CH395969A - Procédé d'obtention de dérivés des colchicines et thiocolchicines - Google Patents

Description

  
 



   La présente invention a pour objet un procédé de préparation de dérivés déméthylés de la série de la colchicine ou de la série de la thiocolchicine à partir de composés de la série de la colchicine ou de la série de la thiocolchicine répondant à la formule   générale   
EMI1.1     
 dans laquelle   R1 =      H, -OH, -O-acyle, -O-alcoyle,      -O-aralcoyle, -O-hétérosyle; ;

   R, = H, ou alcoyle;      R3    = H, acyle, alcoyle,   hétérosyle;      R4    = -O-alcoyle, -S-alcoyle,
EMI1.2     


<tb> -S-alcoyle,
<tb> O
<tb> 
EMI1.3     
 qui peuvent être identiques ou différents, sont H, alcoyle ou   hydroxyalcoyle;    ce procédé est caractérisé en ce qu'on soumet les composés de la formule générale à l'action de micro-organismes choisis dans les familles des moisissures, bactéries et levures, laisse l'incubation se poursuivre et isole le dérivé formé.



   On peut par exemple employer la colchicine, la   colchicéine,    le colchicoside, la substance C (2-déméthyl-colchicine), la substance F (N-méthyldesacétylcolchicine) de SANTAVY, une tropaminone ou un thiodérivé correspondant, un   sulfoxyde    de thiocolchicines, ou un dérivé   N-désacétylé,    N-alcoylé ou Nacylé correspondant, on laisse l'incubation du microorganisme se poursuivre et isole le dérivé formé.



   Pour isoler le dérivé formé, il convient de soumettre le mélange réactionnel à une extraction par un solvant non miscible à l'eau. On peut chromatographier l'extrait avant de procéder à la cristallisation du dérivé recherché.



   Les substances nouvelles obtenues par la mise en oeuvre du procédé de l'invention se caractérisent par une amélioration notable de l'action pharmacodynamique, comparée à celle de la matière première de départ. Ainsi, l'action antimitotique est accentuée et la toxicité réduite, ceci permettant, en outre, leur utilisation industrielle en agriculture pour les modifications de la mitose et la création de polyploïdes soit par épandage de solutions aqueuses ou de suspensions des produits sur des sols cultivés, soit par traitement préalable des semences avec les produits purs ou dilués dans un solvant ou sur support.



   On savait déjà que certains micro-organismes sont capables de provoquer divers changements sur les molécules de certaines substances chimiques bien déterminées. Ainsi, en série stéroïde, on a mis au point plusieurs procédés conduisant à l'introduction de groupements hydroxylés ou encore à la création de doubles liaisons. Rien de tel n'avait encore été observé dans la série   colchicique.    Le procédé de la présente invention permet, pour la première fois, l'accès, de façon imprévisible, à des nouveaux composés d'un grand intérêt, dont la préparation semblait jusqu'à ce jour impossible.

   La synthèse chimique des colchicines n'ayant pas encore pu être réalisée, les modifications moléculaires des substances de cette famille étaient encore très réduites.
Procédé d'obtention de dérivés des   colehicines    et   tliiocolchicines     
 Pour préparer une culture bien évoluée d'un micro-organisme, appartenant de préférence au groupe des fungi, on peut procéder d'après G. SMITH: Industrialmycology. On utilise un micro-organisme sélectionné dans les classes des streptomyces, moisissures, bactéries et levures. On peut suivre l'évolution de l'action du micro-organisme sur le composé de départ à l'aide de la méthode chromatographique sur papier.

   On utilise de préférence une culture bien évoluée âgée de trente à soixante-douze heures et dont le   pH    est compris entre 3 et 8, l'incubation consécutive pouvant se poursuivre pendant vingt-quatre à quatre-vingt-dix heures.



   Au lieu d'utiliser directement la culture entière, on peut aussi filtrer le mycélium du micro-organisme cultivé, remettre le mycélium en suspension dans un tampon aqueux à   pH    5 à 8 et ajouter la colchicine ou la thiocolchicine, le reste des opérations étant mené comme ci-dessus.



   La titulaire a testé une série de micro-organismes qui se sont tous avérés capables d'effectuer les transformations moléculaires sur lesquelles repose le procédé de la présente invention. Parmi ces micro-organismes, on peut citer, à titre d'exemple:
 N  ATCC
 Saccharomyces ellipsoideus . 4097
 Streptomyces griseus . . . . . . 10137
 Fusarium roseum 10914
 Fusarium oxysporum 7601
 Fusarium javanicum . . . . . . 12575
 Fusarium gladioli ....... 11137
 Fusarium solani ....... 11712
 Curvularia lunata : ....... 12017
   Corynebacterium      simplex .......    6946
 Cunninghamella blakesleeana ....... 8688
 Aspergillus niger . . . . . . . 10548
 Streptococcus sp.



   Les exemples suivants montrent comment on peut réaliser la présente invention.



   Exemple 1
 Obtention d'une nouvelle substance tropolonique par intervention microbiologique sur la colchicine
 On introduit 850 mg de colchicine dans 4 litres d'une culture de Streptomyces griseus (ATCC 10137) âgée de quarante-huit heures. On laisse le mélange incuber pendant quarante-huit heures à la température ambiante. On extrait par 5 fois 400 cm3 de chloroforme, réunit les extraits, les sèche sur sulfate de magnésium et évapore à sec sous vide. On reprend le résidu dans 100 cm3 du mélange chloroforme-éther   (1: 2)    et chromatographie sur 100 g d'alumine selon Brockmann. La colchicine non transformée est éluée par le mélange chloroforme-éther   (1: 2),    tandis que le produit de transformation, plus fortement retenu sur la colonne, est élué à son tour par le mélange chloroforme-méthanol (99-1).



   Les fractions éluées sont rassemblées et évaporées à sec sous vide. On reprend le résidu en chloroforme-éther   (1: 2)    et obtient ainsi 160 mg de petits cristaux hexagonaux jaunes, F = 176-1780 C (fusion lente en tube),   [ai'5      =-1960    + 2(c = 1 %, méthanol).



   Le produit nouveau est soluble dans l'eau, l'alcool, l'acétone et le chloroforme.   I1    est insoluble en éther et en benzène. Les éluats chloroforme-éther   (1: 2)    fournissent quantitativement la colchicine de départ dont la molécule n'a pas été modifiée.



   La nouvelle substance obtenue selon le présent exemple offre les caractéristiques   suivantes   
Spectre ultraviolet:
   #    max = 237,5   mF    (log   E    = 4,47)
   #    max = 353   mF    (log   e    = 4,20)
 Le spectre infrarouge met en évidence un hydroxyble libre ; il différencie la substance nouvelle des autres colchicines connues.



   Analyse:
 Trouvé: C   55,70/0,    H   5, 1  /o,      C1      16, 20  /o,   
N 2,8    /o,    OMe 20,5    /o.   



   Ces valeurs analytiques correspondent à la formule brute   C21HO6N,    pour un produit solvaté renfermant 0,7 molécule de chloroforme de cristallisation.



   Action antimitotique de la nouvelle substance tropolonique obtenue par intervention microbiologique sur la colchicine.



   On prépare 1 cm3 d'une solution aqueuse à 1   0/,,    de la substance nouvelle obtenue selon cet exemple, puis 1 cm3 de dilution à 0,2 et 0,05    /00.    On immerge dans chaque concentration, pendant trois heures, 5 à 10 semences de lentille, préalablement trempées dans l'eau pendant une quinzaine d'heures. On dépose alors les semences sur une ouate de cellulose imbibée d'eau et laisse la germination progresser à 20-240 C pendant 4 jours. On compare alors les plantules à celles de témoins non traités ou traités par des concentrations semblables de colchicine. Les différences de longueur de développement des plantules et des radicelles permet de situer l'action antimitotique de la substance nouvelle. Les résultats de l'expérience figurent au tableau ci-dessous.
EMI2.1     


<tb>



   <SEP> Semences <SEP> germées <SEP> Long. <SEP> des <SEP> plantules <SEP> Long. <SEP> des <SEP> radicelles <SEP> Tubérisation
<tb> Eau <SEP> pure <SEP> (témoins) <SEP> 9/10 <SEP> 40 <SEP> 60 <SEP> néant
<tb> Colchicine <SEP> 1 <SEP>    # <SEP>     <SEP> 8/8 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP>    +++    <SEP> 
<tb> Substance <SEP> nouvelle <SEP> 1 <SEP>     /oo    <SEP> - <SEP> 8/8 <SEP> 5 <SEP> 9 <SEP> +++
<tb> Colchicine <SEP> 0,2 <SEP>    # <SEP>     <SEP>    @ <SEP>    8/8 <SEP> 4 <SEP>    a'    <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP>    + <SEP>       ++    <SEP> 
<tb> Substance <SEP> nouvelle <SEP> 0,

  2 <SEP>    # <SEP>     <SEP> 8/8 <SEP> 5 <SEP> à <SEP> 12 <SEP> 8 <SEP> + <SEP> +
<tb>   
 L'action antimitotique est donc sensiblement égale à celle de la colchicine.



   Exemple 2
 Obtention d'une nouvelle substance tropolonique par intervention microbiologique sur la thiocolchicine.



   On introduit 920 mg de thiocolchicine dans 3,7 litres d'une culture de Streptomyces griseus (ATCC 10137) âgée de quarante-huit heures. On laisse le mélange incuber pendant quarante-huit heures à la température ambiante. On extrait par 5 fois 300 cm3 de chloroforme, réunit les extraits, les lave à l'eau et réextrait par 4 fois 100 cm3 de soude N/10. On réunit les liqueurs sodiques, les acidifie par l'acide chlorhydrique et les extrait par 4 fois 25 cm3 de chloroforme.



   La solution chloroformique est séchée sur sulfate de magnésium et évaporée à sec sous vide. Le résidu dissous en chloroforme-éther (1:1) et passé rapidement sur 10 g d'alumine selon Brockmann. On élue au chloroforme, réunit les solutions chloroformeéther et chloroforme, évapore à sec sous vide et cristallise en benzène pour obtenir 175 mg de petits cristaux jaunes en losanges, insolubles en éther, peu solubles dans l'acétone, le benzène et l'eau, solubles dans le méthanol, l'éthanol, le chloroforme et les liqueurs alcalines,   F= 182-1870C    (fusion lente en tube),   [&alpha;]D20      =-2810      +    2 (c = 0,5    /o,    méthanol).



   La nouvelle substance obtenue selon le présent exemple offre les caractéristiques   suivantes   
 1. En méthanol:
   ?    max 257-258   mF,      e    = 20400 log. 4,30
   A    max 290-292   mF,      e    = 10 150 log. 4,00
   A    max 335   ma,    E = 16320 log. 4,20
 2.

   En solution sodique:
   #    max 254   mu,    E = 27 100 log. 4,43
   #    max 287   mu,      e    = 15060 log. 4,17
   #    max 375   mll,      e    = 15650 log. 4,19
 Analyse:
 Trouvé : C 64,10%, H 5,9   O/o,    N 3,3    /0,    S 7,5   O/o,   
OMe   15, 0 /o.   



   Ces valeurs analytiques correspondent à la formule brute   CsîHOsNS,    pour un produit solvaté renfermant 0,25 molécule de benzène de cristallisation.



   Soumis au test décrit en fin de l'exemple 1, sur la semence de lentille, ce nouveau produit issu de   hi    thiocolchicine montre une excellente activité antimitotique.



   Détermination des indices thérapeutiques de substances nouvelles obtenues par intervention microbiologique sur la colchicine et la thiocolchicine.



   Les substances nouvelles obtenues selon les exemples 1 et 2 sont soumises aux tests de la toxicité aiguë par voie   intrapéritonéale    chez la souris et de l'action antimitotique selon la technique décrite par R. JEQUIER, D. BRANCENT et M. PETER
FALVI (Archives Internationales de Pharmacodynamie et de thérapie, 103, 243 (1955) sur le rat. On détermine la DL50 (dose léthale 50% des animaux traités) et la   DAM100    (dose antimitotique : cellules en mitose/nombre total de cellules), puis l'indice thérapeutique   (DL55    divisée par DAM100) et compare les résultats obtenus avec ceux de la N-désacétyl-thiocolchicine, produit ayant, jusqu'à ce jour, fourni l'indice thérapeutique le meilleur.

   Les résultats figurent au tableau suivant:
EMI3.1     


<tb>  <SEP> Produits <SEP> DL50 <SEP> mg/kg <SEP> DAM100 <SEP> mg/kg <SEP> Indice <SEP> thérapeutique
<tb> Colchicine. <SEP> 2 <SEP> 0,7 <SEP> 3
<tb> N-Désacétyl-thiocolchicine <SEP> 210 <SEP> 10 <SEP> 21
<tb> Substance <SEP> nouvelle <SEP> de <SEP> l'exemple <SEP> 1 <SEP> 200 <SEP> 5 <SEP> 40
<tb> Substance <SEP> nouvelle <SEP> de <SEP> l'exemple <SEP> 2 <SEP> 120 <SEP> 5 <SEP> 24
<tb> 
 Les produits obtenus suivant l'invention présentent donc des indices thérapeutiques jusqu'à ce jour inégalés.



   On peut obtenir comme suit une culture bien évoluée de Streptomyces griseus (ATCC   10 137):   
On prépare un milieu de culture composé comme suit
 Glucose. . . . . . . . 10 g
 Corn steep liquide .... 10 g
 Farine de soja ...... 10 g
 Extrait de malt sec . . . . 5 g
 Carbonate de   calcium...    1 g
 Chlorure de   sodium . . . .    5 g
 Eau ..... q. s. p.   1000cm3   
 On stérilise à 1150 C pendant 20 minutes, refroidit à 250 C, ensemence par des spores récoltées sur gélose et incube à 250 C pendant quarante-huit heures.
  

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé de préparation de dérivés déméthylés de la série de la colchicine ou de la série de la thiocolchicine à partir de composés de la série de la colchicine ou de la série de la thiocolchicine répondant à la formule générale: EMI4.1 dans laquelle Rl = H, -OH, -O-acyle, -O-alcoyle, -O-aralcoyle, -O-hétérosyle; R2 = H, ou alcoyle; R2 = = H, acyle, alcoyle, hétérosyle ; R4 = -O-alcoyle, -S-alcoyle, EMI4.2 <tb> -S-alcoyle, <tb> O <tb> EMI4.3 qui peuvent être identiques ou différents, sont H, alcoyle ou hydroxyalcoyle, caractérisé en ce que l'on soumet les composés de la formule générale à l'action de micro-organismes choisis dans les familles des moisissures, bactéries et levures, laisse l'incubation se poursuivre et isole le dérivé formé.

   SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que la culture du micro-organisme utilisée est âgée de trente à soixante-douze heures au moment de l'adjonction du dérivé colchicique à transformer.

   2. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que le pH de la culture utilisée est compris entre 3 et 8.

   3. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on laisse l'incubation se poursuivre pendant vingt-quatre à quatre-vingt-dix heures.

   4. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que le micro-organisme utilisé est pris parmi les suivants : Saccharomyces ellipsoideus, Streptomyces griseus, Fusarium roseum, Fusarium oxysporum, Fusarium javanicum, Fusarium gladioli, Fusarium solani, Curvuiaria lunata, Corynebacterium simplex, Cunninghamella blakesleeana 8688 ou Aspergillus niger.

   5. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on utilise une culture de Streptomyces griseus âgée de quarante-huit heures et laisse fincuba- tion se poursuivre pendant quarante-huit heures à la température ambiante.

   6. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'après avoir préparé la culture du micro-organisme, on filtre le mycélium et remet ce dernier en suspension dans un tampon aqueux à pH de 5 à 8, avant d'ajouter la matière première à transformer.

   7. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on isole le dérivé formé, par extraction par un solvant non miscible à l'eau, chromatographie éventuelle et cristallisation.