CA2144739A1 - Microgranules utilisables en combinaison avec des inoculums bacteriens, leur obtention et leur application en agriculture - Google Patents
Microgranules utilisables en combinaison avec des inoculums bacteriens, leur obtention et leur application en agricultureInfo
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Abstract
Procédé pour améliorer le rendement des cultures agricoles, dans lequel on utilise un inoculum contenant au moins une culture microbienne et des microgranulés, ledit procédé étant caractérisé en ce que les microgranulés comprennent au moins une substance capable de favoriser la croissance des germes de l'inoculum.
Description
~ 1 ~ 4 ~ 3 ~
MICROGRANULES UTILISABLES EN COMBINAISON AVEC DES
INOCULUMS BACTERIENS, LEUR OBTENTION ET LEUR
APPLICATION EN AGRICULTURE
L'invention concerne le domaine des cultures agricoles dans lesquelles on utilise des semences, des plants et tous autres supports de culture connus. Sous un autre aspect l'invention fait partie de la technique générale du traitement des sols en agriculture. Elle est applicable avec beaucoup d'avantages aux cultures de légumineuses.
Dans la technique antérieure, on a déja proposé
de mettre en oeuvre des inoculums microbiens en agriculture. Le but de cette technique est d'apporter au moment de la mise en place dans le sol des graines ou des plants, les bactéries utiles ou indispensables pour la croissance de la plante. Les inoculums utilisés a cet effet peuvent être des cultures microbiennes liquides, ou sur support solide. Il peut s'agir également de cultures microbiennes déshydratées, sous forme de gel ou de lyophilisat.
Les inoculums actuellement mis en oeu~re et devant faire l'objet d'une homologation sont des cultures pures, exemptes de contaminant afin de faciliter le contrôle de qualité, améliorer la survie et empêcher toute introduction autre que le microbe autorisé.
On connaît plusieurs techniques différentes d'utilisation de tels inoculums. Par exemple, dans le cas des légumineuses, une premiere techniques consiste a apporter l'inoculum au moment du semis par mise en contact avec la graine. Une variante consiste a mettre en oeuvre des graines préinoculées. Une autre technique prévoit l'inoculation du lit de semences :
l'inoculum est alors apporté dans la raie de semis, soit sous forme liquide, soit sous forme de W094/06733 ~ ~ 9 PCT/FR93/00901 microgranulés, ceux-ci étant pratiquement épandus a l'aide de dispositifs connus a cet effet pour distribuer les produits phytosanitaires. Cette dernière technique est souvent préférée par les agriculteurs, car les quantités de produit a manipuler sont plus faibles que dans le cas de l'inoculation des semences. Par exemple, il suffit d'utiliser environ 10 kg par hectare de microgranulés au lieu de 80 a 150 kg de graines dans le cas de l'inoculation des semences.
Les résultats dé~a enregistrés dans la pratique montrent aussi que l'efficacité de la technique d'inoculation du lit de semences aussi bonne.
A titre illustratif, on connaît actuellement une technique qui consiste à mélanger au moment de l'emploi, à sec, une certaine quantité d'inoculum bactérien sur support solide, tel que de la tourbe, avec des microgranulés minéraux d'origine industrielle, tels que des argiles, des carbonates ou autres, dont la taille est appropriée pour l'épandage.
Dans la pratique la granulométrie est d'environ 0,2 à
O,8 mm. Une telle technique a l'avantage d'utiliser des microgranulés peu coûteux, en combinaison avec des faibles quantités d'inoculums, lesquels peuvent être facilement conservés à part. Dans une telle technique, on ne se préoccupe pas vraiment de la fixation de l'inoculum sur les microgranulés, ceux-ci ne servant en fait qu'à diluer l'inoculum. La nature de tels microgranulés peut être très variée et en dehors des matériaux argileux et minéraux, dé~à cités, on peut mentionner la tourbe, le sable, les billes de polyéthylène et autres matieres analogues susceptibles d'être épandues par les engins agricoles.
Une autre technique connue consiste a inoculer a l'avance et lors de la fabrication des granulés de nature diverse, de maniere a réaliser des ~ ~14~739 microgranulés prêts a l'emploi. On connaît ainsi des granulés contenant le ou les micro-organismes a inoculer, a base d'argile, de tourbe, d'alginates, de vermiculite, de perlite, de gels de divers polysaccharides, de silice, de sulfate de calcium. Ont été également décrits des microgranulés comportant des associations de constituants, par exemple de la calcite enrobée de tourbe, des gels de polysaccharides et de silice, des mélanges tourbe-argile et de sulfate de calcium, des argiles et alginates, entre autres.
Cette technique de réalisation a l'avance des microgranulés inoculés est séduisante, mais il est tres difficile de fabriquer ces produits en conditions stériles et d'assurer un stockage a basse température compte tenu des volumes impliques, la quantite de produit a utiliser etant de l'ordre de lO ~g par hectare par exemple. Par ailleurs, si l'on introduit aussi des substances nutritives avec le support des microgranules inocules, il y a un risque accru de développement de germes contAmi~nts dans le milieu ainsi enrichi.
Les brevets et demandes de brevet suivants illustrent cet état de la technique.
Le brevet US-5055293 (ARONSON) a pour objet la lutte biologique contre les larves d'un insecte infectant le maïs.
Des granules d'argile inerte, ou d'un autre matériau minéral ou organique acceptable pour l'usage agricole, recouvert d'une couche de bactéries Bacillus laterosporus y sont décrits.
Ils peuvent être vaporisés avec une solution de cellules ou de spores pouvant contenir des matières nutritives et des excipients, puis être séchés.
Ce document ne mentionne pas le dépôt de microorganismes, juste avant l'application en champ, 21~L7~ 4 sur des granules contenant déjà des matieres nutritives.
La demande de brevet européen EP-A-0295968 (PIONEER FRANCE MAIS) a pour objet la protection de microorganismes contenus dans des compositions d'engrais. Les microorganismes sont microencapsulés dans une matrice de polysaccharide, puis l'inoculum ainsi préparé est mélangé a l'engrais sous forme solide ou sous forme liquide immediatement avant l'épandage. On notera, qu~il n'est question que d'engrais minéraux pour la croissance des plantes et non d'addition de substrats nutritifs pour obtenir une croissance dans le sol d'un microorganisme. De plus, les microorganismes sont prémicroencapsules avant leur melange a l'engrais.
La demande europeenne EP-A-0203708 (AG~ACE~US) concerne un procede d'adsorption de bacteries en phase stationnaire par melange des suspensions de bacteries avec un support granulaire, chimiquement inerte et poreux, puis sechage. Aucune substance nutritive n'est ajoutee a ces granules.
Enfin, la demande européenne EP-A-0479 402 (LIJIMA, RYUSUKE) a pour objet une methode de production d'un fertilisant mycélien dans laquelle on incube des thermoactinomycètes en présence d'un support poreux, ledit support ayant été au préalable malaxé avec de l'acide pyrolignique.
Les thermoactinomycetes sont laissés en fermentation durant au moins deux jours en maintenant la température entre 55 et 80-C.
Les microorganismes ne sont donc pas ajoutés juste avant l'application en champ des granules.
La présente invention appartient a la technique générale d'inoculation microbienne a l'aide de microgranulés a inoculer extemporanément. Elle a W094/06733 ~ 14 ~ 7 3 ~ PCT/FR93/0090l principalement pour objet d'utiliser des microgranulés qui, apres enfouissement dans les sols, permettent d'améliorer la survie et d'obtenir une multiplication des micro-organismes de l'inoculum.
Sous un premier aspect, l'invention concerne des microgranulés comprenant un support solide et au moins une substance capable de favoriser la croissance des germes d'un inoculum microbien avec lequel les micro-granules sont mis en contact au moment de l'emploi.
Les microgranulés selon l'invention ne sont pas inoculés à l'avance. Ils sont mis en oeuvre, au moment de l'emploi, conjointement avec l'inoculum microbien.
Sous un autre aspect, l'invention a aussi pour objet un procédé pour améliorer le rendement des cultures agricoles, dans lequel on utilise un inoculum contenant au moins une culture microbienne et des microgranulés, ledit procédé étant caractérisé en ce que les microgranules comprennent au moins une substance capable de favoriser la croissance des germes de l'inoculum.
Le procéde de l'invention consiste donc a utiliser des microgranules contenant une su~stance, notamment un substrat nutritif, capable de favoriser la croissance des germes de l'inoculum, lesdits microgranules étant prepares a l'avance et pouvant être stockes a l'etat sec, et a les inoculer au moment de l'emploi par un inoculum microbien, afin d'obtenir dans le sol une meilleure survie et une croissance de cet inoculum.
Pour les besoins de la presente invention, on peut utiliser tout type de microgranules obtenus par broyage ou granulation, qu'il s'agisse de microgranules de nature minerale ou organigue, ou des melanges de tels granulés. Parmi les granules
MICROGRANULES UTILISABLES EN COMBINAISON AVEC DES
INOCULUMS BACTERIENS, LEUR OBTENTION ET LEUR
APPLICATION EN AGRICULTURE
L'invention concerne le domaine des cultures agricoles dans lesquelles on utilise des semences, des plants et tous autres supports de culture connus. Sous un autre aspect l'invention fait partie de la technique générale du traitement des sols en agriculture. Elle est applicable avec beaucoup d'avantages aux cultures de légumineuses.
Dans la technique antérieure, on a déja proposé
de mettre en oeuvre des inoculums microbiens en agriculture. Le but de cette technique est d'apporter au moment de la mise en place dans le sol des graines ou des plants, les bactéries utiles ou indispensables pour la croissance de la plante. Les inoculums utilisés a cet effet peuvent être des cultures microbiennes liquides, ou sur support solide. Il peut s'agir également de cultures microbiennes déshydratées, sous forme de gel ou de lyophilisat.
Les inoculums actuellement mis en oeu~re et devant faire l'objet d'une homologation sont des cultures pures, exemptes de contaminant afin de faciliter le contrôle de qualité, améliorer la survie et empêcher toute introduction autre que le microbe autorisé.
On connaît plusieurs techniques différentes d'utilisation de tels inoculums. Par exemple, dans le cas des légumineuses, une premiere techniques consiste a apporter l'inoculum au moment du semis par mise en contact avec la graine. Une variante consiste a mettre en oeuvre des graines préinoculées. Une autre technique prévoit l'inoculation du lit de semences :
l'inoculum est alors apporté dans la raie de semis, soit sous forme liquide, soit sous forme de W094/06733 ~ ~ 9 PCT/FR93/00901 microgranulés, ceux-ci étant pratiquement épandus a l'aide de dispositifs connus a cet effet pour distribuer les produits phytosanitaires. Cette dernière technique est souvent préférée par les agriculteurs, car les quantités de produit a manipuler sont plus faibles que dans le cas de l'inoculation des semences. Par exemple, il suffit d'utiliser environ 10 kg par hectare de microgranulés au lieu de 80 a 150 kg de graines dans le cas de l'inoculation des semences.
Les résultats dé~a enregistrés dans la pratique montrent aussi que l'efficacité de la technique d'inoculation du lit de semences aussi bonne.
A titre illustratif, on connaît actuellement une technique qui consiste à mélanger au moment de l'emploi, à sec, une certaine quantité d'inoculum bactérien sur support solide, tel que de la tourbe, avec des microgranulés minéraux d'origine industrielle, tels que des argiles, des carbonates ou autres, dont la taille est appropriée pour l'épandage.
Dans la pratique la granulométrie est d'environ 0,2 à
O,8 mm. Une telle technique a l'avantage d'utiliser des microgranulés peu coûteux, en combinaison avec des faibles quantités d'inoculums, lesquels peuvent être facilement conservés à part. Dans une telle technique, on ne se préoccupe pas vraiment de la fixation de l'inoculum sur les microgranulés, ceux-ci ne servant en fait qu'à diluer l'inoculum. La nature de tels microgranulés peut être très variée et en dehors des matériaux argileux et minéraux, dé~à cités, on peut mentionner la tourbe, le sable, les billes de polyéthylène et autres matieres analogues susceptibles d'être épandues par les engins agricoles.
Une autre technique connue consiste a inoculer a l'avance et lors de la fabrication des granulés de nature diverse, de maniere a réaliser des ~ ~14~739 microgranulés prêts a l'emploi. On connaît ainsi des granulés contenant le ou les micro-organismes a inoculer, a base d'argile, de tourbe, d'alginates, de vermiculite, de perlite, de gels de divers polysaccharides, de silice, de sulfate de calcium. Ont été également décrits des microgranulés comportant des associations de constituants, par exemple de la calcite enrobée de tourbe, des gels de polysaccharides et de silice, des mélanges tourbe-argile et de sulfate de calcium, des argiles et alginates, entre autres.
Cette technique de réalisation a l'avance des microgranulés inoculés est séduisante, mais il est tres difficile de fabriquer ces produits en conditions stériles et d'assurer un stockage a basse température compte tenu des volumes impliques, la quantite de produit a utiliser etant de l'ordre de lO ~g par hectare par exemple. Par ailleurs, si l'on introduit aussi des substances nutritives avec le support des microgranules inocules, il y a un risque accru de développement de germes contAmi~nts dans le milieu ainsi enrichi.
Les brevets et demandes de brevet suivants illustrent cet état de la technique.
Le brevet US-5055293 (ARONSON) a pour objet la lutte biologique contre les larves d'un insecte infectant le maïs.
Des granules d'argile inerte, ou d'un autre matériau minéral ou organique acceptable pour l'usage agricole, recouvert d'une couche de bactéries Bacillus laterosporus y sont décrits.
Ils peuvent être vaporisés avec une solution de cellules ou de spores pouvant contenir des matières nutritives et des excipients, puis être séchés.
Ce document ne mentionne pas le dépôt de microorganismes, juste avant l'application en champ, 21~L7~ 4 sur des granules contenant déjà des matieres nutritives.
La demande de brevet européen EP-A-0295968 (PIONEER FRANCE MAIS) a pour objet la protection de microorganismes contenus dans des compositions d'engrais. Les microorganismes sont microencapsulés dans une matrice de polysaccharide, puis l'inoculum ainsi préparé est mélangé a l'engrais sous forme solide ou sous forme liquide immediatement avant l'épandage. On notera, qu~il n'est question que d'engrais minéraux pour la croissance des plantes et non d'addition de substrats nutritifs pour obtenir une croissance dans le sol d'un microorganisme. De plus, les microorganismes sont prémicroencapsules avant leur melange a l'engrais.
La demande europeenne EP-A-0203708 (AG~ACE~US) concerne un procede d'adsorption de bacteries en phase stationnaire par melange des suspensions de bacteries avec un support granulaire, chimiquement inerte et poreux, puis sechage. Aucune substance nutritive n'est ajoutee a ces granules.
Enfin, la demande européenne EP-A-0479 402 (LIJIMA, RYUSUKE) a pour objet une methode de production d'un fertilisant mycélien dans laquelle on incube des thermoactinomycètes en présence d'un support poreux, ledit support ayant été au préalable malaxé avec de l'acide pyrolignique.
Les thermoactinomycetes sont laissés en fermentation durant au moins deux jours en maintenant la température entre 55 et 80-C.
Les microorganismes ne sont donc pas ajoutés juste avant l'application en champ des granules.
La présente invention appartient a la technique générale d'inoculation microbienne a l'aide de microgranulés a inoculer extemporanément. Elle a W094/06733 ~ 14 ~ 7 3 ~ PCT/FR93/0090l principalement pour objet d'utiliser des microgranulés qui, apres enfouissement dans les sols, permettent d'améliorer la survie et d'obtenir une multiplication des micro-organismes de l'inoculum.
Sous un premier aspect, l'invention concerne des microgranulés comprenant un support solide et au moins une substance capable de favoriser la croissance des germes d'un inoculum microbien avec lequel les micro-granules sont mis en contact au moment de l'emploi.
Les microgranulés selon l'invention ne sont pas inoculés à l'avance. Ils sont mis en oeuvre, au moment de l'emploi, conjointement avec l'inoculum microbien.
Sous un autre aspect, l'invention a aussi pour objet un procédé pour améliorer le rendement des cultures agricoles, dans lequel on utilise un inoculum contenant au moins une culture microbienne et des microgranulés, ledit procédé étant caractérisé en ce que les microgranules comprennent au moins une substance capable de favoriser la croissance des germes de l'inoculum.
Le procéde de l'invention consiste donc a utiliser des microgranules contenant une su~stance, notamment un substrat nutritif, capable de favoriser la croissance des germes de l'inoculum, lesdits microgranules étant prepares a l'avance et pouvant être stockes a l'etat sec, et a les inoculer au moment de l'emploi par un inoculum microbien, afin d'obtenir dans le sol une meilleure survie et une croissance de cet inoculum.
Pour les besoins de la presente invention, on peut utiliser tout type de microgranules obtenus par broyage ou granulation, qu'il s'agisse de microgranules de nature minerale ou organigue, ou des melanges de tels granulés. Parmi les granules
2~ ~73~ 6 d'origine minérale, on peut citer les argiles industrielles et les mélanges argileux, qui ont donné
de bons résultats pratiques. Quant aux microgranulés d'origine organique, on peut citer divers substrats granulés ou broyés, à base de tourbe, compost, résidus végétaux et autres. La littérature technique contient de nombreux exemples de microgranulés utilisables ainsi que des indications sur la granulométrie souhaitable. Il convient de choisir des dimensions de grains qui conviennent a l'épandage avec les engins sgricoles usuels, et on sait qu'une dimension appropriée pour la taille des microgranulés est de l'ordre de 0,2 a 0,8 mm, a titre indicatif et non limitatif.
Selon la caractéristique essentielle de l'invention, les microgranulés en cause sont enrichis a l'avance, par mise en contact des microgranulés proprement dits et du substrat d'enrichissement, le~uel consiste en au moins une substance capable de favoriser la croissance des germes de l'inoculum microbien.
Dans la pratique, l'enrichissement des microgranulés a l'avance peut être réalisé par imbibition, immersion ou pulvérisation des microgranulés et séchage ultérieur, par granulation d'une suspension de matériau solide et du substrat d'enrichissement ou par mélange des microgranulés avec les substrats d'enrichissement finement broyés. Selon ce mode de réalisation, les microgranulés préparés a l'avance peuvent être stockés secs, de façon a ne pas permettre le développement des micro-organismes durant le stockage.
Pour ce qui est des substances ou substrats d'enrichissement, on peut utiliser tout produit capable de favoriser la survie et la multiplication du germe a inoculer, soit directement en permettant ou stimulant sa croissance, soit en limitant la croissance des germes compétiteurs du sol. On peut notamment utiliser des substrats carbonés comme le glucose, le glycérol et toute autre source de carbone convenant a la croissance de la plupart des micro-organismes ou bien au contraire faire appel a des substrats carbonés spécifiques du germe a favoriser.
Il est également possible d'utiliser d'autres produits, not~mment azotés ou phosphorés et plus généralement tout nutriment susceptible de permettre la croissance du germe a inoculer. Mais, selon le concept inventif présentement décrit, on peut aussi utiliser des biocides compatibles avec le germe a inoculer mais susceptibles d'inhiber la croissance des compétiteurs ou de la ralentir, tels que des produits actifs dans le sol contre les bactéries, les champignons et les protozoaires. Ces types de produits sont connus de l'homme du métier et peuvent être notamment choisis parmi les antibiotiques , les fongicides et plus généralement tout produit phytosanitaire.
Il a été indiqué précédemment que dans le procédé de l'invention on pouvait utiliser un inoculum contenant au moins une culture microbienne. De fait, l'inoculation peut faire appel a un ou plusieurs germes, qui peuvent être apportés successivement ou en mélange. Les microgranulés sont inoculés par l'utilisateur, au moment de l'emploi ou peu de temps avant celui-ci. Tous les types d'inoculum peuvent être utilisés, quels que soient leur support et leur conditionnement, par exemple des inoculums sur support solide, tel que la tourbe, des inoculums liquides, des inoculums en gel ou des inoculums lyophilisés.
C'est techniques d'inoculation sont connues de W O 94/06733 ~ ~ ~ PC~r/FR93/00901 2 ~ 8 l'homme du métier et n'ont pas à être décrites plus en détail.
L'invention peut être appliquée avec un ou plusieurs micro-organismes susceptibles d'être utilises dans l'inoculation des semences, des plants, des supports de culture et des sols. Il s'agit notamment de tous les micro-organismes utilisables pour favoriser directement la croissance des plantes, tels que ceux appartenant aux espèces Rhizobium, Bradyrhizobium, Azospirillum, ainsi que les champignons ecto- et endomycorhizogenes. Des resultats probants ont été obtenus avec le micro-organisme Bradyrhizobium japonicum. Entrent également dans le cadre de l'invention les micro-organismes utilisables en lutte biologique contre les maladies des plantes et les ravageurs, comme les bactéries antagonistes des bactéries et des champignons phytopathogenes (P.G.P.R.
: Plant Growth Promoting Rhizobacteria, Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus et autres genres similaires), les champignons antagonistes des champignons phytopathogenes (Fusarium, Trichoderma, et autres especes similaires) et les bactéries et champignons entomopathogenes (Bacillus thuringiensis, Beauveria, et autres espèces similaires). On peut encore citer les micro-organismes utilisables dans la dépollution et la bioremédiation des sols.
L'invention procure des avantages par rapport à
l'utilisation traditionnelle d'inoculum. On sait en effet que l'efficacité des inoculations microbiennes dans l'agriculture dépend directement du nombre de germes vivants et efficaces apportés. Il est également connu que les pertes immédiates à l'inoculation sont généralement très importantes et sont dues principalement a la mortalité des germes apportés par dessication. On s'efforce donc à l'heure actuelle de W094/06733 ~1~ 4 7 ~ ~ PCT/FR93/00901 9 ~, .
trouver des procédés qui permettent d'augmenter la dose possible de micro-organismes à inoculer. Mais il - faut aussi limiter les pertes de micro-organismes lors de l'utilisation aux champs, tout en tenant compte des limites physiques, les quantités possibles à inoculer étant limitées par le poids de graines ainsi que par les équipements disponibles, aussi bien qu'économiques (coûts de production, stockage). Pour cette raison, on a déjà proposé dans la technique antérieure de réaliser la croissance du micro-organisme inoculé dans les sols, mais seulement après inoculation. Certaines tentatives ont été faites pour ajouter des substrats nutritifs directement dans le sol, par exemple un substrat carboné. Mais il faut alors ajouter au sol, par exemple dans le cas du traitement d'un lit de semences, entre 20 et 200 kg de substrat carboné par hectare, ce qui correspond à des quantités totalement irréalistes en grandes cultures.
L'invention permet d'obtenir une croissance dans le sol des germes apportés en augmentant leur nombre, ce qui se traduit soit par un effet amélioré
de l'inoculation, soit par un effet de sécurité au cas où des conditions difficiles sont présentes lors du traitement d'inoculation, ce qui peut etre le cas d'un inoculum partiellement déficient ou d'une mortalité
anormale à l'inoculation. Grace à l'invention, la dose de micro-organismes mise à la disposition de la semence ou de la plante peut etre augmentée ou maintenue dans d'excellentes conditions de sécurité.
On a déjà dit précédemment que l'on connaissait dans la technique antérieure l'utilisation de microgranulés, et plus particulièrement de microgranulés préinoculés c'est-à-dire inoculés à
l'avance lors de la fabrication. Par rapport à une telle technique de microgranulés préinoculés, la -W O 94/06733 ~ ~ ~ 10 PC~r/FR93/00901 présente invention procure de nombreuX avantages, en particulier les suivants :
- l'invention permet d'utiliser des microgranules du commerce, géneralement peu coûteux, - l'enrichissement en substrat nutritif peut etre réalisé sans exigence de stérilité et est donc moins couteux, - risques nuls ou très reduits de développement de germes contaminants dans les microgranulés au stockage tstockage sec), alors que de tels risques apparaissent sur des microgranulés préinoculés, - stockage possible a température ordinaire sur une longue durée, les propriétés du microgranulé
n'étant pas liées au nombre de germes qu'il contient et a leur survie, alors qu'on connalt l'effet défavorable de la température pour la survie d'un inoculum et des microgranulés préinoculés, - stockage au froid possible de l'inoculum microbien en petit emballage séparé des microgranulés, lesquels peuvent être conditionnés en emballage volumineux, - possibilités variées de jouer sur la nature et la concentration des substrats, l'adaptation de la nature et de la spécificité du substrat au germe a inoculer, - possibilité d'addition de biocides défavorisant les competiteurs, sans ris~ues de toxicité par contact prolongé entre l'inoculum et le microgranulé.
L'invention sera maintenant illustrée sans etre aucunement limitée par des exemples de mise en oeuvre au laboratoire et au champ .
La figure l représente les résultats obtenus avec des granules enrichis de Bradyrhizobium japonicum. Le développement des microorganismes ( en W094/06733 1i PCT/FR93/00901 ordonnée ) est suivi en fonction du temps (en jour).
1es figures 2 et 3 illustrent la croissance de populations de la souche de Pseudomonas C7Rl2 sous forme liquide (L), sous forme argile normale (A) et sous forme argile enrichie (Ae), respectivement en sol naturel (figure 2 ) et en sol desinfecte (figure3).
Les figures 4 et 5 représentent l'évolution du nombre de plantes de lin saines (en ordonnée) en fonction du nombre de jour ( en abscisse) respectivement en sol naturel (figure 4) et en sol désinfecté (figure 5) traitées par différentes formulations de microorganismes.
EXEMPLE l: Microqranulés inoculés par BradYrhizobium japonicum.
On exposera d'abord tous les moyens et modes de réalisation de l'expérimentation et ensuite les résultats de celle-ci.
SOUCHES
Tous les essais en serre et au champ sont réalisés avec la souche G49 commerciale (IARI SBl6, New Delhi) de Bradyrhizodium ~aponicum. La culture choisie est celle du soja.
On sait gue, pour cette plante, la nodulation (nombre de nodosités, poids des nodosités) croît quand la dose de Bradyrhizobium japonicum apportée augmente.
Par ailleurs, le rendement est lié à la nodulation.
Pour suivre l'évolution de populations introduites dans les sols, on a utilisé une souche de B.japonicum résistante a des antibiotiques. Au laboratoire, a été isolé sur boîte de Pétri contenant des antibioti~ues un mutant spontané de G49 résistant a la rifampicine (l00 mg/ml) et a la kanamycine (200 mg/ml), dont la stabilité a été vérifiée et qui a été
denomme G49RfKm.
Cette nouvelle souche a été déposée a la 73~ 12 collection CNCM de l'Institut Pasteur sous le N I-1264 le ll Septembre 1992.
MICROGRANULES
Il s'agit de produits commerciaux repondant aux criteres suivants :
- densité suffisamment élevée pour permettre une bonne descente dans le microgranulateur, - granulométrie : assez fine et homogene, comprise entre 0,2 et 0,8 mm, - pH compatible avec la survie des bactéries, - absence de toxicité vis-a-vis des bactéries inoculées, - mélange avec un inoculum facile a réaliser, retenant suffisamment la tourbe, et donnant un produit homogene.
On a utilisé des granulés ayant une porosité
suffisante et ne se déstructurant pas dans l'eau, afin de conserver toutes leurs propriétés lors des phases d'imprégnation (par la solution d'enrichissement) et de séchage. Cette procédure n~altere pas la facilité
de distribution des microgranulés par microgranulateur.
Deux types de microgranulés répondant a ces exigences ont été mis en oeuvre, l'un appelé K, a base de cristoballite, et l'autre M, forme de montmorillonite calcinée.
Le tableau 1 donne les caractéristiques essentielles de ces microgranulés.
~44'7~
Caractéristi~ues essentielles de microqranulés K et M utilisés dans les expérimentations K M
Composition cristoballite te (silice) calcinée illite < 10 % (argile) Teneur en eau à pF 2,5 (point de ressuyage d'un sol) 0,64 0,39 à pF 4,2 (point de flétrissement) 0,48 0,21 pH 5,5 7,8 Granulométrie :
> 0,8 mm 1,0 ~ 1,4 %
0,8 - 0,25 mm 98 % 98 %
< 0,25 mm 1 % 0,2 %
Densité :
humidité 0 % 0,57 1,0 humid~té 13 % 1,0 humidité 30 % 0,70 Nombre de particules par kg 13 à 17X106 5 a 8X106 30 Déstructuration par l'eau non non SUBSTRATS D'ENRICHISSEMENT
Ils sont formés essentiellement d'une source de carbone, d'une source d'azote, et d'éléments minéraux.
Les produits retenus pour l'enrichissement sont dissous dans l'eau. Le volume ne doit pas être excessif, de façon a être absorbé entierement par la porosité des microgranulés. Mais il doit être suffisamment élevé pour, d'une part entraîner une dissolution complete des produits, d'autre part -40 permettre une homogénéisation du mélange avec les microgranulés avant son absorption complete.
-Cette solution est apportée sur les microgranulés secs, l'ensemble étant brassé
immédiatement afin d'obtenir un mélange uniforme. Elle 7 3 ~ ~
W O 94/06733 14 PC~r/FR93/00901 est absorbee par la porosite.
Un sechage ulterieur permet de laisser le substrat nutritif sec dans cette porosité, autorisant une conservation longue, même dans des conditions non steriles.
Les concentrations utilisées pour les expérimentations varient de 16 à 96g de matières organiques (exprimées en carbone organiques), par kg de microgranulés secs.
FONGICIDES ASSOCIES
Après un test sur leur efficacité contre les champignons du sol et leur innocuité vis-à-vis des souches inoculées, les produits retenus sont ajoutes dans la solution d'enrichissement, avant leur incorporation dans les microgranulés.
SOLS ET SUPPORTS DE CULTURE UTILISES
Essais au champ L'essentiel du travail a été conduit sur un sol argileux du domaine de l'INRA - Dijon, et une partie secondaire a concerné un sol sableux de la région. Ces sols étaient au départ dépourvus de B. japonicum.
Les caractéristiques essentielles sont données dans le tableau 2.
2~L7~
Tableau 2 : Caractéristiques des sols utilisés pour les essais au champ CaractéristiquesSol argileux Sol 5 sableux Granulometrie en g/kg argile 382 75 limon 562 227 sable 56 698 Humidite equivalente en p 100 28.1 9.9 Carbone organique methode Anne 16.06.9 15 en g/k Matières organiques en g/kg 27.5 11.9 Azote organique total en g/kg 1.560.67 (Méthode Kjeldahl) pH eau 7.0 7.3 Calcaire total 0 0 25 Capacite d'echange cationique Metson en meq p 100 21.7 4.3 Essais au laboratoire.
Ils ont ete realises pour leur presque totalite avec le même sol argileux que celui utilise pour les essais au champ. Ce sol est depourvu de B. japonicum.
PLANTE
Tous les essais ont ete realises avec la variete de soja Maple Arrow, de type indetermine et appartenant au groupe de precocite OO.
INOCULUMS
En cas d'utilisation de la souche G49 normale, l'inoculum, tourbe ou liquide, est un produit commercial ("Biodoz", de la Societe LIPHA ).
L'inocolum de la souche G49 resistante (G49RfKm) est produit au laboratoire.
Une fiole contenant un milieu de culture liquide,a base d'extrait de malt, est inoculee stérilement a partir d'un tube gélosé contenant la W094/06733 214 ~ ~ 3 9 16 PCT/FR93/00901 souche. Elle est ensuite placée sur une table d'agitation (200 rpm) a 28 C pendant 6 a 7 jours. La culture obtenue alors constitue l'inoculum liquide utilise, qui peut être conserve plusieurs mois a 4 C.
Pour la production d'inoculum tourbe, on part d'une tourbe stérile de même origine que celle de l'inoculum commercial. Dans un flacon contenant 30g de ce produit, a 12% d'humidité, on ajoute 12 ml d'inoculum liquide. Après homogénéisation et maturation 2 a 3 s~ines a température ambiante, on obtient un produit qui a sensiblement les memes propriétés que la tourbe commerciale: humidité de 55-60%, richesse de 1'ordre de 109 germes par gramme de tourbe.
TECHNIQUES D'INOCULATION DES MICROGRANULES
On a retenu une proportion correspondant a celle de l'inoculation au champ, soit 4 ~ d'inoculum pur par rapport aux microgranules.
Compte tenu des quantites nécessaires pour l'introduction dans le sol, des facilités de manipulation et de la précision espérée, on a travaillé sur des lots de 25 g de microgranules (mesurés secs et sans enrichissement), en flacons de 250 ml.
Pour l'utilisation avec l'inoculum tourbe, les microgranulés sont d'abord humidifiés au niveau voulu.
Ensuite, chaque lot est inoculé avec 1 a 1,3 g d'inoculum, le tout étant homogénéisé, puis utilisé
dans les minutes suivantes.
Lorsqu'ils sont employés avec un inoculum liquide, les microgranulés, secs au départ, reçoivent un inoculum préalablement dilué de facon a apporter simultanement 1 ml d'un inoculum pur pour 25 g de microgranulés, mais aussi la quantité d'eau nécessaire pour être a l'humidité voulue (7,5 ml pour K et 3,25 W094/06733 21~ ~ 7 ~ 9 PCT/FR93/00901 17 ~
ml pour M dans la plupart des expérimentations). Après agitation pour homogénéisation, les microgranules sont - utilises rapidement.
Techniques d'introduction dans les sols et d'incubation Après tamisage à 4 mm ou à 2 mm, les sols sont introduits dans des flacons en verre, soit à raison de 50 g de sol sec dans un flacon de 500 ml, soit de 20 g dans 250 ml. L'humidité est ajustee 24 h à l'avance, en general au niveau de 80 ~ de la capacite de retention en eau.
Dans ces flacons, sont introduits respectivement 300 mg et 120 mg de microgranules, ce qui represente respectivement environ 4500 et 1800 microgranules pour K, 2100 et 800 pour M.
Les flacons sont ensuite agités manuellement de façon à répartir les microgranulés dans tout le volume de sol.
Les flacons inoculés sont mis à incuber en les fermant avec un film plastique, destiné à empêcher la perte d'eau tout en permettant les échan~es respiratoires. Ils sont ensuite placés à l'obscurité, en general à 20- C, mais aussi à 15- C ou à 28- C pour certains essais.
Les denombrements sont realises sur la totalite d'un flacon après plusieurs jours d'incubation.
Denombrements en boîtes de Petri L'essentiel des mesures consiste en des denombrements de populations de B. japonicum capables de former des colonies sur boîtes de Petri contenant un milieu de culture gelose. Ces denombrements sont realises à plusieurs stades de l'inoculation :
- inoculums eux-mêmes, avant utilisation, sur des ~uantites generalement de 1 ml ou 1 g, - microgranules après inoculation, en W O 94/06733 PC~r/FR93/00901 w14~7~ 18 travaillant soit sur la totalité d~un lot, soit sur des aliquotes, - sols ayant reçu des microgranulés inoculés, en travaillant sur la totalité du contenu d'un flacon.
5Les produits a dénombrer pour leur richesse en B. japonicum sont introduits dans 100 ml d'une solution d'extraction et placés sur une table d'agitation (200 rpm) pendant 30 minutes.
Des dilutions successives sont ensuite réalisées au 1/10, et les suspensions bactériennes obtenues sont étalees sur les milieux de denombrement par l'une des deux methodes suivantes.
En absence de sol, un appareil (Spiral System) dépose un volume connu de la suspension sur le milieu gelose d'une boîte de Petri. Celle-ci est ensuite mise a incuber à 28- C, puis les colonies presentes sont denombrees a 5 ou 6 jours, d'ou un comptage en ufc (unites formant une colonie). Un calcul a partir des dilutions utilisees permet de determiner la richesse du produit à analyser.
En presence de sol, l'sppareil precedent est inutilisable, et les denombrements sont realises par la methode appelee "double couche". Un faible volume, 0,1 ou 0,2 ml, d'une suspension a denombrer est introduite dans un tube a hémolyse contenant 3 ml de solution gelosee à 0,7 % en surfusion (43 C). Apres homogeneisation, ce melange est etale sur une boîte de Petri contenant le milieu de culture gelose, ainsi que les antibiotiques et fongicides auxquels la souche G49RfKm est resistante.
Apres incubation 7 jours a 28- C, les colonies presentes sur les boîtes sont denombrees, les dilutions etant realisees de façon a compter entre 30 et 300 colonies par boîte.
35Tous les denombrements sont realises avec 3 ~1~4739 W O 94/06733 PC~r/FR93/00901 1~ , ,, répétitions pour chaque traitement, et les résultats sont donnés avec les écarts-type calculés.
- Essais au champ Les essais mis en place sur les sols précédemment décrits sont des dispositifs à 4 blocs complets.
Le semis est effectué fin Avril-début Mai, l'objectif étant d'apporter 600 000 graines par hectare (variété Maple Arrow) inoculées a la dose agronomique, soit 10 kg de microgranulés par hectare, en lignes espacées de 30 cm. Ceux-ci sont enrichis et inoculés dans les mêmes conditions que pour les travaux au laboratoire, en lots de 1 kg, l'inoculation ayant lieu au champ quelques minutes avant le semis.
L'irrigation est réalisée en cours de saison, en fonction des besoins de la culture.
RESULTATS
Les résultats des expérimentations sont rapportés ci-apres.
La figure 1 résume les résultats obtenus lors d'essais de laboratoire, comparant des microgranulés enrichis(E) ou non enrichis (M), inoculés par un inocolum liguide et incubés dans un sol non stérilisé, maintenu humide (H) ou soumis a la dessication (S).
Nombre de germes B. japonicum récupérés apres inoculation en liguide sur microgranulés et introduction dans le sol, en fonction du temps et selon le déssechement du sol en cours d'incubation.
Les légendes de la figure sont : N = microgranulés non enrichis, E = microgranulés enrichis GLY3C, H= sol maintenu humide (82% de la capacité de rétention en eau) pendant les 21 jours, S = sol soumis a un déssechement naturel apres 7 jours d'incubation.
D'apres les résultats illustrés sur la figure 1, on voit que :
W094/06733 ~1~ 4 7 3 9 20 PCT/FR93/0090l - apres 7 jours, les microgranulés enrichis permettent d'obtenir une multiplication de B.
japonicum d'un facteur supérieur à 10 par rapport aux microgranulés non enrichis, - apres 21 jours, les microgranulés enrichis maintiennent le nombre de B. japonicum à un niveau 10 fois supérieur à celui obtenu avec les microgranules non enrichis quand le sol est maintenu humide et a un niveau plus de 100 fois superieur quand le sol se desseche.
Les tableaux 3 à 7 resument les resultats obtenus lors d'essais au champ. Pour chaque tableau, les donnees d'une même colonne suivies de la même lettre ne sont pas statistiquement differentes au seuil de 5 % suivant le test de Newman et Keuls.
Dans les tableaux 3 et 4, sont rassembles les premiers resultats obtenus au cours d'essais au champ en 1988 et 1989 respectivement. Ils montrent un effet significatif de l'enrichissement sur la nodulation.
Les tableaux 5, 6 et 7 concernent des essais effectues en 1990 et 1991 avec diverses conditions de traitement, telles qu'indiquées en bas de chaque tableau.
Dans le tableau 5, les traitements correspondant à l'invention (microgranulés enrichis inocules par un inoculum tourbe) sont les traitements
de bons résultats pratiques. Quant aux microgranulés d'origine organique, on peut citer divers substrats granulés ou broyés, à base de tourbe, compost, résidus végétaux et autres. La littérature technique contient de nombreux exemples de microgranulés utilisables ainsi que des indications sur la granulométrie souhaitable. Il convient de choisir des dimensions de grains qui conviennent a l'épandage avec les engins sgricoles usuels, et on sait qu'une dimension appropriée pour la taille des microgranulés est de l'ordre de 0,2 a 0,8 mm, a titre indicatif et non limitatif.
Selon la caractéristique essentielle de l'invention, les microgranulés en cause sont enrichis a l'avance, par mise en contact des microgranulés proprement dits et du substrat d'enrichissement, le~uel consiste en au moins une substance capable de favoriser la croissance des germes de l'inoculum microbien.
Dans la pratique, l'enrichissement des microgranulés a l'avance peut être réalisé par imbibition, immersion ou pulvérisation des microgranulés et séchage ultérieur, par granulation d'une suspension de matériau solide et du substrat d'enrichissement ou par mélange des microgranulés avec les substrats d'enrichissement finement broyés. Selon ce mode de réalisation, les microgranulés préparés a l'avance peuvent être stockés secs, de façon a ne pas permettre le développement des micro-organismes durant le stockage.
Pour ce qui est des substances ou substrats d'enrichissement, on peut utiliser tout produit capable de favoriser la survie et la multiplication du germe a inoculer, soit directement en permettant ou stimulant sa croissance, soit en limitant la croissance des germes compétiteurs du sol. On peut notamment utiliser des substrats carbonés comme le glucose, le glycérol et toute autre source de carbone convenant a la croissance de la plupart des micro-organismes ou bien au contraire faire appel a des substrats carbonés spécifiques du germe a favoriser.
Il est également possible d'utiliser d'autres produits, not~mment azotés ou phosphorés et plus généralement tout nutriment susceptible de permettre la croissance du germe a inoculer. Mais, selon le concept inventif présentement décrit, on peut aussi utiliser des biocides compatibles avec le germe a inoculer mais susceptibles d'inhiber la croissance des compétiteurs ou de la ralentir, tels que des produits actifs dans le sol contre les bactéries, les champignons et les protozoaires. Ces types de produits sont connus de l'homme du métier et peuvent être notamment choisis parmi les antibiotiques , les fongicides et plus généralement tout produit phytosanitaire.
Il a été indiqué précédemment que dans le procédé de l'invention on pouvait utiliser un inoculum contenant au moins une culture microbienne. De fait, l'inoculation peut faire appel a un ou plusieurs germes, qui peuvent être apportés successivement ou en mélange. Les microgranulés sont inoculés par l'utilisateur, au moment de l'emploi ou peu de temps avant celui-ci. Tous les types d'inoculum peuvent être utilisés, quels que soient leur support et leur conditionnement, par exemple des inoculums sur support solide, tel que la tourbe, des inoculums liquides, des inoculums en gel ou des inoculums lyophilisés.
C'est techniques d'inoculation sont connues de W O 94/06733 ~ ~ ~ PC~r/FR93/00901 2 ~ 8 l'homme du métier et n'ont pas à être décrites plus en détail.
L'invention peut être appliquée avec un ou plusieurs micro-organismes susceptibles d'être utilises dans l'inoculation des semences, des plants, des supports de culture et des sols. Il s'agit notamment de tous les micro-organismes utilisables pour favoriser directement la croissance des plantes, tels que ceux appartenant aux espèces Rhizobium, Bradyrhizobium, Azospirillum, ainsi que les champignons ecto- et endomycorhizogenes. Des resultats probants ont été obtenus avec le micro-organisme Bradyrhizobium japonicum. Entrent également dans le cadre de l'invention les micro-organismes utilisables en lutte biologique contre les maladies des plantes et les ravageurs, comme les bactéries antagonistes des bactéries et des champignons phytopathogenes (P.G.P.R.
: Plant Growth Promoting Rhizobacteria, Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus et autres genres similaires), les champignons antagonistes des champignons phytopathogenes (Fusarium, Trichoderma, et autres especes similaires) et les bactéries et champignons entomopathogenes (Bacillus thuringiensis, Beauveria, et autres espèces similaires). On peut encore citer les micro-organismes utilisables dans la dépollution et la bioremédiation des sols.
L'invention procure des avantages par rapport à
l'utilisation traditionnelle d'inoculum. On sait en effet que l'efficacité des inoculations microbiennes dans l'agriculture dépend directement du nombre de germes vivants et efficaces apportés. Il est également connu que les pertes immédiates à l'inoculation sont généralement très importantes et sont dues principalement a la mortalité des germes apportés par dessication. On s'efforce donc à l'heure actuelle de W094/06733 ~1~ 4 7 ~ ~ PCT/FR93/00901 9 ~, .
trouver des procédés qui permettent d'augmenter la dose possible de micro-organismes à inoculer. Mais il - faut aussi limiter les pertes de micro-organismes lors de l'utilisation aux champs, tout en tenant compte des limites physiques, les quantités possibles à inoculer étant limitées par le poids de graines ainsi que par les équipements disponibles, aussi bien qu'économiques (coûts de production, stockage). Pour cette raison, on a déjà proposé dans la technique antérieure de réaliser la croissance du micro-organisme inoculé dans les sols, mais seulement après inoculation. Certaines tentatives ont été faites pour ajouter des substrats nutritifs directement dans le sol, par exemple un substrat carboné. Mais il faut alors ajouter au sol, par exemple dans le cas du traitement d'un lit de semences, entre 20 et 200 kg de substrat carboné par hectare, ce qui correspond à des quantités totalement irréalistes en grandes cultures.
L'invention permet d'obtenir une croissance dans le sol des germes apportés en augmentant leur nombre, ce qui se traduit soit par un effet amélioré
de l'inoculation, soit par un effet de sécurité au cas où des conditions difficiles sont présentes lors du traitement d'inoculation, ce qui peut etre le cas d'un inoculum partiellement déficient ou d'une mortalité
anormale à l'inoculation. Grace à l'invention, la dose de micro-organismes mise à la disposition de la semence ou de la plante peut etre augmentée ou maintenue dans d'excellentes conditions de sécurité.
On a déjà dit précédemment que l'on connaissait dans la technique antérieure l'utilisation de microgranulés, et plus particulièrement de microgranulés préinoculés c'est-à-dire inoculés à
l'avance lors de la fabrication. Par rapport à une telle technique de microgranulés préinoculés, la -W O 94/06733 ~ ~ ~ 10 PC~r/FR93/00901 présente invention procure de nombreuX avantages, en particulier les suivants :
- l'invention permet d'utiliser des microgranules du commerce, géneralement peu coûteux, - l'enrichissement en substrat nutritif peut etre réalisé sans exigence de stérilité et est donc moins couteux, - risques nuls ou très reduits de développement de germes contaminants dans les microgranulés au stockage tstockage sec), alors que de tels risques apparaissent sur des microgranulés préinoculés, - stockage possible a température ordinaire sur une longue durée, les propriétés du microgranulé
n'étant pas liées au nombre de germes qu'il contient et a leur survie, alors qu'on connalt l'effet défavorable de la température pour la survie d'un inoculum et des microgranulés préinoculés, - stockage au froid possible de l'inoculum microbien en petit emballage séparé des microgranulés, lesquels peuvent être conditionnés en emballage volumineux, - possibilités variées de jouer sur la nature et la concentration des substrats, l'adaptation de la nature et de la spécificité du substrat au germe a inoculer, - possibilité d'addition de biocides défavorisant les competiteurs, sans ris~ues de toxicité par contact prolongé entre l'inoculum et le microgranulé.
L'invention sera maintenant illustrée sans etre aucunement limitée par des exemples de mise en oeuvre au laboratoire et au champ .
La figure l représente les résultats obtenus avec des granules enrichis de Bradyrhizobium japonicum. Le développement des microorganismes ( en W094/06733 1i PCT/FR93/00901 ordonnée ) est suivi en fonction du temps (en jour).
1es figures 2 et 3 illustrent la croissance de populations de la souche de Pseudomonas C7Rl2 sous forme liquide (L), sous forme argile normale (A) et sous forme argile enrichie (Ae), respectivement en sol naturel (figure 2 ) et en sol desinfecte (figure3).
Les figures 4 et 5 représentent l'évolution du nombre de plantes de lin saines (en ordonnée) en fonction du nombre de jour ( en abscisse) respectivement en sol naturel (figure 4) et en sol désinfecté (figure 5) traitées par différentes formulations de microorganismes.
EXEMPLE l: Microqranulés inoculés par BradYrhizobium japonicum.
On exposera d'abord tous les moyens et modes de réalisation de l'expérimentation et ensuite les résultats de celle-ci.
SOUCHES
Tous les essais en serre et au champ sont réalisés avec la souche G49 commerciale (IARI SBl6, New Delhi) de Bradyrhizodium ~aponicum. La culture choisie est celle du soja.
On sait gue, pour cette plante, la nodulation (nombre de nodosités, poids des nodosités) croît quand la dose de Bradyrhizobium japonicum apportée augmente.
Par ailleurs, le rendement est lié à la nodulation.
Pour suivre l'évolution de populations introduites dans les sols, on a utilisé une souche de B.japonicum résistante a des antibiotiques. Au laboratoire, a été isolé sur boîte de Pétri contenant des antibioti~ues un mutant spontané de G49 résistant a la rifampicine (l00 mg/ml) et a la kanamycine (200 mg/ml), dont la stabilité a été vérifiée et qui a été
denomme G49RfKm.
Cette nouvelle souche a été déposée a la 73~ 12 collection CNCM de l'Institut Pasteur sous le N I-1264 le ll Septembre 1992.
MICROGRANULES
Il s'agit de produits commerciaux repondant aux criteres suivants :
- densité suffisamment élevée pour permettre une bonne descente dans le microgranulateur, - granulométrie : assez fine et homogene, comprise entre 0,2 et 0,8 mm, - pH compatible avec la survie des bactéries, - absence de toxicité vis-a-vis des bactéries inoculées, - mélange avec un inoculum facile a réaliser, retenant suffisamment la tourbe, et donnant un produit homogene.
On a utilisé des granulés ayant une porosité
suffisante et ne se déstructurant pas dans l'eau, afin de conserver toutes leurs propriétés lors des phases d'imprégnation (par la solution d'enrichissement) et de séchage. Cette procédure n~altere pas la facilité
de distribution des microgranulés par microgranulateur.
Deux types de microgranulés répondant a ces exigences ont été mis en oeuvre, l'un appelé K, a base de cristoballite, et l'autre M, forme de montmorillonite calcinée.
Le tableau 1 donne les caractéristiques essentielles de ces microgranulés.
~44'7~
Caractéristi~ues essentielles de microqranulés K et M utilisés dans les expérimentations K M
Composition cristoballite te (silice) calcinée illite < 10 % (argile) Teneur en eau à pF 2,5 (point de ressuyage d'un sol) 0,64 0,39 à pF 4,2 (point de flétrissement) 0,48 0,21 pH 5,5 7,8 Granulométrie :
> 0,8 mm 1,0 ~ 1,4 %
0,8 - 0,25 mm 98 % 98 %
< 0,25 mm 1 % 0,2 %
Densité :
humidité 0 % 0,57 1,0 humid~té 13 % 1,0 humidité 30 % 0,70 Nombre de particules par kg 13 à 17X106 5 a 8X106 30 Déstructuration par l'eau non non SUBSTRATS D'ENRICHISSEMENT
Ils sont formés essentiellement d'une source de carbone, d'une source d'azote, et d'éléments minéraux.
Les produits retenus pour l'enrichissement sont dissous dans l'eau. Le volume ne doit pas être excessif, de façon a être absorbé entierement par la porosité des microgranulés. Mais il doit être suffisamment élevé pour, d'une part entraîner une dissolution complete des produits, d'autre part -40 permettre une homogénéisation du mélange avec les microgranulés avant son absorption complete.
-Cette solution est apportée sur les microgranulés secs, l'ensemble étant brassé
immédiatement afin d'obtenir un mélange uniforme. Elle 7 3 ~ ~
W O 94/06733 14 PC~r/FR93/00901 est absorbee par la porosite.
Un sechage ulterieur permet de laisser le substrat nutritif sec dans cette porosité, autorisant une conservation longue, même dans des conditions non steriles.
Les concentrations utilisées pour les expérimentations varient de 16 à 96g de matières organiques (exprimées en carbone organiques), par kg de microgranulés secs.
FONGICIDES ASSOCIES
Après un test sur leur efficacité contre les champignons du sol et leur innocuité vis-à-vis des souches inoculées, les produits retenus sont ajoutes dans la solution d'enrichissement, avant leur incorporation dans les microgranulés.
SOLS ET SUPPORTS DE CULTURE UTILISES
Essais au champ L'essentiel du travail a été conduit sur un sol argileux du domaine de l'INRA - Dijon, et une partie secondaire a concerné un sol sableux de la région. Ces sols étaient au départ dépourvus de B. japonicum.
Les caractéristiques essentielles sont données dans le tableau 2.
2~L7~
Tableau 2 : Caractéristiques des sols utilisés pour les essais au champ CaractéristiquesSol argileux Sol 5 sableux Granulometrie en g/kg argile 382 75 limon 562 227 sable 56 698 Humidite equivalente en p 100 28.1 9.9 Carbone organique methode Anne 16.06.9 15 en g/k Matières organiques en g/kg 27.5 11.9 Azote organique total en g/kg 1.560.67 (Méthode Kjeldahl) pH eau 7.0 7.3 Calcaire total 0 0 25 Capacite d'echange cationique Metson en meq p 100 21.7 4.3 Essais au laboratoire.
Ils ont ete realises pour leur presque totalite avec le même sol argileux que celui utilise pour les essais au champ. Ce sol est depourvu de B. japonicum.
PLANTE
Tous les essais ont ete realises avec la variete de soja Maple Arrow, de type indetermine et appartenant au groupe de precocite OO.
INOCULUMS
En cas d'utilisation de la souche G49 normale, l'inoculum, tourbe ou liquide, est un produit commercial ("Biodoz", de la Societe LIPHA ).
L'inocolum de la souche G49 resistante (G49RfKm) est produit au laboratoire.
Une fiole contenant un milieu de culture liquide,a base d'extrait de malt, est inoculee stérilement a partir d'un tube gélosé contenant la W094/06733 214 ~ ~ 3 9 16 PCT/FR93/00901 souche. Elle est ensuite placée sur une table d'agitation (200 rpm) a 28 C pendant 6 a 7 jours. La culture obtenue alors constitue l'inoculum liquide utilise, qui peut être conserve plusieurs mois a 4 C.
Pour la production d'inoculum tourbe, on part d'une tourbe stérile de même origine que celle de l'inoculum commercial. Dans un flacon contenant 30g de ce produit, a 12% d'humidité, on ajoute 12 ml d'inoculum liquide. Après homogénéisation et maturation 2 a 3 s~ines a température ambiante, on obtient un produit qui a sensiblement les memes propriétés que la tourbe commerciale: humidité de 55-60%, richesse de 1'ordre de 109 germes par gramme de tourbe.
TECHNIQUES D'INOCULATION DES MICROGRANULES
On a retenu une proportion correspondant a celle de l'inoculation au champ, soit 4 ~ d'inoculum pur par rapport aux microgranules.
Compte tenu des quantites nécessaires pour l'introduction dans le sol, des facilités de manipulation et de la précision espérée, on a travaillé sur des lots de 25 g de microgranules (mesurés secs et sans enrichissement), en flacons de 250 ml.
Pour l'utilisation avec l'inoculum tourbe, les microgranulés sont d'abord humidifiés au niveau voulu.
Ensuite, chaque lot est inoculé avec 1 a 1,3 g d'inoculum, le tout étant homogénéisé, puis utilisé
dans les minutes suivantes.
Lorsqu'ils sont employés avec un inoculum liquide, les microgranulés, secs au départ, reçoivent un inoculum préalablement dilué de facon a apporter simultanement 1 ml d'un inoculum pur pour 25 g de microgranulés, mais aussi la quantité d'eau nécessaire pour être a l'humidité voulue (7,5 ml pour K et 3,25 W094/06733 21~ ~ 7 ~ 9 PCT/FR93/00901 17 ~
ml pour M dans la plupart des expérimentations). Après agitation pour homogénéisation, les microgranules sont - utilises rapidement.
Techniques d'introduction dans les sols et d'incubation Après tamisage à 4 mm ou à 2 mm, les sols sont introduits dans des flacons en verre, soit à raison de 50 g de sol sec dans un flacon de 500 ml, soit de 20 g dans 250 ml. L'humidité est ajustee 24 h à l'avance, en general au niveau de 80 ~ de la capacite de retention en eau.
Dans ces flacons, sont introduits respectivement 300 mg et 120 mg de microgranules, ce qui represente respectivement environ 4500 et 1800 microgranules pour K, 2100 et 800 pour M.
Les flacons sont ensuite agités manuellement de façon à répartir les microgranulés dans tout le volume de sol.
Les flacons inoculés sont mis à incuber en les fermant avec un film plastique, destiné à empêcher la perte d'eau tout en permettant les échan~es respiratoires. Ils sont ensuite placés à l'obscurité, en general à 20- C, mais aussi à 15- C ou à 28- C pour certains essais.
Les denombrements sont realises sur la totalite d'un flacon après plusieurs jours d'incubation.
Denombrements en boîtes de Petri L'essentiel des mesures consiste en des denombrements de populations de B. japonicum capables de former des colonies sur boîtes de Petri contenant un milieu de culture gelose. Ces denombrements sont realises à plusieurs stades de l'inoculation :
- inoculums eux-mêmes, avant utilisation, sur des ~uantites generalement de 1 ml ou 1 g, - microgranules après inoculation, en W O 94/06733 PC~r/FR93/00901 w14~7~ 18 travaillant soit sur la totalité d~un lot, soit sur des aliquotes, - sols ayant reçu des microgranulés inoculés, en travaillant sur la totalité du contenu d'un flacon.
5Les produits a dénombrer pour leur richesse en B. japonicum sont introduits dans 100 ml d'une solution d'extraction et placés sur une table d'agitation (200 rpm) pendant 30 minutes.
Des dilutions successives sont ensuite réalisées au 1/10, et les suspensions bactériennes obtenues sont étalees sur les milieux de denombrement par l'une des deux methodes suivantes.
En absence de sol, un appareil (Spiral System) dépose un volume connu de la suspension sur le milieu gelose d'une boîte de Petri. Celle-ci est ensuite mise a incuber à 28- C, puis les colonies presentes sont denombrees a 5 ou 6 jours, d'ou un comptage en ufc (unites formant une colonie). Un calcul a partir des dilutions utilisees permet de determiner la richesse du produit à analyser.
En presence de sol, l'sppareil precedent est inutilisable, et les denombrements sont realises par la methode appelee "double couche". Un faible volume, 0,1 ou 0,2 ml, d'une suspension a denombrer est introduite dans un tube a hémolyse contenant 3 ml de solution gelosee à 0,7 % en surfusion (43 C). Apres homogeneisation, ce melange est etale sur une boîte de Petri contenant le milieu de culture gelose, ainsi que les antibiotiques et fongicides auxquels la souche G49RfKm est resistante.
Apres incubation 7 jours a 28- C, les colonies presentes sur les boîtes sont denombrees, les dilutions etant realisees de façon a compter entre 30 et 300 colonies par boîte.
35Tous les denombrements sont realises avec 3 ~1~4739 W O 94/06733 PC~r/FR93/00901 1~ , ,, répétitions pour chaque traitement, et les résultats sont donnés avec les écarts-type calculés.
- Essais au champ Les essais mis en place sur les sols précédemment décrits sont des dispositifs à 4 blocs complets.
Le semis est effectué fin Avril-début Mai, l'objectif étant d'apporter 600 000 graines par hectare (variété Maple Arrow) inoculées a la dose agronomique, soit 10 kg de microgranulés par hectare, en lignes espacées de 30 cm. Ceux-ci sont enrichis et inoculés dans les mêmes conditions que pour les travaux au laboratoire, en lots de 1 kg, l'inoculation ayant lieu au champ quelques minutes avant le semis.
L'irrigation est réalisée en cours de saison, en fonction des besoins de la culture.
RESULTATS
Les résultats des expérimentations sont rapportés ci-apres.
La figure 1 résume les résultats obtenus lors d'essais de laboratoire, comparant des microgranulés enrichis(E) ou non enrichis (M), inoculés par un inocolum liguide et incubés dans un sol non stérilisé, maintenu humide (H) ou soumis a la dessication (S).
Nombre de germes B. japonicum récupérés apres inoculation en liguide sur microgranulés et introduction dans le sol, en fonction du temps et selon le déssechement du sol en cours d'incubation.
Les légendes de la figure sont : N = microgranulés non enrichis, E = microgranulés enrichis GLY3C, H= sol maintenu humide (82% de la capacité de rétention en eau) pendant les 21 jours, S = sol soumis a un déssechement naturel apres 7 jours d'incubation.
D'apres les résultats illustrés sur la figure 1, on voit que :
W094/06733 ~1~ 4 7 3 9 20 PCT/FR93/0090l - apres 7 jours, les microgranulés enrichis permettent d'obtenir une multiplication de B.
japonicum d'un facteur supérieur à 10 par rapport aux microgranulés non enrichis, - apres 21 jours, les microgranulés enrichis maintiennent le nombre de B. japonicum à un niveau 10 fois supérieur à celui obtenu avec les microgranules non enrichis quand le sol est maintenu humide et a un niveau plus de 100 fois superieur quand le sol se desseche.
Les tableaux 3 à 7 resument les resultats obtenus lors d'essais au champ. Pour chaque tableau, les donnees d'une même colonne suivies de la même lettre ne sont pas statistiquement differentes au seuil de 5 % suivant le test de Newman et Keuls.
Dans les tableaux 3 et 4, sont rassembles les premiers resultats obtenus au cours d'essais au champ en 1988 et 1989 respectivement. Ils montrent un effet significatif de l'enrichissement sur la nodulation.
Les tableaux 5, 6 et 7 concernent des essais effectues en 1990 et 1991 avec diverses conditions de traitement, telles qu'indiquées en bas de chaque tableau.
Dans le tableau 5, les traitements correspondant à l'invention (microgranulés enrichis inocules par un inoculum tourbe) sont les traitements
3, 6, 8, 10.
On peut constater une augmentation du nombre de nodosites par plantes au stade V3, générale pour tous les traitements, comparé au témoin microgranulés non enrichis (traitement 2). Cette augmentation est significative seulement pour les traitements 6 et 10.
De même, on obtient une augmentation du taux d'azote des graines pour les traitements 3, 6, 8, 10, significative seulement pour les traitements 8 et 10.
Dans le tableau 6, les traitements 2, 6, 9 et 10 correspondent a l'invention (microgranulés enrichis - inoculés par inoculum tourbe (2 et 6), ou par inoculum liquide (9 et lO)).
Avec un inoculum tourbe (2 et 6 compares a 1), on constate une augmentation du nombre de nodules, non significative au stade V3, mais significative au stade R4 pour le traitement 6 (ajout d'un fongicide dans l'enrichissement).
Avec un inoculum liquide (lO comparé à 9), on obtient une augmentation significative de la nodulation a V3 et R4, ainsi qu'une augmentation significative du taux d'azote des graines.
Dans le tableau 7, les traitements 2, 3, 4, 5, (inoculés avec un inoculum tourbe) et 10 (inoculé avec un inoculum liquide) correspondent a l'invention.
Avec l'inoculum tourbe (2, 3, 4, 5 comparés a 1), on obtient des augmentations non significatives de la nodulation aux stades V3 et R4, mais des augmentations significatives du taux d'azote des graines. A noter que ce dernier effet est obtenu avec différents substrats carbonés.
Avec l'inoculum liquide (10 comparé a 9), on obtient une augmentation significative importante de la nodulation (V3 et R4) et du taux d'azote des graines.
EXEMPLE 2: Microqranulés inoculés Par Fusarium ou Pseudomonas.
Parmi les malsdies cryptogamiques dont sont affectées les plantes maraîcheres et les plantes horticoles, la fusariose vasculaire, trachéomycose dûe aux formes pathogenes du champignon Fusarium oxysporum, est l'une des plus problématiques car il n'existe pas a ce jour de moyen de lutte chimique spécifique.
W094/06733 ~J l ~ 47 3 22 PCT/FR93/0090l Par contre, la lutte biologique faisant appel à
la compétition entre une forme non pathogene et la forme pathogène spécifique de la meme espece de Fusarium oxysporum donne des resultats satisfaisants dans les conditions de culture sous serre, soit en substrat artificiel, soit en sol désinfecté. Le principe consiste a introduire l'inoculum non pathogène dans le substrat au moment du semis ou du repiquage. De plus, l'effet antagoniste de souches non pathogenes de F.oxysporum peut etre augmenté si l'on co-inocule certaines bactéries fluorescentes appartenant au genre Pseudomonas.
Le but des expérimentations de cet exemple est de tester un mode de formulation original qui consiste a donner un avantage compétitif a l'inoculum par incorporation d'une source de nutriments dans le support de formulation. Les dynamiques de populations de bactéries du genre Pseudomonas Sp. ont été mesurées a la fois en sol natural et en sol désinfecté.
L'activité des microorganismes inoculés a également été testée dans des biotests réalisés en serre utilisant le couple plante hôte-pathogene lin F.oxysporum f.sp. lini.
MATERIEL ET METHODES
1- Les souches et les véqétaux.
Fusarium oxysporum souche Fo47B10, mutant spontané résistant au bénomyl de la souche Fo47 utilisée en lutte biologique (n- de collection CNCM I-1363).
Fusarium oxysporum f.sp. lini, souche Foln 3, (n de collection CNCM I-1362) pathogene du lin.
Pseudomonas fluorescent souche C7R12 mutant spontané résistant a la rifampycine de la couche C7 utilisée en lutte biologique (n de collection CNCM I-35 1361).
Le lin Linum usitatissimum, variété Opaline, sensible a la fusariose vasculaire.
2- Le sol.
Sol limono-argileux prélevé dans la région de Dijon, séché à l'air et tamisé a 2mm. (composition:
sable 15 ~, limon 47%, argile 35%, C 1.2 %, CaC03 0%, pH 6,9).
Le sol est distribué dans des containers en aluminium a raison de 140 g de sol sec/container. Le sol désinfecté a été passé 3 fois 1 heure a l'autoclave a 120 C a 24h d'intervalle. L'humidité du sol est ajustée a pF3 ( 20% sol sec) lors de l'inoculation.
3. Les inoculums 3.1- PréParation des inoculums fonqiques Pour les biotests.
Les champignons sont cultivés 5 ~ours sur milieu malt liquide agité a 25-C (malt Difco lOg, eau déminéralisée 1000 ml). La culture est ensuite filtrée pour éliminer le mycélium. Les spores contenues dans le filtrat sont lavées 3 fois a l'eau stérile par centrifugation 20 min, 4000 g.
L'inoculum de la souche de Fusarium non-pathogene Fo47B10 est préparé sous forme d'inoculum liquide (suspension de spores dans l'eau stérile).
L'inoculum de la souche de Fusarium pathogene Foln3 est préparé sous forme de formulation talc: le culot final est repris dans un volume d'eau minimum (environ 20% du volume initial de la culture) et est incorporé a du talc vierge (1 volume de culot -2 volumes de talc). Le mélange est mis a sécher 48h dans une étuve ventilée a 20 C. Le talc est ensuite pulvérisé et tamisé a 200 ym. Il est conservé a 4 C.
Son titre est mesuré avant toute utilisation. Le talc inoculé est éventuellement dilué dans du talc vierge W094/06733 ~ 24 PCT/FR93/0090l lorsque des faibles densités d'inoculum sont nécessaires.
3.2. Préparation des inoculums bactériens Dans ce cas, l'argile est enrichie avec du glycérol comme source de carbone a raison de 120 g de glycérol/kg d'argile. Les bactéries produites sur milieu solide King B (Peptone Difco 20g, glycérine 12.6g, K2HPO4 1.3g, MgSO47H2O 1.5g, Agar 15g, eau distillée 1000 ml) sont récupérées dans de l'eau stérile et lavées 3 fois par centrifugation (20 min, 4000g). Elles sont incorporées a l'argile au moment de leur introduction dans le sol.
Les témoins sont réalisés par inoculation directe de la suspension de bactéries lavées dans un volume permettant d'ajuster l'humidité à la valeur de pF3.
On peut constater une augmentation du nombre de nodosites par plantes au stade V3, générale pour tous les traitements, comparé au témoin microgranulés non enrichis (traitement 2). Cette augmentation est significative seulement pour les traitements 6 et 10.
De même, on obtient une augmentation du taux d'azote des graines pour les traitements 3, 6, 8, 10, significative seulement pour les traitements 8 et 10.
Dans le tableau 6, les traitements 2, 6, 9 et 10 correspondent a l'invention (microgranulés enrichis - inoculés par inoculum tourbe (2 et 6), ou par inoculum liquide (9 et lO)).
Avec un inoculum tourbe (2 et 6 compares a 1), on constate une augmentation du nombre de nodules, non significative au stade V3, mais significative au stade R4 pour le traitement 6 (ajout d'un fongicide dans l'enrichissement).
Avec un inoculum liquide (lO comparé à 9), on obtient une augmentation significative de la nodulation a V3 et R4, ainsi qu'une augmentation significative du taux d'azote des graines.
Dans le tableau 7, les traitements 2, 3, 4, 5, (inoculés avec un inoculum tourbe) et 10 (inoculé avec un inoculum liquide) correspondent a l'invention.
Avec l'inoculum tourbe (2, 3, 4, 5 comparés a 1), on obtient des augmentations non significatives de la nodulation aux stades V3 et R4, mais des augmentations significatives du taux d'azote des graines. A noter que ce dernier effet est obtenu avec différents substrats carbonés.
Avec l'inoculum liquide (10 comparé a 9), on obtient une augmentation significative importante de la nodulation (V3 et R4) et du taux d'azote des graines.
EXEMPLE 2: Microqranulés inoculés Par Fusarium ou Pseudomonas.
Parmi les malsdies cryptogamiques dont sont affectées les plantes maraîcheres et les plantes horticoles, la fusariose vasculaire, trachéomycose dûe aux formes pathogenes du champignon Fusarium oxysporum, est l'une des plus problématiques car il n'existe pas a ce jour de moyen de lutte chimique spécifique.
W094/06733 ~J l ~ 47 3 22 PCT/FR93/0090l Par contre, la lutte biologique faisant appel à
la compétition entre une forme non pathogene et la forme pathogène spécifique de la meme espece de Fusarium oxysporum donne des resultats satisfaisants dans les conditions de culture sous serre, soit en substrat artificiel, soit en sol désinfecté. Le principe consiste a introduire l'inoculum non pathogène dans le substrat au moment du semis ou du repiquage. De plus, l'effet antagoniste de souches non pathogenes de F.oxysporum peut etre augmenté si l'on co-inocule certaines bactéries fluorescentes appartenant au genre Pseudomonas.
Le but des expérimentations de cet exemple est de tester un mode de formulation original qui consiste a donner un avantage compétitif a l'inoculum par incorporation d'une source de nutriments dans le support de formulation. Les dynamiques de populations de bactéries du genre Pseudomonas Sp. ont été mesurées a la fois en sol natural et en sol désinfecté.
L'activité des microorganismes inoculés a également été testée dans des biotests réalisés en serre utilisant le couple plante hôte-pathogene lin F.oxysporum f.sp. lini.
MATERIEL ET METHODES
1- Les souches et les véqétaux.
Fusarium oxysporum souche Fo47B10, mutant spontané résistant au bénomyl de la souche Fo47 utilisée en lutte biologique (n- de collection CNCM I-1363).
Fusarium oxysporum f.sp. lini, souche Foln 3, (n de collection CNCM I-1362) pathogene du lin.
Pseudomonas fluorescent souche C7R12 mutant spontané résistant a la rifampycine de la couche C7 utilisée en lutte biologique (n de collection CNCM I-35 1361).
Le lin Linum usitatissimum, variété Opaline, sensible a la fusariose vasculaire.
2- Le sol.
Sol limono-argileux prélevé dans la région de Dijon, séché à l'air et tamisé a 2mm. (composition:
sable 15 ~, limon 47%, argile 35%, C 1.2 %, CaC03 0%, pH 6,9).
Le sol est distribué dans des containers en aluminium a raison de 140 g de sol sec/container. Le sol désinfecté a été passé 3 fois 1 heure a l'autoclave a 120 C a 24h d'intervalle. L'humidité du sol est ajustée a pF3 ( 20% sol sec) lors de l'inoculation.
3. Les inoculums 3.1- PréParation des inoculums fonqiques Pour les biotests.
Les champignons sont cultivés 5 ~ours sur milieu malt liquide agité a 25-C (malt Difco lOg, eau déminéralisée 1000 ml). La culture est ensuite filtrée pour éliminer le mycélium. Les spores contenues dans le filtrat sont lavées 3 fois a l'eau stérile par centrifugation 20 min, 4000 g.
L'inoculum de la souche de Fusarium non-pathogene Fo47B10 est préparé sous forme d'inoculum liquide (suspension de spores dans l'eau stérile).
L'inoculum de la souche de Fusarium pathogene Foln3 est préparé sous forme de formulation talc: le culot final est repris dans un volume d'eau minimum (environ 20% du volume initial de la culture) et est incorporé a du talc vierge (1 volume de culot -2 volumes de talc). Le mélange est mis a sécher 48h dans une étuve ventilée a 20 C. Le talc est ensuite pulvérisé et tamisé a 200 ym. Il est conservé a 4 C.
Son titre est mesuré avant toute utilisation. Le talc inoculé est éventuellement dilué dans du talc vierge W094/06733 ~ 24 PCT/FR93/0090l lorsque des faibles densités d'inoculum sont nécessaires.
3.2. Préparation des inoculums bactériens Dans ce cas, l'argile est enrichie avec du glycérol comme source de carbone a raison de 120 g de glycérol/kg d'argile. Les bactéries produites sur milieu solide King B (Peptone Difco 20g, glycérine 12.6g, K2HPO4 1.3g, MgSO47H2O 1.5g, Agar 15g, eau distillée 1000 ml) sont récupérées dans de l'eau stérile et lavées 3 fois par centrifugation (20 min, 4000g). Elles sont incorporées a l'argile au moment de leur introduction dans le sol.
Les témoins sont réalisés par inoculation directe de la suspension de bactéries lavées dans un volume permettant d'ajuster l'humidité à la valeur de pF3.
4- Les analyses Chaque container constitue une unité
expérimentale. 3 unités expérimentales constituant 3 répétitions indépendantes sont réalisées pour un traitement donné. Les containers incubent a 25-C. Les dynamiques de population sont suivies pendant 20 a 30 jours.
A intervalles de temps réguliers, 5g de sol par unité expérimentale sont prélevés, mis en suspension dans 100 ml d'eau et agités fortement pendant 15 min sur un agitateur constituant les suspensions meres.
Une série de suspensions dilutions au 1/10 est réalisée a partir de chacune de ces suspensions meres.
Les dénombrements fongiques sont réalisés par incorporation de 1 ml de la suspension au niveau de dilution considéré dans du milieu malt agar+bénomyl en surfusion (malt lOg, agar 15g, acide citrique apres autoclavage 250 mg, Benomyl apres autoclavage 10 mg sous forme de benlate a 50% de matiere active, eau 21 4 ~
déminéralisée 1000 ml). 5 boîtes par niveau de dilution sont ensemencées.
Les dénombrements bacteriens sont realisés par étalement aux billes de 100 ~1 de la suspension au niveau de dilution considére sur du milieu King B agar additionne de 75 mg/l de rifampycine. Trois boîtes par niveau de dilution sont ensemencees.
Les boîtes sont mises à incuber à 25-C et sont lues apres 24h pour les bacteries et 48 a 72h pour les champignons.
expérimentale. 3 unités expérimentales constituant 3 répétitions indépendantes sont réalisées pour un traitement donné. Les containers incubent a 25-C. Les dynamiques de population sont suivies pendant 20 a 30 jours.
A intervalles de temps réguliers, 5g de sol par unité expérimentale sont prélevés, mis en suspension dans 100 ml d'eau et agités fortement pendant 15 min sur un agitateur constituant les suspensions meres.
Une série de suspensions dilutions au 1/10 est réalisée a partir de chacune de ces suspensions meres.
Les dénombrements fongiques sont réalisés par incorporation de 1 ml de la suspension au niveau de dilution considéré dans du milieu malt agar+bénomyl en surfusion (malt lOg, agar 15g, acide citrique apres autoclavage 250 mg, Benomyl apres autoclavage 10 mg sous forme de benlate a 50% de matiere active, eau 21 4 ~
déminéralisée 1000 ml). 5 boîtes par niveau de dilution sont ensemencées.
Les dénombrements bacteriens sont realisés par étalement aux billes de 100 ~1 de la suspension au niveau de dilution considére sur du milieu King B agar additionne de 75 mg/l de rifampycine. Trois boîtes par niveau de dilution sont ensemencees.
Les boîtes sont mises à incuber à 25-C et sont lues apres 24h pour les bacteries et 48 a 72h pour les champignons.
5- Les biotests Les traitements identiques a ceux prevus pour les dynamiques de population sont realises de maniere concommitante a ces derniers et incubent dans les mêmes conditions. Les containers sont ouverts aussi frequemment que ceux destines a l'étude des dynamiques. Les biotests sont realises apres que les populations aient atteint un plateau en l'occurrence, apres 30 jours d'incubation.
Le principe des biotests consiste à introduire dans le sol contenant soit la souche de Fusarium Fo47B10, soit la souche de Pseudomonas C7R12 soit les deux, une souche de Fusarium oxysporum pathogene du lin, la souche Foln3 est de cultiver du lin sur ce sol. L'activite antagoniste de Fo47B10 et de C7R12 est mesuree relativement au nombre de plantes saines restantes.
3g de talc apportant 104 propagules de Foln3/g de sol sont melanges au sol de chaque container (melange realise au Turbula type T2C, 20'). Pour les experimentations de co-inoculation, la souche Fo47B10 est apportee sous forme d'une suspension de spores apres l'incorporation de l'argile inoculee par Pseudomonas, dans un volume qui permet d'ajuster l'humidite a la valeur de pF3.
W 0 94/06733 ~ ~ A 4 ~ 3 9 26 PC~r/FR93/00901 Les densites théoriques d'inoculum sont de 105, 104 et 107 CEU/g de sol sec pour respectivement Fo47B10, Foln3 et C7R12, quelque soit le mode de formulation. Les formulations argile, argile enrichie et liquide sont codées A, Ae, et L respectivement dans le texte et dans les figures. Le sol est ensuite réparti dans les 12 puits d'une rangée d'une plaque de polystyrene comportant 20 rangées. Le volume d'un puits est d'environ 10 ml. Les plaques sont placées en chambre climatisée dans les conditions suivantes:
photopériode 15h-9h, intensité lumineuse 13000 lux, humidite 80% la nuit et 60% le jour, température 15 C
la nuit et 17 C le jour pendant 15 jours puis 20-C la nuit et 26 C le jour les 8 semaines restantes. Les arrosages sont effectués 2 fois/jour a l'eau du robinet et 1 fois/semaine avec de la solution nutritive.
Notation: Les notations sont faites tous les trois jours a partir de la 3eme semaine apres la date de mise en place du biotest en chambre climatisée. Les plantes présentant des symptômes de fusariose sont coupées (un isolement est réalisé pour vérification) et le nombre de plantes saines restantes est enregistré et exprimé sous forme d'un pourcentage relatif au nombre initial de plantes.
RESULTATS
1. DYNAMIOUES DE POPULATIONS:
1.1 Dynamique de Population de C7R12 en sol naturel.
Les résultats sont représentés sur la figure 2 dans laquelle L, A et Ae signifient respectivement culture liquide, argile et argile enrichi.
L'inoculum apporte est en théorie de 107 bactéries/g de sol sec. L'inoculum liquide autorise une récupération immédiate des germes de 70%, et les 7 ~ ~
populations de Pseudomonas se maintiennent à une densité proche de la valeur initiale, soit 3,2 107.
L'inocolum A autorise une recupération immédiate des germes de 1,3% et se stabilise dans le sol a ce niveau. Par contre, si l'inoculum Ae n'autorise qu'une récupération immédiate des germes de 0,02%, la population inoculée selon cette formulation passe de 1,3 105 a 8,5 107 en 4 jours et se stabilise a un niveau supérieur a la population obtenue avec l'inoculum liquide.
1.2 DYnamique de PoPulation de C7R12 en sol désinfecté.
La encore, le pourcentage de récupération varie avec le type de formulation. Il est de 42% pour la formulation liquide contre 0,6% pour la formulation Ae. Dans tous les cas, la densité de la population de Pseudomonas augmente fortement. Les plateaux atteints par les traitements L et A sont proches et voisins de 108 par exces. Ce plateau est superieur dans le cas du traitement Ae où la densite atteinte est superieure a 109 (2,3 109) bacteries/g sol sec.
Les résultats sont représentés sur la figure 3.
II. A~llvll~ ANTAGONISTE
2.1- C7R12 en sol naturel.
Les résultats sont repris sur la figure 4. La souche Fo47blO seule occasionne un retard important dans l'apparition des symptômes. La co-inoculation avec Pseudomonas augmente légerement ce retard et aboutit à l'issue du test à un pourcentage de survie supérieur a celui obtenu avec Fo47B10 seul, mais il n'est pas possible de différencier les deux formulations A et Ae.
2.2- C7R12 en sol desinfecte.
Comme le montre la figure 5, la souche Fo47B10 ne fait que retarder l'apparition des symptômes, mais ~ 1 447~ 28 dans une proportion moindre que celle observee dans le cas du sol naturel. La co-inoculation avec Pseudomonas formule A permet d'augmenter ce retard. La plus grande efficacite est cependant obtenue avec la formulation Ae.
DISCUSSION - CONCLUSION
On constate que l'apport de nutriments azotes et carbones dans le support de formulation (Ae) permet une croissance tres importante des populations bacteriennes introduites, aussi bien en sol naturel qu'en sol desinfecte. Si la croissance de bacteries introduites en sol desinfecte n'est pas un phenomene nouveau, on peut constater neanmoins que la capacite biotique du milieu a ete augmentee par l'apport d'argile enrichie, alors que les plateaux obtenues avec les deux autres modes de formulation sont confondus. Par contre, la croissance d'une population bacterienne et son etablissement a une densite elevee (> 107 bacteries/g sol sec) n'ont que rarement ete decrits en sol naturel.
On observe une meilleure efficacite protectr~ce de la co-inoculation Fusarium-Pseudomonas en s~l desinfecte via la formulation Ae qui s'explique, par une densite plus elevee de la population bacterienne.
En sol naturel, cet effet est moins marque car l'efficacite propre de Fusarium importante dans ce cas peut difficilement etre amelioree mais la tendance va cependant dans le sens d'un effet benefique de la formulation Ae.
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FEUlllE DE REMPLACEMENT
Le principe des biotests consiste à introduire dans le sol contenant soit la souche de Fusarium Fo47B10, soit la souche de Pseudomonas C7R12 soit les deux, une souche de Fusarium oxysporum pathogene du lin, la souche Foln3 est de cultiver du lin sur ce sol. L'activite antagoniste de Fo47B10 et de C7R12 est mesuree relativement au nombre de plantes saines restantes.
3g de talc apportant 104 propagules de Foln3/g de sol sont melanges au sol de chaque container (melange realise au Turbula type T2C, 20'). Pour les experimentations de co-inoculation, la souche Fo47B10 est apportee sous forme d'une suspension de spores apres l'incorporation de l'argile inoculee par Pseudomonas, dans un volume qui permet d'ajuster l'humidite a la valeur de pF3.
W 0 94/06733 ~ ~ A 4 ~ 3 9 26 PC~r/FR93/00901 Les densites théoriques d'inoculum sont de 105, 104 et 107 CEU/g de sol sec pour respectivement Fo47B10, Foln3 et C7R12, quelque soit le mode de formulation. Les formulations argile, argile enrichie et liquide sont codées A, Ae, et L respectivement dans le texte et dans les figures. Le sol est ensuite réparti dans les 12 puits d'une rangée d'une plaque de polystyrene comportant 20 rangées. Le volume d'un puits est d'environ 10 ml. Les plaques sont placées en chambre climatisée dans les conditions suivantes:
photopériode 15h-9h, intensité lumineuse 13000 lux, humidite 80% la nuit et 60% le jour, température 15 C
la nuit et 17 C le jour pendant 15 jours puis 20-C la nuit et 26 C le jour les 8 semaines restantes. Les arrosages sont effectués 2 fois/jour a l'eau du robinet et 1 fois/semaine avec de la solution nutritive.
Notation: Les notations sont faites tous les trois jours a partir de la 3eme semaine apres la date de mise en place du biotest en chambre climatisée. Les plantes présentant des symptômes de fusariose sont coupées (un isolement est réalisé pour vérification) et le nombre de plantes saines restantes est enregistré et exprimé sous forme d'un pourcentage relatif au nombre initial de plantes.
RESULTATS
1. DYNAMIOUES DE POPULATIONS:
1.1 Dynamique de Population de C7R12 en sol naturel.
Les résultats sont représentés sur la figure 2 dans laquelle L, A et Ae signifient respectivement culture liquide, argile et argile enrichi.
L'inoculum apporte est en théorie de 107 bactéries/g de sol sec. L'inoculum liquide autorise une récupération immédiate des germes de 70%, et les 7 ~ ~
populations de Pseudomonas se maintiennent à une densité proche de la valeur initiale, soit 3,2 107.
L'inocolum A autorise une recupération immédiate des germes de 1,3% et se stabilise dans le sol a ce niveau. Par contre, si l'inoculum Ae n'autorise qu'une récupération immédiate des germes de 0,02%, la population inoculée selon cette formulation passe de 1,3 105 a 8,5 107 en 4 jours et se stabilise a un niveau supérieur a la population obtenue avec l'inoculum liquide.
1.2 DYnamique de PoPulation de C7R12 en sol désinfecté.
La encore, le pourcentage de récupération varie avec le type de formulation. Il est de 42% pour la formulation liquide contre 0,6% pour la formulation Ae. Dans tous les cas, la densité de la population de Pseudomonas augmente fortement. Les plateaux atteints par les traitements L et A sont proches et voisins de 108 par exces. Ce plateau est superieur dans le cas du traitement Ae où la densite atteinte est superieure a 109 (2,3 109) bacteries/g sol sec.
Les résultats sont représentés sur la figure 3.
II. A~llvll~ ANTAGONISTE
2.1- C7R12 en sol naturel.
Les résultats sont repris sur la figure 4. La souche Fo47blO seule occasionne un retard important dans l'apparition des symptômes. La co-inoculation avec Pseudomonas augmente légerement ce retard et aboutit à l'issue du test à un pourcentage de survie supérieur a celui obtenu avec Fo47B10 seul, mais il n'est pas possible de différencier les deux formulations A et Ae.
2.2- C7R12 en sol desinfecte.
Comme le montre la figure 5, la souche Fo47B10 ne fait que retarder l'apparition des symptômes, mais ~ 1 447~ 28 dans une proportion moindre que celle observee dans le cas du sol naturel. La co-inoculation avec Pseudomonas formule A permet d'augmenter ce retard. La plus grande efficacite est cependant obtenue avec la formulation Ae.
DISCUSSION - CONCLUSION
On constate que l'apport de nutriments azotes et carbones dans le support de formulation (Ae) permet une croissance tres importante des populations bacteriennes introduites, aussi bien en sol naturel qu'en sol desinfecte. Si la croissance de bacteries introduites en sol desinfecte n'est pas un phenomene nouveau, on peut constater neanmoins que la capacite biotique du milieu a ete augmentee par l'apport d'argile enrichie, alors que les plateaux obtenues avec les deux autres modes de formulation sont confondus. Par contre, la croissance d'une population bacterienne et son etablissement a une densite elevee (> 107 bacteries/g sol sec) n'ont que rarement ete decrits en sol naturel.
On observe une meilleure efficacite protectr~ce de la co-inoculation Fusarium-Pseudomonas en s~l desinfecte via la formulation Ae qui s'explique, par une densite plus elevee de la population bacterienne.
En sol naturel, cet effet est moins marque car l'efficacite propre de Fusarium importante dans ce cas peut difficilement etre amelioree mais la tendance va cependant dans le sens d'un effet benefique de la formulation Ae.
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FEUlllE DE REMPLACEMENT
Claims (15)
1. Procédé pour améliorer le rendement des cultures agricoles, dans lequel on utilise un inoculum contenant au moins une culture microbienne et des microgranulés, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'on utilise des microgranulés préparés à l'avance, lesdits microgranulés contenant une substance , notamment un substrat nutritif, capable de favoriser la croissance des germes de l'inoculum et lesdits microgranulés étant inoculés au moment de l'emploi par un inoculum microbien.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise des microgranulés de nature minérale ou organique ou des mélanges de tels granulés, obtenus par broyage ou granulation.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise des granulés d'origine minérale, tels que des argiles industrielles et les mélanges argileux.
4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise des microgranulés d'origine organique, par exemple à base de tourbe, compost, résidus végétaux et autres.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les microgranulés ont une dimension de grain convenant à
l'épandage avec les engins agricoles usuels, notamment une granulométrie de l'ordre de 0,2 a 0,8 mm.
l'épandage avec les engins agricoles usuels, notamment une granulométrie de l'ordre de 0,2 a 0,8 mm.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que l'enrichissement des microgranulés a l'avance est réalisée par inhibition, immersion ou pulvérisation des microgranulés et séchage ultérieur, par granulation d'une suspension de matériau solide et du substrat d'enrichissement ou par mélange des microgranulés avec les substrats d'enrichissement finement broyés.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce à titre de substance ou substrat d'enrichissement, on utilise tout produit capable de favoriser la survie et la multiplication du germe à inoculer soit directement, en permettant ou stimulant sa croissance, soit en limitant la croissance des germes compétiteurs du sol.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on utilise des substrats carbonés comme le glucose, le glycérol et toute autre source de carbone convenant à la croissance des micro-organiques ou bien des substrats carbonés spécifiques du germe à
favoriser.
favoriser.
9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on utilise d'autres produits, notamment azotés ou phosphorés et, d'une manière générale, tout nutriment susceptible de permettre la croissance du germe à inoculer.
10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'à titre de substance ou substrat d'enrichissement, on utilise des biocides compatibles avec le germe à inoculer, mais susceptibles d'inhiber la croissance des compétiteurs ou de la ralentir, tels que des produits actifs dans le sol contre les bactéries, les champignons et les protozoaires, ces produits pouvant notamment être choisis parmi les antibiotiques et les fongicides.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'inoculation met en oeuvre un ou plusieurs germes qui peuvent être apportés successivement ou en mélange.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que'on utilise des inoculums sur support solide, tel que la tourbe, des inoculums liquides ou des inoculums en gel ainsi que des inoculums lyophilisés.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que, à titre de micro-organismes pour l'inoculation, on utilise un ou plusieurs des micro-organismes destinés à favoriser directement la croissance des plantes, tels que Rhizobium, Bradyrhizobium, Azospirillum, ainsi que les champignons ecto et endomycorhizogènes, ainsi que les micro-organismes utilisables en lutte biologique contre les maladies des plantes et les ravageurs, comme les bactéries antagonistes des bactéries et des champignons phytopathogènes (P.G.P.R.: Plant Growth Promoting Rhizobacteria, Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus et autres genres similaires), les champignons antagonistes des champignons phytopathogènes (Fusarium, Trichoderma, et autres espèces similaires) et les bactéries et champignons entomopathogènes (Bacillus thuringiensis, Beauveria, et autres espèces similaires) et les micro-organismes utilisables dans la dépollution et la bioremédiation des sols.
14. Microgranulés comportant un support solide et au moins une substance capable de favoriser la croissance des germes d'un inoculum microbien avec lequel les microgranulés sont mis en contact au moment de l'emploi.
15. Microgranulés selon la revendication 14, préparés à l'avance et stockés séparément, notamment à
l'état sec.
l'état sec.
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