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Verfahren zur Herstellung von as Methylphenoxymethylpenicillin durch Fermentation Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ct-Methylphenoxymethylpenicillin der Formel
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dem Precursor, jedoch vorteilhaft an einer von der Stelle der Precursorzufuhr verschiedenen Stelle, zugesetzt werden. Die Zufuhr der neutralisierend wirkenden Stoffe erfolgt in der Regel in Abhängigkeit von der Zufuhr an Precursor.
Vorzugsweise wird während des Precursorzusatzes in der Fermentationslösung ein PH-Wert im physiologischen Bereich, insbesondere ein PH zwischen 6,5 und 7,5 eingeregelt. In einzelnen Fällen kommt es während der Fermentation zu einem Abbau der im Überschuss zugesetzten Precursorverbindung, was einen weiteren Vorteil bei der nachfolgenden Extraktion darstellt.
Die beim erfindungsgemässen Verfahren als Precursor verwendeten Säurehalogenide enthalten ein asymmetrisches C-Atom und können daher in verschiedenen isomeren Formen verwendet werden ; meist wird das Racemat zur Acylierugn verwendet, in welchem Falle man dann das entsprechende DL-Penicillin bzw. die beiden diastereoisomeren Penicilline, erhält. Als Puffersubstanzen haben sich Natriumbicarbonat oder Phosphatgemische besonders zweckmässig erwiesen, während als neutralisierend wirkende Stoffe unter anderem Lösungen von Alkalihydroxyden, insbesondere Natriumhydroxyd, in Frage kommen.
Die als Precursors im Sinne der Erfindung angewendeten Säurehalogenide führen zu günstigen Ausbeuten an Penicillin. Sie zeichnen sich ferner durch eine selektive Wirksamkeit gegen Bakterien aus ; eine Hemmung des Wachstums des Pilzes erfolgt bei den angewendeten Konzentrationen noch nicht. So unterdrückt z. B. ein im Laufe der Fermentation erfolgender Zusatz von. 0,3% α-Methyl-phenyoxyessigsäurechlorid das Wachstum der für die submerse Penicillinproduktion so gefährlichen Penicillinase bildenden Fremdkeime.
Das erfindungsgemäss erhaltene Penicillin zeichret sich durch seine Säurestabilität sowie durch seine Depotwirkung aus und ist insbesondere auch für die Oraltherapie geeignet.
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1 :0, 025% MnSO4. tLO 0,01 % CaCl 3,0 % Laktose 1, 0 % Glukose
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mitphenoxyessigsäurechlorid zugesetzt.
Beispiele 2-6 : Für dieFermentationgemäss den Beispielen 2-6 wurde eine Stammnährlösung folgender Zusammensetzung verwendet :
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0,01 % CaCL ;
4,0 % Laktose
1,0 % Glukose
Das PH der Nährlösung wurde mit NaOH auf 6,0 eingestellt. Vor der Beimpfung wurde der sterilen Nährlösung 1% einer 25%igen CaCO3-Suspension zugefügt.
Beispiel 2 :
90 ml Stammnährlösung,
10 ml Bierhefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/l),
0, 1 vol.-% α-Phenoxypropionsäurechlorid (Gesamtmenge) ab der 72. h in 12 h
Intervallen zugesetzt,
1% Sporenimpfgut des Pen. chrys. -Stammes 351.
Gärgefäss : 2 l Erlenmeyerkolben auf Rundschüttelmaschine mit 240 Umdr/min und 30 mm Hub, Gärzeit : 168 h, Gärtemperatur : 24oC.
Erreichter Penicillingehalt (Plattentest gegen Staphylococcus aureus SG 511) : 3200 E/ml.
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Im Vergleichskolben wurde ohne Zusatz von α-Phenoxypropionsäurechlorid gearbeitet: nach Beendi- gung der Fermentation wurde ein aliquoter Teil nach Abtrennung vom Mycel in Gegenwart von Natrium- bicarbonat mit überschüssigem Phenoxypropionsäurechlorid acyliert, wobei nach der gleichen Testmetho- de nur 2 900 E/ml Penicillin festgestellt wurden. i Beispiel 3 : 4750 ml Stammnährlösung,
250 ml Cornsteepliquor (mit 40 g sTICKSTOFF/L), 0,15 Vol.-% α-Phenoxypropionsäurecholorid (Gesamtmenge) ab der 36. h in 4 h
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90 mm Scheibenrührer, Gärzeit : 108 h, Gärtemperatur : 240C ; i Erreichter Penicillingehalt (Jodometrischer Test) : 1750 E/ml.
Zur Aufarbeitung wurde die Fermentationsflüssigkeit filtriert, wobei ein FlUssigkeitsvolumen von
4, 2 l anfiel. Dieses Kulturfiltrat wurde mit 1, 5 l Butylacetat bei einem PH-Wert von 2,0 extrahiert und das Penicillin aus der Butylacetatphase mit Puffer PH 7,0 rückextrahiert. Nach erneutem Überführen in
50 ml Butylacetat erhielt man eine Lösung mit einem Penicillingehalt von 119 000 E/ml. Das Penicillin wurde durch Zusatz von in Methanol gelöstem Kaliumacetat ausgefällt.
Ausbeute : 3, 3 g < x-Phenoxyäthylpenicillin-Kaliumsalz a 1480 E/mg (Jodometrischer Test).
Das ausgeschiedene Kaliumsalz zeigte nach einstündigem Stehen bei PH 2 eine Aktivitätsabnahme von lolo.
Im Vergleichsfermenter wurde ohne Zugabe von ct-Phenoxypropionsäurechlorid fermentiert ; nach Be- endigung der Fermentation wurde ein aliquoter Teil nach Abtrennung vom Mycel in Gegenwart von Na- triumbicarbonat mit überschüssigem Phenoxypropionsäurechlorid acyliert, wobei nach der gleichen Test- methode nur 1500 E/ml Penicillin festgestellt wurden.
Beispiel 4 :
4250 ml Stammnährlösung,
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Fermentation an kontinuierlich zugesetzt, 7% Mycelimpfgut des Stammes Pen. chrysog. 1014.
Gärgefäss : 10 1 Nirostafermenter, Vortex System, 800 Umdr/min,
90 mm Scheibenrührer, Gärzeit : 96 h, Gärtemperatur : 24oC.
Erreichter Penicillingehalt (Jodometrischer Test) : 2 000 E/ml.
Zur Aufarbeitung wurde die Kulturlösung filtriert und das Filtrat zur Inaktivierung der natürlichen Penicilline auf PH 2,5 angesäuert und 1 h bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach dieser Zeit betrug der Penicillingehalt der Lösung 1700 E/ml. 4 l dieses so vorbehandelten Kulturfiltrates wurden nun mit 2 l Butylacetat extrahiert. Aus der Butylacetatphase wurde das Penicillin mit 500 ml Bicarbonatlösung in die wässerige Phase überführt. Diese Bicarbonatlösung wurde nach Ansäuerung auf PH 2 mit 70 ml Butylacetat extrahiert. Aus der Butylacetatphase wurde das Penicillin mit einer 0,5-molaren Lösung von Kaliumacetat inButanol ausgefällt. Es wurden 3,34g α-Phenoxyäthylpenicillin-Kaliumsalz a 1470 E/mg erhalten (Jodometrischer Test).
Zur Identifizierung des Penicillins wurde 1 g mit 5-molarer Salzsäure hydrolysiert. Die ausgeschiedene α-Phenoxypropionsäure wies einen Schmelzpunkt von 116 bis 1170C auf und zeigte im MischSchmelzpunkt mit synthetischem Material keine Depression.
Im Vergleichsfermenter wurde ohne Zugabe von α-Phenoxypropionsäurechlorid fermentiert; nach Beendigung der Fermentation wurde ein aliquoter Teil nach Abtrennung vom Mycel in Gegenwart von Natriumbicarbonat mit überschüssigem Phenoxypropionsäurechlorid acyliert, wobei nach der gleichen Testmethode nur 1500 E/ml Penicillin festgestellt wurden.
Beispiel 5 : 4950 ml Stammnährlösung,
150 g Erdnusspresskuchen (mit 7% Stickstoff),
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letzten Einspritzungen je 0, 05 Vol.-% beträgt,
5% Mycelimpfgut des Pen. chrysog.-Stammes 347.
! Gärgefäss : 10 l Nirostafermenter, Vortex System, 650 Umdr/min,
90 mm Scheibenrührer, Gärzeit : 90 h,
Gärtemperatur : 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (Jodometrischer Test) : 1650 E/ml.
Die Fermentationslösung wurde abfiltriert, wobei ein Flüssigkeitsvolumen von 4, 11 erhalten wurde.
Daraus wurde das Penicillin mit 11 Methylisobutylketon bei PH 2,0 extrahiert ; sodann wurde das Penicillin in eine Pufferlösung überführt. Aus der Pufferlösung wurde das Penicillin mit 40 ml Butylacetat rückextra- hiert, wobei eine Lösung mit 120 000 E/ml erhalten wurde, aus der das Penicillin mit einer 0, 7-moiaren
Kaliumacetatlösung in Äthanol als Kaliumsalz abgeschieden wurde. Es wurden 2, 86 g et-Phenoxyäthyl- penicillin-Kaliumsalz mit einer jodometrisch getesteten Milligrammaktivität von 1450 Einheiten isoliert.
ImVergleichsfermenter wurde ohne Zugabe von α-Phenoxypropionsäurechlorid fermentiert; nach Be- endigung der Fermentation wurde ein aliquoter Teil nach Abtrennung vom Mycel in Gegenwart von Na- triumbicarbonat mit überschüssigem Phenoxypropionsäurechlorid acyliert, wobei nach der gleichen Test- methode nur 1350 E/ml Penicillin festgestellt wurden.
Beispiel 6 :
900 1 Stammnährlösung.. "
100 l Hefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/l), 0.1 Vol.-% α-Phenoxypropionsäurechlorid (Gesammenge) ab der 48. h in 12 h
Intervallen zugesetzt, 100/0 Mycelimpfgut des Pen. chrysog.-Stammes 1014, 0, 2% Spermöl.
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: 1500 l Nirostafermenter,Gärzeit : 96 h,
Gärtemperatur :24 C.
Erreichter Penicillingehalt (Jodometrischer Test) : 2200 E/ml.
Zur weiteren Verarbeitung wurde die Rohlösung filtriert und die erhaltenen 900 1 Flüssigkeit in 5 Stufen in üblicher Weise extrahiert. Nach der 5. Extraktionsstufe fielen 17, 6 1 Butylacetatphase mit 90000 E/ml an. Es wurde mit 2, 5-molarer Kaliumacetatlösung in Methanol gefällt, wobei 805 g Kalium- - α-phenoxyäthylenpenteillinsalz mit einer Aktivität (Jodometrischer Test) von 1470 E/mg erhalten wur- den. Das Kaliumsalz wies nach einstündiger Inkubation bei PH 2 und Zimmertemperatur noch 90% der ursprünglichen Aktivität auf.
ImVergleichsfermenter wurde ohne Zugabe von α-Phenoxypropionsäurechlorid fermentiert; nach Be- endigung der Fermentation wurde ein. aliquoter Teil nach Abtrennung vom Mycel in Gegenwart von Natriumbicarbonat mit überschüssigem Phenoxypropionsäurechlorid acyliert, wobei nach der gleichen Testmethode nur 1650 E/ml Penicillin festgestellt wurden..
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von α-Methylphenxymethylpenicillin durch Fermentation, dadurch gekennzeichnet, dass man während der Fermentation ein a-Methylphenoxyessigsäurehalogenid zusetzt und das gebildete säurestabile Penicillin in Form der freien Säure oder als Salz gewinnt.
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Process for the production of α-methylphenoxymethylpenicillin by fermentation The invention relates to a process for the production of ct-methylphenoxymethylpenicillin of the formula
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be added to the precursor, but advantageously at a point different from the point at which the precursor is fed. The supply of the neutralizing substances is usually dependent on the supply of precursor.
A pH value in the physiological range, in particular a pH between 6.5 and 7.5, is preferably set in the fermentation solution during the addition of the precursor. In individual cases, the precursor compound added in excess decomposes during fermentation, which is a further advantage in the subsequent extraction.
The acid halides used as precursors in the process according to the invention contain an asymmetric carbon atom and can therefore be used in various isomeric forms; mostly the racemate is used for acylation, in which case the corresponding DL-penicillin or the two diastereoisomeric penicillins are obtained. Sodium bicarbonate or phosphate mixtures have proven to be particularly useful as buffer substances, while solutions of alkali hydroxides, in particular sodium hydroxide, can be used as neutralizing substances.
The acid halides used as precursors for the purposes of the invention lead to favorable yields of penicillin. They are also characterized by a selective activity against bacteria; the growth of the fungus is not yet inhibited at the concentrations used. So suppressed z. B. an addition of in the course of the fermentation. 0.3% α-methyl-phenoxyacetic acid chloride prevents the growth of the foreign germs which form penicillinase, which are so dangerous for submerged penicillin production.
The penicillin obtained according to the invention is distinguished by its acid stability and by its depot effect and is also particularly suitable for oral therapy.
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1: 0.025% MnSO4. tLO 0.01% CaCl 3.0% lactose 1, 0% glucose
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with phenoxyacetic acid chloride added.
Examples 2-6: For the fermentation according to Examples 2-6, a stock nutrient solution of the following composition was used:
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0.01% CaCl;
4.0% lactose
1.0% glucose
The pH of the nutrient solution was adjusted to 6.0 with NaOH. Before inoculation, 1% of a 25% CaCO3 suspension was added to the sterile nutrient solution.
Example 2:
90 ml stock nutrient solution,
10 ml brewer's yeast autolysate (with 20 g nitrogen / l),
0.1% by volume of α-phenoxypropionic acid chloride (total amount) from the 72nd hour in 12 hours
Intervals added,
1% spore inoculum of the pen. Chrys. Tribe 351.
Fermentation vessel: 2 l Erlenmeyer flask on a rotary shaker with 240 rev / min and 30 mm stroke, fermentation time: 168 h, fermentation temperature: 24oC.
Achieved penicillin content (plate test against Staphylococcus aureus SG 511): 3200 U / ml.
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In the comparison flask, no α-phenoxypropionic acid chloride was added: after the fermentation had ended, an aliquot was acylated after separation from the mycelium in the presence of sodium bicarbonate with excess phenoxypropionic acid chloride, with only 2900 U / ml using the same test method Penicillin were detected. i Example 3: 4750 ml stock nutrient solution,
250 ml corn tea pliquor (with 40 g NITROGEN / L), 0.15% by volume of α-phenoxypropionic acid chloride (total amount) from the 36th hour in 4 hours
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90 mm disc stirrer, fermentation time: 108 h, fermentation temperature: 240C; i Achieved penicillin content (iodometric test): 1750 U / ml.
For work-up, the fermentation liquid was filtered, whereby a liquid volume of
4, 2 liters. This culture filtrate was extracted with 1.5 l of butyl acetate at a pH of 2.0 and the penicillin was back-extracted from the butyl acetate phase with pH 7.0 buffer. After transferring again to
50 ml of butyl acetate gave a solution with a penicillin content of 119,000 U / ml. The penicillin was precipitated by adding potassium acetate dissolved in methanol.
Yield: 3.3 g <x-phenoxyethylpenicillin potassium salt a 1480 U / mg (iodometric test).
After standing for one hour at pH 2, the precipitated potassium salt showed a decrease in activity of lolo.
In the comparison fermenter, fermentation was carried out without adding ct-phenoxypropionic acid chloride; After the fermentation had ended, after separation from the mycelium, an aliquot was acylated in the presence of sodium bicarbonate with excess phenoxypropionic acid chloride, only 1500 U / ml penicillin being determined using the same test method.
Example 4:
4250 ml stock nutrient solution,
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Fermentation on continuously added, 7% mycelium inoculum of the strain Pen. Chrysog. 1014.
Fermentation vessel: 10 1 stainless steel fermenter, vortex system, 800 rev / min,
90 mm disc stirrer, fermentation time: 96 h, fermentation temperature: 24oC.
Achieved penicillin content (iodometric test): 2,000 U / ml.
For work-up, the culture solution was filtered and the filtrate was acidified to pH 2.5 to inactivate the natural penicillins and left to stand for 1 h at room temperature. After this time the penicillin content of the solution was 1700 U / ml. 4 l of this pretreated culture filtrate were then extracted with 2 l of butyl acetate. The penicillin was transferred from the butyl acetate phase into the aqueous phase with 500 ml of bicarbonate solution. After acidification to pH 2, this bicarbonate solution was extracted with 70 ml of butyl acetate. The penicillin was precipitated from the butyl acetate phase with a 0.5 molar solution of potassium acetate in butanol. 3.34 g of α-phenoxyethylpenicillin potassium salt a 1470 U / mg were obtained (iodometric test).
To identify the penicillin, 1 g was hydrolyzed with 5 molar hydrochloric acid. The precipitated α-phenoxypropionic acid had a melting point of 116 to 1170C and showed no depression at the mixed melting point with synthetic material.
In the comparative fermenter, fermentation was carried out without adding α-phenoxypropionic acid chloride; After completion of the fermentation, an aliquot part was acylated after separation from the mycelium in the presence of sodium bicarbonate with excess phenoxypropionic acid chloride, only 1500 U / ml penicillin being determined by the same test method.
Example 5: 4950 ml stock nutrient solution,
150 g peanut press cake (with 7% nitrogen),
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last injections is 0.05% by volume,
5% mycelium inoculum of the Pen. Chrysog. Strain 347.
! Fermentation vessel: 10 l stainless steel fermenter, vortex system, 650 rev / min,
90 mm disc stirrer, fermentation time: 90 h,
Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 1650 U / ml.
The fermentation broth was filtered off, a liquid volume of 4.11 being obtained.
The penicillin was extracted therefrom with 11 methyl isobutyl ketone at pH 2.0; then the penicillin was transferred to a buffer solution. The penicillin was back-extracted from the buffer solution with 40 ml of butyl acetate, a solution with 120,000 U / ml being obtained from which the penicillin with a 0.7 molar
Potassium acetate solution in ethanol was deposited as the potassium salt. 2.86 g of et-phenoxyethyl penicillin potassium salt with an iodometrically tested milligram activity of 1450 units were isolated.
Fermentation was carried out in the comparative fermenter without adding α-phenoxypropionic acid chloride; after the end of the fermentation, an aliquot part was acylated after separation from the mycelium in the presence of sodium bicarbonate with excess phenoxypropionic acid chloride, only 1350 U / ml penicillin being determined using the same test method.
Example 6:
900 1 stock nutrient solution .. "
100 l of yeast autolysate (with 20 g nitrogen / l), 0.1% by volume of α-phenoxypropionic acid chloride (total) from the 48th hour in 12 hours
Added at intervals, 100/0 mycelium inoculum of Pen. Chrysog. Strain 1014, 0.2% sperm oil.
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: 1500 l stainless steel fermenter, fermentation time: 96 h,
Fermentation temperature: 24 C.
Achieved penicillin content (iodometric test): 2200 U / ml.
For further processing, the crude solution was filtered and the 900 l liquid obtained was extracted in 5 stages in the usual way. After the 5th extraction stage, 17.6 l of butyl acetate phase with 90,000 U / ml were obtained. It was precipitated with 2.5 molar potassium acetate solution in methanol, 805 g of potassium-α-phenoxyethylene penteillin salt having an activity (iodometric test) of 1470 U / mg being obtained. After one hour of incubation at pH 2 and room temperature, the potassium salt still had 90% of its original activity.
Fermentation was carried out in the comparative fermenter without adding α-phenoxypropionic acid chloride; after completion of the fermentation a. aliquot after separation from the mycelium acylated with excess phenoxypropionic acid chloride in the presence of sodium bicarbonate, whereby only 1650 U / ml penicillin were determined by the same test method.
PATENT CLAIMS:
1. A process for the production of α-methylphenxymethylpenicillin by fermentation, characterized in that an α-methylphenoxyacetic acid halide is added during the fermentation and the acid-stable penicillin formed is recovered in the form of the free acid or as a salt.