CH354545A - Verfahren zur Behandlung von Pflanzenteilen zum Nachweis von Virosen - Google Patents

Description

  Verfahren zur Behandlung von     Pflanzenteilen    zum Nachweis von     Virosen       Die Erfindung betrifft ein     Verfahren    zur -Be  handlung von Pflanzenteilen, wie Stengeln, Blättern,  insbesondere Knollen, zum Nachweis von     Virosen,     indem Veränderungen in der Zellwand oder im  Plasma durch     Anfärbung    sichtbar gemacht werden.  Die     Erfindung    eignet sich namentlich zum Nach  weis der     Blattrollkrankheit    der     Kartoffel.     



  Die Erreger von Virus-Krankheit lassen sich nur  schwer nachweisen; ihre Grösse liegt weit unterhalb  der Grenze des Auflösungsvermögens der gewöhn  lichen Mikroskope.  



  Der Nachweis des     Blattrollvirus    gelingt durch den       Augenstecklingstest,    eine Methode, die vielfach an  gewandt wird, aber sehr zeitraubend ist.  



  Weiterhin ist aus der Literatur bekannt:  Beitrag  zum     frühzeitigen    Nachweis der     Blattrollkrankheit     der Kartoffel durch     Anfärbung    des     Phloems     (s.  Festschrift     Appel,        Biol.    Zentralanstalt, 1947); ferner  ist bekannt der     Fuchsintest    mit einer     Fuchsinlö-          sung        ( Diamantfuchsin        DAB    6 ; Markenprodukt).

         Fuchsin    färbt alle Zellwände (von gesunden und  kranken Pflanzen) intensiv rot und ausserdem den  Inhalt vereinzelter     Phloemzellen    in Stengeln und  Blättern     blattrollkranker    Kartoffelpflanzen. Man  muss hierbei in Querschnitten die sehr     englumigen     Zellen mit gefärbtem Plasma als Symptom für     Blatt-          roll    suchen. Täuschungen sind bei diesem Test  leicht möglich. Deshalb ist das Verfahren für den  modernen Zuchtbetrieb mit vielen Serienuntersuchun  gen wenig geeignet.  



  Ferner wird in der gleichen Arbeit auch über  die Anwendung der in neuerer Zeit eingeführten       fluoreszenzmikroskopischen    Analyse zum Nachweis  des     Blattrollvirus    berichtet. Hierfür bedient     man     sich der Doppelfärbung zweier     Fluorochrome,    näm  lich von      Rhodamin    B  und     Coriphosphin     (Mar  kenprodukte). In diesem Zusammenhang wird auch    die     Anfärbung    an kranken Mutterknollen stark an  fälliger Frühsorten erwähnt.  



  Eine Nachprüfung dieser Versuche zeigte, dass  die     Anfärbung    der Zellwände mit      Rhodamin        B      und      Coriphosphin     zwar reproduzierbar ist, jedoch  technische Schwierigkeiten bietet.  



  Untersucht wurde auch das von     Strugger    vor  geschlagene     Fluorochrom         Akridinorange     (Marken  produkt)     (Strugger:     Die     Vitalfluorochromierung    des  Protoplasmas , s. Naturwissenschaften 34, 1947,  Seiten 267 bis 273). In     Phloemsträngen,    die längs  im Blickfeld lagen und den     Blattrollvirus    enthielten,  trat nach Behandlung mit     diesem    Farbstoff folgende       Fluoreszenzerscheinung    auf: An einzelnen Zellen  des Bündels konnte man die Tüpfel der Wand leuch  tend grünlich schimmernd auf dunklem, rotem  oder grünlichem Grund erkennen.  



  Die     Anfärbungen    nach den Literaturangaben  sind offenbar an die Zellwände gebunden.  



  Weder der eine noch der andere     Anfärbetest     sind für die Bedürfnisse der Praxis ausreichend,  weil sie bei der Kleinheit der     Phloemzellen    bzw. der  relativ schwachen Fluoreszenz zu hohe Anforderun  gen an den Beobachter stellen.  



  Es wurde daher versucht, auf     Vitalfarbstoffe    und  normales Licht auszuweichen, um den     Zellinhalt    wie       beim        Fuchsintest    anzufärben. Zur Verbesserung  dieses Testes mussten solche Farbstoffe ausfindig ge  macht werden, welche nicht die Zellwände, wohl aber  das kranke Plasma anfärben. Nun gibt es zwar viele  Farbstoffe, welche die Zellwände färben, aber  keinen Farbstoff, der lebendes Plasma anzufärben  vermag (vgl. hierzu     Strugger    1. c.).  



  Für die Lösung des Problems war die eigene Er  kenntnis auf Grund eigener Beobachtungen von Be  deutung, dass man Protoplasma von Pflanzenzellen  mit scheinbar normaler Struktur kurz vor dem Tode,      etwa bei Wundreiz, intensiv anfärben kann. In       Weiterführung    dieser Erkenntnis wurde angenom  men, dass eine Behandlung von Pflanzenteilen mit       Fluorochromen,    deren photodynamische Wirkung eine  erhebliche Schädigung des Plasmas oder zumindest  der den     veränderten    Zellwänden benachbarten  Plasmateile zur Folge hat, daher die Aufnahme  bereitschaft des Plasmas für bei normalem Licht  sichtbare Farbstoffe erhöhen dürfte.

   Diese Ver  mutung hat sich bestätigt und führte zur Entwick  lung des erfindungsgemässen Verfahrens, das dadurch  gekennzeichnet ist, dass die     Pflanzenteile    mit min  destens einem     Fluorochrom    und mindestens einem       Vitalfarbstoff    in Lösung behandelt werden. Unter       Vitalfarbstoffen    werden solche Farbstoffe verstan  den, die die Pflanzenzellen nicht oder wenigstens  nicht so stark     ändern,    dass der Tod eintritt. Es  werden zweckmässig solche Farbstoffe     verwendet,    die  normale Zellwände nicht oder kaum anfärben.

   Ba  sische, bei normalem Licht sichtbare Farbstoffe  werden bevorzugt.     Fluorochrom-    und     Vitalfarbstoff-          lösungen    können gleichzeitig oder nacheinander auf  die Pflanzenteile zur Einwirkung gebracht werden.  



  Vor der Anwendung der     Fluorochromlösung    bzw.  gleichzeitig mit der     Fluorochromlösung    kann ein  Agens auf die Pflanzenteile zur Einwirkung gebracht  werden, welches die     Anfärbbarkeit    erhöht. Hierfür  eignen sich     Kaliumchlorid    oder andere auf die     Hy-          dratation    einwirkende Substanzen, ferner Narkotika,  wie z. B.     Athylalkohol.     



  <I>Beispiele</I>       1.        Eine        Mischlösung,        die        0,005%         Akridinorange           (3,6-Tetramethyldiamino-akridin)    der Firma     Merck,          Darmstadt,        0,01%         Bordeauxrot         (Natriumsalz        der          a-Naphthylamino-        aza    -     2-naphthol-3,        6-disulfosäure)     der Firma     Merck,    Darmstadt, und 0,

  3     Mol    Kalium  chlorid enthält, wird mit einem     pH    von 3,7-4,0 zum  Nachweis einer Virusinfektion auf die zu prüfen  den Pflanzenteile, z. B. vollausgereifte Kartoffel  knollen, zur Einwirkung gebracht. Die Farblösung       darf    nicht zu dunkel sein, weil die     Knollenschnitte     während der Färbung     belichtet    werden müssen, und  zwar am besten mit UV-Licht, um eine Rotfärbung  in etwa 15 Minuten zu erreichen. Viruskranke  Knollen zeigen in einer Reihe von     Phloembündeln     einzelne     Zellen,    zuweilen nur eine Zelle, die bei  Längsaufsicht dunkelrot gefärbt erscheinen; diese  heben sich sehr klar von den praktisch ungefärbten  Nachbarzellen ab.

    



  Zweckmässig arbeitet man zur Orientierung mit  einer Vergrösserung, bei der man gerade noch die       langgestreckten        Phloemzellen    als rote      Strichel     er  kennen kann, und     wählt    hierfür ein schwach ver  grösserndes Objektiv und ein stark vergrösserndes  Okular. Zum Nachprüfen wird ein stärkeres Objek  tiv benutzt.  



       2.        Eine        Mischlösung,        die        0,01%         Akridin-          orange     sowie     0,0081/9         Auramin     (Markenprodukt;

    Chlorhydrat des Tetramethyldiamino-benzophenon-         imids),        0,04 /o     Bordeauxrot , 0,6     Mol        Kalium-          chlorid,    0,03     Mol    Aluminiumchlorid, 4     Mol        Harn-          stoff,        0,5%        Äthylalkohol        enthält,        wird        auf        einen        pH     von etwa 3,

  7 mit Salzsäure eingestellt und zum  Nachweis einer Virusinfektion an Kartoffelknollen  (dünne Schnitte mit Leitbündeln) verwendet. Wäh  rend der Färbung wird mit UV-Licht 15 Minuten  lang belichtet. Die Färbung wird klarer, wenn man  die Färbung in zwei Stufen ausführt, zunächst mit  beiden     Fluoreszenzfarben        +        KCl        +        A1C13        +    Harn  stoff     -f-    Alkohol bei     pH    3,7 und 15 Minuten langer  Bestrahlung mit UV-Licht; sodann wird mit Bor  deauxrot und     KCl    bei     pH    3,7 ohne Bestrahlung  etwa 8 Minuten lang nachgefärbt.  



  Es können sich im     Phloem    oder den Geleitzellen  danach anfärben:  a) die     Phloemzelle,    dass sie in Aufsicht lang  gestreckt rot erscheint;  b) nur ein Ende der sonst ungefärbten     Phloem-          zelle,    so lang, wie die Zelle breit ist;  c) eine Partie im Plasma, scharf umgrenzt etwa  wie eine     Plastide    oder ein grosser Kern;  d) Geleitzellen;  e) Zellkerne.    Es gibt oft mehrere dieser Symptome in einem  Schnitt. Sie lassen sich den verschiedenen Viren wie  folgt zuordnen: Bei Befall mit     Blattrollvirus    können  die     Phloemzellen    wie a) gefärbt sein. Sie sind dann  stark gequollen.

   Dieses Zeichen für     Blattroll    tritt  jedoch fast nur auf bei Pflanzen, die im Jahr vorher  gesund waren. An sekundärkranken Pflanzen tritt die  Färbung meist nach b) auf. Auch dann ist die ge  färbte Partie stark gequollen.  



  Sehr ähnlich sind die Symptome bei Befall mit       Bukettvirus.    Die     Anfärbung    nach Modus a) ist  häufig. Die Färbung nach b) tritt ebenfalls oft auf,  jedesmal schwächer gequollen als bei     Blattrollvirus.     



  Bei mit X-Virus befallenen Knollen sind      Plasti-          den     nach Modus c) gefärbt und schwach gequollen.  Die Symptome<I>a), b)</I> und c) treten noch in an  derer Form auf, indem sie durch verschiedene       Quellung    von den eben beschriebenen mehr oder  minder gut unterscheidbar sind, wobei die Zugehörig  keit zu bestimmten Viren noch nicht sicher geklärt  ist. So dürfte das Symptom für     Y-Virus    wie a) sein,  nur     ungequollen.    Ein dem X-Virus ähnliches Symp  tom dürfte dem A-Virus zuzuschreiben sein.  



  3. Unter gleichen Bedingungen wie bei Beispiel  2 färben sich an Längsschnitten von Trieben des  Apfels, wenn sie vom     Stilett-(Rugh        purple)-Virus     befallen sind,     Phloemzellen    nach Modus<I>a)</I> und<I>b)</I>  (siehe Beispiel 2). Da im Holzteil Fasern und andere  Bestandteile rot gefärbt werden, empfiehlt es sich,  die in diesem Fall stark quellende Wirkung des     KCl     auf gefärbte     Phloemzellen    zur leichten Unterschei  dung heranzuziehen. Gesunde Apfeltriebe zeigen  keine     Anfärbung    im     Phloem.     



  4. Unter gleichen Bedingungen wie bei Beispiel  2 färben sich in Längsschnitten von Kirschtrieben,      wenn sie vom     ringspot-Virus    befallen sind,     Phloem-          zellen    nach Modus<I>a)</I> und<I>b)</I> an (siehe Beispiel 2).  Auch hier     empfiehlt    es sich, die     Quellung    mit     KCl     zur Unterscheidung von gefärbten Fasern im Holz  teil heranzuziehen. Das Symptom b) herrscht jedoch  vor, so dass gefärbtes     Phloem    vom gefärbten Holz  teil auch ohne     Quellung    gut zu unterscheiden ist.  Schwerkranke Zellen zeigen fast nur Symptome nach  b); latente Virusträger haben daneben noch viele  Symptome nach a).

   Pflanzen ohne Virus haben un  gefärbtes     Phloem.  

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Behandlung von Pflanzenteilen zum Nachweis von Virosen unter Verwendung von Fluorochromen, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzenteile mit mindestens einem Fluorochrom und mindestens einem Vitalfarbstoff in Lösung behandelt werden. UNTERANSPRüCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass die Pflanzenteile zuerst mit einer Fluorochromlösung und sodann mit einer Vitalfarb- stofflösung behandelt werden. 2.

   Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass ein basischer Vitalfarbstoff in saurer Lösung angewandt wird. 3. Verfahren nach Patentanspruch und Unter anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fluorochromlösung und die Vitalfarbstofflösung gleichzeitig zur Einwirkung bringt. 4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass ausserdem gelöste Stoffe, wie Ka- liumchlorid, welche die Hydratation beeinflussen, zur Einwirkung gebracht werden. 5.

   Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass ausserdem Narkotika, wie Äthyl- alkohol, zur Einwirkung gebracht werden. 6. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass 3,6-Tetramethyldiamino-akridin als Fluorochrom und das Natriumsalz der a-Naph- thylamino-azo-2-naphthol-3,6-disulfosäure als Vital farbstoff verwendet werden. 7. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass die Pflanzenteile während der Färbung mit UV-Licht bestrahlt werden.