zu gesetzt 1 % Sporenimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 351.
Gärgefäss: 21 Erlenmeyerkolben auf Rundschüttel- maschine mit 240 U/min und 30 mm Hub. Gärzeit: 170 Stunden.
Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (Plattentest gegen Staphy- lococcus aureus SG 511): 4600 E/ml. <I>Beispiel 7</I> 95 ml Stammnährlösung 5 ml Cornsteepliquor (mit 40 g Stickstoff/ 0,12 % a-Äthylphenoxyessigsäurechlorid (Gesamt- menge) ab der 48.
Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt 2 % Sporenimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 351.
Gärgefäss: 21 Erlenmeyerkolben auf Rundschüttel- maschine mit 260 U/min und 20 mm Hub. Gärzeit: 166 Stunden.
Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (Plattentest gegen Staphy- lococcus aureus SG 511): 2200 E/ml.
<I>Beispiel 8</I> 4250 ml Stammnährlösung 750 ml Bierhefeautolysat (mit 15 g Stickstoff/1) 0,14 % a-Dimethylphenoxyessigsäurechlorid (Ge- samtmenge) ab der 36. Stunde in Intervallen von 6 Stunden zugesetzt 5 % Mycelimpfgat des Stammes 351. Gärgefäss: 101 Nirostafermenter, Vortex System, 800 U/min, 90 mm Scheibenrührer.
Gärzeit: 96 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 2000 E/ml. <I>Beispiel 9 -</I> 4950 ml Stammnährlösung 150 g Erdnusspresskuchen (mit 7 % Stickstoff) 0,16 0/0 o4Cresoxyessigsäurechlorid (Gesamtmenge)
ab Beginn der Fermentation kontinuierlich zu gesetzt 10 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 347.
Gärgefäss: 101 Nirostafermenter, Vortex System, 900 U/min, 70 mm Scheibenrührer.
Gärzeit: 100 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 1850 E/ml. <I>Beispiel<B>10</B></I> 4750 ml Stammnährlösung 250 ml Cornsteepliquor (mit 40 g Stickstoff/1) 0,10 0/0 o-Methoxyphenoxyessigsäurechlorid (Ge samtmenge) ab der 48. Stunde in Intervallen von 4 Stunden zugesetzt 7 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014.
Gärgefäss: 101 Nirostafermenter, Vortex System, 800 U/min, 80 mm Scheibenrührer.
Gärzeit: 90 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 2800 E/ml.
<I>Beispiel 11</I> 4500 ml Stammnährlösung 500m1 Bierhefeautolysat (mit 20g Stickstoff/1) 0,12 % o-Chlorphenoxyessigsäurechlorid (Gesamt- menge) ab der 24. Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt 15 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014.
Gärgefäss: 101 Nirostafermenter, Vortex System, 700 U/min, 90 mm Scheibenrührer.
Gärzeit: 108 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 1900 E/ml. <I>Beispiel 12</I> 4500 ml Stammnährlösung 500 ml Bierhefeautolysat (mit 18 g Stickstoff/ 0,15 0/0 o-Nitrophenoxyessigsäurechlorid (Gesamt menge) ab der 36. Stunde in Intervallen von Stunden zugesetzt 10 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014.
Gärgefäss: 101 Nirostafermenter, Vortex System, 900 U/min, 70 mm Scheibenrührer.
Gärzeit: 96 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 2100 E/ml. <I>Beispiel 13</I> l61 Stammnährlösung 500 g Erdnusspresskuchen (mit 7 % Stickstoff) 0,13 % Isopropylidenaminoxyessigsäurechlorid
EMI0006.0010
(Gesamtmenge) ab der 48.
Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt 5 % Mycelimpfgut des Stammes 347 0,1 % Spermöl.
Gärgefäss: 201 Nirostafermenter, Schikanensystem, 400 U/min, 0,51 Luft/1 Nährlösung/min. Gärzeit: 90 Stunden.
Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 1600 E/ml.
<I>Beispiel 14</I> 14,31 Stammnährlösung 700 ml Cornsteepliquor (mit 45 g Stickstoff/1) 0,15 0,'o p-Cresoxyessigs.äurechlorid (Gesamtmenge) ab der 48. Stunde in Intervallen von 6 Stunden zugesetzt 10 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014 0,2 % Spermöl.
Gärgefäss: 201 Nirostafermenter, Schikanensystem, 350 U/min, 0,71 Luft/1 Nährlösung/min. Gärzeit: 96 Stunden.
Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 3600 E/ml.
<I>Beispiel 15</I> 151 Stammnährlösung 1500 ml Bierhefeautolysat (mit 22 g Stickstoff/ 0,16 % Phenylmercaptoessigsäurechlorid (Gesamt- menge) ab Beginn der Fermentation kontinuier lich zugesetzt 7 % Mycelimpfgut des Stammes 1014 0,3 % Spermöl.
Gärgefäss: 201 Nirostafermenter, Schikanensystem, 450 U/min, 0,61 Luft/1 Nährlösung/min. Gärzeit: 96 Stunden.
Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 4000 E/ml.
<I>Beispiel 16</I> 900l Stammnährlösung l001 Bierhefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/1) 0,2 % Phenylessigsäurechlorid (Gesamtmenge) ab der 24.
Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt 10 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 351 0,2 % Spermöl Gärgefäss: l5001 Nirostafermenter, Schikanensystem, 400 U/min, 0,61 Luft/1 Nährlösung/min.
Gärzeit:<B>100</B> Stunden. Gärtemperatur: 24 C. Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 4500 E/ml.
<I>Beispiel 17</I> 7501 Stammnährlösung 1501 Presshefeautolysat (mit 15 g Stickstoff/ 0,18 % n-Butoxyessigsäurechlorid (Gesamtmenge) ab der 48. Stunde in Intervallen von 6 Stunden zu gesetzt 7 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014 0,3 % Spermöl.
Gärgefäss: 15001 Nirostafermenter, Schikanensystem, 400 U/min, 0,51 Luft/1 Nährlösung/min.
Gärzeit: 96 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 3800 E/ml.
<I>Beispiel 18</I> 1800 Liter Stammnährlösung 200 Liter Hefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/ 0,15 Vol.-% a-Phenoxypropionsäurechlorid (Ge- gesamtmenge)gelöst in der vierfachen Volums- menge Äthylacetat, zugegeben von der 48.
Stunde in Intervallen von 12 Stunden 10 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014 0,2 % Spermöl.
Gärgefäss: 3000 Liter Flussstahl, Schikanensystem, 400 U/min, 0,751 Luft/1 Nährlösung/min. Gärzeit: 90 Stunden.
Gärtemperatur: 25 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 2500 E/ml.
Die weitere Aufarbeitung erfolgt analog Beispiel 5. <I>Beispiel 19</I> 9501 Stammnährlösung 501 Cornsteepliquor (mit 40 g Stickstoff/1) 0,22% Phenylmercaptoessigsäurechlorid (Gesamt- menge) ab der 36.
Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt 5 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 351 0,25 % Spermöl.
Gärgefäss: 15001 Nirostafermenter, Schikanensystem, 450 U/min, 0,51 Luft/1 Nährlösung/min.
Gärzeit: 104 Stunden. Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 4000 E/ml.
<I>Beispiel 20</I> <B>9001</B> Stammnährlösung 1001 Brauereihefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/l) 0,18% a-Methylphenylessigsäurechlorid (Gesamt- menge) ab der 12.
Stunde in Intervallen von 10 Stunden zugesetzt 7,5 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014 0,3 % Spermöl.
Gärgefäss: 15001 Nirostafermenter, Schikanensystem, 350 U/min, 0,71 Luft/1 Nährlösung/min. Gärzeit: 115 Stunden.
Gärtemperatur: 27 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 3500 E/ml.
<I>Beispiel 21</I> 1000 Liter Stammnährlösung 200 Liter Presshefeautolysat (mit 16 g Stickstoff/1) 0,25 % Cyclohexylessigsäurechlorid (Gesamtmenge) ab der 30. Stunde in Intervallen von 8 Stunden zugesetzt 10 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014 0,4 % Spermöl.
Gärgefäss: 15001 Nirostafermenter, Schikanensystem, 300 U/min, 0,81 Luft/1 Nährlösung/min.
Gärzeit: 90 Stunden. Gärtemperatur: 26 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 3200 E/ml.
<I>Beispiel 22</I> (Mischfermentation) 18001 Stammnährlösung 2501 Bierhefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/ 0,065 % Natriumphenoxyacetat (zusammen mit der Nährlösung sterilisiert) 0,18 % a-Methylphenoxyessigsäurechlorid (Gesamt- menge) ab der 48.
Stunde in Intervallen von 12 Stunden zugesetzt 10 % Mycelimpfgut des Penicillium chrysogenum- Stammes 1014 0,25 % Spermöl.
Gärgefäss: 25001 Nirostafermenter, Schikanensystem, 300 U/min, 1,01 Luft/1 Nährlösung/min. Gärzeit: 105 Stunden.
Gärtemperatur: 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (jodometrischer Test): 4000 E/ml.
Von der ermittelten Gesamtmenge an Penicillin von 4000 E/ml entfielen, wie analytisch festgestellt wurde, auf Phenoxymethylpenicillin 2400 E/ml und auf a-Methylphenoxymethylpenicillin 1600 E/ml.
Gleichzeitig mit dem vorstehenden Ansatz wur den unter den gleichen Bedingungen zwei Fermen tationen durchgeführt, wobei in dem einen Fall die 0,065 % Natriumphenoxyacetat weggelassen wurden, während im zweiten Falle die 0,18 % a-Methylphen- oxyessigsäurechlorid weggelassen wurden.
Dabei wurden beim ersten Fermentationsansatz 1800 E/ml a-Methylphenoxymethylpenicillin erhalten, während beim zweiten Ansatz eine Ausbeute von 5000 E/ml Phenoxymethylpenicillin erzielt werden konnte.
Die Gesamtausbeute von zwei Ansätzen nach dem Verfahren des Beispiels 22 beträgt somit 8000 E/ml, während gesonderte Ansätze zur Gewinnung von Phenoxymethylpenicillin einerseits und a-Methyl- phenoxymethylpenicillin anderseits unter gleichen Fer- mentationsbedingungen 5000 E/ml bzw. 1800 E/ml, zusammen also 6800 E/ml, ergeben.
Die Fermen- tation unter Verwendung von zwei Precursorverbin- dungen bei einem Fermentationsansatz führt also pro zwei Ansätzen zu einer Ausbeuteerhöhung um 1200 E/ml.
Process for the production of penicillins The present invention relates to a process for the production of penicillins of the formula CsHioOsNS-NH-Z, -R, - (X-Rz) n I wherein Z1 is a CO or S02 group, R1 a divalent, optionally substituted, aliphatic radical, X is a direct bond, oxygen or sulfur and R2 is an organic radical, preferably an aliphatic, araliphatic,
aromatic or heterocyclic radical, which can optionally be substituted, and n = 1 or 2.
In the biosynthetic production of penicillins, the general procedure is that the radical desired in the side chain of the penicillin molecule is introduced by adding chemical compounds, so-called precursors, during the fermentation period.
The fermentation period is to be understood as the period between the addition of fungal mycelium to the nutrient solution and separation of the mycelium. Such a method is e.g. As described in British Patent Specification No. 643,514.
Individual penicillins, such as B. (a-methyl) -phenoxymethylpenicillin, however, have so far not been produced in a purely biosynthetic way.
The aim of the present invention is to create a fermentation process in which, with the addition of a suitable precursor compound, not only already known penicillin, such as phenoxymethylpenicillin, p-cresoxymethylpenicillin, phenylmercaptomethylpenicillin, benzyl penicillin and n- Butoxymethylpenicillin, can be obtained with improved yield,
but with which one can now surprisingly also produce penicillins by fermentation, which were previously produced by submerged fermentation using Penicillium notatum or Penicillium chrysogenum or
whose mutants could not be obtained in the presence of customary precursor compounds. It is known that precursor compounds which are derived from o-substituted phenyl and phenoxyacetic acids such as 2-chlorophenoxyacetic acid, 2-cresoxyacetic acid, 2-oxyphenoxyacetic acid, 2-oxyphenoxyacetic acid and 2-methoxyphenoxyacetic acid,
so far not at all have been incorporated by fermentation; Corresponding precursor compounds derived from m-substituted phenyl and phenoxyacetic acids, such as 3-oxyphenoxyacetic acid and 3-nitrophenoxyacetic acid, were incorporated only poorly and with low yield.
According to the invention, it is now possible to obtain penicillins, such as penicillins which are derived from the following precursor acids, only with difficulty or with only a low yield or not at all by fermentation:
4-Ethylphenoxyacetic acid, 4-propylphenoxyacetic acid, 4-tert-butylphenoxyacetic acid, 4-n-hexylphenoxyacetic acid, 4-acetophenoxyacetic acid, 4-acetylaminophenoxyacetic acid, 4-pentylketophenoxyacetic acid, 4-oxyphenoxyacetic acid, 4-oxyphenoxyacetic acid , 4-formylphenoxyacetic acid,
4-nitrophenoxyacetic acid, 4- cyanophenoxyacetic acid and 4-sulfonic acid phenoxyacetic acid can be produced in good yield by using acid halides of the formula II (R2-X) .- Ri-Z2, II where Z2 symbolizes a COHal or S02Hal group as precursor compounds sated, used.
In this case, however, the addition of precursors should as a rule extend over a considerable part of the fermentation period. The aliphatic radical R1 can be straight or branched; it can be in the straight chain and resp.
or have one or more double bonds in the side chain. Furthermore, the radical R1 can carry one or more substituents; Examples of such substituents are alkyl, alkenyl, aminoalkyl, N acylaminoalkyl, optionally substituted amino or hydroxyl groups, optionally substituted aromatic radicals,
such as phenyl and aralkyl radicals.
In order to achieve increased yields, it can be advantageous to start adding the precursor only after the fermentation has started for a short time, preferably after the usual fermentation time. Furthermore, the fermentation should expediently be continued for 3 to 5 hours after the last addition of precursor. In the new process, the precursor can be added intermittently with the addition of small amounts or, preferably, continuously. Should it occur during fermentation, e.g.
If, for example, the use of excess acid halide leads to a decrease in the pH value, which would have a damaging effect on the further course of the fermentation, this decrease in the pH value can be counteracted by adding suitable buffer substances to the nutrient solution or by means of alkaline substances.
The buffer substances can already be present in the solution from the outset or can be added simultaneously with the precursor, but advantageously at a point different from the point where the precursor is supplied. The supply of neutralizing substances takes place as a rule depending on the supply of precursor.
Sodium bicarbonate or phosphate mixtures have proven particularly useful as buffer substances, while substances with a neutralizing effect u. a. Solutions of alkali hydroxides, especially sodium hydroxide, come into question.
A pH value in the physiological range is preferably adjusted in the fermentation solution during the addition of the precursor.
During the fermentation there can also be a breakdown of excess precursor compound, which is a further advantage in the subsequent extraction.
If acid halides which contain an asymmetric carbon atom are used as precursors in the process according to the invention, they can be used in various isomeric forms; mostly the racemate is used for the acylation, in which case the corresponding DL-penicillin or the two diastereoisomeric penicillins are obtained.
The acid halides used as precursors in the context of the invention lead to favorable yields of penicillin. They are also characterized by a selective activity against bacteria; an inhibition of the growth of the fungus could not be observed at the concentrations used. It has also been found that there are differences in the suitability of Penicillium strains for use in the process according to the invention.
Examples of particularly suitable Penicillium strains are Penicillium chrysogenum WIS Q 176 and Penicillium chrysogenum 51-20 and their mutants.
In the context of the precursor compounds used in the inventive method, the halides of the a-substituted acetic acids, eg. B. phenoxyacetic acids, and especially those acetic acids whose a-carbon atom has a tertiary character, have a special position, especially because penicillins with residues of such acetic or phenoxyacetic acids are difficult or impossible to access through the usual fermentation methods were.
Examples of such acetic acids substituted on the a-carbon atom are (a-methyl) -phenoxyacetic acid, (a-phenyl) -phenoxyacetic acid, a-phenoxystearic acid, N-acetyltryptophan and mandelic acid.
But also penicillins of aromatic radicals containing alkanoic or alkene carboxylic acids, which have 2 or 3 substituents on the aromatic ring, are now on. Easily accessible by fermentation.
Examples of such compounds are di-substituted phenoxyacetic acids, such as 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 3,4-dichlorophenoxyacetic acid, 3-chloro-4-methylphenoxyacetic acid, 4-chloro-3-methylphenoxyacetic acid, 3-methyl-6 -chlorophenoxyacetic acid, 3,4-dimethylphenoxyacetic acid, 3,5-dimethylphenoxyacetic acid, 2,
4-dinitrophenoxyacetic acid and tri-substituted phenoxyacetic acids, such as 4-chloro-3,5-dimethylphenoxyacetic acid.
Further examples of compounds which are now used in the form of their acid halides and are built into the penicillin molecule during fermentation are oxyacetic acids and aliphatic carboxylic acids, preferably ethoxyacetic acid, (n-hexyloxy) acetic acid, (n-heptyloxy) acetic acid , Caproic acid, caprylic acid, capric acid, lauric acid,
Adipic acid; Mercaptoacetic acids, such as 2-methyl-4-oxy-phenyl mercaptoacetic acid, 3-methyl-4-oxy-phenyl mercaptoacetic acid, α-4-oxyphenylmercaptophenylacetic acid and 4-tolylmercaptoacetic acid, pyridoxyacetic acid, s-naphthoxyacetic acid, 4-oxyphenyl-a - thiopropionic acid, phenylserine,
Benzyl sulfonic acid and 4-oxycinnamic acid.
It has also been found that the precursor compounds can advantageously be added in the fermentation as a solution in a non-toxic organic solvent. In this way, it is possible to keep the amount of by-products produced during fermentation particularly low. The organic solvents used for the precursor compound are preferably esters, in particular ethyl acetate or amyl acetate, but also e.g. B.
Chloroform and methyl isobutyl ketone. The mixing ratio of precursor compound to organic solvent is expediently set in the range from 1: 1 to 1:20.
The present invention is also based on the object of preparing mixtures of penicillins, of which at least one component is an acid-stable penicillin, e.g. B. one of those penicillins, as defined in more detail in Austrian Patent No. 178,692, to make herzu in a simple and economical manner. Mixtures of penicillin salts, of which at least one salt is derived from an acid-stable penicillin lin, have e.g.
B. because of their synergistic effect gained importance.
It has now been found that such mixtures of penicillins or their salts can be obtained by the process according to the invention in a convenient, simple and economical manner by means of fermentation if at least part of the fermentation is carried out in the presence of at least two different precursor compounds, of which at least one is an acid halide of the formula II.
In this particular embodiment of the method according to the invention, precursor compounds for at least two penicillins are therefore present in one and the same fermentation tank. With such a management of the fermentation one obtains. Surprisingly, an increased overall yield of Pe nicillin, compared to the same fermentation approach, in which only a single precursor compound, be it, as previously usual, z.
B. in the form of an alcohol or an acid such as phenoxyethanol or phenoxyacetic acid, be it in the form of a reactive derivative of an acid such as α-methylphenoxyacetic acid chloride is added. In such a fermentation according to the invention, in which z.
B. two precursor compounds are added, these precursor compounds can be two reactive derivatives of different carboxylic acids, such as phenoxy acetic acid and α-methylphenoxyacetic acid, z. B. phenoxyacetic acid chloride and a-methylphenoxyacetic acid chloride be.
It is particularly expedient to work with the fermentation with simultaneous use of a precursor of the carboxylic acid type and a precursor of the reactive derivative of carboxylic acid type. The procedure here can be, for example, that at least one carboxylic acid, e.g.
B. phenoxyacetic acid, is added in insufficient amounts, that is, in an amount that does not utilize the full capacity of the fungus. In the further course of the fermentation can then continuously or intermittently we at least one reactive derivative of one of the added acid, such as phenoxyacetic acid, different carboxylic acid, such as an acid chloride, z. B. a methylphenoxyacetic acid chloride are added.
<I> Examples </I> To carry out the fermentation described in the examples, a stock nutrient solution of the following composition was used:
EMI0003.0064
0.0 <B> 1 </B> <SEP>% <SEP> FCS04 <SEP>. <SEP> 7 <SEP> H. <U> 0 </U>
<tb> 0.4 <SEP>% <SEP> HgP04
EMI0003.0065
0.025 <SEP>% <SEP> MnS04 <SEP>. <SEP> H20
<tb> 0.01 <SEP>% <SEP> caC12
<tb> 4.0 <SEP>% <SEP> lactose
<tb> 1.0 <SEP>% <SEP> glucose. The pH of the nutrient solution was adjusted to 6.0 with NaOH.
Before the inoculation, 1% of a 25% CaCOg suspension was added to the sterile nutrient solution.
<I> Example 1 </I> 90 ml stock nutrient solution 10 ml brewer's yeast autolysate (with 20 g nitrogen / liter) 0.1 vol:% a-phenoxypropionic acid chloride (total amount) added from the 72nd hour at intervals of 12 hours 1% Spore inoculum of the Penicillium chrysogenum strain 351.
Fermentation vessel: 21 Erlenmeyer flasks on a rotary shaker with 240 revolutions per minute (rpm) and 30 mm stroke.
Fermentation time: 168 hours. Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (plate test against Staphylococcus aureus SG 511): 3200 units per ml (U / ml).
In the comparison flask, no α-phenoxypropionic acid chloride was added; After the fermentation had ended, the mycelium was separated from an aliquot; the culture fluid obtained was acylated in the presence of sodium bicarbonate with excess phenoxypropionic acid chloride, where only 2900 U / ml penicillin were found using the same test method.
<I> Example 2 </I> 4750 ml stock nutrient solution 250 ml corn tea pliquor (with 40 g nitrogen / liter) 0.15 vol:% a-phenoxypropionic acid chloride (total amount) from the 36th
5% mycelial vaccine of the strain Penicillium chrysogenum 351 added at intervals of 4 hours.
Fermentation vessel: 101 stainless steel fermenter, vortex system, 800 rpm, 90 mm disc stirrer.
Fermentation time: 108 hours. Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 1750 U / ml.
For work-up, the fermentation liquid was filtered, resulting in a liquid volume of 4.21. This culture filtrate was extracted with 1.5 l of butyl acetate at a pH of 2.0 and the penicillin was extracted from the butyl acetate phase with buffer pH 7,
0 back extracted. After again transferring to 50 ml of butyl acetate, a solution was obtained with a penicillin content of 119,000 U / ml. The penicillin was precipitated by adding potassium acetate dissolved in methanol. Yield: 3.3 g of a-phenoxyethylpenicillin potassium salt, 1480 U / mg (iodometric test).
The precipitated potassium salt showed an activity decrease of 10% after standing for one hour at pH 2.
In the comparison fermenter, fermentation was carried out without adding α-phenoxypropionic acid chloride; After the fermentation had ended, the mycelium was filtered off from an aliquot; the filtrate was acylated in the presence of sodium bicarbonate with excess phenoxypropionic acid chloride, only 1500 U / ml penicillin being determined by the same test method.
<I> Example 3 </I> 4250 ml stock nutrient solution 750 ml brewer's yeast autolysate (with 15 g nitrogen / liter) 0.12 vol.% A-phenoxypropionic acid chloride (total amount)
7% mycelium inoculum of the strain Penicillium chrysogenum 1014 was added continuously from the start of the fermentation.
Fermentation vessel: 101 Nitrosta fermenter, Vortex system, 800 rpm, 90 mm disc stirrer.
Fermentation time: 96 hours. Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 2000 U / ml.
For work-up, the culture solution was filtered and the filtrate was acidified to pH 2.5 to inactivate the natural penicillins and left to stand for 1 hour at room temperature. After this time the penicillin content of the solution was 1700 U / ml. 4 liters of this pretreated culture filtrate were now extracted with 2 liters of butyl acetate. The penicillin was transferred from the butyl acetate phase into the aqueous phase with 500 ml of bicarbonate solution.
After acidification to pH 2, this bicarbonate solution was extracted with 70 ml of butyl acetate. The penicillin was precipitated from the butyl acetate phase with a 0.5 molar solution of potassium acetate in butanol. 3.34 g of a-phenoxyethylpenicillin potassium salt (1470 U / mg) were obtained (iodometric test).
To identify the penicillin, 1 g of the potassium salt obtained was hydrolyzed with 5 molar hydrochloric acid. The precipitated a-phenoxypropionic acid had a melting point of 116 to 117 C;
when a mixture of the precipitated product melted with synthetic α-phenoxypropionic acid (mixed melting point), there was no depression.
In the comparison fermenter, fermentation was carried out without adding α-phenoxypropionic acid chloride; After the fermentation had ended, the mycelium was separated from an aliquot of the fermentation liquid, whereupon acylation was carried out in the presence of sodium bicarbonate with excess phenoxypropionic acid chloride; using the same test method, only 1500 U / ml penicillin were found.
<I> Example 4 </I> 4950 ml stock nutrient solution 150 g peanut press cake (with 7% nitrogen) 0.2% by volume a-phenoxypropionic acid chloride (total amount) from the 24th
Added hour at intervals of 12 hours, the amount added for the last two injections is 0.05 vol. -1 / o 5% mycelium inoculum of the Penicillium chrysogenum strain 347.
Fermentation vessel: 101 stainless steel fermenter, vortex system, 650 rpm, 90 mm disc stirrer.
Fermentation time: 90 hours. Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 1650 U / ml.
The fermentation solution was filtered off, a liquid volume of 4.1 liters being obtained. The penicillin was extracted therefrom with 11 methyl isobutyl ketone at pH 2.0;
the penicillin was then transferred to a buffer solution with a pH of 7.2. The penicillin was back-extracted from the buffer solution with 40 ml of butyl acetate, a solution with 120,000 U / ml being obtained from which the penicillin was deposited as the potassium salt with a 0.7 molar potassium acetate solution in ethanol.
2.86 g of a-phenoxyethylpenicillin potassium salt with an iodometrically tested milligram activity of 1450 units were isolated.
In the comparison fermenter, fermentation was carried out without adding α-phenoxypropionic acid chloride; after the fermentation had ended, the mycelium was separated from an aliquot of the fermentation liquid;
acylation was then carried out in the presence of sodium bicarbonate with excess phenoxypropionic acid chloride, only 1350 U / ml penicillin being determined using the same test method.
<I> Example 5 </I> 9001 Stock nutrient solution 1001 Yeast autolysate (with 20 g nitrogen / liter) 0.1 vol. -11/9 α-phenoxypropionic acid chloride (total amount) added from the 48th hour at intervals of 12 hours 10% Mycelium inoculum of the Penicillium chrysogenum strain 1014 0.2% sperm oil.
Fermentation vessel: 15001 stainless steel fermenter, baffle system, 450 rpm, 0.6 liters of air per liter of nutrient solution per minute.
Fermentation time: 96 hours. Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 2200 U / ml.
For further processing, the crude solution was filtered and the obtained 9001 liquid was extracted in 5 stages in the usual way. After the 5th extraction stage fell. 17.61 butyl acetate phase with 90,000 U / ml. It was precipitated with 2.5 molar potassium acetate solution in methanol, 805 g of potassium a-phenoxYäthylpenicillinsalz.niit an activity (iodometric test) of 1470 U / mg were obtained.
After incubation for 1 hour at pH 2 and room temperature, the potassium salt still had 90% of the original activity.
In the comparison fermenter, fermentation was carried out without adding α-phenoxypropionic acid chloride; after the fermentation had ended, the mycelium was separated from an aliquot; the fluid freed from the mycelium was acylated in the presence of sodium bicarbonate with excess phenoxypropionic acid chloride, only 1650 U / ml penicillin being determined using the same test method.
<I> Example 6 </I> 90 ml stock nutrient solution 10 ml brewer's yeast autolysate (with 20 g nitrogen / liter) 0.15% phenoxyacetic acid chloride (total amount) added at intervals of 12 hours from the 24th hour 1% spore inoculum of Penicillium chrysogenum Tribal 351.
Fermentation vessel: 21 Erlenmeyer flasks on a rotary shaker with 240 rpm and 30 mm stroke. Fermentation time: 170 hours.
Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (plate test against Staphylococcus aureus SG 511): 4600 U / ml. <I> Example 7 </I> 95 ml stock nutrient solution 5 ml corn tea pliquor (with 40 g nitrogen / 0.12% a-ethylphenoxyacetic acid chloride (total amount) from the 48th
2% spore inoculum of Penicillium chrysogenum strain 351 was added at intervals of 12 hours.
Fermentation vessel: 21 Erlenmeyer flasks on a rotary shaker with 260 rpm and 20 mm stroke. Fermentation time: 166 hours.
Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (plate test against Staphylococcus aureus SG 511): 2200 U / ml.
<I> Example 8 </I> 4250 ml stock nutrient solution 750 ml brewer's yeast autolysate (with 15 g nitrogen / l) 0.14% a-dimethylphenoxyacetic acid chloride (total amount) from the 36th hour at intervals of 6 hours added 5% mycelium vaccine Tribe 351. Fermentation vessel: 101 stainless steel fermenter, vortex system, 800 rpm, 90 mm disc stirrer.
Fermentation time: 96 hours. Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 2000 U / ml. <I> Example 9 - </I> 4950 ml stock nutrient solution 150 g peanut press cake (with 7% nitrogen) 0.16 0/0 o4 cresoxyacetic acid chloride (total amount)
from the start of fermentation, 10% mycelial inoculum of Penicillium chrysogenum strain 347 is continuously added.
Fermentation vessel: 101 stainless steel fermenter, vortex system, 900 rpm, 70 mm disc stirrer.
Fermentation time: 100 hours. Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 1850 U / ml. <I> Example<B>10</B> </I> 4750 ml stock nutrient solution 250 ml corn tea pliquor (with 40 g nitrogen / 1) 0.10 0/0 o-methoxyphenoxyacetic acid chloride (total amount) from the 48th hour at intervals 7% mycelial inoculum of Penicillium chrysogenum strain 1014 added over a period of 4 hours.
Fermentation vessel: 101 stainless steel fermenter, vortex system, 800 rpm, 80 mm disc stirrer.
Fermentation time: 90 hours. Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 2800 U / ml.
<I> Example 11 </I> 4500 ml stock nutrient solution 500m1 brewer's yeast autolysate (with 20g nitrogen / l) 0.12% o-chlorophenoxyacetic acid chloride (total amount) from the 24th hour at intervals of 12 hours added 15% mycelium inoculum of Penicillium chrysogenum - tribal 1014.
Fermentation vessel: 101 stainless steel fermenter, vortex system, 700 rpm, 90 mm disc stirrer.
Fermentation time: 108 hours. Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 1900 U / ml. <I> Example 12 </I> 4500 ml stock nutrient solution 500 ml brewer's yeast autolysate (with 18 g nitrogen / 0.15% o-nitrophenoxyacetic acid chloride (total amount) added at intervals of hours from the 36th hour 10% mycelial inoculum of Penicillium chrysogenum - tribal 1014.
Fermentation vessel: 101 stainless steel fermenter, vortex system, 900 rpm, 70 mm disc stirrer.
Fermentation time: 96 hours. Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 2100 U / ml. <I> Example 13 </I> 161 Stock nutrient solution 500 g peanut press cake (with 7% nitrogen) 0.13% isopropylideneamineoxyacetic acid chloride
EMI0006.0010
(Total amount) from the 48th
5% mycelium inoculum of strain 347 0.1% sperm oil added at 12 hour intervals.
Fermentation vessel: 201 stainless steel fermenter, baffle system, 400 rpm, 0.51 air / 1 nutrient solution / min. Fermentation time: 90 hours.
Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 1600 U / ml.
<I> Example 14 </I> 14.31 stock nutrient solution 700 ml cornsteel liquor (with 45 g nitrogen / l) 0.15.0, 'o p-cresoxyacetic acid chloride (total amount) added at intervals of 6 hours from the 48th hour 10% mycelium inoculum of the Penicillium chrysogenum strain 1014 0.2% sperm oil.
Fermentation vessel: 201 stainless steel fermenter, baffle system, 350 rpm, 0.71 air / 1 nutrient solution / min. Fermentation time: 96 hours.
Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 3600 U / ml.
<I> Example 15 </I> 151 Stock nutrient solution 1500 ml of brewer's yeast autolysate (with 22 g nitrogen / 0.16% phenyl mercaptoacetic acid chloride (total amount) from the start of fermentation added continuously from the start of fermentation 7% mycelium inoculum of strain 1014 0.3% sperm oil.
Fermentation vessel: 201 stainless steel fermenter, baffle system, 450 rpm, 0.61 air / 1 nutrient solution / min. Fermentation time: 96 hours.
Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 4000 U / ml.
<I> Example 16 </I> 900l stock nutrient solution l001 brewer's yeast autolysate (with 20 g nitrogen / 1) 0.2% phenylacetic acid chloride (total amount) from the 24th
Hour at intervals of 12 hours added 10% mycelium inoculum of the Penicillium chrysogenum strain 351 0.2% sperm oil Fermentation vessel: 15001 stainless steel fermenter, baffle system, 400 rpm, 0.61 air / 1 nutrient solution / min.
Proofing time: <B> 100 </B> hours. Fermentation temperature: 24 C. Achieved penicillin content (iodometric test): 4500 U / ml.
<I> Example 17 </I> 7501 Stock nutrient solution 1501 Pressed yeast autolysate (with 15 g nitrogen / 0.18% n-butoxyacetic acid chloride (total amount) from the 48th hour at intervals of 6 hours added 7% mycelium inoculum of the Penicillium chrysogenum strain 1014 0.3% sperm oil.
Fermentation vessel: 15001 stainless steel fermenter, baffle system, 400 rpm, 0.51 air / 1 nutrient solution / min.
Fermentation time: 96 hours. Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 3800 U / ml.
<I> Example 18 </I> 1800 liters of stock solution 200 liters of yeast autolysate (with 20 g nitrogen / 0.15% by volume a-phenoxypropionic acid chloride (total amount) dissolved in four times the volume amount of ethyl acetate, added from the 48.
Hour at intervals of 12 hours 10% mycelium inoculum of the Penicillium chrysogenum strain 1014 0.2% sperm oil.
Fermentation vessel: 3000 liters mild steel, baffle system, 400 rpm, 0.751 air / 1 nutrient solution / min. Fermentation time: 90 hours.
Fermentation temperature: 25 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 2500 U / ml.
Further work-up is carried out as in Example 5. Example 19 9501 Stock nutrient solution 501 Cornsteepliquor (with 40 g nitrogen / l) 0.22% phenyl mercaptoacetic acid chloride (total amount) from the 36th
5% mycelium inoculum of the Penicillium chrysogenum strain 351 0.25% sperm oil was added at 12 hour intervals.
Fermentation vessel: 15001 stainless steel fermenter, baffle system, 450 rpm, 0.51 air / 1 nutrient solution / min.
Fermentation time: 104 hours. Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 4000 U / ml.
<I> Example 20 </I> <B> 9001 </B> Stock nutrient solution 1001 Brewer's yeast autolysate (with 20 g nitrogen / l) 0.18% a-methylphenylacetic acid chloride (total amount) from the 12th
7.5% mycelium inoculum of the Penicillium chrysogenum strain 1014 0.3% sperm oil was added at 10 hour intervals.
Fermentation vessel: 15001 stainless steel fermenter, baffle system, 350 rpm, 0.71 air / 1 nutrient solution / min. Fermentation time: 115 hours.
Fermentation temperature: 27 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 3500 U / ml.
<I> Example 21 </I> 1000 liters stock nutrient solution 200 liters press yeast autolysate (with 16 g nitrogen / 1) 0.25% cyclohexyl acetic acid chloride (total amount) from the 30th hour at intervals of 8 hours added 10% mycelium inoculum of the Penicillium chrysogenum strain 1014 0.4% sperm oil.
Fermentation vessel: 15001 stainless steel fermenter, baffle system, 300 rpm, 0.81 air / 1 nutrient solution / min.
Fermentation time: 90 hours. Fermentation temperature: 26 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 3200 U / ml.
<I> Example 22 </I> (mixed fermentation) 18001 stock nutrient solution 2501 brewer's yeast autolysate (with 20 g nitrogen / 0.065% sodium phenoxyacetate (sterilized together with the nutrient solution) 0.18% a-methylphenoxyacetic acid chloride (total amount) from the 48th
10% mycelium inoculum of the Penicillium chrysogenum strain 1014 0.25% sperm oil was added at intervals of 12 hours.
Fermentation vessel: 25001 stainless steel fermenter, baffle system, 300 rpm, 1.01 air / 1 nutrient solution / min. Fermentation time: 105 hours.
Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 4000 U / ml.
Of the total amount of penicillin determined of 4000 U / ml, as was determined analytically, phenoxymethylpenicillin accounted for 2,400 U / ml and α-methylphenoxymethylpenicillin 1,600 U / ml.
Simultaneously with the above approach, two fermentations were carried out under the same conditions, in which case the 0.065% sodium phenoxyacetate was omitted, while in the second case the 0.18% α-methylphenoxyacetic acid chloride was omitted.
1800 U / ml of α-methylphenoxymethylpenicillin were obtained in the first fermentation batch, while a yield of 5000 U / ml phenoxymethylpenicillin could be achieved in the second batch.
The total yield of two batches using the method of Example 22 is thus 8000 U / ml, while separate batches for the production of phenoxymethylpenicillin on the one hand and α-methylphenoxymethylpenicillin on the other hand under the same fermentation conditions 5000 U / ml and 1800 U / ml, respectively i.e. 6800 U / ml.
The fermentation using two precursor compounds in one fermentation batch thus leads to a yield increase of 1200 U / ml per two batches.