PT1423011E - Composição bioinaculante que inclui estirpes bacterianas, de b. subtilis ou de b. lentimorbus, do leite de vaca - Google Patents

Description

- 1 -DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÃO BIOINOCULANTE QUE INCLUI ESTIRPES BACTERIANAS DE B. SUBTILIS ou DE B. LENTIMORBUS, DO LEITE DE VACA"

Domínio Técnico A invenção presente diz respeito a uma composição sinergístíea útil a título de bioinoculante, contendo a composição referida estirpes bacterianas com os Nos. de acessão NRRL B-30486, NRRL B-30487, e NRRL-B 30488, indivíduaImente ou em todas as suas combinações possíveis, e opcionalmente um veículo, demonstrando cada uma destas estirpes uma actividade promotora de plantas, uma actívídade de controlo de fungos fitopatogénicos, uma capacidade de tolerância a condições de stress abiótico, uma capacidade de solubílização de fosfato em condições de stress abiótico; para além disto, um método de produzir a composição referida com elas, e para além disto , um método de se isolarem as estirpes bacterianas referidas a partir do leite da vaca 'Sahiwal'.

Estado dos Conhecimentos à Data da Invenção e do solo.

Existe uma O mundo microbiano é uns microcosmos cujas actividades são de importância central para a biosfera. Os produtos microbianos contribuem para a salubridade do ambiente, das plantas, pública, Λ ζ. diversidade notável de microrganismos, quanto à sua especialização ecológica e fisiológica. Eles evoluíram de modo a suportarem, e mesmo a florescerem, em quase qualquer nicho imaginável, por menos hospitaleiro que seja. Os microrganismos também formam uma série de associações com outros micróbios e com outras plantas e animais. Eles podem ser patogénicos, parasitas, simbiontes, comensais e saprófitas, e portanto, a sua influência ecológica propaga-se a todos os níveis tróficos da vida e a todas as gamas de ecossistemas possíveis. Os micróbios já comprovaram ser uma fonte excepcionaimente rica de novos produtos, e tudo índica que eles continuarão a desempenhar o mesmo papel no futuro. É portanto importante que se explore a biodiversidade para encontrarem novos micróbios que possuam significado ecológico ou valor económico. Isto tem levado os microbiologistas a continuar a pesquisar novos micróbios úteis a partir de fontes que permanecem não caracterizadas.

De acordo com a mitologia Hindu, bem como com as práticas da medicina tradicional Indiana (tanto as dos sistemas clássicos como o Ay urveda e o Siddha, como as práticas dos aldeões rurais), o leite de vaca tem propriedades saudáveis de rejuvenescimento e protecção da saúde, e tem sido afirmado tratar-se de um dos melhores agentes vitalizantes [Caraka-Samhita, Editor e tradutor P. Sharma, Chauidhambha Oríentalia, Varanasi, índia, volume 1, pág. 213 (1981); P. Pushpangadan, Ethncbiology in índia: A status report, Mínistry of Environment and Forests, Government of índia, New Delhi (1994); P.Pushpangadan, All 3 índia Coordínated research p moject on ethnobiology: Final technical report 1982-1938, Ministry of Environment and Forests, Governrnen t of índia, New Delhi (1998)]. 0 leite pode ser definido coroo a secreção normal da glândula mamária dos mamíferos. 0 leite tal como é segregado pela glândula dos mamíferos, é isento de microrganismos. No entanto, os microrganismos associados com a tera movem-se subindo o canal da teta e entram no interior do úbere [J. C. Olsen e G. Mccquot. Milk and milk Products. Em: International commission on microbiological specifications for foods. Mícrobial ecology of foods. Food commodities. Vol. 2. New York: Academic Press (1980) pp. 470-486]. Desta forma, mesmo o leite ordenhado assepticamente contém microrganismos, sobretudo bactérias. 0 número de bactérias presentes em leite mungido assepticamenue é habitualmente em número limitado e incluem sobretudo mi crococos, lactococos, estafilococos, estreptococos, e bacilos [F. L. Bryan, Journal of Food Protection, Volume 46, pp. 637-649 (1983); R. A. Ledford. Raw milk and fluid milk products. Em: Applied daíry mícrobiology. Editores E. H. Marth e J. L. Steele, New York : Mareei Dekker, Inc. (1998) págs. 55-64].

Sabe-se já há mais de quarenta anos, que a maior parte das bactérias que ocorrem habitualmente no leite o consideram um meio relativamente desfavorável e portanto pareceria que o leite possui propriedades de selectividade que são pronunciadas [T. Gibsor, e Y. A. Abd-El-Malek, 4

Canadian Journal of Microbiclogy, Volume 3, págs. 203-213, (1957)] . É por esta razão que a flora bacteriana que invadiu a teta e/ou o úbere tem que apresentar uma capacidade persistente de sobrevivência e multiplicação, nestas condições que não são as óptimas. 0 trabalho desenvolvido pelos autores sobre leite que se descreve neste pedido diz portanto respeito à sobrevivência da flora bacteriana na teta e/ou no úbere, após haver conseguido penetrar no leite obtido em ordenha asséptica, integrando a tarefa de pesquisa de novos micróbios, a partir de um ninho ecológico que ainda não estava caracterizado.

Melhorar a fertilidade do solo é uma das tácticas maís habituais para se aumentar a produção na agricultura e das florestas. Isolaram-se a partir do leite bactérias que beneficiam as plantas. Por inoculação de sementes ou do solo com microrganismos beneficiais, tem-se levado a cabo melhoramento de cultivares há longos anos. Foram identificados diversos mecanismos diferentes, como sendo responsáveis por essa promoção do crescimento das plantas. Por exemplo, determinados microrganismos promovem indírectamente o crescimento das plantas por inibirem o crescimento de microrganismos nocivos; ou aumentam, o crescimento das plantas dírectamente pela produção de hormonas de crescimento; e/ou adjuvando as plantas na tarefa de absorção de nutrientes, por exemplo fósforo (P) [C. S. Nautiyai et al. , FEMS Microbiology Letters, Volume 182, págs. 291-296 (2000)]. 5

No entanto, um factor importante para o insucesso na comercialização de bioinoculantes tem sido a inconsistência dos resultados de ensaios de campo, uma vez que o seu estabelecimento e o seu desempenho são fortemente afectados por factores ambientais, especialmente nas condições de stress que estão presentes no solo, por exemplo, relativas a sais, pH, e temperatura [C. S. Nautiyal et ai. , FEMS Microbiology Letters, Volume 182, págs. 291-296 (2000)]. Seria portanto desejável proporcionar estirpes bacterianas resistentes ao stress como bioinoculantes [C. S. Nautiyal, Biocontrol of plant diseases for agricultura.1 sustaínabílity. Em: Biocontrol potential and its exploitation in sustainabie agriculture. Volume 1, Eds, R. K.Upahyay, K. G.Mukerji, e B. P.Chamola, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York (2000) págs. 9-23]. Incluem-se nos microrganismos promotores do crescimento das plantas, sem que a estes se limitem, Rhizcbium, Pseudomonas, Azospíríllum, e Bacillus etc. [A. R. Saxena et al., Bacterial biocontrol agents and their role in plant disease management. Em: Biocontrol potential and íts exploitation in sustainabie agriculture. Volume 1, Eds. R.K. Upadhyay, K, G.Mukerji, e B. P. Chamola, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York (2000) págs. 25-37]. A utilidade do B. subtilis como fonte de antagonistas dos fungos patogénicos das plantas, Sclerotium rolfsií, está bem documentada [P. Broadbent et al.; Australían. Journal cf Biologícal Sciences, Volume 24, pág. 975 (1971)]. Baker et ai. [Phytopathoiogy, Volume 73, 1148- 6 1152 (1983)] também descrevem a utilização de B. subtilis como agente de biocontrolo de fungos patogénicos das plantas. Pusey et al., [Plant Disease, Volume 72, págs. 622-626 (1988)1 e P. L. Pusey [Patente dos Estados Unidos N° 5.047.39] descreveram o controlo do apodrecimento de frutos após a colheita utilizando B. subtilis. S. D. Heíris et ai., [Patente dos Estados Unidos N° 6.103.228] descreveram métodos de se protegerem ou de se tratarem plantas contra ínfecções por fungos e por bactérias bem como infestações de Diabrotica virgifera usando B. subtilis. O B. lentimorbus é o agente que provoca a bacteriose leitosa em larvas de Popíllia japonica e em larvas de escaravelho relacionadas [K. E. Rippere et al. International Journal of Systematic Bacteriology, Volume 48, págs. 395-402 (1998)], e é portanto utilizado para o controlo de larvas de determinados insectos [R. E. Gordon et al., The genus Bacillus, Agriculture handbook no. 427, United States Department of Agriculture, U. S. Government príntíng Office, Washington D. C. (1973)]. O B. lentimorbus também tem sido usado para aumentar a produção de peixe [W. T. Loqan et al., Patente dos Estados unidos N° 5.746.155] e para tratar pintos do dia [W. T. Logan et al., Patente dos Estados Unidos N° 6.017.525],

Para se propagarem bactérias são habitualmente utilizados veículos em inoculantes comerciais, tais como vermículite, carvão, carboxímeticelulose, turfa, perlite, 7 polivinil-pirrolidona, e talco. Também tem sido utilizado como veiculo, para Azotobacter chroococcicum e para Rhizobium japonicum, lama prensada, um produto "efluente" obtido durante o fabrico de açúcar [IK. S. Jauhri, Indian Journal Agriculture Research, Volume 24, págs. 189-197 (1990)]. A lama prensada, tal como qualquer outro estrume orgânico, afecta as p ropriedades físicas, químicas biológicas dos solos. Ela também ajuda a aumentar agregados estáveis em água nos solos. Ela pode compostada com resíduos de lavage ns de destilarias, utilizada como um melhor estrume orgânico do que a lama compactada por si só [D. P. Yadav. Recycling of sugar factory press mud ín agriculture. Em: Recycling of crop, animal, human, and industrial wastes in agriculture. Ed. H. L. 3. Tandon, Eertilizer development and consultation organization, New Delhi (1995) págs. 91-108]. A indústria ambiental e a agrícola também beneficiariam claramente da existência de um método simples, mais barato, de se produzirem inoculantes microbianos para as plantas, as sementes, e os solos.

Enquanto por um lado o trabalho em microbiologia do leite tem focado até hoje as bactérias psicrotróficas por causa da sua importância para o leite e para os produtos lácteos [Μ. A. Cousin, Journal of food protectíon. Volume 45, págs. 172-207 (1982); R. A. Ledford. Raw milk and fluid milk Products. Em: Applied dairy microbiology. Eds. E. H. Martha and J. I». Steele, New York: Mareei uekker, Inc. (1998) paq s. 55-64], não foi descrita ainda 8 qualquer estirpe bacteriana no leite be vaca, a qual tenha a capacidade de controlar funges fitopatogénicos, de promover o crescimento de plantas, a tolerância aos stresses abióticos, e de solufaílizar fosfato em condições de stress abiótico. A índia é um dos poucos países do mundo que tem contribuído fortemente para o acervo genético Internacional em gado e a melhoria da população animal no mundo. Os bovinos e os búfalos contribuem para quase 15 % do produto interno bruto indiano. 0 país possui 23 % da população bovina mundial. Gado é o termo comum que designa os mamíferos herbívoros domesticados que contribuem para o género Sos, da família Bovidae. 0 gado moderno pode ser classificado em duas espécies: B. taurus, que tem origem na Europa e inclui a maior parte das raças modernas de gado leiteiro e de gado para carne, e B. indicus, que tem origem na indica e é caracterizado por uma bossa e pela cernelha. Estes últimos estão hoje em dia largamente distribuídos em África e na Ásia, com populações ma is pequenas importadas para a América do Norte (em especial no Sul dos E. U.) , para a América Central, e para a América do Norte e Central.

Integram o gado leiteiro são aquelas raças que foram desenvolvidas sobretudo para a produção do leite. Na América do Norte, as principais raças de gado leiteiro são a Holstein-Frísia, a Ayrashíre, a Brown Swíss, e Jersey.

Entre as raças maís importantes de gado leiteiro B, 9 ináicus, que se encontram sobretudo na índia, encontram-se a Gir, a Hariana, a Red Sindhí, a Tharparker, e a Sahiwal. A Sahiwal é de longe a melhor raça no sub continente. É uma raça comparativamente pesada com um corpo simétrico e pele solta, quando comparada com a Red Sindhí a que se assemelha bastante. Os animais são habitualmente compridos e carnudos e ma is pesados. A cor é de um vermelho acastanhado ou vermelho pálido, por vezes contendo manchas brancas. São mantidas na índia diversas manadas desta raça. 0 rendimento em leite encontra-se na gama de entre 1400 e 2500 kg. Esta característica é herdada a uma taxa de entre 0,2 e 0,3. Ά idade aquando do primeiro parto encontra-se na gama de entre 37 e 48 meses, e o intervalo entre partos é de entre 430 e 580 dias. A Sahiwal é uma das raças preferidas no sub continente. Foi exportada para o Sri Lanka, para o Kenya e para muitos países da América Latina e das Caraíbas, aonde se desenvolveu a partir de cruzamentos de Sahiwal e Jersey uma nova raça denominada Jamaica Hope [P. N. Bhat, Handbook of Animal Husbandry, Dírectorate of Publication and Information on Agriculture, Krishi Anusandhan Bhawan, Pusa, New Delhi (1997) . Não existe portanto nenhuma indicação clara até hoje, de que quaisquer bactérias isoladas a partir da vaca possam actuar como agentes de biocontrolo, e certamente não existe nenhuma demonstração de estimulação do crescimento de plantas directamente estimulada e mediada por bactérias por si próprias. No entanto, uma estirpe bacteriana capaz de promover o crescimento das plantas, a tolerância face a 10 stresses abioticos, e de solahiJizar fosfato em condições de stress abíótíco, se uma tal bactéria fosse isolada, encontraria aplicação imediata, por exemplo, em solos afectados por fitopatogéneos, apresentando uma pequena disponibilidade de nutrientes tais como fósforo, e stresses ambientais, etc., mas não produziria o resultado pretendido quanto ao melhoramento pretendido nc desenvolvimento do cultivar, e para além disso, não foi descrito nenhum processo para a selecção de uma tal estirpe bacteriana. Verificámos por comparação directa sobre uma diversidade de tipos de plantas, que a combinação singular de estirpes bacterianas seleccíonadas é eficaz era aumentar o crescimento e a saúde das plantas. A invenção presente diz respeito a novas estirpes de bactérias isoladas da vaca, que apresentam a capacidade de controlar fungos fitopatogénicos, a de promover o crescimento das plantas, a tolerância para com os stresses abióticos, de solubilízar fosfato em condições de stress abiótico, e a um método para a selecção dessas estirpes.

Objectos da invenção presente 0 Principal obieoto da invenção presente é isolar estirpes bacterianas a partir da vaca, as quais sejam úteis como biomoculantes.

Outro objecto principal da invenção presente é isolar estirpes bacterianas a partir da vaca Sahiwal, as

i I quais tenham actividade de promoção do crescimento de plantas.

Ainda outro objecto da invenção presente é isolar estirpes bactérianas a partir da vaca oahrwal, as quais apresentem uma actividade de promoção de crescimento das plantas em pelo menos 5 I do peso em seco.

Ainda outro objecto da invenção presente é isolar estirpes bacterianas a partir da vaca Sahiwal, as quais demonstrem actividade de promoção das plantas em termos de uma mortalidade diminuída na sementeira, uma melhor germinação das plântulas, uma maior altura das plantas, um maior número de vagens, e um maior peso em seco das sementes.

Ainda outro objecto da invenção presente é isolar estirpes bacterianas a partir da vaca Sahiwal, as quais apresentem actividade de controlo de fungos fitopatogénicos.

Ainda outro objecto da invenção presente é isolar estirpes bacterianas a partir da vaca baiiíwal, as quais apresentem a propriedade de solubilizar fosfato. estirpes b apresentem abiótíco.

Lnda outro objecto da invenção presente é isolar cterianas a partir da vaca Sahiwal, as quais actividade de gerar tolerância face a stress 12 Ainda outro estirpes bacterianas apresentem capacidade objecto da invenção presente é a partir da vaca Sahrwax, as de tolerância a 4-8 % de sal. sorar puais estirpes

Ainda outro objecto da invenção presente é isolar bacterianas a partir da vaca Sahiwal, as quais apresentem capacidade de tolerar um pH 4-10.

Ainda outro objecto da invenção presente é isola’ estirpes bacterianas a partir da vaca Sahiwal, as quais apresentem capacidade de tolerar temperaturas de 50-60°C,

Ainda outro objecto da invenção presente é desenvolver uma formulação sinergistica que inclua três estirpes isoladas da vaca Sahiwal e em que a composição referida apresente propriedades que incluam controlar fungos fitopatogénicos, promover o crescimento de plantas, pos suir t ole irânci .a face a s' tresses abióticos, sc 'lubí lizar fos fato em condiçõe :S de stres abiótico, prc iduzir met abolitos anti- fúngic nos. Aí nda 0 tl L Γ 0 objec ::to da invenção pr esen f" 0 Á des envolvi Pi }-* uma form .u X a ç a o crus0 inclui tre^ est irpes í 30 ladas da vaca Sahiwal, úteis r' 0 jTj Q £1 nin GCUÍ ante, apr e s ent ar ido uma vi abi iidade máxima em condições div β X 8 α S ris armazei 13 Cp em ou estuí "agem, ou em co ndíções de cai CípO .

Ainda outro objecto da invenção presente é 13 desenvolver uma formulação que inclui as três estirpes isoladas da vaca Sahiwal, com os Nos. de acessão NRRL B-30486, NRRL B-30487, e NRRL-B30488, em que a formulação referida pode assumir uma forma líquida ou em seco, para aplicação em sementes, plantas, e solo.

Descrição resumida da invenção presente A invenção presente diz respeito a uma composição sinergística útil como bioinoculante, contendo a composição referida estirpes bacterianas com os Nos. de acessão NRRL B-30486, NRRL B- 30487, e NRRL-B 30488, individualmente ou qualquer das suas combinações possíveis, e opcionalmente um veículo, em que cada uma das estirpes evidencia actividade de promoção de plantas, actividade controladora de fungos patogénícos, capacidade de tolerância de stress abiótico, capacidade de solubilização de fosfato em. condições de stress abiótico; para além disso a invenção diz respeito a um métodos de produzir a composição referida com essas estirpes, e para além disso, a um método de se isolarem as estirpes bacterianas referidas a partir da vaca 'Sahiwal'.

Descrição pormenorizada da invenção presente A invenção presente diz portanto respeito a uma composição sinergística útil como bioinoculante, contendo a composição referida estirpes bacterianas com os Nos. de acessão NRRL B-30486, NRRL B-30487, e NRRL-B 30488, indívídualmente ou em qualquer uma das suas combinações - 1.4 - possív eis, e ODcionalmer te um vel -culo, e m q1 je cada uma da e s t i rp p s evidencie ac L _L X ida de promot ora de pl an ias activí d a de de contro Xo d & fungos f itopa togéni cos capa c x dacie de tolerar c Oi XCL içõ es de stress abiót icc capací dade de solubilíz 3 Έ f OS fat o em cc )ndi ções de st abiótico; para além disto, um método de produção da composição referida de bactérias, e para além disto, um método para se isolarem as referidas estirpes bacterianas a partir da vaca 'Sahíwal'.

Uma concretização da invenção presente, é uma composição sinergística útil como bioinoculante, contendo a composição referida estirpes bacterianas com os Nos. de acessão NRRL B-30486, NRRL B-30487, e NRRL-B 30488, individualmente ou em qualquer uma das suas combinações possíveis, e opcionalmente um veículo.

Noutra concretização da invenção presente, as estirpes NRRL B-30486, e NRRL B-30488 pertencem ao grupo dos Bacillus lentimorbus.

Noutra concretização ainda da invenção presente, d estirpe NRRL B-30487 perte nce ao grupo dos tidC X1 J.US subtilis. Noutra concretização ainda da invenção T) r- 0 s P Π1“ ρ f CL estirpe NRRL B-30486 tem σ S Cd racterística s que se PC rmenorízam adia nte: 1 ^

Característíeas NRRL B-30486 Forma Dimensões: Hastes Largura, μιη 1 c: o a 1 τ f υ Comprimento, μπι 3, 0-6, 0 Reacção de Gram Reecçâo 3 Catalase + Crescimento anaeróbíco + Keacçao de Vosges-Roskauer pH em caldo V-P Ácido de: c c; j f -~j u-glucose D-arabinose D-xilose D-manitol + Gás de glucose Hidrólise de: Caseína Gel atina Amido Nitrato a nitrito Utilização de citrato Formação de indole Crescimento em caldo + nutriente ao pH: 6, 8 4- 5,7 Crescimento em NaCl: + a 2 % ^3 o -f n c, H / -o + a 10 1 + Crescimento a: 5} p, 0 p X 4 0°C è π η o r* 55°C 65 °C -f

Numa outra concretização ainda da invenção presente, a estirpe NRRL B-3048? característícas que se pormenorizam adiante: as

Cara cr . stícas NRRL B-30486

Forma Dimensões Largura, μιπ Reacção de Gram Reacção à Catalase Crescimento anaeróbico Reacção de Vosges-Roskauer pH em caldo V-P Ácido de: D-glucose D-arabinose D-xilose D-manitol Gás de glucose Hidrólise de: Caseína Gelatina Amido Nitrato a nitrito Utilização de citrato Formação de indole Crescimento em caldo nutriente ao pH:6, 8

Ov 15 5,8 + +

Crescimento em NaCl: a 2 1 c o.

Crescimento 30°C 4 0 °C 10 °C 5 5 ° C 65°C

Numa mcreti; 13.0 ainda

NRRL B-30488 tem

invenção presente, a estirpe : NRRL B-30488 tem as características que se pormenorizam SCJlSTltΘ I Características N RRL B-30486 Forma Dimensões Hastes Largura, μπι 1 r 3 ™ & / ίο Comprimento, mm 5,0-10.0 Reacção de Gram Reacção à Catalase X Crescimento anaeróbico Reacção de 4- Vosges-Roskauer pH em caldo V-P Ácido de: 5,2 D— g rucose D-arafcínose D-xilose D-manitol Gás de glucose Hidrólise de: Caseína Gelatina Amido Nitrato a nitríto Utilização de citraro Formação de índole Crescimento em. caldo nutriente ao pH: -h 6, 8 + 5, 7 Crescimento em NaCl: 4- â Z fí + a 5 % + η o Cl l ¾ + -v 1 Π o G. -L o Crescimento a: 30 °C + 4 0°C ς n 0 p 55 °C X

Noutra concretização ainda da invenção presente, o veículo é seleccionado de entre um conjunto constituído 18 ^ 18 ^ vermicu iite, carvão, uma n ustura de lama comprimida de itação em fábricas de açúcar e de lavagens de r1ar xa descartáveis f β de lama comprimida de carbonatação em fábricas de açúcar.

Nourra concretização ainda da invenção presente, , as razões entre as três estirpes são de cerca de 1:1:1.

Noutra concretização ainda da invenção presente, a concentração total das estirpes é de 4-10 ufc/g de veículo, e de preferência de 6-8 ufc/g.

Neutra concretização ainda da invenção presente, a concentração de cada estirpe é de 4-10 ufc/g de veículo, e de preferência de 1-8 ufc/g.

Noutra concretização ainda da invenção presente, o período de gestação das estirpes é de 55-65 minutos a 30°C

Noutra concretização ainda da invenção presente, as estirpes referidas colonizam as raízes das plantas.

Noutra concretização ainda da invenção presente, as estirpes referidas sobrevivem na planta a todas as estações. anos

Neutra concretização ainda da invenção presente, is estímpes referidas sobrevivem pelo menos 2 a 3 anos na composiça

Uma outra concretização ainda da invenção presente, e um método in vit ro de se isolarem as est irpes bacteríanas com os Nos. de acessão NRRL B-3C486, NRRL B-30487, e NRRL-3 30488, a partir do leite da vaca 'Sahiwal', tendo as estirpes referidas propriedades, incluindo c controlo de fungos fítopatogénicos, a promoção do crescimento das plantas, possuírem tolerância em relação a stresses abióticos, solubílizarem fosfate em condições de stress abíótico, originando metaboiitos anti fúngicos, obter ieice da va.ca ! Saliiwal!, (

Noutra concretização ainda da invenção presente, plaqueia-se leite sobre um meio de cultura.

Noutra concretização ainda da invenção presente, incuba-se a cultura a uma temperatura de 25-35°C, durante cerca de 1-3 dias.

Noutra concretização ainda da invenção presente, seleccionam-se todas as bactérias morfologicamente distintas, da cultura. presente anterior uma zona a

30-35°C

Numa outra concretização ainda da invenção despistam-se as estirpes referidas no passo que suprimem fungos patogénícos, por demonstrarem de inibição de pele menos 2 mm, quando se incubam , de preferência a 28°C, durante 20-35 dias, de 20 preferência 27 dias.

Noutra concretização ainda da intenção presente, o despiste das estirpes referidas seleccionadas no passo anterior, quanto à sua actividade de promoção do crescimento das plantas, evidenciando pelo menos um aumento da massa em seco de 5 I, quando se façam crescer plantas na presença de bactérias seleccionadas, a uma concentração de entre Log 6 a 10 de UFC,/semente, ou de cerca de Log 6 a 8 de UFC/grama de solo.

Noutra concretização ainda da invenção presente, despista-se nas estirpes referidas no passo anterior, as que são tolerantes a uma concentração de sal de 4-8%, para nova selecção ulterior.

Noutra concretização ainda da invenção presente, despista-se nas estirpes referidas no passo anterior, as que são rolerantes a um stress de pH 4-10, para nova selecção ulterior.

Noutra concretização ainda da invenção presente, despista-se nas estirpes referidas no passo anterior, as que são tolerantes a um stress de temperatura de 50-60°C, para nossa selecç ão ulterior Noutra concretiza çâo ainda da invenção presente, despista-u ;p Γ' a. S estirpes referidas no passo anterior, quanro à sua capacidade de solo íbilizar fos fato nas - 21 condições de stress abiótíco de alta concentração em sal, pH, s temperatura, para nova selecçao ulcerror.

Noutra concretização ainda da invenção presente, isolam-se as três estirpes bacterianas.

Noutra concretização ainda da invenção presente, seleccíona-se a activídade promotora do crescimento de plantas de entre um conjunto constituído por Zea mays, Abelmoschus esculentus, Luffa cylíndrica, Lycopezsicon aesculenzum, j-Lb-Qliuoschus asciiJ-snLus, θ lucuiuís seiivus.

Noutra concretização ainda da invenção presente, o meio de cultura é Agar Nutriente, contendo o meio referido extracto de carne de vaca (2-10 g), peptona (5-15 g, cloreto de sódio (2-10 g), agar (10-20 g), água destilada (cerca de 1,0 L) , com um pH na gama de entre 7,0-7,4.

Noutra concretização aír.da da invenção presente, testa-se a tolerância ao pH a 30°C.

Noutra concretização ainda da invenção presente, a gama de humidade do solo é de entre 15 e 30 I, de preferência 20 I. o

Noutra concretização ainda da invenção presente, presente é de preferência NaCl.

Noutr a concretização a índa da inv o crescimento das estirpes é feito em Nutriente (NB) constituído por extracto de (0,5 %), peptona (1 %), NaCl (0,5 %), e água enção presente, meio de Caldo

03.ΓΠΘ G6 VdC-S destilada, com )H do mc

Noutra concretização ainda da invenção presente, os fungos patogénicos são seleccionados de entre um conjunto constituído por F. moníliforme, C. falcatum, F. oxysporum, F, sp. ciceri, R, solaní, Pythium sp., Phoma sorghíí, Sclerotium rolfsii, Alternaria solaní, Curvularia lunata, Sclerotinia sclerotiorum, e Aspergillus nlger.

Noutra concretização ainda da invenção presente, a concentração das estirpes encontra-se entre 4-10 UFC/mL.

Noutra concretização ainda da invenção presente, a solubilização do fosfato aumenta de cerca de 428 I aquando de um aumento conjunto da temperatura, do sal, e do pH.

Noutra concretização ainda da invenção presente, a solubilização do fosfato aumenta de cerca de 160 1 com o aumento da concentração em sal.

Noutra concretização ainda da invenção presente, a solubilização do fosfato aumenta de cerca de 130 % com o aumento do pH.

Noutra concretização ainda da invenção presente, em que as estirpes são seleccionadas para uma elevada resistência de tolerância ac stress de pH elevado, de preferência a pH 9.

Noutra concretização ainda da invenção presente, as estirpes são seieccionadas para tolerância ao stress de urna temperatura de 55°C.

Noutra concretização ainda da invenção presente, seleccionam-se as bactérias que demonstram os melhores resultados em temos de uma menor mortalidade das plântulas, e uma melhor germinação das piântulas, um maior porte das plantas, um maior número de vagens e um maior valor do peso eco das sementes resultantes.

Noutra concretização ainda da invenção presente, a actividade promotora de plantas aumenta de 3-400 %.

Noutra concretização ainda da invenção presente, a concentração de fungos encontra-se na gama de entre 4-7 esporos/mL de meio de cultura.

Noutra concretização ainda da invenção presente, as condições de stress abiótico para a solubilização do fosfato são seleccionadas de entre um conjunto de condições que incluem um pH elevado na gama de 7-9, uma temperatura elevada na gama de 30-45°C, e uma concentração em sal na gama de entre 0,1-4 %.

Outra concretização ainda da invenção presente, é um método de se preparar uma formulação para promover o crescimento das plantas, a qual inclua estirpes bacteríanas com os Nos. de acessão NRRL B-30486, NRRL B-30487, e MRRL-B 30488, indivídualmente ou em qualquer das diversas suas combinações possíveis, e um veículo.

Noutra concretização ainda da invenção presente, fazem-se crescer bactérias numa cultura, indivídualmente, até concentrações de entre cerca de iog 8 a 11 ufc/mL, de preferência entre iog 9 e 10 ufc/mL, seguindo-se opcíonalmente misturar-se as culturas em quantidades iguais, quando se pretenda preparar um consórcio.

Noutra concretização ainda da invenção presente, diluí-se a cultura referiça com água numa razão de entre 1:50 a 1:150, de preferência a 1:100, contendo aproximadamente log 8-9 ufc/mL de bactérias.

Noutra concretização ainda da invenção presente, faz-se uma aspersão com cerca de 1-3 litros da cultura/ton de veiculo homogeneizado de fresco, de preferência 2 litros da cultura/ton de veículo homogeneizado de fresco, e mistura-se.

Noutra concretização ainda da invenção presente, revolvem-se os amontoados obtidos acima, diariamente, pelo menos duas vezes ao dia durante cerca de 2 dias, para se - ο ^ — Ζ ,j aumentar a temperatura nesses montes até 70-75°C.

Noutra concretização ainda da invenção presente, faz-se uma aspersão com água resultantes de lavagens ou com agua, do amontoacio gue se está a revotver, durante cerca de 40 dias, para se manter um teor de humidade de cerca de

Noutra concretização ainda da invenção presente, revolvem-se os amontoados ainda durante mais 3-5 dias, desta feita para se diminuir a humidade e a temperatura do produto fermentado, até cerca de 30 % e 40-45°C.

Noutra concretização ainda da invenção presente, embala-se o bioinoculante para promoção do crescimento de plantas, pronto apara a sua aplicação.

Noutra concretização ainda da invenção presente, o veículo e seleccíonado de entre um conjunto constituído por lama compactada suifitada fresca, e lama compactada de carbonataçao.

Noutra concretização ainda da invenção presente, o meio de cultura é um meio NB.

Noutra concretização ainda da invenção presente, homogeneíza-se a mistura manualmente e utilizando um aparelho pneumático. 2 6 -

Outra concretização ainda da invenção presente, é aquela em que a formulação referida demonstra viabilidade máxima, quando submetida a diversas condições de armazenagem ou em estufas, ou no campo.

Noutra concretização ainda da invenção presente, a razão entre as várias estirpes é de cerca de 1:1:1.

Noutra concretização ainda da invenção presente, utiliza-se a formulação referida em plantas, sementes, e solo.

Outra concretização ainda da invenção presente, é um método de se utilizar uma formulação para promoção do crescimento das plantas, contendo as estirpes bacterianas com os N0s. de acessão NRRL B-30486, NRRLB--30487, e NRRL-B30488, indívídualmente ou em qualquer uma sua combinação possível, com veículo, incluindo o método referido os passos de se aplicar o bioinoculante referido sob forma líquida ou seca, a sementes, plantas, e solo.

Noutra concretização ainda da invenção presente, o bioinoculante referido também contém as gomas ou os açúcares para melhorar a adesão.

Noutra concretização ainda da invenção presente, a razão entre as várias estirpes é de cerca de 1:1:1.

Outra concretização ainda da invenção presente, é 2 / aquela em que a formulação referida demonstra viabilidade máxima, quando submetida s diversas condições de armazenagem ou em estufas, ou no campo.

Noutra concretização ainda da invenção presente, o veiculo é seleccionado de entre um conjunto constituído por lama compactada sulfitada fresca, e lama compactada de carbonatação.

Noutra concretização ainda da invenção presente, as plantas da variedade a ser testada quanto à promoção do seu crescimento no campo é colocada na presença de uma concentração de entre cerca de log 7-9 ufc/semente ou de entre cerca de log 6-8 ufc/grama de solo.

Noutra concretização ainda da invenção presente, a formulação utilizada, por si só ou em conjunto com outros produtos químicos, é inócua para com o crescimento e a sobrevivência das bactérias.

Noutra concretização ainda da invenção presente, os produtos químicos são seleccionados de entre um conjunto constituído por pesticidas, adubos, nematodicídas, e herbicidas, incluindo-se ou não, por exemplo a granulação para limitar a severidade do efeito destes produtos químicos.

Outra concretização ainda da invenção presente, é um método de se utilizar uma formulação útil como ) as estirpes B-30486, NRRL3- em qualquer uma bíoinoculante, contendo essa composiçb bacterianas com os Nws. de acessão NRRL -304 87, e NRRL-B30488, indívídualmente ou sua combinação possível, com veículo.

Noutra concretização ainria da invenção presente, as estirpes bacterianas referidas são cultivadas num meio de cultura até atingirem a fase logarítmica.

Noutra concretização ainda da invenção presente, dilui-se a cultura referida com água, numa razão de entre 1:10 e 1:100.000, sendo preferida a razão de 1:100.

Noutra concretização ainda da invenção presente, mistura-se a cultura diluída referida ccm um veículo inerte em pó, estando o grau de humidade da mistura a entre 20-40 %, de preferência a cerca de 30 %, em base húmida.

Noutra concretização ainda da invenção presente, incuba-se a mistura referida durante pelo menos cerca de dois dias, mantendo constante o teor de humidade dessa mistura.

Noutra concretização ainda da invenção presente, aumenta-se a contagem de bactérias na mistura referida, até cerca de log 4-10 UFC/g de veículo.

Noutra concretização ainda da invenção presente, monitoriza-se a taxa de sobrevi. vencia das bactérias ao longo de um período de pelo menos um ano, na composição referiaa, θιϊι gue as estirpes loacteríanas esoao presenLes cie preferência numa gama de entre Log 7 a 9 UFC/g de veículo, demonstrando uma taxa de sobrevivência muito grande para os micróbios como inoculo.

Noutra concretização ainda da invenção presente, o veículo é seleccionado de entre um conjunto que incluí vermículite, carvão, uma mistura de lama fermentada compactada de sulfitação de fábrica de açúcar com lavagens provenientes da destilaria, e lama compactada da carbonatação da fábrica de açúcar, casca de arroz, carboximetilcelulose, turfa, perlite, calco, e polivinilpirrolidona.

Noutra concretização ainda da invenção presente, seleccionam-se os veículos preferidos de entre um conjunto constituído por vermículite, carvão, e lama fermentada compactada.

Noutra concretização ainda da invenção presente, a contagem bacteriana é de preferência cerca de Log 8 UFC/g de veículo.

Nou tr a concrei - J_ Z dÇ d O d 11 ida da inven ÇdO DT i. 0gPR te, d S P I. d l: L .as 01- ί í c ' crescim entO 56 T) r omo v e r ã S 3.0 sel PQP ~L tjliG. Gâ S Λ o u.d entr nir coniunto const 1 tu ído po r gr ão de bi CO f A. escu ie. ntu s, e C. satívus, e g mays, e 1 ri 11 cum a eí siivuiu r P G1 'ycine im 3 X f Θ Píl um sa t. ivum, e Im pa t i ens 30 30 da invenção presente, a de 1:1:1, no caso de

Noutra concretização ainda o rácio entre as estirpes é de cerc. um consorcíação.

Noutra concretização ainda da invenção presente, o meio de crescimento é meio NB.

Noutra concretização ainda da invenção presente, fazem-se crescer as bactérias indivíduaImente até uma concentração de entre cerca de Log 9 e 10 UFC/ml, seguindo-se uma mistura das culturas, em rácios de cerca de 1:1:1.

Noutra concretização ainda da invenção presente, diluí-se a cultura com água, de preferência à razão e 1:10, contendo aproxímadamente Log 8-9 ufc/ml.

Noutra concretização ainda da invenção presente, a humidade do produto é regulada em amontoados.

Noutra concretização ainda da invenção presente, c s aut ores cr iaram um novo mé todo de despistar fc jactérí as para selee ci onar aquelas estirpes bacteriar: ία S que ãDI ese ntam a capacidade de controlar 4C. „ T.. lUC :gos fít opa togéni C 0 q de promove: ^ rs crescim ento das pl antas , a tol erâ ncia p ar a os , stresses abí óticos, ( e a solubíli Cl Cl to do fos f at o sob condit çoes cte st >"<0 o c p h .. cu^ Cl „w·. lotico. Que ndo são uti líz ados c ΟΙΓ :C bí O i η o c u 1 a n r es, as novas bactérias ooti das - 31 por este método dos autores, têm a capacidade de controlar fungos íítopatogéníeos e de promover o crescimento das plantas, sob ccndições do campo.

Cs autores também verificaram a existência de três novas estirpes de Bacíllus, quer para serem utilizadas individualmente ou sob a forma de uma nova mistura ou consorcíação que proporciona uma sinergia única, as quais têm a capacidade de controlar fungos fitopatogénicos sob condições de campo, de proporcionar tolerância face a condições incluindo stresses abióticos, e de solubilizar fosfato sob condições de stress abíótico. O método de despiste inclui: 1. Isolar estirpes bacterianas dc leite e seleccionar as bactérias com potencial para suprimir o crescimento dos fungos patogénicos Colletotrichum falcatum, Sclerotium rolfsii, Alternaria solani, Penicíllíum sp., Pythium aphanidermatum, Phytophthora palmivora, Curvularia lunata, Sclerotinia sclerotíorum, e Aspergillus niger, sob condições ín vítro, em placas de agar nutriente (NA), raspando uma a quarto colónias bacterianas singelas em torno da extremidade de uma plac â 0'Θ Petrí c om 90-mm A Ci diâmetro e ínci ibando ”3 c 2 8 0 C durante dois dí 6. S r transferir un i inoculo d.0 S êppQOP numa pas tilha de a (5 —rniri") para 0 centr d da placa , indivi dualmente, d de origem dos fungos a testar em partir de uma placa durante 2 a 7 dias; e seleccionar as estirpes erianas que tem actívidade de biocontrolo que iam o crescimento microbiano. 2. Despistar, nas bactérias seleccionadas no passo i e numa estufa, como apresentando potencial para suprimir o crescimento de fungos patogénícos em condições ín vitro, do seguinte modo: fazem-se crescer plantas de milho na presença de bactérias seleccionadas no passo 1 numa estufa, com a concentração de cerca de Log 8 unidades formadoras de colónias (ufc)/semente em solo não estéril; fazer-se crescer plantas de milho de controlo, tal como acima mas sem adição das bactérias; e seleccionando como bactérias promotoras do crescimento aquelas estirpes que levam as plantas tratadas a evidenciar um peso seco superior. 3. Despistar, nas bactérias seleccionadas no passo 2 comc promotoras do crescimento das plantas, as que apresentam tolerância a stress abiótico (sal, pH, e temperatura) sob condições in vitro, da seguinte forma: seleccionam-se como bactérias tolerantes ao st ΣΘΒ S aquelas bactér seleccionadas no pas S 0 7 p que exibem tolerân a 6 % de sal (NaCl), pH de 5-9, e uma temperar

de 55°C no 4. Caracterização de bactérias seleccíonadas passo 3 tolerantes ao stress abiótico, quanto à sua capacidade para solubilízar fosfato em condições de stress abiótico (sal, pH, e temperatura), do seguinte modo: estimativa quantitativa de solubilização de fosfato em caldo utilizando o meio de crescimento de fosfato (NBRIP) do National Botanical Research Institute; elucidar o efeito do sal (NaCl) , do pH, e da temperatura, sobre a solubilização do fosfato, fazendo crescer as estirpes sobre N3RIP contendo diversas quantidades de NaCl (peso/volume), de pH, e de temperatura, tal como indicado; inoculando meio NBRIP com a estirpe bacteriana a cerca de um Log 9 ufc/mL; autoclavar o meio não inoculado para servir como controlo. 5. Despistar, nas bactérias seleccíonadas no passo 3, as que são tolerantes sobrevivendo em veículos, para a sua utilização comercial como bioinocuiante, do seguinte modo: cultivar as bactérias num meio de crescimento; adicionar células em fase logarítmica a. diversos veículos, em especial a veículos tais como vermiculite, carvão, e lama fermentada compactada; aplicar-se em seguida o ínóculo a sementes (por exemplo, preparando uma suspensão contendo a mistura de veículo/bactérias e gomas ou açúcares para melhorar a adesão) ou aplicando direccamente ao 34 solo ou, mergulhando as suspensões veículo/bactérias nos sulcos de plantação cu misturando com outro material a plantar; utilizando a formulação que demonstre o máximo de viabilidade (em diversas condições de armazenagem ou em estufas ou no campo) para plantas, para sementes e para o solo, 6, Ensaio de campo das bactérias seleccionadas no passo 3, tolerantes a stress abiótico, quanto à capacidade de controlo de patogéneos de plantas, em especial de fungos, tais como Fusarium oxysporum f. sp. ciceri, isto é, para diminuir a incidência ou a severidade da doença em grão de bico produzido no campo e quanto à capacidade de controlar patogéneos de plantas, em especial fungos, tais como Fusarium moniliforme e Colletotríchum falcatum em cana de açúcar produzida no campo, utilizando diversos veículos tais como verrr.ículite. 7, Ensaio de campo das bactérias seleccionadas no passe 3 tolerantes ao stress abiótico, quanto à sua capacidade para promover o crescimento de plantas, para cana de açúcar produzida no campo, utilizando diversos veículos tais como verrnículite e lama de fermentação compactada. seleccionadas pelo

As estirpes bacterianas 35 processo acima têm a capacidade de controlar fungos íitopatogénicos, de promover o crescimento das plantas, têm tolerância ac siress abiótico, e solubilizam fosfato sob condições de stress abiótico.

De acordo com estes factos, é um objecto da invenção proporcionar um método de seleccionar aquelas estirpes que têm a capacidade de controlar fungos fitopatogénicos, ae promover o crescimento das plantas, que apresentam tolerância aos stresses abióticos, e que solubilizam fosfato sob condições de stress abiótico, utilizando as estirpes bacterianas que desta forma se seleccíonaram.

Também é um objecto da invenção proporcionar um meio de despistar bactérias para seleccionar aquelas estirpes que tenham a capacidade de controlar fungos fitopatogénicos e de promover o crescimento das plantas em condições de campo.

Um outro —l 10 o ecto novas estirpes de B, 1 ei tenham α C â p 3 CI. d 3 G Θ de con da invenção ainda é proporcionar tímorbus e de B. subtílis que rolar fungos fitopatogénicos, de npç n 1 p η +· p c vi α ..o ^rQiUuo f que apresentam abióticos, e que solubilizam promover o crescimento tolerância aos stresses DS" ;ões de stress abiótico. miro od' :o aa invc ídequados para as estirpes bacterianas, em particular, novas di' 36 - esti ‘HD s de S _i 0 nLimoxbus e Q 0 B. subti lis cionac âS no passo 3, quanto à sua SOO T '0 V i V7 ência em s o s veí cul rt O para produç ão com ercia 1 C orno ocular tes pa ra pia: itas, para serr entes pcUTa o sol o.

Um outro objecto ainda da invenção é proporcionar novas estirpes de B. lentimcrhus e de S. subtílis que tenham a capacidade de controlar fungos fitopatogénicos em condições de campo.

Ainda un outro objecto da invenção é proporcionar novas estirpes de B. ientimcrbus e de B. subtílis que tenham a capacidade de promover o crescimento das plantas em condições de campo.

Tornar-se-ão aparentes outros objectivos e outras vantagens da invenção, a partir da descrição que se segue. Deve no entanto entender-se que a descrição pormenorizada e os exemplos específicos, embora indiquem as concretizações preferidas da invenção, são dadas apenas a título de ilustração of, uma vez que se tornarão aparentes diversas alterações e modificações adentro do espírito e do âmbito da invenção, aos especialistas da técnica, a partir desta descrição pormenorizada.

Nesta descrição, a expressão "bactérias do leite" é utilizada para referir bactérias, que conseguiram entrar para mo leite ordenhado em condições de assepsia, invadindo a teta e/ou o úbere, e que têm a capacidade de persistência η 8 s 13 s assegurando a sua sobrevivência e a multiplicação, condições sub-óptimas.

As bactérias descritas neste pedido pertencem portanto à flora bacteriana capaz de sobreviver na teta e/ou no úbere, representando um nicho ecológico que ainda não foi caracterizado.

Verificou-se -que a percentagem de estirpes bacterianas que evidenciam actividade de biocontrolo contra fungos fitopatogénicos era máxima no leite de vaca Sahiwal, e em seguida no humano, no da vaca Holstein e no da búfala. Do ponto de vista deste parâmetro o leite da vaca Sahiwal era superior ao humano, ao da vaca Holstein e ao da búfala. Selecções extensivas feitas sobre um grande número de estirpes bacterianas recolhidas de leite humano, da vaca Sahiwal, da vaca Holstein e da búfala, evidenciaram que algumas destas estirpes, tal como se descrevem adiante, têm a capacidade de estimular o crescimento das plantas.

Um aspecto da invenção presente relaciona-se portanto com um método para despistar bactérias humanas no leite humano, da vaca Sahiwal, da vaca Holstein e da búfala, e a sua aplicação para promover o crescimento das plantas.

Em prirti erro ^ϋΟ’α.Γ s. s bactéria Q Çpb w> iw> C5 1 SC >ladas p< or proce saimentos pad xão 03 Q < como os descritos em Eklund Lank: ford, Labora tory ma nu al -Ç r-\ -y ry λ r i'Ji Lj tf i leral mie -< r v"1 hi o 1 ο π iv s j-... \__? .u_. —i— ·.—e 38 (Prentice-Hail, Jnc. , EUA (1967), págs. 21-27]. Por exemplo, preparam-se diluições em série das amestras de leite e podem ser plaqueadas espalhando-as sobre diversos meios gerais. Inclui-se nos exemplos dos meios gerais, que podem servir para propagar um grande numero de bactérias, o NA e outros semelhantes. Em seguida as placas de NA são incubadas durante 1 a 3 dias a uma temperatura adequada para o crescimento bacteriano, em geral a cerca de 25 a 35cC. A temperatura preferida para incubação das placas é de 3 0 ° C.

Em seguida, submetem-se estirpes individuais das bactérias a um primeiro despiste, para seleccionar bactérias que apresentem potencial para suprimir fungos fitopatogénicos em condições in vitro tal como se já se descreveu [C. 3. Nautiyal, Current Microbiology, Volume 35, págs. 52-56 (1997)].

Plaquearam-se colónias bacterianas em placas NA em torno de placas de Petri de 90-mm de diâmetro, e incubaram-se as placas a 25-35°C durante 1 a 2 dias. Transferiu-se um disco de agar de inoculo dos fungos a testar (5-mm quadrados) para o centro da placa indívídualmente a partir de uma placa fonte des fungos. Depois de uma incubação durante 5 a 7 dias observavam-se facilmente zonas de inibição no caso das estirpes bacterianas que possuíam uma activídade de biocontrolo. A escolhi ao •iodo „ncubí iolónii 3 9 - bacteríanas nas placas antes de serem provocadas com os fungos patogénicos no tesce e do período de incubação destas placas para observar a zona de inibição, depende da taxa de crescimento dos fungos patogénicos que se pretendem testar. Por exemplo se o fungo cresce depressa, como por exemplo Rhizoctonía, então prefere-se que as colónias bacteríanas nas placas NA sejam plaqueadas ao longo do perímetro de placas de Petri de 90-miri de diâmetro, pelo menos 2 dias antes de se transferir para o centro da placa a pastilha de inoculo de fungo em agar. Por outro lado, quando o fungo crescer devagar, por exemplo Fusarium, então prefere-se que seja transferida a pastilha de agar com o inoculo do fungo a testar para o centro da placa, e incubam-se as placas durante 2 a 3 dias para dar ao fungo tempo suficiente para crescer, antes de as colónias bacteríanas serem plaqueadas em torno do perímetro nas placas de Petri a NA.

Despistam-se as estirpes bacteríanas isoladas no passo anterior para seleccionar aquelas que, a uma concentração determinada, promovem o crescimento das plantas em condíçõ es de C— di i». 3. ^ p» o.. —i·· p** o ΙΏ 0 anteriormente havia s ído descrito [ C . S . . Nautíyai, Current Mícrobíology, Volume 34, págs. 12-17 (1997)]. Neste t este fazem-se crescer sementes esterilizadas de milho sobre solo não esterilizado, e ínocula-se corn as estirpes bacteríanas, indivídua.! mente, a uma concentração de Log 6-10 ufc/semente. A concentração preferida de inócuio é de Log 8 ufc/semente. Cbservou-se que os tabuleiros (35 x 35 cm) com 16 (4 χ 4) locais por tabuleiro (espaçados de 7 cm de largura, 10 cm de profundidade e a 1 cm uns dos outros) tinham, dimensões apropriadas para se fazer o crescimento do milho e de outras plantas, para o teste levado a cabo em estufa. Colocou-se em cada um dos locais uma altura de 8 cm de solo não esterilizado. Embora também se pudesse utilizar solo esterilizado ou qualquer outro material que suportasse o crescimento de plantas, tal como por exemplo vermiculite, em vez do solo não estéril, preferiu-se utilizar no teste em estufa, solo não estéril do campo, no qual estas bactérias se destinam a ser libertadas.

Adicionou-se água da torneira a cada buraco, antes de se plantarem sementes, para ajustar o solo a uma humidade de 15 a 30 %. A humidade preferida no solo é de 20 %. Cclocaram-se em cada buraco quatro sementes tratadas com bactérias. Levou-se a cabo a experiência na estufa com quatro conjuntos diferentes de 16 plântulas de milho cada um, tanto para sementes não tratadas cem bactérias (controlo) como para as tratadas com bactérias (tratadas). Ena cada conjunto, registaram-se dados das plântulas com 21 dias de idade, no que toca ao peso seco médio de 16 plantas. Para se considerar a estirpe bacteriana um promotor de crescimento de plantas, era necessário que as plântulas tratadas cora as bactérias tivessem um peso seco pelo menos 10 % superior ao das plantas não tratadas corn bactérias que eram comparáveis com estas.

As estirpes bacterianas que desta forma 41 - seleccíonaram forma em seguida sujeitas a uma avaliação da tolerância ao stress abiótico, despistando-se em primeiro lugar a sua capacidade de crescer em caldo nutriente (NB) contendo 6 % de sal (NaCl; pH 7, e temperatura de 30°C), de um dia para o outro (14-16 h) num incubador orbital refrigerado, da New Brunswick Scientifíc, EUA, Modelo Innova 4230, a 18C rpm. Fízeram-se crescer as estirpes que toleravam 6 % de sal a pH 9 (6 % de NaCl e temperatura de 30°C), e fínalmente fízeram-se crescer as estirpes que toleravam 6 % de sal e pH 9, a uma temperatura de 5 50 C. Contaram-se as células viáveis retirando amostras a diversas alturas na presença ou na ausência de stress, tal como se indica. Colocaram-se diluições em série de cada amostra em pontos (25 μΐ) de placas NA, e incubou-se a 300°C em triplicado tal como havia sido descrito [C. S. Nautiyal et al., FEMS Mícrobiology Letters, Volume 182, págs. 291-296 (2000)]. Contaram-se as células viáveis ao fim de 2-3 dias.

Examinaram-se ainda mais em pro fundidade as 3 estirpes bacterianas to lerantes ao s l.ress abiótico (s a i, pH, e temperatura), que haviam sido selee o o onadas tal como se descreveu acima, despistando-se a sua capacidade de solubiliza Levou-se solubili za crescrment Instítute Λ . Nci 1.1 Liya ção de fosfato em condições de stress abiótico. a cabo uma estimativa quantitativa da cão de fosfato em caldo utilizando o meio de o com fosfato do National (NBRIP) tal como se descreveu i, 1 mo hl cr om or ogy Letters,

Jotanical Researc ;enc: nfp rr

Volume 170 f p á CJ 3 42 265-270 (1999)].

Testou-se o efeito do sal (NaCl) , do pH, e da temperatura, sobre a solubilização de fosfato, fazendo crescer as bactérias em NBRIP na presença de NaCl, pH, e temperatura, conjugados de acordo com o método de Fiske e Subbarow [C. H. Fiske e Y. Subbarow, Journal of Biological Chemístry, Volume 66, págs. 375-400 (1925)].

As estirpes em questão Bacíllus lentímorbus NBRI0725, Bacíllus subtílis NBRI1205, e Bacíllus lentímorbus NBRI3009 têm as características taxonómicas listadas na Tabela 1, em comparação com as de estirpes já conhecidas de B. lentímorbus e de B. subtílis.

Comparação características bioquímicas e físicas de Bacíllus lentímorbus NBRIQ725 (invenção), Bacíllus lentímorbus NBRI3009 (invenção), Bacíllus lentímorbus (descritivo), Bacíllus subtílis NBRI1205 (invenção) e B. subtílis (descritivo) .

Bacíllus lentímorbus Bacíllus subtílis NBRI NBRI 3009 NBRI 1205 0725 Descritív De s c r i t í v 0* O

Características Invenção Invenção j_ D VG Π CâO Forna Hastes Hastes Η n e f p. S 43

Bac: illus lentímorbus Bacillus subtilis NBRI NBRI 3009 NBRI 1205 0725 Descritiv Descritiv 0* o

Caract.er.í st.i cas Invenção Invenção invenção Dimensões: Largura, μη 1,5-2,0 1,5-2,0 0,5- O Có 0,7- 0,7 0, 8 Comprimento, μια 3,0-6,0 5,10-10,0 1,8- 7,0 2,0-3,0 Reacção de Gram 4- “f + + + Reacção à Catalase - - - -f + Crescimento anaeróbico Reacção de + + e - - Vosges- Roskauer - - - T + pH em caldo V-P 5,5 5, 9- 5,8 5,0- 8,9 8,0 Ácido de: D-glucose i + + 4- + D-arabinose — _ _ 4_ X D-xilose - - - + "f C—manitol _ _ + Gás de glucose + 1. + _ — Hidrólise de: Caseína X Gelatina T +

Amido

Bacillus lentimorbus Bacillus subtilis NBRI NBRI 3009 NBRI 1205 0725 Descritív Descritiv 0* O Características Invenção Invenção Invenção Hidrólise de: Nitrato nitrito a - - - + + Utilização citrato Οιθ - - - + + Formação indole de - - - - - Crescimento em C H J_ d C nutriente ao pH: 6, 8 + + - _L + 5,7 + + - T + Crescimento em NaCl: a 2 % + + - + + a 5 % + + - 4- a 7 % + - - + a 10 % + -f _ - ND Crescimento a: 30°C + + -f •f + 40°C + -f" - + + 50°C + + - + T 55°C 'f + - -4- + 65 °C - - - - - Tal como descrito em R. Agriculture handbook Ne 427, U.S. Government printíng Cf fú E. Gordon et United States oe, Washington D ai., The Department .C. (1973), genus Bacillus, of Agrículture, : ND = sem dados disponíveis. 45

As 3 estirpes 3. lentimorbus NBRI0725, B. subtilis NBRI1205, e B. lentimorbus N8RI3009, isoladas da vaca Sahiwal e seieccionadas pelo método de despiste tal como se descreveu acima têm a capacidade de controlar os fungos fitopatogéniccs, de promover o crescimento das plantas, têm tolerância aos stresses abióticos, e solubilizam fosfato sob condições de stress abiótico. 0 B. lentimorbus NBRI0725, o B. subtilis NBRI1205, e o B. lentimorbus NBRI3009 foram depositadas sob a alçada do tratado de Budapeste a 5 de Julho de 2001, na ARS Patent culture collection, United States Department of

Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, E. U. A.. Às estirpes bacterianas B. lentimorbus NBRI0725, B. subtilis NBRI1205, e B. lentimorbus NBRI3009 foram atribuídos os números NRRL respectivamente, de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. 1entimorbus NRRL B-3 0 4 8 8.

Para além das outras propriedades anotadas acima, incluem-se nos atributos inesperados e surpreendentes destas estirpes especificas de E. lentimorbus e de B. subtilis, as características seguintes.

Todas estas três estirpes foram isoladas do leite da vaca Sahiwal. Estas estirpes têm, um período de gestação em cultura curto (55-65 minutos a 30°C). Em cultura pura, as estirpes inibem o crescimento de muitos fungos patogénicos para as plantas. As estirpes são capazes de colonizar as raízes das plantas. Estas bactérias diminuem - 4 6 -as doenças das plantas no solo, tanto sob condições de estufa como no campo. As estirpes da invenção presente são capazes de promover o crescimento das plantas, tanto sob condições de estufa como nc campo. Para além disco, as estirpes continuam a sobreviver no solo todo ao longo da estação de crescimento da planra.

As estirpes de Bacillus em apreço também apresentam tolerância aos stresses abióticos, tais como 6 % de sal (NaCl), pH de 5-9, e temperatura de 55°C.

As estirpes de Bacillus em apreço têm a capacidade de solubilizar fosfato sob condições de stress abiórico, por exemplo 0-4 % de sal (NaCl), pH de 1-9, e temperaturas de 30-45°C. A actividade de solubilização de fosfato das estirpes é induzida na presença de elevadas concentrações de sal, a pH elevado, e a alta temperatura.

Encontra-se adentro do âmbito da invenção 0 isolamento de quaisquer tipo de bactérias que tenham α capacidade de controlar fungos fitopatogénicos, de promov er o crescimento das plantas, apresentem tolerância aos stresses abióticos, e solubilizem fosfato sob condições de stress abiótico, no entanto os Bacillus são as bactérias preferidas porque (1) elas podem ser facilmente isoladas, cultivadas e identificadas; (2) como são estirpes que ocorrem naturalmente cs seus isolados ou as estirpes não necessitam de engenharia genética para que sejam eficazes; (3) uma vez que são nutricionalmente versáteis, elas são substratos capazes de utilizar um grande número de orgânicos, incluindo exsudações radículares; (4) são capazes de suprimir um ou mais fungos patogénicos; (5) têm um estádio nos ciclos da sua vida, em que são resistentes a condições ambientais adversas e duras; (6) são tolerantes em relação a stresses abiótícos (nível elevado de sal, pH elevado, e temperatura elevada); (7) são capazes de solubilizar fosfato sob condições de stress abiótico (nível elevado de sal, pH elevado, e temperatura elevada); (8) colonizam a rízosfera do sistema radícular da(s) plantais) que os hospeda(m) durante a totalidade das estações durante as quais ocorre o crescimento no campo; (9) aumentam o rendimento da(s) planta(s) hospedeira(s) em condições de campo; e (10) são relativamente fáceis de desenvolver para aplicações comerciais.

Outro aspecto da invenção diz respeito a um método de se controlarem doenças das plantas e de se promover o crescimento das plantas no solo, tanto em condições de estufa como nas do campo. As 3 estirpes bacteríanas designadas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B—30488 são especíalmente preferidas neste processoO. Utiliza-se um inoculante da estirpe em apreço de tal forma que a colonização ocorra, na gama de cerca de Log 4-10 unidades formadoras de colónia/grama (ufc/g) ocorrência de raiz, e

de preferência Log 6-8 ufc/g. R especialm enre preferida neste processo uma mistura das 3 estirpes (consorciação) designadas B. lentimorbus NRRL Q_ 3048 6, B. subtilis NRRL - 48 - B-30487, e 3. len tira orbus NRRL B-30488, nas razões de 1:1:1, constituída por cerca de Log 6-10 ufc/raL de cada uma, e de preferênc ia Log 7-8 ufc /rrtL de cada uma. 0 inoculo pode ser aplicado directamente às sementes ou plantas, pode estar presente nc solo antes de se fazer o plantio ou pode ser distribuído, por exemplo espalhando-o, ou pulverizando-o, ou por outra sistemas semelhante, por sobre a cultura ou a camada superior do solo, ou nos sulcos do solo nos quais se plantou a cultura.

Podem tratar-se as sementes por revestimento com uma composição correndo as bactérias em apreço, mergulhando as sementes num líquido que contenha essas bactérias, aspergindo-as com o líquido, ou por outro método conhecido na técnica para aplicação de bactérias a sementes.

De acordo dom um outro aspecto ainda da invenção, podem produzír-se indivídualmente culturas de B. lentimozbus NRRL B-30436, de B. subtilís NRRLB-30487, e de B. lentímorbus NRRL 3-30488, era melaços diluídos com água à razão de entre 1:1 e 1:10. No entanto, a diluição de 1:5 é especíalmente preferida neste processo. As estirpes bacteríanas podam ser utilizadas indivíduaImente, ou sob a forma de um consórcio na razão de 1:1:1, constituído por cerca de Log 6-11 ufc/rnL de cada uma, e de preferência Log 8-9 ufc/mL de cada uma, o que é especialmente preferido neste processo. Podo-se diluir mais com água a consorciação que se obtém desta forma, à razão de entre 1:10 e 1:10.000.

Mo entanto é especíalmente preferida neste processo uma diluição a 1:100. A produção das bactérias por crescimento das suas culturas em melaços torna o processo economicamente muito viável. Podem utilizar-se as bactérias produzidas desta forma para em seguida se tratarem sementes por revestimento com uma composição contendo as bactérias em apreço, mergulhando-as num contentor com o líquido que contém estas bactérias, ou aspergindo-as com o líquido, ou por outro método conhecido na técnica para se aplicarem bactérias às sementes.

De acordo com mais um aspecto da invenção, o processo da invenção pode ser utilizado com qualquer tipo de bactérias ou com outros microrganismos capazes de sobreviver sob condições de stress abiótíco, por exemplo, tolerantes ao sal, ao pH, e à temperatura. São especíalmente interessantes as bactérias que tenham propriedades bíocídas, por exemplo, biofungícidas, pesticidas, e outras propriedades; as que promovem c crescimento das plantas, e solubílizem o fosfato em condições de stress abiótico, por exemplo a elevada concentração de sal, pH elevado, e temperatura elevada, e que sejam capazes de viver no solo em presença das plantas.

Incluir-se-iam nos veículos que se podem utilizar para efectuar a dispersão das estirpes em apreço, todos aqueles que são habítualmente utilizados para Inocular 50 culturas, e nos quais se incluem veículos tais como cascas de arroz, carboximetílcelulose, turfa, perlite, polivinil-pirrolidona, e talco. As bactérias nessas composições estão a teores de cerca de Log 4-10 ufc/g de veiculo. São espeeialmente preferidos neste processo os veículos tais como a vermiculíte ou o carvão ou lama fermentada compactada. Fazem-se crescer as bactérias em caldo, até se obter a quantidade necessária, e depois mistura-se com o veículo para se obter o inoculo pretendido, seguindo-se a cura da mistura por métodos bera conhecidos.

De acordo com esta concretização da invenção, o veículo óptimo pode variar de acordo com as bactérias que forem utilizadas. Qualquer uma das composições acima, líquidos, pós, turfa, solo, vermiculíte, carvão, lama fermentada compactada e outras semelhantes, podem conter nutrientes nelas incluídos ou um meio que seja um veículo apropriado, tal como água, óleos ou materiais de base sólidos tais como pós, turfa, solo, vermiculíte, carvão, lama fermentada compactada e quaisquer outros agentes.

No entanto, tal como demonstrado pelos exemplos adiante, são preferidos a vermiculíte, o carvão, e a lama fermentada compactada.

Um aspecto mais desta invenção diz respeito a um processo pelo qual a composição sinergístíca da invenção que desta forma se produziu pode ser utilizada de uma maneira qualquer já conhecida na técnica, por exemplo, 51 incluindo um tratamento prévio do solo ou das sementes ou das raízes de plantas prevíamente germinadas, por si só ou em combinação com outros produtos químicos que sejam inócuos para o crescimento e a sobrevivência de bactérias, por exemplo compostos promotores do crescimento das plantas, pesticidas, adubos, nematodicidas, herbicidas, com ou sem, por exemplo, granulação com carbonato de cálcio para limitar a severidade do efeito destes materiais. No entanto, tal como se demonstra no exemplo adiante, são preferidos os pesticidas biocompatíveis.

Os exemplos que se apresentam adiante de uma forma não limitativa tornarão possível que a invenção seja mais bem entendida. EXEMPLO 1

Isolamento de estirpes bacterianas do leite

Seleccionaram-se cinquenta representantes de colónias bacterianas predominantes, morfologicamente distintas, presentes nas placas, a partir de três amostras individuais de cada um dos seguintes leites: leite de humanes saudáveis, de vaca local (Sahiwal), de vacas exóticas (Holstein Frísia) e de búfala. Recolheram-se portanto no tocai 600 estirpes bacterianas para despístagem ulterior. Recolheu-se leite humano a partir de três mães com crianças ao peito, com idades de entre 6 e 12 semanas. O leite das vacas de raça Sahiwal pura #12, #217, e #249, 52 foi obtido na quinta Galaria, Departamento de Produção Animal, Governo de Uttar Pradesh, Lucknow. Recolheu-se leite das vacas exóticas da raça Holstein Frísia (15/16) #154, #412, e #667, na Quinta Militar Indiana, Central Command Headquarters, Indian Army, Lucknow. Recolheram-se amostras de leite de búfala numa quinta comercial local. 0 leite foi obtido em contentores estéreis depois de se tomar o cuidado de sanítízar a teta e o operário manuseador. Obtiveram-se as amostras de leite de manhã, da parte média da corrente de leite proveniente da teta e dirigido directamente para o contentor estéril, sem qualquer contacto, e armazenaram-se num contentor em congelado, durante o seu transporte. Plaqueou-se então uma diluição em série das amostras de leite, menos do que duas horas após a sua obtenção, por sobre placas de agar Nutriente (NA) (5,0 g de extracto de carne de vaca, 10,0o g de peptona, 5,0 g de cloreto de sódio, 15 g de agar, água destilada 1000 mL, pH 7,2).

Obtiveram-se Isolados puros das estirpes individuais das bactérias representativas das colónias morfologicamente diferentes presentes nas placas, de modo aleatório, e purífícaram-se sub-cultivando cada estirpe individual em placas NA para se obter uma cultura pura. Cada isolado foi armazenado numa solução aquosa de 30 I de glicerol, a -25°C.

As contagens bacteríanas totais das três amostras individuais de leite recolhidas de mulheres saudáveis, de 53 vacas Sahiwal, de vacas Holstein, era de Log 3 ufc/mL, em comparação com mais uma unidade logarítmica, Log 4 ufc/mL, para o leite de búfala (Tabela 2). TABELA 2

Parâmetro Amo s tra de leite proveniente de Mulher Vaca Vaca Búfala Sahiwal Holstein Bactérias (cfu/mL) J p ry a_J O Lj 0 f Log 3,1 Log 3, 2 Log 4,2 EXEMPLO 2

Despiste de estirpes bacteriarxas sob condições in vítro, quanto à sua capacidade de suprimir fungos e bactérias patogénicos

Submeteram-se as 600 estirpes bacterianas, obt idas P elo procedimento delineado no Exemplo i , c í um des píste quant o à sua capacidade de ii cibír o cresc íment O de Col letot rí .ChuiTl fa1 cat um, Sclerc jííum rolfsií, A Item azia Sol anif CGPi. icillium sp,, Pyth íum aphani derma tl m, Phy topht hc >ra palmívora, Curvul ãriã lunata, Sc lerot na sclerotí cr um, 6 Aspergil1us nigez sob condições in vítro como se seoue* iolS (JU Bâ 2Γ ΗΓΠ“ S Θ quatro colónias de bact érías singelas sobre placas NÃ, em torno do perímetro Hp rt rd. ko lacas de Petri de 90 mm de diâmetro , e incubaram-se dur ante dois

Transferiu-se então uma pastilha de inoculo do dias a 28°C. 54 fungo a testar sobre agar (5 mm quadrados) para o centro da placa, individualmente a partir de uma placa fonte de fungo. Depois de incubar durante 5 a 7 dias, observavam-se facilmente zonas de inibição no caso das estirpes bacterianas que possuíam a actívídade de bíocontrolo, porque o crescimento dos fungos em torno da zona plaqueada com bactérias era inibido. Por outro lado, no caso das estirpes bacterianas que não possuíam actívídade de bíocontrolo, o crescimento dos fungos em torno da zona plaqueada não estava inibido, e os fungos conseguiam crescer até à periferia da placa (Tabela 3). Seleccionaram-se como sendo positivas as estirpes que evidenciavam uma zona de protecção de pelo menos 2 mm, as quais foram utilizadas em trabalhos ulteriores. TABELA 3

Fungo patogénico % de bactérias evidenciando bíocontrolo Mulher Vaca Vaca Búfala Sahíwal Holstein Colletotrichum falcat um 0 17 0 8 Sclerotíum rolfsii 0 8 0 0 Alternaria solaní 8 8 8 8 Penícillium sp. 8 0 0 0 Pythíum aphanídermatuM 8 8 8 0 55 (continuação)

Fungo patogénico % de s bactérias evidenciando biocontrolo Mulher Vaca Sahiwal Vaca Holstein Búfala Phytophthora 8 8 8 0 palmívcra Curvularia lunata 17 8 0 0 Sclerotinia 0 17 8 0 sclerotiorum Aspergi 11us níger 0 17 8 0

Verificou-se que a % de estirpes bacterianas que exridenciavam actividade de biocontrolo contra os fungos fitcpatogénicos era máxima na vaca Sahiwal, e em seguida na mulher, ria vaca Holstein e na búfala. Do ponto de vista deste parâmetro, o leite da vaca Sahiwal era superior ao humano, ao da vaca Holstein e ao da búfala (Tabela 2), Seleccionaram-se como positivas as estirpes que evidenciavam uma zona de inibição de pelo menos 2 mm, que se utilizaram para trabalho suplementar.

Das 600 estirpes testadas in vitro, em apenas 150 se determinou possuírem a actividade de biocontrolo, de acordo com os critérios acima. EXEMPLO 3

Despiste de estirpes bacterianas quanto à sua 56 capacidade de promover o crescimento de plantas em estufa

Despistou-se nas 150 estirpes bacterianas que suprimiam os fungos patogénicos in vítro, em estufa, a sua capacidade de promover o crescimento de plantas, fazendo crescer sementes de milho tratadas com bactérias em solo não esterilizado, usando como controlo sementes de milho sem tratamento bacteriano. O processo de despiste das estirpes bacterianas da invenção presente quanto à sua capacidade de promover o crescimento de plantas em estufa, é descrito em especial com referência a plantas de milho. No entanto não se deverá concluir que o processo de despiste de estirpes bacterianas quanto à sua capacidade de promover o crescimento de plantas em estufa se limita a estas plantas, pois pode utilizar-se qualquer outra planta adequada.

Utilizou-se solo não esterilizado da quinta do National Botanical Research Institute em Lucknow para avaliar quanto a capacidade potencial de promover o crescimento de plantas em estufa das 150 estirpes.

Preparou-se inoculo bacteriano para sementes de milho raspando cultura após 48 h de crescimento, em placas com 10 mL de água com sal a 0,85 %. Esterilizaram-se superfícialmente sementes de milho agitando-as cuidadosamente num agitador de vaivém (80 R. P. M. a 28°C) com etanol a 70 I (durante 5 min.), com lixívia Chlorox a 20 % (duranre 10 min.), e em seguida por três vezes com água estéril. Depois disto, mergulharam-se as sementes esterilizadas superficialmente na suspensão bacteriana, durante 4 h a 28°C num agitador de vaivém a 100 R. p. M.. Imergiram-se as sementes de controlo (não tratadas com. bactérias) em água com sal a 0,85 I, da lavagem de placas não inoculadas. Determinaram-se os teores das sementes em bactérias agitando 4 sementes de cada tratamento, e plaqueando após diluição em série sobre uma placa NA. Determinaram-se os valores médios de ufc/semente como as medias dos valores de ufc/g das três populações nas três réplicas por tratamento, após 48 h de incubação das placas a 28°C. Inocularam-se sementes para tratamento, para as quais se utilizaram misturas dos três isolados, utilizando o mesmo número total de bactérias que foi utilizado para inoculo nos tratamento com isolado único. Desta forma, utilizou-se um terço da quantidade normal de cada isolado, na mistura.

Utili zaram-se tabuleiros (35 x 35 cm) com 16 locais ( 4 x 4) por tabuleiro (cada espaço tinha 7 cm de largura, 10 cm de profundidade e 1 cm de distância entre si), para crescer o milho. Cada local foi enchido até 8 cm de altura com solo não esterilizado. Adicionou-se água da torneira (25 inL) a cada buraco, antes de se plantarem as sementes, para ajustar a humidade do solo a 20 %. Adicionaram-se quatro sementes tratadas com bactérias por buraco. 58

Levou-se a cabo a experiência na estufa com quarto conjuntos distintos de 16 plântulas de milho cada um, para sementes não tratadas com bactérias (controlo) e semente tratadas com bactérias (tratadas). Em cada conjunto, anotaram-se dados acerca de plântulas aos 21 dias de idade, no que toca ao peso seco das plantas. Para que uma estirpe bacteriana fosse considerada como promotora do crescimento de plantas, as plântulas tratadas com as bactérias respectivas tinham que apresentar em média pelo menos maís 10 % de peso seco do que as plantas não tratadas com bactérias que com estas se compararam.

Das 150 estirpes bacterianas testadas no teste em estufa, determinou-se que 50 eram promotoras do crescimento de plantas, de acordo com os critérios acima. EXEMPLO 4

Despiste da tolerância das estirpes bacterianas ao stress abiótico

As estirpes bacterianas que suprimiam os fungos patogénícos e promoviam o crescimento das plantas de milho quando avaliadas em estufa fazendo crescer sementes de milho tratadas com bactérias em solo não estéril, em comparação com plantas de milho não tratadas com bactérias, foram em seguida testadas quanto à sua tolerância a stress abiótico, da seguinte forma: Testou-se a tolerância das estirpes em relação ao sal (NaCl), ao pH, e à temperatura, 59 fazendo-as crescer em caldo nutriente (NB; 5,0 g de extracto de carne de vaca, 10,0 g de peptona, 5,0 g de cloreto de sódio, 1.000 inL cie água destilada, pH 7,2), em diversas condições de stress, por exemplo, tal como 6 % de sal (NaCl), pH de 5-9 pH, e temperatura de 55°C. Contaram-se as células viáveis retirando amostras a diversos instantes, na presença ou na ausência de stress, como se indica. Em primeiro lugar, as 50 estirpes foram submetidas a um stress de 6 % de sal. Quinze das 50 estirpes foram capazes de crescer na presença de um stress salino de 6 %, de um dia para o outro (14-16 h) a 30°C, numa incubadora refrigerada da New Brunswick Scientific, EUA, Modelo Innova 4230, agitada a 180 rpm. As 15 estirpes tolerantes ao stress de 6 % de sal também foram capazes de crescer de um dia para o outro a um stress de pH 9,0. No entanto, apenas 3 estirpes das 15 foram capazes de sobreviver de um dia para o outro com um stress de temperatura de 55CC. Plaquearara-se pontualmente diluições em série de cada uma das amestras (25 μΐό em placas NA, e incubou-se a 30°C, em triplicado, tal como anteriormente descrito [C. S. Nautíyal et al., FEMS Microbiology Letters, Volume 182, págs. 291— 296 (2000)]. Contaram-se as células viáveis passados 2-3 dias.

Das 50 estirpes bacterianas testadas no teste de tolerância ao stress, as 3 estirpes NRRL com os números B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtílís NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 foram cesta forma determinadas como sende tolerantes ao stress, de acordo com os critérios 60 acima. EXEMPLO 5

Capacidade de 3. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e 3. lentimorbus NRRL B-30488 para solubilizar fosfato em condições de stxess abiótico

Testaram-se as 3 estirpes bacterianas 3. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 que suprimiam os fungos patogénicos, promoviam o crescimento das plantas de milho quando avaliadas em estufa fazendo crescer sementes de milho tratadas com bactérias em solo não estéril, em comparação com plantas de milho não tratadas com bactérias, e eram tolerantes a stresses abióticcs (sal, pH, e temperatura), foram em seguida testadas quanto à sua capacidade de solubilizar fosfato sob condições de stress abiótico, da seguinte forma: Lavou-se a cabo uma estimativa quantitativa da solubilização de fosfato em caldo usando balões de Erlenmeyer (150 mL) contendo 10 mL de meio inoculado, em triplicado, com a estirpe bacteríana (100 pL de inoculo com cerca de Log 9 ufc/mL).

Os valores referem-se à quantidade de p solubilizado (em pg/mL) pelas estirpes, quando feitas crescer individualmente durante 3 dias no meio de crescimento de fosfato do National Botanícal Research Institute (NBRIP; 10 g de glucose; 5 g de fosfato tricálcico Ca3 (PO*)2; 5 g de MgCl2*6H20; 0,25 g de 5

MgSOí. 7H20; 0,2 g de KC1 e 0,1 g de (NH4)2S04 [C.

Nautiyai, FEMS Microbiology Letters, volume 170, págs. 265-

270 (1999)], a 30° C na presença de 0 % de sal (NaCl), a pH 7. Testou-se o efeito do sal (NaCl), do pH, e da temperatura sobre a solubilização do fosfato fazendo· ~òS crescer em NBRIP na presença de NaC 1 (0, 1,2, e 4 %) , a pH (7 e 9), e às temperaturas (30 e 45°C), tal como se índica (Tabela 4) . A título de controles negativos utilizaram-se culturas discretas, autoclavadas e não inoculadas. Incubaram-se os balões durante 3 dias a 30°C numa incubadora refrigerada da New Brunswick Scientific, EUA, Modelo Innova 4230, agitada a 180 rpm.. Recolheram-se as estirpes por centrifugação a 10.000 rpm durante 10 min, usando uma centrífuga Scrvall RC 5C, Dupont, EUA. Estimou-se a concentração de fosfato no sobrenadante da cultura usando o método de Fiske e Subbarow [c. H. Fiske e y. Subbarow, Journal of Biological Chemistry, Volume 66, págs. 375-400 (1925)]. TABELA 4 % de sal__Solubilização de fosfato (μς/πιΣ.) (NaCl) _pH 7__pH 9

__30°C 45°C 30°C 45°C

Estirpe NRRL B-30486 Q 3,0 6, 6 3,8 8,1 1 4,7 6, 5 4,6 11, 6 2 4,5 9, 9 CQ 11,2 62 (continuação) 5 $ ã 1 Solubilização de fosfato (pg/mL) ! 3Cl j pH 7 pH 9 30°C 4 5°C 30°C 45°C 4 4,8 10,5 4,1 10,3 NRRL B-30487 0 2,4 1, 3 0,83 1,5 1 3,4 6, 0 2,8 3,2 2 6,2 6, 0 5,5 5,7 4 2,5 12,5 5,6 13,2 NRRL B-30488 0 33,8 42,9 42,9 4 3,0 1 17,0 42,9 13,5 43,0 2 12,0 0,0 19,4 43,0 4 13, 0 0, 0 8,8 43, 0

Todas as 3 estirpes bacterianas, B. lentímorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentímorbus NRRL 3-30488, demonstraram uma capacidade de indução da solubilização de fosfato variável, sob condições ín vitro e na presença de condições de stress de sal elevado, pK elevado, e temperatura elevada. EXEMPLO 6

Capacidade de B. lentímorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentímorbus NRRL B-30488, em condições in vitro, para suprimir fungos patogénicos na presença, ou na ausência, de stress salino elevado e de pH

Despistou-se nas 3 estirpes bacterianas, B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e 3. lenzimorbus NRRL B-30488, a actividade de bíocontrolo contra diversos fungos patogénicos de plantas, em condições in vitro e na presença ou na ausência de stress de teor elevado de sal e valores de pH (Tabela 5) . TABILA 5

Estirpe patogénica Zona de inibição (mm) B-30486 B-30487 B-30488

.um oxysoorum f. sp. cíceri 3; 0 % de sal (NaCl) 10 20 10 pH 3; 4 % de sal 20 25 20 pH 3; 7 % de sal 10 MG* 20 pH 7; 0 % de sal 8 6 7 pH 7; 2 % de sal 17 20 15 pH 7; 4 1 de sal 12 NG 16 pH 9; 01 de sal 5 5 5 pH 9; 2 % de sal "0 Λ- z. U 10 15 pH 3; 4 % de sal 13 NG 14 pB 11; 0 1 de sal 15 10 2 0 pH 11; 2 1 de sal 20 20 20 pH 11; 4 % de sal 15 10 2 0 Scleroíium rolfsíi pH 3; 0 % de sal 5 NZ** ς pK 3; 2 % de sal 10 c J N Z pH 3; 4 % de sal 20 c; NG - 64 - (continuação) Estirpe patogénica Zona de inibição (mm) B-3048 6 B- -30487 B -304B8 pH 7; 0 % de sal 3 10 NZ pH 7; 2 % de sal 4 3 O L· pH 7; 4 % de sal NG NG NG pB 9; 0 % de sal 8 NZ / pH 9; 2 % de sal 13 Π 13 pH 3; 4 % de sal 25 10 20 pH 11; 0 1 de sal 5 NZ NZ pH 11; 2 % de sal 20 20 20 pH 11; 4 % de sal 20 c J 25 Zona de ir mbição a pH 7; 0% de sal Rhizoctonia solani 6 NZ 3 Alternaria solani 10 6 8 Pythíum ãphanidermatum 10 4 10 Phytophthora palmivora 6 12 7 Sclerotium sclerotiorum 14 10 11 Colletotrichum falcatum 11 10 NZ Penicillium sp. 2 5 N Z Curvularia lunata 2 'p 10 Aspergillus niger 9 10 3 Phoma sorghii M2 5 NZ Fusaríum monílíforme 11 6 10 NG* - Sem crescimento de fungos; NZ * * = sem zona de inibiç ão NRRL 8-30486, B.

Todas as 3 estirpes bacterianas ti. lentimorbus subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 demonstraram actividade de biocontrolo variável contra diversos fungos fitopatogénicos, em condições ín vitro e na presença de stress devido a elevada concentração de sal e/ou ao pH. As estirpes também demonstraram actividade de biocontrolo variável contra diversos fungos fitopatogénicos, em condições in viera na presença ou na ausência de stress devido a elev concentração de sal e ao pH Explorou-se portanto possibilidade de se utilizarem consorciações de todas três bactérias. EXEMPLO 7

Interacção de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, individualmente e em consorciação, sob condições in vitro, contra os fungos fitopatogénicos do grão de bico

Elucidou-se a interacção de F. oxysporum f. sp. ciceri, de Rhízoctonia solani, de Pythium sp., e de S. sclerotiorum com B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRLB-30488, quer individualmente quer em consorciação, em meio liquido, num teste de culturas dual, fazendo crescer as bactérias/consorciação em caldo nutriente, na presença e na ausência des fungos. Inocularam-se individualmente em balões de Erlenmeyer de 150 mL contendo 10 mL de caldo nutriente, discos de agar (de 5 mm de diâmetro) dos fungos F. oxysporum f. sp. ciceri, Rhizcctonia solani, Pythium sp., e S. sclerotiorum.

Inoculou-se uma suspensão de S. lentimorhus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B, lentimorhus NRRL B-30488, individualmente bem como a sua consorciação, contendo Log 8,0 ufc/mL, e incubaram-se os balões a 30JC durante 7 dias, numa incubadora agitada em condições estáticas, e deixaram-se as culturas de controlo crescer sem bactérias. Preparou-se a consorciação das 3 estirpes bacterianas B. lentimorhus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorhus NRRL B-30488 misturando as 3 culturas a cerca de Log 8,0 ufc/mL, em rácios de 1:1:1. Determinou-se o peso seco de micélio do fungo que havia crescido na presença, e na ausência, de B. lentimorhus NRRL B-30486, de B. subtilis NRRLB-30487, e de B. lentimorhus NRRL B-30488, individualmente e em consorciação, separando o meio gasto por filtração usando um papel de filtro Whatman N°. 1, e secando a massa de fungo sobre o papel de filtro, a 60°C durante 3 dias. Os resultados do teste da interacção de B. lentimorhus NRRL B-30486, de B. subtilis NRRLB-30487, e de B. lentimorhus NRRL B-30488, individualmente e em consorciação, sob condições in vitro, com F. oxysporum f. sp. ciceri, Rhizoctonia solani, Pythium sp., e S. sclerotiorum, são apresentados na Tabela 6. 67 TABELA 6

Tratamento Fungos Peso seco o 0 de inibição (mg) IãC6 dO controlo F. oxysporum f. sp. cíceri (PO) 1. FO 150 0 FU + B-30486 78 48 3. FO + B-30487 96 36 4 . FO + B-30488 84 44 5. FO+B-30486+ B-30487+ B-30488 56 63 Rhizoctonia solani (RS) 1. RS 80 0 2. RS + B-30486 30 83 3. RS -r B-30487 34 58 4. RS - B-30488 48 40 5. RS+B-30486+ B-30487+ B-30488 26 68 Pythium sp. (PS) 1 . PS o n j u 0 2. PS + B-30486 40 20 3. PS + 3-30487 4 8 4 4. PS + 3-30488 23 54 C. •~J ♦ PS+B-304 86+ B-30407+ B-30488 n 1 5 8 Scl erotinía sclerotiorum (SS) 1. «D 313 0 s. SS + B-3048 6 72 77 3 Sb 4· B-304b / 96 69 4 , SS + B-30488 84 7 3 5. 38+6-30486+ B-3048 /+ 6-30488 64 80

Como se

Dode ver dos resultados

OUe SãO apresentados na Tabela 6, todas as três estirpes bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, de B. subtilís NRRLB-30487, e de B. lentimorbus NRRL B-30488, individualmente e em consorciação, sob condições ín vitro, inibiram efectivamente o crescimento de F. oxysporum f. sp. cíceri, Rhizoctonia solani, Pythium sp., e S. sclerotiorum. No entanto, a consorciação das estirpes bacterianas era a mais eficaz para inibir o crescimento dos fungos testados. EXEMPLO 8

Sobrevivência de B. lentimorbus NRRL B-30486, de B. svbtilis NRRLB-30487, e de B. lentimorbus NRRL B-30488, individualmente e em consorciação, sobre vermiculite como veículo

Levou-se a cabo a determinação sobrevivência de B. lentimorbus NRRL B-30486, de B. subtilís NRRLB-30487, e de B. lentimorbus NRRL B-30488, individualmente e em consorciação, sobre vermiculite como veículo, ao longo de um período de doze meses, a 10°C, de acordo com o método seguinte. Fizeram-se crescer individualmente as três estirpes bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilís NRRLB-30487, e 3. lentimorbus NRRL B-30488, no meio de crescimento líquido NB. Fízeram-se crescer as culturas em balões de 2 litros contendo 1,5 litros de meio NB e incubaram-se durante 2 dias a 30°C numa incubadora 69 refrigerada com agitação da New Brunswick Scientific, EUA, Modelo Innova 4230, a 180 rpm. Passados 2 dias de crescimento, adicionou-se 300 mL da cultura a 1 kg de verm.iculíte estéril contida num. saco plástico autoclavável, procedimento de que resultou cerca de 30 % de humidade no produto. Preparou-se a consorciação das 3 estirpes bacterianas, B. 2 ent imortais NRRL B-30486, B. subtílís NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 misturando as 3 culturas a aproximadamente Log 8,5 ufc/rnL, à razão de 1:1:1. Incubando os sacos selados durante 2 dias a 30°C permitiu fazer a cura da preparação bioinoculante. Depois da cura, os sacos selados foram armazenados a 10°C, e retiraram-se alíquotas periodicamente para medições de viabilidade (Tabela 7 viabilidade do produto foi determinada pelo método padrão da diluição em série, sobre placas NA. TABELA 7

Meses Log cfu/g de vermicuiíte B-30486 B-30487 B-30488 B-30486+B-30487+B-30488 0 CO 42* CO CO 1 1 CO 4^. 8,5 1 10,2 9,7 10,3 9,8 2 9, 8 9, 7 9,9 9,2 4 9,4 9,3 9, 6 9,2 6 6,8 8,3 8 9 8,8 9 R â ^ r * OO 8,5 8,8 12 7,9 7,7 8,3 8,1 70

Tal como se vê na Tabela 7, todas as 3 estirpes B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilís NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, índividualmente e em consorcíação, demonstram umas boas taxas de sobrevivência, durante a armazenagem de longa duração sobre vermiculite a 10°C. Passados doze meses de armazenagem, estava presente cerca de Log 8 ufc/g de vermiculite. Estes dados indicam que a vermiculite funciona como um excelente material veiculante para as estirpes serem mais tarde inoculadas sobre sementes, sobre plantas ou no solo, uma vez que não se observou perda apreciável de viabilidade celular. EXEMPLO 9

Actividade de biocontrolo de B. lentimorbus NRRL B-30486, B, subtilís NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, individualmente e em consorcíação, em estufa, contra fungos fitopatogénicos do grão de bico

Testaram-se as 3 estirpes bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilís NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, individualmente e em consorciação, em estufa, contra fungos fitopatogénicos de grão de bico. Levou-se a cabo o cultivo dos fungos para o ensaio com as plantas, utilizando um balão de Erlenmeyer de 1.000 mL contendo 100 g de milho e 400 g de areia grossa que se autoclavou, e depois de autoclavado ajustou-se a humidade a 15 % com água destilada estéril. Incubou-se o frasco a 30°C, individualmente, com uma pastilha de agar 71 com 10 mm de diâmetro proveniente de uma cultura sobre agar nutriente, de F, cxysporum f. sp. ciceri, R. solaní e Pythium sp., no escuro, durante 4 semanas. Passadas quarto semanas secou-se a mistura ao ar e moeu-se e peneirou-se para se obterem partículas cujas dimensões eram de 0,5 mm. Misturou-se cada um dos inócuios intimamente com o solo estéril, a 0,15 I de inoculo, em relação ao peso total do solo, para se obrer uma mistura final, com 0,45 % de ínóeulo de F. oxysporum f. sp. ciceri, R. solaní e Pythium sp. por peso total de solo, tal como havia sido descrito anteriormente [C. S. Nautiyal, Current Microbiology, Volume 35, págs. 52-58 (1997)]. A experiência para examinar a actívidade de biocontrolo de B, lentimorbus NRRL B-304S6, B. subtílis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, indívidualmente e em consorcíação, foi levada a cabo sobre quatro conjuntos diferentes de 30 plântulas de grão de bico cada um, para sementes tratadas e não tratadas (controlo). Prepararam-se as sementes de grão de bico para ínóeulo com B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtílis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, indívidualmente e em consorcíação, tal como se descreveu no Exemplo 3, excepto que se utilizou vermiculíte como veículo, tal como se descreveu no Exemplo 8, em vez de se fazer o ínóeulo dírecto da placa de Petrí. Em cada conjunto, anotaram-se dados durante cinco meses do crescimento da planta, no que toca à germinação das plântulas, à mortalidade das plântulas (plântulas mortas, limitação da altura da plântuia, folhas caídas, raízes 72 descoradas), altura da planta, número de vagens e peso seco das sementes. Tabelam-se os resultados na Tabela 8 que se segue. TABELA 8

Observações

Inoculo B-30486

Germinação de plântuias (%) Mortalidade de plântuias (%) Altura das plantas (cm) Número de vagens/pianta Peso seco de 100 sementes B-30487

Germinação de plântuias (%) Mortalidade de plântuias (%) Altura das plantas (cm) Número de vagens/pianta Peso seco de 100 sementes B-30488

Germinação de plântuias (%) Mortalidade de plântuias (%) Altura das plantas (cm) Número de vagens/pianta Peso seco de 100 sementes B-3 0 4 8 6+3-3 0 4 8 7-B~ 3 0 4 8 8 (conscrciação)

Tratamento

Contra!o não inoculado Inoculado 1 de aumento face ao controlo 82 93 13,41 87 31 -64,36 29 37 27,58 39 48 23,07 17 20 18,78 71 82 15, 49 87 38 -56,32 29 34 17,24 39 43 10,25 17 19 12,73 82 100 21, 95 87 28 -67,8 29 41 41,37 39 52 33,33 17 20 21,95 73 (continuação)

Observações Tratamento Inócuio Controlo na o inoculado Inoculado % de aumento face ao controlo Germinação de plântulas (%) 82 100 21, 95 Mortalidade de plântulas (%) 87 10 -85,5 Altura das plantas (cm) 29 43 48,27 Número de vagens/planta 39 61 56,41 Peso seco de 100 sementes 17 23 39, 5 Tal como se pode ver pelos resultados que se apresentam na Tabela 8, as plantas inoculadas evidenciaram menor mortalidade das plântulas, e melhor germinação das plântulas, altura das plantas, número de vagens e peso seco de sementes, quando comparadas com o controlo não inoculado. Entre as plantas inoculadas, a consorciação evidenciou os melhores resultados, em termos de menor mortalidade das plântulas, e melhor germinação das plântulas, altura das plantas, número de vagens e peso seco de sementes. EXEMPLO 10

Actividade de promoção do crescimento de plantas de B. lentimorbus NRRL B-30486, B, subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-304S8, individualmente e em consorciação, em estufa, utilizando grão de bico A experiência para determinar a actividade de 7 4 - promoção do crescimento de plantas de B. lentimorbus NRRL B-30496, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, individualmente e em consorcíaçâo, foi levada a cabo sobre quatro conjuntos diferentes de 30 plântulas de grão de bico cada um, para sementes tratadas e não tratadas (controlo). Prepararam-se as sementes de grão de bico para inoculo com B. lentimorbus NRRL B-304S6, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, individualmente e em consorcíaçâo, utilizando vermicnlite como veículo, tal como se descreveu no Exemplo 9. Em cada conjunto, anotaram-se dados durante cinco meses do crescimento da planta, no que toca à germinação das plântulas, à altura da planta, ao número de vagens e ao peso seco das sementes. Tabelam-se os resultados na Tabela 9 que se segue. TABELA 9

Observações ___Tratamento

Controlo % de

Inóculo não Inoculado aumento inoculado face ao controlo B-30486

Germinação de plântulas (!) u 2 100 21,95 Altura das plantas (cm) 9 Q dl 38 31,03 Número de vagens/planta 39 53 m p q '-J f U .A Peso seco de 100 sementes 17 21 27 RR *0— ^ ^ d U- B-30487 Germinação de prânuulâs (%) "7 -1 / 1 92 λ BL f 1 3 Altura das plantas (cm) 29 39 34,4 3 Número de vagens/planta 39 46 17, 95 - 75 (continuação)

Observações Inoculo Controlo não inoculado Tratamento inoculâoo 1 de aumento face ao controlo Peso seco de 100 sementes 17 20 18,78 B-30488 Germinação de plântulas (%) 82 100 21,95 Altura das plantas (cm) 29 44 51,72 Número de vagens/planta 39 59 51,28 Peso seco cie 100 sementes 17 23 40,0 B-30466+B-30487+B-30488 (consorciação) Germinação de plântulas (%) 82 100 21,95 Altura das plantas (cm) 29 46 58,62 Número de vagens/planta 39 64 64,10 Peso seco de 100 sementes 17 25 48,48 Tal como se pode ver pelos resultados que se apresentam na Tabela 9, as plantas inoculadas evidenciaram melhor germinação das plântulas, altura das plantas, número de vagens e peso seco de sementes, quando comparadas com o controlo não inoculado. Entre as plantas inoculadas, a consorciação evidenciou os melhores resultados, em termos de melhor germinação das plântulas, altura das plantas, número de vagens e pese seco de sementes. EXEMPLO 11

Actividade de promoção do crescimento de plantas 76 76 B. subtilis em estufa, da consorciação de B. lentimozbus NRRL B»3Q^g NRRLB-30487, e B. lentimozbus NRRL ®"304gg sobre diversas plantas

Prepararam-se as sementes e p,. ^ " *l°cularam-se para testar a actividade de promoção do crescm letto das plantas da consorciação de B. lentimorbus NRRL B-on ^-86, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B~3q ,, em estufa e sobre diversas plantas, tal como se ηω ^creveu acima no

Exemplo 8. A experiência na estufa fci v aba a cabo sobre quatro conjuntos diferentes de 16 plântui-, cada um, para as sementes não tratadas com bactérias , 'm^ntrolo; , e para as sementes tratadas com bactérias, de Zaa m^ys

Ahelmoschus esculentus, Luffa cylindrica, Lycopersícon esculentum, e Cucumis sativus. Em cada conjunto, anotaram-se os dados relativos às plântulas com 21 dias de idade, no que toca ao peso seco de plantas. Os resultados da actividade de promoção do crescimento da consorciação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, em estufa e sobre diversas plantas, estão listados na Tabela 10. TABELA 10

Plantas em teste

Peso seccp_ji^WjPl^nta___

Centroio-" % Qe não inoculado aumento inoculado face ao controlo 1. Zea mays 67,5 80 i q ς ^ ^ r 2. Abelmoschus esculentus 20 35 7 κ n *_/ [ b (continuação)

Plantas em teste

Peso seco (mg)/planta

Controlo % de não Inoculado aumento inoculado face ao controlo 3. Luffa cylindrica 76 110 44,73 4. Lycopersicon esculentum 2 5 150,0 5. Cucumis sativus 0 κ £- -~J 110 340,0

Tal como o demonstram os dados listados na Tabela 10, observou-se uma actividade de promoção do crescimentos das plantas variável, da consorciação de B. lentímorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentímorbus NRRL B-30488, em estufa, relativamente a Zea mays, Abelmoschus esculentus, Luffa cylindrica, Lycopersicon esculentum, e Cucumis sativus. Tal como é aparente nos resultados, o peso seco médio das plântuias tratadas com bactérias excedia em 18-340 % o peso seco comparável nas plântuias não tratadas com bactérias. EXEMPLO 12

Determinação em campo da actividade de biocontrolo da consorciação de B. lentímorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentímorbus NRRL B-30488, contra fungos fitopatogénicos do grão de bico actividade de biocontrolo da s NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30488, contra fungos

Testou-se em campo a consorciação de B. lentimcrbu NRRLB-30487, e B. lentímorbus firopatogénicos do grão de bico, nas quintas da Banaras Hindu University, Varanasi; Chandra Shelchar Azad University of Agriculture & Technology, Kanpur, e no Indian Agricultura! Research Institute, New Delhi, em talhões que apresentavam um historial consistente de mfecçoes fortes da variedade Rhadey de grão de bico por parte de F. oxysporum f. sp. ciceri. Propagaram-se as estirpes bacterianas tal como se descreveu no Exemplo 8. Semearam-se rodos os ensaios em Outubro de 2000 e coiheram-se passados cinco meses de crescimento, em Março de 2001. A humidade do solo nos campos na altura da sementeira variou adentro da gama de 25-30 %, e as culturas dependeram exclusivamente das águas pluviais. Não se utilizaram práticas de cultivo mecânicas depois da sementeira. Cada experiência ocorreu num desenho aleatorizado em bl ocos. Seis réplicas por tratamento adentro dos blocos, eram constituídas por talhões com três filas de 4 m (espaçamento de 30 c :m) . Passados 10 após a germinação, diminuiu-se o número de plântulas para 59 plântulas por fila. Todos cs resultados foram obtidos das filas interiores, excluindo duas filas adjacentes como filas de guarda, tanto para as sementes de grão de bico não tratadas com bactérias (controlo), como para as tratadas com a consorciação de B, lentimorbus NRRL B-30486, B, suht ilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, 1 τ nn Q 1 uUtj O Ufc/mL). Os valores são médias de seis réplicas com 10 p lantas cada uma, enquanto os valores para os pesos secos (g), sao a média de 100 sementes aleatoriamente escolhidas, de seis réplicas de 10 plantas cada uma. TABELA 11

Observações Localização Controlo não inoculado Tratamento Inoculado % de aumento face ao controlo Varanasi Sobrevivência das plântulas (%} 55 73 33, 69 Altura das plantas (cm) 41 57 38,05 Número de vagens/planta 65 79 20,39 Peso de 100 sementes (g) 17 20 19, 87 Rendimento/talhão (g) 410 725 76,83 Kanpur Sobrevivência das plântulas (%) 40 83 105,19 Altura das plantas (cm) 47 62 32,2 Número de vagens/planta 62 94 51, 61 Peso de 100 sementes (g) 16 20 24,68 Rendimento/talhão (g) 345 870 152,17 New Delhi Sobrevivência das plântulas (!) 47 87 85,11 Altura das plantas (cm) 47 57 21,27 Número de vagens/planta 44 104 136, 36 Peso de 100 sementes (g) 15 19 26, 49 Rendimento/talhão (g) 450 900 100,00 Tal como se pode ver nos dados listados na Tabela 11, em todas as localidades e em comparação com o controlo, as sementes de grão de bico tratadas com a consorciação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtílis NRRLB-30487, e B. lentímorbus NRRL B-30488, demonstraram desempenho - RC: ~ - RC: ~ melhorado, em termos de aumento sobreviventes, de altura das plantas, por planta, de peso de 100 sementes talhão. de % de plântulas de número de vagens e de rendimento por EXEMPLO 13

Sobrevivência de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, individualmente e em consorciação, utilizando carvão como veículo

Levou-se a cabo a determinação da sobrevivência das 3 estirpes bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, Ξ. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, individualmente e numa consorciação, sobre carvão como veiculo, ao longo de um período de seis meses, a 10°C, de acordo com o método seguinte. Fizeram-se crescer individualmente as 3 estirpes bacterianas, B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, em meio de cultura líquido NB. As culturas foram feitas em balões de 2 litros cont endo 1,5 litros de meio NB, e foram incubadas durante 2 dias a 30°C numa incubadora refrigerada New Brunswick Scienti fic, EUA, Modelo Inncva 4230, a 180 rpm. Pas sados 2 dias de crescimento, adícíonaram-se 600 mL da cultura a 1 kg de carvão estéril contido num saco plástico autoclavável, permitindo obter um produto com cerca de 30 % de humidade. Preparou-se a consorciação das 3 estirões bacterianas, B. 81 lentímorbus NRRL 3-30486, B. subtílis NRRLB-30487, e B. ientimorbus NRRL B-30488, misturando as 3 culturas a cerca de Log 8.5 ufc/mL, em rácios de 1:1:1. Incubando os sacos selados durante 2 dias a 30°C permitiu curar a preparação bíoinoculante. Depois da cura, armazenaram-se os sacos selados a 10°C e retiraram-se periodicamente alíquotas para medição de viabilidade. Determinou-se a viabilidade do produto pelo método padrão de diluição em série, sobre placas NA. A Tabela 12 mostra a sobrevivência das 3 estirpes bacterianas, B. Ientimorbus NRRL B-30486, B. subtílis NRRLB-30487, e B. Ientimorbus NRRL B-30488, individualmente e sob a forma de uma consorciaçâo, sobre carvão como veículo, ao longo de um período de seis meses, a 10°C, após a colheita. TABELA 12

Meses Log cfu/g sol ore carvão B-30486 B-30487 B-30488 B-30486+B-30487+B-30488 (consorciaçâo) o 8,4 CD GO ! 8,5 1 Q 0 9,5 9,6 9,2 2 9/1 9,1 9,5 9, 6 6 8, 7 8,4 8,9 Γ ΟΟ b 7 i < t X 7,6 7,5 7,8

Tal como se lista na Tabela 12, todas as três 82 estirpes R, lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB--ju4e 7, e e. lentimorbus NRRL B-30488, individualmente e sob a forma de uma consorciação, demonstram boas taxas de sobrevivência, aurante uma armazenagem de longa duração, soore carvao a 10°C. Passados seis meses se armazenagem, esLdvam presentes cerca de Log 7 ufc/g. estes dados indicam que o carvão funciona como um excelente material veiculante, embora não tão eficaz quando comparado com a vermiculíte, para as estirpes que se destinavam a ser inoculadas riais tarde, sobre sementes, sobre plantas, ou no solo. No entanto, corno material veiculante, o carvão é 8 vezes mais barato do que a vermiculite. 0 menor custo do carvão torna a seiecção deste material veiculante muito atraente para a sua utilização comercial em grande escala. EXEMPLO 14

Utilização de lama de sulfitação de fábrica de açúcar compactada, e de água de lavagem de destilaria como veiculo pa^ra se preparar em escala comercial uma consorciação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488

Levaram-se a cabo os seguintes procedimentos para se utilizar lama de sulfitação de fábrica de açúcar compactada, e de água de lavagem de destilaria como veículo para se preparar em escala comercial, depois da sua fermentação utilizando uma consorciação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus 83 NRRL B-30488.

Fizeram-se crescer indivídualmente culturas de B. Icntimorbus NRRL B-30486, B. subtilís NRRLB-30487, e B. lentímorbus NRRL B-30488 em melaços diluídos coro água à razão de 1:5, e incubaram-se durante 3 dias a 30°C numa incubadora refrigerada New Brunswick Scientífic, EUA, Modelo Innova 4230 agitada a 180 rpm. Passados 3 dias de crescimento preparou-se a consorciação das 3 estirpes bacterianas B. lentímorbus NRRL B-30486, B. subtilís NRRLB--30487, e B. lentímorbus NRRL B-30488 misturando as 3 culturas a cerca de Log 9 ufc/mL, à razão de 1:1:1. Diluíu-se a consorciação que deste modo se obteve com água, à razão de 1:10, concendo cerca de Log 8-9 ufc/mL. O crescimento das bactérias em melaços torna o processo economicamente muito viável.

Espalham-se cerca de 300 ton de lama sulfitada fresca compactada, obtida na clarificação de sumo de cana de açúcar com carbonato de cálcio e díóxido de enxofre, sobre um pavímenro cimentado, com uma largura de 2,5 metros, uma altura de 1,5 metros e em montes com comprimento de 150 metros. Revolveu-se a lama compactada e homogeneizou-se, quer manualmente quer utilizando um dispositivo pneumático, antes de se lhe adicionar cerca de 600 litros de consorciação de B. lentímorbus NRRL B-30486, 3. subtilís NRRLB-30487, e B. lentímorbus NRRL B-30488, preparada cal como se descreveu acima, isto é, 2 litros da consorciação por tonelada de lama compactada, e voltou a 84 misturar-se. Passados 2 a 3 dias, a temperatura dos amontoados sobe até 7Q-75°C. De aí em diante revolvem-se os amontoados 2 vezes ao dia e faz-se a sua aspersão com águas provenientes da lavagem da destilaria, para se manter a humidade a 55-65 %, durante um prazo de até 40 dias. Depois de cerca de 40 aspersões pára-se o sistema de aspersão com. as águas de lavagem e continuam a revolver-se os amontoados regularmente durante 3 a 5 dias para se diminuir a humidade do produto fermentado até cerca de 30 %. Habitualmente a temperatura dos amontoados baixa para 40-45°C ao fim de 45 dias. Nesta altura o produto está completamente fermentado e pronto para ser embalado e aplicado.

Para monitorizar a presença de estirpes de Bacíllus durante o processo fermentativo nos amontoados, isoiou-se uma estirpe espontânea derivada, resistente a rífampicina, de B. lentimorbus, NRRL B-30488R, em placas de NA contendo 100 pg de rífampicina. A estirpe espontânea B. lentimorbus NRRL B-30488R evidenciava um crescimento comparável ao da estirpe de tipo selvagem de B. lentimorbus NRRLB-30488, com base na dimensão da colónia, em placas de agar contendo 100 pg de rífampicina, e foi seleccicnada para estudos complementares. Utilizaram-se placas de agar contendo 100 μα de rífampicina por inL, uma quantidade suficiente para inibir o crescimento de outras bactérias em lama compactada não esterilizada e águas provenientes de lavagens, para recuperar a B. lentimorbus NRRL B-30488R dos amontoados durante o processo fermentativo. A presença de B. lentimorbus NRRL B-30488R a Log 8 ufc/g no produto fermentado aos 45 dias é indicativa da sobrevivência, multiplicação e presença continuada da estirpe de B. lentimorbus NRRL B-30488R, durante o processo de fermentação. EXEMPLO 15

Utilização de lama compactada de carbonatação de fábricas de açúcar como veículo para preparar em escala comercial consorciações de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-3Q487, e B. lentimorbus NRRL B-30488

Os procedimentos utilizados para fermentar lama compactada de carbonatação de fábricas de açúcar como veículo para preparar em escala comercial consorciações de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, foram idênticas às descritas acima no Exemplo 14, excepto que se utilizou água em vez do fluido de lavagens, para se manter a humidade durante a fermentação. EXEMPLO 16

Análise comparativa da actividade de promoção do crescimento de plantas da consorciação de B, lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, em estufa, utilizando vermiculite, carvão, lama compactada fermentada de sulfitação em fábricas de açúcar e águas de lavagem de destilaria, e lama compactada 86 de carbonatação de fábricas de açúcar, em plantas

Prepararam-se as sementes e inocularam-se com a consorcíaçâo de B. lentímorhus NRRL B-30486, B. subtílis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-3C488, em estufas, utilizando vermiculíte, carvão, lama compactada fermentada de suifitaçào em fábricas de açúcar e águas de lavagem de destilaria, e lama compactada de carbonatação de fábricas de açúcar, em sementes de plantas como veículos para testar a actívidade de promoção de plantas da consorcíaçâo de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtílis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-3G488, em estufas, sobre diversas plantas, tal como se descreveu acima, respectivamente nos Exemplos 8, 13, 14, e 15. Levou-se a cabo a experiência em estufa usando quatro conjuntos diferentes de 16 plântulas cada um, provenientes de sementes não tratadas com bactérias, e travadas com bactérias, de A. esculentus, C. sativus, Z. mays, Triticum aestivum, Glycíne max, Pisum sativum, e Impatiens balsamina. Em cada conjunto, anotaram-se os dados respeitantes a plântulas com 21 dias de idade com respeito ao peso em seco das plantas. Os resultados da promoção do crescimento das plantas por parte da consorcíaçâo de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtílis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, em estufa, para diversas plantas, utilizando como veículos vermiculíte, carvão, lama compactada fermentada de sulfítação em fábricas de açúcar e águas de lavagem de destilaria, e lama compactada de carbonatação de fábricas de açúcar, sâo apresentados na Tabela 13. 87 TABELA 13

Meses Peso seco (mg)/planta Veículo Controlo não inoculado Inoculado % de aumento face ao controlo Vermíeulíte 1. A. esculentus 28 47 67,85 2. C. sativus 30 95 216,67 3. Z. mays 61 74 21,31 4. Triticum aestivuw. 15 23 53,33 5. Glycine Max 47 73 55,32 6. Pis um sativum 57 85 49,12 7. Impatiens balsamina 4 9 200,00 Carvão 1. A. esculentus 31 50 61,23 2. C. sativus 34 94 176,4 3. Z. mays 65 83 27,83 4. Triticum aestívum 17 26 52,94 5. Glycine Max 42 72 71,42 6. Pisum sativum 52 83 59,62 7. Impatiens balsamina 4 9 Lama compactada fermentada de suífitação em fábricas de açúcar e lavagens de destilaria 125,0 1 J. » A. esculentus 25 38 52,0 9 ^ C. sativus 28 56 100, 0 3. Z. mays 57 70 22,81 4. Triticum aestivum 13 20 53,84 (continuação) Meses Veículo Peso Controlo não inoculado seco (mg)/planta % de aumento Inoculado face ao controlo 5. Glycíne Max 40 69 72,5 6. Písum satívum 49 7 6 55,1 7. Impatiens balsamína 5 10 Lama compactada fermentada de carbonatação em fábricas de açúcar 100,0 1. A. esculentus 36 54 50,0 2. C. sativus 33 63 90, 90 3. Z, mays 52 66 26, 92 4. Tritícum aestivum 12 20 66,62 5. Glycíne Max 42 71 69,05 6. Pisum satívum 48 7 4 54,17 7. Impatiens balsamína 4 10 150, 0 de açúcar.

Tal como é demonstrado pelos dados da Tabela 13, existe uma resposta de promoção variável do crescimento das plantas, por parte da consorciaçâo de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtil is NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, em estufa. Tal como se pode concluir dos resultados, o peso seco das sementes obtidas a partir das plantas tratadas com bactérias, de A. esculentus, C. sativus, 2. mays, Triticnm aestivum, Glycíne max, Písum satívum, e Impatiens balsamína foi maior, na gama de 21-150 I, quando comparado com o obtido a partir de plântuias não tratadas com bactérias, utilizando como veiculo vermiculíte, carvão, lama compactada fermentada de suifítação em fábricas de açúcar e águas de lavagem de destilaria, e lama compactada de carbcnatação de fábricas 89 EXEMPLO 17

Ensaio de campo da actividade de biocontrolo por parte da consorciação de B. lentimarbus NKRL B-30486, B. svibtilís NRRLB-30487, e B. lentimoxbus NRRL B-30488, contra fungos fitopatogénicos da cana de açúcar, utilizando vermiculite como veículo A dimensão de talhão de ensaio de campo para todos os ensaios de campo foi de 9,0 x 3,5 metros, constituídos por quatro filas para cada tratamento, em triplicado.

Os ensaios de campo utilizando a variedade de cana de açúcar Cos 95255 foram levados a cabo colocando estacas de cana de açúcar na altura do plantio, directamente sobre vermiculite, que continha a consorciação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, a um grau de saturação de 20 o c ·

Preparou-se inoculo de ambos os

Fusarium moníliforme

Colletotrichum patogénecs faicatum, multiplicados em meio líquido, para um teste de cultura dual, fazendo crescer os fungos indivíduaImente em NB. índívídualmente discos de agar 'com diâmet Ύ~ r\ L. moníliforme e do C. faicatum em balões Η o 250 mL, contendo 100 mL de NB. Incubaram- se 0°C durante 10 dias sob condições esuáticas.

Inocularam-se de 5mm) do F. Erlenmeyer de cs balões a 3 90 Díluiu-se o inoculo com solução salina estéril a 0,85 % feita com água Milli Q (MQW), a uma concentração de esporos de Log 5 a 6 esporos/mL. Mergulharam-se as estacas no inoculo que dessa forma se preparara, de F. monilíforme ou de C. falcatvm, consoante indicado, durante 30 minutos, antes da plantação. Também se utilizou o inoculo para

banhar as filas antes de se plantar a cana de açúcar. A experiência foi levada a cabo em talhões com fusaríose, aonde no ano anterior a incidência desta doença tinha sido de até 95 %.

Levou-se a cabo o primeiro ensaio de campo de cana de açúcar utilizando talhões (com diâmetro de 9 polegadas) em Agosto de 2000, nos Dhampur Sugar Mills Ltd., Rozagaon, Faízabad, utilizando a consorciação. Passados três meses de crescimento, mudaram-se as plantas dos vasos para o campo. Anotou-se em Agosto de 2001 o número de plantas infectadas, a altura das plantas, o número de rebentos, e o perímetro das canas. Na Tabela 14 apresentam-se os resultados do reste. TABELA 14

Observações ___Tratamento__

Controlo não % de aumento

Fungos inoculado Inoculado face ao controlo

Fusa ri um mcníliforme

Mortalidade 30 0 n.a.*

Altura da planta (cm) 161,8 181,4 12,11 91 (continuação)

Observações Tratamento Fungos Controlo não inoculado Inoculado % de aumento face ao controlo Número de rebentos/planta 3,1 6, 4 106, 4 Perímetro da cana (cm) 5, 8 8,1 3 9,66 Colletotrichum falcatum Mortalidade 80 0 n.a. Altura da planta (cm) 152 162 6,57 Número de rebentos/planta 4,6 6, 6 43,47 Perímetro da cana (cm) 5,8 7,8 34,48 * n.a. = não aplicável

Os resultados apresentados na Tabela 14 demonstram claramente o biocontrolo efectivo da fusariose e do fungo de podridão vermelha em cana de açúcar, os aumentos no número de rebentos, na altura das plantas, e no perímetro das canas, quando se fez a inoculação com a consorciaçào de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. suhtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, utilizando vermiculite como veículo, em comparação com um controlo não inoculado. EXEMPLO 18

Ensaio de campo da actividade de promoção do crescimento de plantas utilizando a consorciaçào de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. suhtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, e vermiculite como veicul 92 relativo a cana de açúcar em Rozagaon ^aram-se a cabo os ensaios de campo utilizando cana ae açúCar colocando estacas de cana de açúcar na axuura do plantio, directamente sobre vermiculite, que continha a consorcíação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilss NR.Rlb-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, preparada tal como se descreveu no Exemplo 8. 0 ensaio com cana de açúcar foi iniciado em Outubro de 2000 nos Dhampur Sugar .Mills Ltd., em Rozagaon. Passados nove meses de crescimento das plantas, anotou-se em Dezembro de 2001 o número de rebentos, a altura das plantas, o perímetro, a quantidade de cana processável, e o rendimento das canas de açúcar por cana. Utilizou-se para os ensaios de campo nos Dhampur Sugar Mills Ltd., em Rozagaon, a variedade de cana de açúcar Ccs-95255. Os resultados do teste nos campos de ensaio, quanto à actividade promotora do crescimento das plantas por parte da consorcíação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtihs NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL b~ 30488, utilizando vermiculite como veículo, para a cana de açúcar, são apresentados na Tabela 15. TABELA 15

Observações Tratamento

Controlo não I de aumento inoculado Inoculado face ao controlo Número de rebentos/p ] qnt-p d U c Cc 6,2 11 n - ^ r u 77,42 Altura da planta (( cm) 200 246 23,0 Perímetro da cana (cm) 9, 1 11,24 23,52 Cana Processável 5 8 O O RO Rendimento em cana/t alhão 128 229 78,9 93

Os resultados apresentados na Tabela 15 mostram claramente um aumento no número de rebentos, na altura das plantas, no perímetro, na cana processável, e no rendimento em cana, nos talhões em que se inoculou a consorciação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-3048S, utilizando vermiculite como veículo, em comparação com o controlo não inoculado. EXEMPLO 19

Ensaio de campo da actividade de promoção do crescimento de plantas utilizando a consorciação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, e vermiculite como veiculo, relativo a cana de açúcar em Dhampur

Levaram-se a cabo os ensaios de campo utilizando cana de açúcar colocando estacas de cana de açúcar na altura do plantio, directamente sobre vermiculite, que continha a consorciação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, preparada tal como se descreveu no Exemplo 8. 0 ensaio com cana de açúcar foi iniciado em Novembro de 2000 nos Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur, Bijnour. Passados treze meses de crescimento das plantas, anotou-se em Dezembro de 2001 o número de rebentos, a altura das plantas, o perímetro, a quantidade de cana processável, e o rendimento das canas de açúcar, por cana. Utilizou-se para os ensaios de campo a variedade de cana de açúcar Cos-95255. Os resultados do teste nos campos de ensaio, quanto à actividade promotora do crescimento das plantas por parte da consorciação de B. lentímozbus NRRL B-30486, 3. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, utilizando verrriicuiíte como veículo, para a cana de açúcar, são apresentados na Tabela 16. TABELA 16 Observações Tratamento Controlo não inoculado % Inoculado face de aumento ao controlo Número de rebentos/planta 6, 0 8,4 40, 0 Altura da planta (cm) 220 251 14,09 Perímetro da cana (cm) 7,2 9,4 30,56 Cana Processável 4 9 125,0 Rendimento em cana/talhão 128 217 69,53

Os resultados apresentados na Tabela 16 mostram aumentos do número de rebentos, da altura das plantas, do perímetro das canas, da cana processável, e do rendimento em canas, nos campos inoculados com a consorciação de B. lentímozbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentímozbus NRRL B-30488, utilizando vermiculite como veículo, em comparação com o controlo não inoculado. EXEMPLO 20

Ensaio de campo da actividade de promoção do crescimento de plantas utilizando a consorciação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. 95 lentimorbus NRRL B-30488, e carvão como veículo

Levaram-se a cabo ensaios de campo colocando hastes de cana de açúcar, na altura do planeio, di rectamente sobre carvão contendo a ccnsorciaçâo de B. lentiaorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, preparada tal como se descreveu no Exemplo 13, 0 ensaio com cana de açúcar foi iniciado eiri Abril de 2001 nos Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur. Passados dez meses de crescimento das plantas, anoteu-se em Dezembro de 2001 o número de rebentos, a altura das plantas, o perímetro, a quantidade de cana processável, e o rendimento das canas de açúcar, por cana. Utilizou-se para os ensaios de campo a variedade de cana de açúcar Cos-95255. Os resultados do teste nos campos de ensaio, quanto à activídade promotora do crescimento das plantas por parte da consorcíação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, utilizando carvão como veículo, para a apresentados na Tabela 17. TABELA 17 cana de açúcar, são Observações Tratamento Controlo não 1 de aumento inoculado Inoculado face ao controlo Número de rebentos/planta 7,2 l·-1 O co 50, 0 Altura da planta (cm) 255 289 13,33 Perímetro da cana (cm) 9,2 10, 8 17,33 Cana Processável 5 9 80,0 Rendimento em cana/talhão 162 208 28,39 ΘΡ SEireo sep oquawTpuai ο θ 'χοΛΒssoooud euBD ap apepiiUHnb p 'ojiauiTjad o 'sequexd sep ρχηρχρ b 'soquaqau ap oaauinu 0 1006 ®P ouquiezaq ma as-noqoue 'SBquBqd sep oquaurrDsouo ap sasauí zap sopessea ‘unduieiiQ ''pop sriTW a:e5ns anduieiiQ sou χοθ£ ®P XJ^qv uib opexoxui χοχ xeonde ap eupo uioo ojesua o ‘ Pl oxduiaxa ou naAacrosap as ouioo yeq epsjedaird 'SSfOE-S IHMN snqzomj4U9T *g s ' 08Ρθε-9ΊΗΗΝ sjjjzqns '3 y98fO£-9 ΊΗΗΝ snqzowjiusj ’Q ap oeôexojosuoo e opuaquoo 'eijpxxqsap ap uiadPApp ap enfie uioo ueonóe ap seoTipçp uia opôppxjins ap epequauuaj epeqoedaioo ριιιρχ ajqos aqueuieqoairjp 'ojquexd op ejnqpe eu ' ueonde ap eueo ap saqseq opupooioo oduiao ap soiesua oqpo p as-iueueAaq οχηοτθΛ ouioo 'B-taBxxqsop ep 1Ηθ£)ΒΑΒχ ©p BILÔB moo jbouób @p SBOxcrqfj UI© OfàBqTJXTlS op epoquourroj BpBqoBduioo buibx a ' 88Ê0ff-S TOHN snqzourrqnaj '3 © '^.δ^Οε-ΗΤΗΗΝ sjjjiqns -g '98ΪΌε-9 TSHN snqzowrçqusj '3 op ofóoToarosuoo b οριίΒζτχτχη sBquBxd op oquourçosocro op OBÓOWOad θρ opBpXAXqOB Bp odurso op OXBSUa TZ oiaHaxa • ορρτηοοϋτ obu οχοχροοο o uioo opoexeduioo uia 'οχηοτΘΔ ouioo ΟΡΛΟΡΟ opueziiiqn '88*00-9 TdHN snqzouijiuaj 'ff ® 'ί.8*0ε-9ΊΗΗΝ srzTiqns -g '98Wc-g qmH snqzomjiuai 'ff ap opòpto-IOsuoo b uioo sopeqnoouT soduieo sou 'seueo uia oauamxpuaã op a ' jaAessaoojd eueo ep 'seueo sep ouqauixjad op 'sequexd sep ρχηχχρ ερ 'soquaqax ap ouarnnu op soauamne uienqsom χχ a; aqeχ eu scpequasajde sopeitnsax sq 9 6 97 açúcar, por cana. Utilizou-se para cs ensaios de campo a variedade de cana de açúcar Cos-95255. Os resultados do reste nos campos de ensaio, quanto à actividade promotora do crescimento das plantas por parte da consorcíação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtílis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, utilizando lama compactada fermentada de sulfitação em fábricas de açúcar com água de lavagem de destilaria, como veículo, para a cana de açúcar, são apresentados na Tabela 18. TABELA 18

Observações Tratamento Controlo não inoculado % Inoculado fac de aumento e ao controlo Número de rebentos/planta 6,2 14 125,8 Altura da planta (cm) 248 285 14,91 Perímetro da cana (cm) 6, 4 11,2 75, 0 Cana Processável 6 11 83,33 Rendimento em cana/talhão 164 237 44,51 Os resultados apresentados na Tabela 1.8 mostram aumentos do número de rebentos, da altura das plantas, do perímetro das canas, da cana processável, e do rendimento em canas, nos campos inoculados com a consorcíação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtílis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, utilizando lama compactada fermentada de sulfitação em fábricas de açúcar com água de lavagem de destilaria como veículo, em comparação com o corrcroio nac inoculado. 98 EXEMPLO 22

Ensaio de campo da actividade de promoção do crescimento de plantas utilizando a consorciação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtílis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, e lama compactada fermentada de sulfitação em fábricas de açúcar, como veiculo

Levaram-se a cabo ensaios de campo colocando hastes de cana de açúcar, na altura do plantio, directamente sobre lama compactada fermentada de sulfitação em fábricas de açúcar, contendo a consorciação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtílis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, preparada tal como se descreveu no Exemplo 14. 0 ensaio com cana de açúcar foi iniciado em Abril de 2001 nos Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur. Passados dez meses de crescimento das plantas, anotou-se em Dezembro de 2001 o número de rebentos, a altura das plantas, o perímetro, a quantidade de cana processávei, e o rendimento das canas de açúcar, por cana. Utilizou-se para os ensaios de campo a variedade de cana de açúcar Cos-9n255. Os resultados do teste nos campos de ensaio, quanto à actividade promotora do crescimento das plantas por parte da consorciação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtílis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, utilizando lama compactada fermentada de sulfitação em fábricas de açúcar, como veículo, para a cara de açúcar, são apresentados na Tabela 19. TABELA 19

Observações Tratamento Controlo não inoculado Inoculado fa % de aumento ce ao controlo Número de rebentos/planta 6,2 16 158,0 Altura da planta (cm) 248 313 26,2 Perímetro da cana (cm) 6,4 12,0 87,5 Cana Processável 6 11,8 96, 6 Rendimento em cana/talhão 164 256 56,0 Os resultados apresentados na Tabela 19 mostram aumentos do número de rebentos, da altura das plantas, do perímetro das canas, da cana processável, e do rendimento em canas, nos campos inoculados com a consorcíação de B. lentimorbus NRRL B— 30486, B. subtílís NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, utilizando lama compactada fermentada de sulfitação em fábricas de açúcar, em comparação com o controlo não inoculado. EXEMPLO 23

Ensaio de campo da actividade de promoção do crescimento de plantas utilizando a consorciação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, e lama de carbonatação, compactada em fábricas de açúcar, fermentada, como veiculo

Levaram-se a cabo ensaios de campo colocando hastes de cana de açúcar, na altura do plantio, 100 directamente sobre e lama de carbonatação, compactada em fábricas de açúcar, fermentada, contendo a consorciação de B. lentimorhus NRRL B-30486, B. subtílís NRRLB-30487, e B. lentímorbus NRRL B-30488, preparada tal como se descreveu no Exemplo 14. O ensaio com cana de açúcar foi iniciado em Maio de 2001 nos Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur. Passados oito meses de crescimento das plantas, anotou-se em Dezembro de 2001 o número de rebentos, a altura das plantas, o perímetro, a quantidade de cana processável, e o rendimento das canas de açúcar, por cana. Utilizou-se para os ensaios de campo a variedade de cana de açúcar Cos-95255. Os resultados do teste nos campos de ensaio, quanto à actívidade promotora do crescimento das plantas por parte da consorciação de B. lentímorbus NRRL B-304S6, B, subtílís NRRLB-30487, e B. lentímorbus NRRL B-30488, utilizando e lama de carbonatação, compactada em fábricas de açúcar, fermentada, como veículo, para a cana de açúcar, são apresentados na Tabela 20. TABELA 20

Observações Tratamento Controlo não x ηocurado g. Inoculado fac de aumento e ao controlo Número de rebentcs/nlanta 6 13 116,6 Altura da planta (cm) 230 2 65 15,22 Perímetro da cana (cm) 7,2 o n j / 0 31,94 Cana Processável t. 11 i/Lo 0 Rendimento em cana/talbão 182 280 53, 85 101

Os resultados apresentados na Tabela 20 mostram aumentos do número de rebentos, da altura das plantas, do perímetro das canas, da cana processável, e do rendimento em canas, nos campos inoculados com a consorcíação de B, lentímorbus NRRL 3-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, utilizando lama compactada fermentada de carbonatação em fábricas de açúcar, em comparação com o controlo não inoculado. EXEMPLO 24

Análise comparativa do efeito de pesticidas sobre o crescimento de B. lentímorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488

Ensaiaram-se as 3 estirpes bacterianas, B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRLB-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30486, para avaliar o efeito de pesticidas sobre o seu crescimento, tal como se segue: Avaliou-se o efeito de pesticidas sobre o crescimento de estirpes bacterianas em caldo utilizando balões de Erlenmeyer (150 mL) contendo 4 0 mL de meio inoculado em triplicado com a estirpe bacteriana (100 jiL de inoculo com cerca de Log 6 ufc./mL) . Os valores referem-se ao número de células (Log ufc/mL) de estirpes que foram individualmente feitas crescer durante 1 dia em NB, a 30°C na presença de pesticida, seguindo a dose recomendada para a sua aplicação. O efeito dos pesticidas sobre o crescimento está apresentado na Tabela 21. Serviram de controlo culturas 102 discretas inoculadas, sem quaisquer pesticidas. Incubaram-se os frascos durante 1 dia a 30°C numa incubadora refrigerada New Brunswick Scientific, EUA, Modelo Innova 4230, a 180 rpm. TABELA 21

Pesticida (Ingrediente activo) log cfu/mL Dose B-304 8 6 recomendada B-30407 B-30488 Controlo 0 -1 / 9 7 FUNGICIDAS Mancozeb a 75 1 WP 3 g/L 2 2 NG** Oxixloreto de cobre a 6 g/L 5 2 3 50 % WP Clorotalonil a 75 % WP 3 g/L NG 2 NG Tridemorf a 80 % WP 2 mL/L 5 6 NG Triadimefon a 25 1 EC*** 4 g/L 5 6 5 Carbendazima a 50 % WP 4 g/L 8 10 10 Carboxina a 75 % WP 4 g/L 5 3 NG Pesticida log cfu/iTib (Ingrediente activo) Dose B-304 8 6 B-30487 B-30488 recomendada Controlo 0 7 9 7 Metalaxil a 8 1 2 g/L 10 10 10 Mancozeb a 64 % WP Tíofanato Metilo a 3 g/L 5 9 8

70 % WP 103

INSECTICIDAS Mcnocrotofos a 36 1 1 mL/L 3 10 5 £. * * -k -k Dimetoato a 30 % EC 2 mL/L 4 7 5 Oxidemeton-metilo a 2 mL/L 7 9 7 25 % EC Deltametrina a 2,3 1 EC 2 mL/L 10 10 10 Endossulfan a 35 % 2 mL/L 6 7 5 EC Dicofol a 18,5 % EC 2,7 mL/L NG 5 O ^J Clorpirifos a 20 % EC 2,5 mL/L 3 5 3 * WP = Pó molhável; * * NG = Ausência - Concentrado emulsionável; **** SL = de cres Líquido cimento; solúvel *** EC

Os resultados apresentados na Tabela 21 demonstram respostas variáveis dos pesticidas sobre o crescimento de B. lentimorbus NRRL B-3Q486, de B. subtilís NRRLB-30487, e de B. lentimorbus NRRL B-30488. De entre os diversos pesticidas ensaiados, o carbendazím a 50 % W. P., o metalaxil a 8 % + rnancczeb a 64% W. P., e a deltametrina a 2,8 % E. C., eram os mais compatíveis para aplicação com B. lentimorbus NRRL B-30486, com B. subtilís NRRLB-30487, e com B, lentimorbus NRRL B-30488.

Entende-se que a descrição pormenorizada acima foi apresentada meramente a título de ilustração, e que podem ser levadas a cabo modificações e variantes de quanto se descreveu.

Lisboa, 28 de Fevereiro de 2007

Claims (43)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição sinergistica útil como bioinoculante, contendo a composição referida as estirões bacterianas com os números de acessão: NRRL B-30486, NRRL B-30487, e NRRL-B 30488, individualmente ou em todas as suas combinações possíveis, e opcionalmente um veículo.
2. 2. Uma composição tal como se reivindicou na reivindicação 1, em que as estirpes NRRL B-30486, e NRRL B—30488 pertençam ao grupe dos Bacíllus lentimorbus.
3. 3. Uma composição tal como reivindicada na reivindicação i, em que a estirpe NRRL B-30487 pertença ao grupo de Bacillus subtilis.
4. 4. Uma composição tal como reivindicada na reivindicação lr em que a estirpe NRRL B-30486 evidencie caracteristicas tais como as listadas adiante: Características NRRL B-30486 Hastes 1,5-2,0 3,0-6,0 + i 5,5 Forma Dimensões: Largura, l·™ Comprimento, jnm Reacção de Gram Reacção à Catalase Crescimento anaeróbico Reacçao ee Vosges-R°skauer pH em câ-i-ao Acido de: 9 9 D-glucose "T D-arabincse - D-xilose - D-manitol - Gás de glucose Hidrólise de: + Caseína - Gelatina - Amido - Nitrato a nitrito - Utilização de citrato - Formação de índole - Crescimento em caldo nutriente ao pH: 6, 8 + 5,7 + Crescimento em NaCl: a 2 % + a 5 1 + a 7 % + a 10 % + Crescimento a: CO Ό o O + kfdi· O o o -Γ 50°C + 55 °C T 65 °C —
5. 5. Uma composição tal como reivindicada n reivindicação 1, em que a estirpe NRRL 8-30487 evidenci característieas tais como as listadas adiante: Característícas__NRRL B-30486 Forma Oval Dimensões Largura, um 2,5 + Reacção de Gram Reacção à Catalase Crescimento anaeróbíco Reacção de Vosges-Roskauer + pH em caldo V-P 5,8 Ácido de: D-glucose + D-arabinose + D-xilose + D-manitol + Gás de glucose - Hidrólise de: Caseína + Gelatina i Amido + Nitrato a nítrito + Utilização de citrato + Formação de índole - Crescimento em caldo nutriente ao pH: 6, 8 + 5,7 ΊΓ Crescimento em NaCl: a 2 % 1 a 5 % -r a 7 % - a 10 % - Crescimento a: 30 °C + tf* O o O + 50 °C + 55 °C + 65°C “‘ 6. Uma composição tal como reivindicada reivindicação 1, em que a estirpe NRRL B-30488 evidenc característícas tais como as listadas adiante: Característi cas NKRL B-30486 Forma Hastes Dimensões Largura, μιη 1,5-2,0 Comprimento, mm 5,0-10.0 Reacção de Gram + Reacção à Catalase - Crescimento anaeróbico + Reacção de Vos ge s-Ro s kaue r 5,2 pH em caldo V-P Acido de: D-glucose + D-arabinose D-xílose D-manitol Gás de glucose Eídrólíse de: Caseína Gelatina Amido Nitrato a nitrito Utilização de citrato Formação de índole Crescimento em caldo nutriente ao pH: 6,8 + 5,7 + Crescimento em NaCl: a 2 I + a 5 I + a 7 % + a 10 % + Crescimento a: 30°C + 40°C + 50°C + 55°C +
6. 7. Uma composição tal como a reivindicada na reivindicação 1, em que c veículo seja seleccíonado de entre um conjunto que inclua veriuiculíte, carvão, urna mistura de lama compactada fermentada de suifitação de fábrica de açúcar, e lama compactada de carbonataçào em fábrica de açúcar. como a reivindicada na das três estirpes sejam
7. 8. Uma composição tal reivindicação 1, em que os rácíos de cerca de 1:1:1.. 5
8. 9. Uma composição tal como a reivindicada na reivindicação 1, em que a concentração total de estirpes seja de 4-10 ufc/g de veículo, e de preferência 6-8 ufc/g de veículo.
9. 10. Uma composição tal como a reivindicada na reivindicação 1, em que a concentração de cada estirpe seja de 4-10 ufc/g de veículo, e de preferência 7-8 ufc/g de veículo.
10. 11. Uma composição tal como a reivindicada na reivindicação 1, em que o período de gestação das estirpes seja de 55-65 minutes a 30°C. 12. Uma composição tal como a reivindicada na reivindicação plantas. 1, em que as estirpes colonizem raízes de 13. Uma composição tal como a reivindicada na reivindicação 1, em que as estirpes referidas sobrevivam a todas as estações da planta.
11. 14. Uma composição tal como a reivindicada na reivindicação 1, em. que as estirpes referidas sobrevivam durante pelo menos 2/3 anos na composição.
12. 15. Um método ín vítro de se isolarem estirpes bacteríanas com os Nos. de acessão NRRL B-30486, NRRL B-30487, e NRRL-B 30488, a partir do leite de vaca 'Sahiwal1, 6 possuindo essas estirpes propriedades, incluindo a de controlar fungos fitopatogénicos, promover o crescimento das plantas, possuir tolerância aos stresses abiótícos, solubílízar fosfato sob condições de stress abíótico, produzindo metabólicos anti-fúngicos, incluindo o método referido os passos de: (a) se recolher leite de vaca 'Sahiwal', (b) se plaquear leite sobre um meio de cultura, (c) se incubar a cultura a uma temperatura de 25-35°C durante cerca de 1-3 dias; d) se seleccionarem todas as bactérias morfologicamente diferentes existentes na cultura, e) se despistarem, de entre as estirpes seleccionadas no passo (d), quais são aquelas que poderão suprimir os fungos fitopatogénicos, por evidenciarem uma zona de inibição de pelo menos 2 mm, após uma incubação a 30-35°C, de preferência a 28°C, durante 20-35 dias, de preferência 27 dias, (f) se despistarem nas estirpes seleccionadas no passo (e), quais aquelas que evidenciam ser bactérias promotoras do crescimento de planras, 7 evidenciando um aumento de pelo menos 5 % do peso seco da planta, quando se deixam crescer plantas na presença das bactérias seleccionadas, numa concentração bacteríana na gama de entre cerca de Log 6 e 10 UFC/semente, ou de cerca de Log 6 a 8 UFC/grama de solo, (g) despístar-se nas estirpes referidas no passo (f) , uma tolerância a stress salino de 4-8 % para uma nova selecção, (h) despístar-se nas estirpes referidas no passo (g) uma tolerância a stress a pH 4-10 para uma nova selecção, (i) despistar-se nas estirpes referidas no passo (h) uma tolerância a um stress de temperaturas de 50-60°, para uma nova selecção, (j) despistar-se nas estirpes referidas no passo (í) uma capacidade de solubílízação de fosfate sob as condições de stress abíótico de, concentração elevada de sal, pH elevado e temperatura elevada, para uma nova selecção, e (k) isolarem-se as três estirpes bacteríar.as pretendidas.
13. 16. Um método tal como o reivindicado na 8 reivindicação 15, em que se seleccíona a actividade de promoção de crescimento de plantas para com um conjunto constituído por Zea mays, Abelmoschus esculentus, Luffa cylíndrica, Lycopersícon esculentus, Abelmoschus esculentus, e Cucumis satívus.
14. 17. Ura método tal como o reivindicado na reivindicação 1b, em que o meio de cultura seja Agar Nutriente, sendo o meio referido constituído por extractc de carne de vaca (2-10 g) , pepcona (5-15 g) , cloreto de sódio (2-10 g) , agar (10-20 g) , água destilada (cerca de 1,0 L), com um pH na gama de entre 7,0-7,4.
15. 18. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 15, em que se testa a tolerância ao pH a 30°C.
16. 19. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 15, em que a humidade do solo se encontre compreendida entre 15-30 %, sendo de p referência a 20 1. 20. Um método tal como o Γ θ i v i .ndicado na reivindicação 15, e uti que o sai seja de pre j-p ·ρρη(· ~ i a NaCl. 21. Um método tal como o Γ 6.1 V1 ndicado na reivindicação 15, em que se façam cr< asce: Γ 3S estirpes em meio de Caldo Nutr dente (NB), constít uítío por extracro de carne de vaca (0,5 %), peptona (1 %), NaCi / 0 ^ 1 l J f ·~ο %) , e água destilada, e em que o pH do meio seja 7,2. 9
17. 22. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 15, em que se seleccíonem os fungos patogénicos de entre um conjunto constituído por F. monílí forme, C. falcatum, F, oxysporum f sp. cíceri, R. solani, Pythium sp., Phoma sorghii, Sclerotium rolfsíi, Alternaria solani, Curvularia lunata, Sclerotinia scierotíorum, e Aspergillus niger.
18. 23. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 15, em que a concentração das estirpes seja de entre ?log? 4-10 UFC/mL.
19. 24. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 15, em que a solubilização do fosfato aumente de cerca de 428 % quando se verifica um conjunto de aumentos da temperatura, do sal, e do pH.
20. 25. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 15, em que a solubilização do fosfato aumente em cerca de 160 % quando aumenta a concentração de sal.
21. 26. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 15, em que a solubilização do fosfato aumente em cerca de 130 % quando aumenta o pH.
22. 27. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 15, em que as estirpes sejam seleccionadas para terem tolerância a pH elevado, de preferência a pH 9. - 10
23. 28. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 15, em que as estirpes sejam seleccionadas para terem tolerância a um stress de temperatura de 55°C.
24. 29. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 15, em que se seleccionem bactérias em termos de menos mortalidade das piântulas, e uma melhor germinação das piântulas, altura das plantas, número de vagens e peso seco das sementes.
25. 30. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 15, em que a actívidade de promoção das plantas aumente de 3-400 %. 31. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 15, em que a concentração dos fungos se encontre entre 4-7 esporos/mL de meio de cultura. 32. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 15, em que se seleccionem as condições de stress abíótico para a solubílízação do fosfato, de entre um conjunto de condições que incluam um pH elevado na gama cie 7-9, uma temperatura elevada na gama de 30-45, e uma concentração em sal na gama de 0,1-4 %.
26. 33. Um método de preparar uma formulação para promoção do crescimento das plantas contendo as estirpes bacterianas corri os Nos. de acessão NRRL R-30486, NRRL B- c;> 487, e NRRL-B 30488, indivídualmente ou em qualquer das suas combinações possíveis, e veículo, em que o método referido inclua os passos de: (a) se fazerem crescer bactérias numa cultura, índividualmente, até concentrações de entre cerca de log 8 a 11 ufc/mL, de preferência entre log 9 e 10 ufc/mL, de bactérias seguindo-se opcionalmente misturarem-se as culturas em quantidades iguais, quando se pretenda preparar um consórcio, (b) se dilua a cultura referida com água numa razão de entre 1:50 a 1:150, de preferência a 1:100, contendo aproxímadamente log 8-9 ufc/mL de bactérias, (c) se fala uma aspersão com cerca de 1-3 litros da cultura/ton de veículo homogeneizado de fresco, de preferência com 2 litros da cultura/ton de veiculo homogeneizado de fresco, e se misture, (d) se revolva os amontoados c >bt idos acima, diariamente, pelo menos duas vezes ao dia durante cerca de 2 dias, para se aumentar a temperatura nesses montes até /0 —/ cv u, (e) se faça uma aspersao com águas resultantes de 12 lavagens ou com água, do amontoado que se está a revolver, durante cerca de 40 dias, para se manter um. teor de humidade de cerca de 55-65 %, (f) se revolvam os amontoados ainda durante maís 3-5 dias, desta feita para se diminuir a humidade e a temperatura do produto fermentado, até cerca de 30 % e 40-45°C, e (g) se embale o bioinoculante para promoção do crescimento de plantas, pronto apara a sua aplicação.
27. 34. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 33, em que o veículo seja seleccionado de entre um conjunto constituído por lama sulfitada compactada fresca, e lama de carbonatação compactada.
28. 35. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 33, em que o meio de cultura seja meio NB.
29. 36. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 33, em que se homogeneíze a mistura manualmente e utilizando um dispositivo pneumático para a revolver.
30. 37. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 33, em que a formulação referida apresente uma viabilidade máxima, em condições de armazenagem 13 13 variadas ou em estufa ou no campo. 38. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 33, em que os rácios entre as estirpes referidas sejam de cerca de 39. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 33, em que s e utilize a formulação referida em plantas, em sementes, e no solo.
31. 40. Um método de se utilizar uma formulação para promoção do crescimento das plantas que inclua as estirpes bacterianas com os Nos de acessão NRRL B-30486, NRRL B-30487, e NRRL-B 30488, individualmente ou em qualquer das suas combinações possíveis, e veículo, incluindo o método referido os passos de se aplicar o bioinoculante referido, sob uma forma líquida ou sólida, a sementes, a plantas, e ao solo.
32. 41. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 40, em que o bioinoculante referido também contenha as gomas ou açúcares para melhorar a adesão. 12. Um reivindicação 40, método tal como o reivindicado na em que as estirpes estão em rácios de 1: 1.
33. 43. Um reivindicação 40 método Lai como o reivindicado na em que a formulação referida demonstre 14 viabilidade máxima, sob diversas condições de armazenagem, ou em estufa ou no campo. 44. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 40, em que o veículo seja seleccionado de entre um conjunto constituído por lama sulfitada compactada fresca, e lama de carbonatação compactada.
34. 45. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 40, em que as plantas das variedades sejam testadas quanto à promoção do seu crescimento no campo na presença de bactérias, numa concentração de entre cerca de Log 7-9 ufc/semente, ou cerca de Log 6-8 ufc/grama de solo.
35. 46. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 40, em que se utilize a formulação, por si só cu em combinação com outros produtos químicos que sejam inócuos para o crescimento e a sobrevivência das bactérias.
36. 47. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 46, em que os produtos químicos se jam seleccionados de entre um conjunto constituído por pesticidas, adubos, nematodicidas, e herbicidas, com ou sem, por exemplo, uma granulação com carbonato de cálcio para limitar a severidade do efeito destes materiais.
37. 48. O método de se fabricar uma composição útil como bíoínoculante, composição essa que inclua as estirpes bacterianas com os Nos de acessão NRRL B-30486, NRRL B- 15 0487, e NRRL-B 30488, individualmente ou em qualquer das uas combinações possíveis, e veículo, incluindo o método eferido os passos de: (a) se cultivarem as estirpes bacterianas referidas são cultivadas num meio de cultura até atingirem a fase logarítmica, (b) se diluir a cultura referida com água, numa razão de entre 1:10 e 1:100.000, sendo preferida a razão de 1:100, (c) se misturar a cultura diluída referida com um veículo inerte em pó, estando o grau de humidade da mistura a entre 20-40 %, de preferência a cerca de 30 %, em base húmida, (d) se incubar a mistura referida durante pelo menos cerca de dois dias, mantendo constante o teor de humidade dessa mistura, (e) se aumentar a contagem de bactérias na mistura referida, até cerca de iog 4-10 UFC/g de veículo, e (f) se monitorizar a taxa de sobrevivência das bactérias ao longo de um período de pelo menos um ano, na composição referida, em que as estirpes bacterianas estejam presentes de preferência numa gama de entre Log 7 a 9 UFC/g de veiculo, demonstrando uma taxa de sobrevivência muito grande para os micróbios como inoculo.
38. 49. Um método tal como o reivindicado na reívindic ação 4 8, em que o veiculo seja seleccíonado de entre de entre um con]unto que inclui vermicuiite, carvão, uma mistura de lama fermentada compactada de sulfitação de fábrica de açúcar com lavagens provenientes da destilaria, e lama compactada da carbonatação da fábrica de açúcar, casca de arroz, carboximetilcelulose, turfa, periite, talco, e polivinilpirrolidona. 0. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 48, em que se selec cionam os veículos preferidos de entre um conjunto constituído por vermicuiite, carvã o, e lam .a fermentada compactada. 51. Um método tal como o reivindicado TO - X reivindicação 48, em que a contagem bacteriana sei a de preferência cerca de Log 8 UFC/g de veí culo. 52. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 48, em que as plantas cujo crescimento se promoverá sejam s s 1 e C C X! onadas de entre um conju .nto constituído por grão de bi .co, A. esculi antiiSf e C. sativ rUS f e Pilum e Glycine max e Z, mays, e Tríticum aestivum, sativum, e Impatiens balsamina. 17
39. 53. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 48, em que o rácio entre as estirpes é de cerca de 1:1:1, no caso de um consorciação.
40. 54. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 48, em que o meio de crescimento seja meio NB.
41. 55. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 48, em que se façam crescer as bactérias individualmente até uma concentração de cerca de Log 9 a 10 UFC/mL, seguindo-se uma mistura das culturas no rácio de cerca de 1:1:1.
42. 56. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 48, em que se dilua a cultura com água, de preferência num rácio de 1:10, contendo aproximadarnente Log 8-9 ufc/mL.
43. 57. Um método tal como o reivindicado na reivindicação 48, em que a humidade seja regulada revolvendo amontoados. Lisboa, 28 de Fevereiro de 2007