MX2013007978A - Formulacion de un inoculante multiespecies para potenciar el crecimiento de plantas. - Google Patents

Abstract

La presente invención contempla una formulación bacteriana que contiene 6 cepas bacterianas diferentes: Azospirillum brasilense Sp7, Burkholderia unamae MTI641, Pseudomonas putida KT2440, Sphingomonas sp. OF 178, Gluconoacetobacter diazotrophicus PAI 5 y Bradyrhizobium sp. MS22, con capacidad de promoción de crecimiento para plantas de interés agrícola y/o bioremediación. La formulación promueve el crecimiento de plantas de maíz y otras de inter´res agrícola. Las bacterias de la presente formulación se adhieren y colonizan las plantas de forma adecuada mediante sus propias capacidades.

Description

FORMULACIÓN DE UN INOCULANTE MULTIESPECIES PARA POTENCIAR EL CRECIMIENTO DE PLANTAS Campo de la invención La presente invención pertenece al campo de la biotecnología, particularmente pertenece al campo de la microbiología, y más particularmente pertenece al campo de la formulación de inoculantes bacterianos.

Estado de la técnica Existe una gran diversidad de especies bacterianas distribuidas en los distintos ecosistemas, las cuales llevan a cabo diferentes funciones en su hábitat y son responsables en gran medida del sostenimiento de la vida en el planeta (Morales-García Y. E. y col. 2010a. BioTecnología 14 (2): 1-29). Tomando en cuenta la información que las bacterias albergan en sus genomas, se considera que representan el más valioso y vasto reservorio de información para ser usado con fines agrobiotecnológicos. Las bacterias llevan a cabo distintas actividades metabólicas que pueden tener efectos benéficos en agricultura, ecología, biorremediación y en biomedicina. Por ejemplo, muchas bacterias estimulan él crecimiento de las plantas, otras degradan compuestos tóxicos para el humano y el ambiente, otras producen compuestos antimicrobianos que pueden usarse en el tratamiento de diversas enfermedades, o productos importantes para la industria. Tomando en consideración las potencialidades agrobiotecnológicas de las bacterias, se han desarrollo inoculantes, que portan diferentes bacterias aisladas de suelo y de la rizósfera de plantas, con el fin de ser aplicados en cultivos de interés agrícola para aumentar su productividad (Fuentes-Ramírez L. E. y Caballero-Mellado J. 2005. Bacterial biofertilizers in PGPR: Biocontrol and Biofertilization, 143-172. Z.A. Siddiqui (ed.), Springer, Dordrecht, The Netherlands). Tanto en el Centro de Ciencias Genómicas de la UNAM como en el laboratorio de Microbiología del Suelo de la BUAP, se desarrollaron biofertilizantes que portan la bacteria Gram negativa Azospirillum brasilense para la inoculación de maíz, trigo y otros cereales. Estos biofertilizantes han sido aplicados exitosamente en más de 2 millones de hectáreas en México, observándose efectos benéficos en la producción de diversos cultivos, y actualmente es producido comercialmente con licénciamiento de la UNAM. Sin embargo, el éxito de los inoculantes alrededor del mundo ha sido variable, por ejemplo la inoculación con Azospirillum, promueve el crecimiento de cultivos en distintos suelos y regiones climáticas, con éxito en el rango de 60 a 70%. Diferentes especies de Rhizobia se han inoculado en millones de hectáreas de varios cultivos de leguminosas con éxito relativo. No obstante, también se han reportado resultados negativos para estimular el crecimiento de plantas en los cultivos, después de la inoculación de las Rhizobia y distintas especies de Pseudomonas.

Distintos factores pueden influir sobre el éxito de un inoculante (Bashan Y. 1998. Biotech. Advances 16:729-770), por ejemplo: 1 ) que una cepa sea competitiva para el ambiente donde será aplicado. 2) Las bacterias usadas para la elaboración de un inoculante deben promover el crecimiento de las plantas e incrementar el rendimiento del cultivo de interés; para este fin, las bacterias deben haber sido respaldadas por diversos estudios que contemplan, colonización de plantas, adherencia a la raíz y las bases moleculares que usan para conseguir la fitoestimulación. 3) La capacidad de las bacterias para colonizar adecuadamente a las plantas, sin causar daño, será determinante para obtener resultados positivos. Además, la colonización de las bacterias debe ser estable para alcanzar mayores probabilidades de éxito en la promoción de crecimiento. 4) La variedad de planta y el genotipo de bacteria usada pueden influir en la adecuada interacción planta-bacteria (Muñoz-Rojas J. y Caballero-Mellado J. 2003. Microb. Ecol. 46(4): 454-46). 5) El antagonismo producido entre los microorganismos de la comunidad del suelo es una de las causas principales que afecta a la competitividad de la cepa del inoculante (Muñoz-Rojas J., y col. 2005. FEMS Microbiol. Ecol. 54: 57-66).

En la naturaleza las plantas están asociadas a muchas bacterias, tanto endófitas como rizosféricas, por lo que se considera que éstas generan consorcios donde existen sinergismos que pueden desencadenar una mejor fitoestimulación. De hecho, en algunos experimentos donde se ha llevado a cabo la coinoculación de dos especies bacterianas se obtuvieron resultados de estimulación de crecimiento o de control biológico más provechosos para las plantas que cuando se llevó a cabo la inoculación con una sola bacteria. Algunos ejemplos exitosos incluyen la co-inoculación de: a) Azospirillum con algunas bacterias solubilizadoras de fosfatos (Belimov A. y col. 1995. Plant Soil. 173:29-37), b) Azospirillum con Rhizobium (Fabri P. y Del Gallo M. 1995. Azospirillum VI and related microorganisms, genetics-physiology-ecology, 257-267. Springer Verlag, Berlín, Heidelberg, Germany), c) Azotobacter con Streptomyces (Elshanshoury A. R. 1995. J. Agron. Crop. Sci. 175:1 19-127), d) Pseudomonas jessenii PS06 con Mesorhizobium ciceri (Valverde A., y col. 2006. Plant Soil 287:43-50), e) Paenibacillus alvei (NAS6G-6) y Bacillus cereus (KFP9-F) en plantas de trigo (Hassen A. I. and Labuschagne N. 2010. World J. Microbiol. Biotechnol. 26:1837-1846), f) Mesorhizobium sp. cepa BHURC03 y P. fluorescens en plantas de garbanzo (C/'cer arietinum L.) (Verma J. P., y col. 2009. Biol. Forum. Int. J. 1 (2): 1 1 -14), entre otros. Sin embargo, poco se conoce de las interacciones entre las distintas especies bacterianas, que ocurren en el suelo y en asociación con las plantas, que podrían impedir el establecimiento de las bacterias benéficas cuando se inoculan solas o en consorcios. Por ésta razón, es deseable estudiar la existencia de actividades antagónicas entre bacterias promotoras del crecimiento de plantas, con la perspectiva de elaborar inoculantes más efectivos y con mayor probabilidad de éxito en la agricultura.

Objeto de la invención El objeto de la presente invención es una preparación biológica que estimula el enraizamiento y crecimiento de las plantas. La preparación biológica está formulada a base de bacterias que promueven exitosamente el crecimiento de plantas independientemente de la condición en la que se evaluó. Las cepas que conforman a la formulación multiespecies son: Burkholderia unamae MTI-641 , Pseudomonas putida KT2440, Bradyrhizobium sp. MS22, Sphingomonas sp. OF178, Azospirillum brasilense Sp7, y Gluconacetobacter diazotrophicus PAI 5; las cuales fueron aisladas de rizósfera o del interior de plantas y pueden coexistir sin hacerse daño alguno en acuerdo con nuestros estudios.

Breve descripción de las figuras La figura 1 es una fotografía de plantas inoculadas con el inoculante multiespecies (A) en comparación a plantas no inoculadas (B) a los 30 días posteriores a la inoculación (dpi) (ejemplo 1 ).

La figura 2 es una gráfica del peso freso de plantas de maíz inoculadas y no inoculadas con los distintos tratamientos (ejemplo 1): (1 ) A. brasilense Sp7, (2) B. unamae MTI-641 , (3) G. diazotrophicus PAI 5, (4) Sphingomonas sp. OF178, (5) P. putida KT2440, (6) Bradyrhizobium sp. MS22, (7) Inoculante multiespecies, (8) células muertas, (9) control no inoculado. Cada valor representa la media de 18 mediciones de masa de plantas independientes con su respectiva desviación estándar. Letras iguales dentro de cada columna significa que los tratamientos no difieren estadísticamente mediante la prueba f-student a un P=0.05.

La figura 3 es una gráfica del peso seco de plantas de maíz inoculadas y no inoculadas con los distintos tratamientos (ejemplo 1 ): (1 ) A. brasilense Sp7, (2) B. unamae MTI-641 , (3) G. diazotrophicus PAI 5, (4) Sphingomonas sp. OF 78, (5 P. putida KT2440, (6) Bradyrhizobium sp. MS22, (7) Inoculante multiespecies, (8) células muertas, (9) control no inoculado. Cada valor representa la media de 18 mediciones de masa de plantas independientes con su respectiva desviación estándar. Letras ¡guales dentro de cada columna significa que los tratamientos no difieren estadísticamente mediante la prueba f-student a un P<0.05.

La figura 4 es una gráfica del peso freso de plantas de maíz inoculadas y no inoculadas con los distintos tratamientos (ejemplo 2): (1 ) A. brasilense Sp7, (2) S. unamae MTI-641 , (3) G. diazotrophicus PAI 5, (4) Sphingomonas sp. OF178, (5 P. putida KT2440, (6) Bradyrhizobium sp. MS22, (7) Inoculante multiespecíes, (8) control células muertas. El control no inoculado se comportó igual que el control de células muertas por lo que fue omitido. Cada valor representa la media de mediciones de masa de plantas independientes con su respectiva desviación estándar. Letras iguales dentro de cada columna significa que los tratamientos no difieren estadísticamente mediante la prueba de Tukey a un P<0.05.

La figura 5 es una gráfica del peso seco de plantas de maíz inoculadas y no inoculadas con los distintos tratamientos (ejemplo 2): (1 ) A. brasilense Sp7, (2) B. unamae MTI-641 , (3) G. diazotrophicus PAI 5, (4) Sphingomonas sp. OF178, (5) P. putida KT2440, (6) Bradyrhizobium sp. MS22, (7) Inoculante multiespeciés, (8) células muertas. El control no inoculado se comportó igual que el control de células muertas por lo que fue omitido. Cada valor representa la media de mediciones de masa de plantas independientes con su respectiva desviación estándar. Letras iguales dentro de cada columna significa que los tratamientos no difieren estadísticamente mediante la prueba de Tukey a un P<0.05.

La figura 6 es una fotografía de la apariencia de plantas de maíz rojo sin inocular (A) e inoculadas con el inoculante multiespeciés (B).

La figura 7 es una fotografía de la apariencia de plantas de maíz de plantas inoculadas con el inoculante multiespecies (B) contra plantas no inoculadas (A), a los 160 dpi.

La figura 8 es una fotografía de las diferencias de elote tierno obtenido de tratamientos de maíz rojo no inoculado (A) e inoculado (B) con el inoculante multiespecies, a los 160 dpi.

La figura 9 es una fotografía de la apariencia de mazorcas de plantas no inoculadas en comparación con mazorcas de plantas inoculadas con el inoculante multiespecie.

La figura 10 es una fotografía de plantas de papa sin inocular (A) e inoculadas con el inoculante multiespecies (B), a los 25 días de crecimiento.

Mejor método de llevar a cabo la invención La presente invención es una formulación inoculante que estimula el enraizamiento y crecimiento de las plantas. La formulación inoculante ? está compuesta a base de las bacterias Burkholderia unamae MTI-64 , Pseudomonas putida KT2440, Bradyrhizobium sp. MS22, Sphingomonas sp. OF 78, Azospirillum brasilense Sp7, y Gluconacetobacter diazotrophicus PAI 5.

Las concentraciones de cada cepa bacteriana añadida a la composición inoculante dependerá de una variedad de factores que incluyen las especies de planta a ser tratadas, la naturaleza y condición del suelo a ser tratado, la forma en la cual el inoculante será aplicado y los medios por los cuales será aplicado, y la etapa de la temporada de crecimiento de la planta durante la cual toma lugar la aplicación. Para cualquier caso, las concentraciones apropiadas pueden ser determinadas por un experto en la técnica utilizando experimentación rutinaria. A manera de ejemplo, la concentración de cada cepa bacteriana presente en la composición inoculante puede estar en el rango de alrededor de 1 x 102 ufc/ml a alrededor de 1 x 1010 ufc/ml, y puede estar alrededor de 1 x 103 ufc/ml, alrededor de 2.5 x 103 ufc/ml, alrededor de 5 x 103 ufc/ml, alrededor de 1 x 104 ufc/ml, alrededor de 2.5 x 104 ufc/ml, alrededor de 5 x 104 ufc/ml, alrededor de 1 x 105 ufc/ml, alrededor de 2.5 x 105 ufc/ml, alrededor de 5 x 105 ufc/ml, alrededor de 1 x 106 ufc/ml, alrededor de 2.5 x 106 ufc/ml, alrededor de 5 x 106 ufc/ml, alrededor de 1 x 107 ufc/ml, alrededor de 2.5 x 107 ufc/ml, alrededor de 5 x 107 ufc/ml, alrededor de 1 x 108 ufc/ml, alrededor de 2.5 x 108 ufc/ml, alrededor de 5 x 108 ufc/ml, alrededor de 1 x 109 ufc/ml, alrededor de 2.5 x 109 ufc/ml, o alrededor de 5 x 109 ufc/ml.

Los expertos en la técnica apreciarán que cualquier planta puede beneficiarse de la aplicación de la composición inoculante de la presente invención para el Süelo, semillas y/o vegetación. Se pueden utilizar realizaciones particulares para ayudar al crecimiento, desarrollo, producción o productividad de los cultivos y pastos y otras plantas de valor económico, incluyendo plantas ornamentales y las plantas cultivadas para aceites y biocombustibles. La planta de cultivo puede ser, por ejemplo, un cultivo alimenticio (para los seres humanos u otros animales), tales como cualquier fruta, vegetales, nueces, semilla o planta de producción de grano.

Las plantas de cultivo de ejemplo incluyen, pero no están limitados a, tubérculos y otros vegetales subterráneos (tales como papas, betabel, rábanos, zanahorias, cebollas, etc.), verduras de crecimiento en suelo (tales como calabaza y otros miembros de la familia de los calabacines, frijoles, espárragos, etc.), hortalizas (como la lechuga, acelga, espinaca, alfalfa, etc.), otros vegetales (por ejemplo, tomates, brócoli, aguacate, etc.), frutas (como aceitunas, frutas de hueso, incluidas nectarinas y duraznos, frutas tropicales como mangos y plátanos, manzanas, peras, mandarinas, naranjas, mandarinas, kiwi, coco, etc.), cereales (como arroz, maíz, trigo, cebada, avena, centeno, etc.), frutos secos (como nueces, cacahuates, avellanas, almendras, etc.), y otros cultivos y plantas de valor económico (como la caña de azúcar, soya, girasol, cañóla, sorgo, pasto, césped, etc.).

La formulación inoculante de la presente invención se puede aplicar directamente a las plantas, partes de plantas (tales como follaje) o semillas, o, alternativamente, se puede aplicar al suelo en el que las plantas están creciendo o para ser cultivadas o en el que las semillas han sido o van a ser sembradas. La aplicación puede ser por cualquier medio adecuado y puede estar en cualquier escala adecuada. Por ejemplo, la aplicación puede comprender el vertido, la dispersión o pulverización, incluyendo difusión o pulverización a mayor escala, remojo de las semillas antes de la siembra, y/o empapando de semillas o plantas de semillero después de la siembra. Los expertos en la técnica apreciarán que varios medios de aplicación pueden ser utilizados en combinación (por ejemplo, remojo de las semillas antes de la siembra seguido por mojado de las semillas plantadas y/o de aplicación a las plántulas o plantas maduras). Las semillas, plántulas y plantas maduras pueden ser tratados tantas veces como sea apropiado. El número de aplicaciones requeridas puede ser determinado fácilmente por los expertos en la técnica dependiendo de, por ejemplo, la planta en cuestión, la etapa de desarrollo de la planta a la que se inicia el tratamiento, el estado de salud de la planta, el crecimiento, condiciones ambientales y/o climáticas en las que la planta se cultiva y el propósito para el que se cultiva la planta. Por ejemplo, en el caso de cultivos de floración, como los tomates, puede ser deseable aplicar el inoculante microbiano una vez o más de una vez durante el período de floración.

La formulación inoculante de la presente invención se puede preparar en cualquier forma adecuada en función de los medios por los que el inoculante se va a aplicar al suelo o a las semillas de plantas o la vegetación. Las formas adecuadas pueden incluir, por ejemplo, suspensiones, líquidos y formas sólidas. Las formas sólidas incluyen polvos, gránulos, formas de partículas más grandes y pellets. Los líquidos pueden incluir soluciones acuosas y suspensiones acuosas, y concentrados emulsionables.

La formulación inoculante de la presente invención supera con mucho a los biofertilizantes de una o dos cepas bacterianas. Debido a que cada cepa bacteriana tiene una función principal y específica sin descartar que algunas posean dos o más funciones benéfica para la planta a la que ayudan.

La mezcla bacteriana de seis cepas de diferentes géneros se creó a partir de un estudio más riguroso donde se evaluaron 120 cepas de 18 géneros diferentes a los cuales se les evalúo su capacidad de producir alguna sustancia inhibitoria por medio de la técnica de agar en doble capa. Muchas bacterias fueron capaces de producir sustancias inhibitorias, otras no fueron productoras bajo las condiciones exploradas. Bradyrhizobium sp. MS22 y B. unamae MTI-641 no fueron capaces de inhibir a ninguna de las cepas exploradas; sin embargo, P. putida KT2440, Sphingomonas sp. OF178, A. brasilense Sp7 y G. diazotrophicus PAI 5 inhiben el crecimiento de algunas otras cepas, pero no a las cepas mencionadas. Por lo tanto, las seis especies bacterianas fueron capaces de coexistir a pesar de producir sustancias inhibitorias contra otras bacterias (A. brasilense Sp. 7, B. unamae MTI-641 , G. diazotrophicus PAI 5, Sphingomonas sp. OF178, Pseudomonas putida KT2440 y Bradyrhizobium sp. MS22). Estas 6 especies bacterianas fueron elegidas para conformar un inoculante multiespecies.

La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos específicos, que no deben interpretarse en modo alguno como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplo 1. Cultivo bacteriano Fue necesario obtener medios de selección para cada una de las 6 especies bacterianas, para permitir el crecimiento de cada una discriminando el crecimiento de las otras cuando provienen de muestras donde las bacterias están coexistiendo. Esto fue fundamental para explorar el número de bacterias presentes en la suspensión para inoculación, en muestras para evaluar la adhesión en las semillas de maíz y en muestras para evaluar la colonización de las bacterias en la rizósfera; lo que permitió conocer si las bacterias coexisten asociadas a las plantas. Se inició con el medio donde dichas cepas crecen habitualmente y se evalúo la capacidad de cada bacteria para crecer en presencia de diferentes tipos de antibióticos y diferentes concentraciones. Los medios de selección resultantes fueron: 1 ) medio LB-Cm100 (cloranfenicol 100 pg/ml) para P. putida KT2440 que crece como colonia grande, cremosa, ligeramente verdosa, mucosa y con olor fétido. 2) Medio Rojo Congo-CRO30 (ceftriaxona 30 µg/ml) donde A. brasilense Sp. 7 crece como colonias roja escarlata, como tela de araña, consistencia dura, el medio se va decolorando y la colonia se hace dura. La morfología de Azospirillum brasilense es inconfundible. 3) BAc CRO30, CAZ30 (Ceftazidima 30 pg/ml) dode crece B. unamae MTI-641 como colonia blanca, redonda, el medio pasa de amarillo a azul intenso. 4) LB 5% Cm30, CTX50 (Cefotaxima 50 pg/ml), donde Sphingomonas sp. OF178 crece como colonia pequeña, redonda y translúcida. Aquí crece también Bradyrhizobium sp. MS22, pero esta última cepa no es traslucida y se puede discriminar entre un tipo de cepa y otro. 5) Medio LGI-CAZ30 donde crece G. diazotrophicus PAI 5 como colonia redonda amarilla, viscosa y translúcida, el medio se decolora con el tiempo. Medio 6) TESMA Ge10 (gentamicina 10 pg/ml), AK30 (amikacina 30 pg/ml), TE30 (tetraciclina 30 pg/ml) donde crece Bradyrhizobium sp. MS22 como colonia blanca redonda y opaca, el medio no sufre cambio de color. Con los medios de selección fue posible explorar la adhesión y colonización de las bacterias cuando están en mezcla, así como la cantidad de bacterias inoculadas.

Ejemplo 2. Obtención de la formulación multiespecies Las seis bacterias son crecidas independientemente en sus medios de selección de forma masiva en placas de vidrio de 20 mm de grosor por 20 cm de diámetro, conteniendo 125 mi de medio selectivo en forma gelificada. El estriado es realizado con hisopos de algodón estéril. Después las placas se incuban a 30 °C, hasta que las cepas alcanzan su crecimiento máximo, 24 h para P. putida KT2440, Sphingomonas sp. OF178, B. unamae MTI-641 y Bradyrhizobium sp. MS22 y 48 h para A. brasilense Sp7 y G. diazotrophicus PAI 5. Posteriormente, cada una de las cepas es colectada con ayuda de una espátula estéril y adicionando 100 mi de agua destilada estéril sobre la placa, la espátula se pasa de lado a lado para desprender las colonias del medio y la suspensión resultante se decanta en un frasco estéril, así se colectan aproximadamente 100 mi de suspensión de cada una de las bacterias en el mismo frasco (alrededor de 600 mi) y la mezcla es aforada a 1.5 L con agua destilada estéril. La suspensión resultante es homogenizada y dispensada en frascos estériles con 250 mi de suspensión de mezcla de bacterias. La suspensión con la mezcla de bacterias es denominada inoculante multiespecies.

Ejemplo 3. Obtención de suspensiones de monoinoculantes Al igual que para obtener la mezcla de bacterias, para obtener los monoinoculantes líquidos, las seis bacterias son crecidas independientemente en sus medios de selección de forma masiva en placas de vidrio de 20 mm de grosor por 20 cm de diámetro, conteniendo 125 mi de medio selectivo en forma gelificada. El estriado es realizado con hisopos de algodón estéril. Después las placas se incuban a 30 °C, hasta que las cepas alcanzan su crecimiento máximo, posteriormente cada una de las cepas es colectada con ayuda de una espátula estéril y adicionando 100 mi de agua destilada estéril sobre la placa, la espátula se pasa de lado a lado para desprender las colonias del medio y la suspensión resultante se decanta en un frasco estéril de forma independiente, así se colectan aproximadamente 100 mi de suspensión de cada una de las bacterias de forma independiente, que es aforada a 1.5 L con agua destilada estéril. La suspensión resultante es homogenizada y dispensada en frascos estériles, con 250 mi de suspensión con cada bacteria. La suspensión obtenida en cada caso se usó como monoinoculante.

Ejemplo 4. Tratamientos de inoculación El número de bacterias presente en la suspensión bacteriana inoculante multiespecies, así como las suspensiones con bacterias independientes fue cuantificado por el método de "goteo por sellado en placa masivo" (Corral-Lugo A., y col. 2012. Revista Colombiana de Biotecnología. XIV (2): 173-182). Todas las bacterias se encuentran en el rango de 108 UFC/ml en la suspensión bacteriana y son similares tanto cuando conforman el inoculante multiespeciés como cuando se encuentran de forma individual.

Los tratamientos que se usaron para realizar la inoculación de semillas o germinados de maíz fueron los siguientes: Inoculante multiespecies (tratamiento 1 o T1), inoculación de forma independiente (monoinoculantes) (T2 a T7), inoculante multiespecies sometido a esterilización por calor y que sirvió como control negativo (T 8). Un tratamiento adicional (no inoculado) fue considerado donde las semillas germinadas o sin germinar se sumergieron en agua (T 9).

Ejemplo 5. Inoculación de germinados o semillas de maíz Las semillas germinadas axénicas de maíz fueron sumergidas en la suspensión correspondiente durante una hora y posteriormente se colocaron en macetas que contenían 2 litros de vermiculita estéril. Las plántulas se regaron con 150 mi de MSJ y 150 mi de agua destilada estéril. Para experimentos de invernadero de maíz rojo se destinaron 50 semillas germinadas para cada tratamiento en cada experimento. Para experimentos de promoción de crecimiento de maíz en suelo se inocularon semillas no germinadas con cada una de las diferentes suspensiones y controles (9 tratamientos).

En el caso de maíces cultivados en suelo estos fueron remojados en una suspensión bacteriana conteniendo 108 UFC/ml de bacterias del multiinoculante durante una hora y se incluyeron controles sin inocular que solo fueron sumergidos en agua. Las semillas de maíz fueron secadas a la sombra, ; ¡la adhesión corroborada y se cultivaron en macetas con suelo o en campo después del surcado de forma tradicional, bajo condiciones de temporal en San Diego Buena Vista, Papalotla, Tlaxcala.

Ejemplo 6. Adhesión v colonización de bacterias asociadas a la rizósfera de maíz El número de bacterias adheridas a los germinados de maíz se determinó en 5 muestras independientes de cada uno de los 9 tratamientos de ios experimentos de invernadero y en 5 semillas de maíz inoculadas para experimentos en suelo. Las semillas germinadas fueron extraídas de las macetas con vermiculita o las semillas sin germinar se extrajeron de las macetas con suelo, en ambos casos se colocaron en tres mi de agua destilada estéril. Las muestras fueron agitadas con vortex, se realizaron diluciones seriadas en factor 1 :10, para posteriormente cuantificar en los medios de selección, muestras representativas de bacterias que crecieron en los medios selectivos y con características fenotípicas idénticas a las cepas inoculadas fueron preservadas en glicerol al 25% a -20°C con el fin de una corroboración molecular futura. La adhesión de las bacterias del inoculante multiespecies en semillas germinadas se observó de forma adecuada, en el orden del 106 UFC/ mi por semilla tanto para germinados inoculados de forma individual como cuando se inocularon con la formulación multiespecies. Los resultados de adhesión a semillas no germinadas fueron similares.

La colonización de las bacterias en la rizósfera de las plantas de maíz se realizó en distintos tiempos de crecimiento de las plantas (10, 20, y 30 dpi) en experimentos de invernadero, con el fin de conocer el comportamiento de las diferentes cepas tanto en asociación con las plantas como mezcla y de forma individual, determinando el número de células de las diferentes especies en la rizósfera de las plantas inoculadas. Para ello, cinco plantas de cada tratamiento fueron extraídas de su maceta, se sacudieron y se colocaron en agua destilada estéril agitando vigorosamente (dilución 1 :10 P V). A partir de la suspensión bacteriana obtenida se realizaron diluciones seriadas 1 :10 y el número de bacterias se determinó en acuerdo a Corral-Lugo y colaboradores (2012) usando los medios de selección. El número de UFC/g de soporte (suelo o vermiculita) de cada especie en las plantas multiinoculadas (inoculante multiespecies) fue comparado con el número UFC de las mismas especies inoculadas de forma independiente. Las bacterias colonizaron bien tanto de forma individual como cuando se inoculan en mezcla, desde los 10 días posteriores a la inoculación (dpi), en el rango de 105 a 106 UFC/g de soporte y se mantienen en números adecuados a los 30 dpi, alrededor de 105 UFC/g de soporte. Lo que muestra que las bacterias también son compatibles en asociación con la planta en los periodos evaluados (10, 20 y 30 dpi).

Ejemplo 7. Promoción de crecimiento de plantas en condiciones de invernadero usando vermiculita como soporte En éste se determinó el peso fresco y seco de las plantas inoculadas con el inoculante multiespecies, las inoculadas con las cepas individuales y las no inoculadas. La evaluación se realizó a los 30 días posteriores a la inoculación (dpi). Para ello las semillas de maíz fueron germinadas y después inoculadas durante una hora con la suspensión bacteriana en acuerdo con los tratamientos descritos. Después, las semillas germinadas, fueron colocados en macetas de 1 L de capacidad que contenían vermiculita estéril (150 g) y fueron humedecidas con 150 mi de agua y una solución MS (20 mi) que contiene solo 10 mg de NH4NO3 (dosis baja de fertilizante). Las plantas fueron regadas de forma periódica con agua destilada estéril (150 mi) y en con medio MS líquido (20 mi en la segunda vez). El total de plantas experimentales fue de 400 plantas (50 por tratamiento), algunas plantas fueron escogidas al azar para evaluar la colonización de bacterias en cada tiempo experimental (apartado de colonización). Los resultados de los parámetros medidos en el crecimiento de plantas fueron sujetos a la comparación estadística mediante la prueba f-student con el programa sigma plot versión 9.0 de Systat Inc. Software.

A los 30 dpi se observó que el tamaño de las plantas inoculadas son estadísticamente mayores a las plantas controles no inoculadas; siendo los tratamientos inoculados con la formulación inoculante multiespecies los de mayor tamaño observado (Fig. 1 , 2). El peso fresco total de las plantas inoculadas con el inoculante multiespecies fue de 12.78 g ±3.43, mientras que el de controles sin inocular fue de 6.77 g ±2.55 y el de controles de células muertas de 6.61 g ±3.14. Las plantas inoculadas con A. brasilense Sp7 (1 1.24 g ±3.71 ), B. unamae MTI-641T (10.87 g ±2.41 ), G. diazotrophicus PAI 5T ( 1.59 g ±3.18) y Sphingomonás sp. OF178 (1 1.32 g ±3.43) mostraron valores ligeramente menores al de plantas inoculadas con EMMIM-1 , pero sin diferencia estadística. Las plantas inoculadas con P. putida KT2440 (9.01 g ±2.27) y Bradyrhizobium sp. MS22 (10.28 g ±3.37) mostraron valores menores a los otros tratamientos inoculados pero superiores al de controles.

El peso seco de las plantas tuvo la misma tendencia que la observada con el peso fresco (Fig. 3). Las plantas inoculadas con inoculante multiespecies son las que mayor peso seco presentaron (720 mg ±130) y sus valores fueron estadísticamente similares al de plantas inoculadas con A brasilense Sp7 (650 mg ±140), B. unamae MTI-641 (650 mg ±100 mg), G. diazotrophicus (690 mg ±160) y Sphingomonas sp. OF178 (690 ±140). Los pesos secos de plantas inoculadas con P. putida KT2440 (550 mg ±130) y Bradyrhizobium sp. MS22 (590 mg ±120) mostraron valores mayores a controles inoculados con células muertas (400 mg ±140) y controles sin inocular (420 mg ±100) para no inoculadas) y menores a inoculante multiespecies.

Ejemplo 8. Promoción de crecimiento en condiciones de invernadero-suelo de campo Éste se realizó similar al ejemplo 1 , explorando 9 tratamientos, pero las semillas no fueron germinadas previamente y en su lugar se inocularon en la suspensión bacteriana respectiva, además de los tratamientos de controles. Se usó suelo homogenizado sin esterilizar en lugar de vermiculita estéril, además no se adicionó fertilizante nitrogenado. El suelo provino de un terreno ubicado en San Diego Buena Vista, Papalotla Tlaxcala (latitud 19° 10' 20.7" N; longitud 98° 9' 53" O). Algunas propiedades fisicoquímicas del suelo fueron determinadas a partir de 5 muestras independientes: contenido de fósforo (72.51 mg/Kg), materia orgánica (1.38% ±0.4) por el método de Walkley y Black AS-07), pH (6.62 ±0.21 ) mediante potenciómetro AS2 y textura por el método de Bouyoucos AS-09: contenido de arcilla: 22% ±1.58, limo 4.80% ±1.92, arena 73.2% ±2.49. También se determinó la presencia de algunos cationes solubles intercambiables en el extracto de saturación, mediante espectrometría de absorción atómica AS-19: fierro (18.31 mg/L ±4.32), manganeso (1.41 mg/L ±0.18), zinc (0.084 mg/L ±0.02), magnesio (6.34 mg/L ±1.01 ), calcio (19 mg/L ±4.62), cobre (0.052 mg/L ±0.008), sodio (109.38 mg/L ±6.68) y potasio (2.28 mg/L ±0.56). En general se observa que el suelo usado para el experimento es de tipo franco arcilloso arenoso y con bajo contenido de materia orgánica y un pH cercano a la neutralidad. Los minerales presentes no representan peligro de salinidad o toxicidad.

En cada tratamiento del ejemplo 2 se incluyeron 30 semillas y el porcentaje de nacencia (germinación y brote) fue determinado: 56% A. brasilense Sp7, 93.33% B. unamae MTI-641 , 96.66% G. diazotrophicus PAI 5, 80% Sphingomonas sp. OF178, 66% P. putida KT2440, 100% Bradyrhizobium sp MS22, 90% inoculante multiespecies, 70% control células muertas, 43% control no inoculado. Los peores porcentajes de nacencia fueron para semillas no inoculadas. Las semillas inoculadas con A. brasilense Sp 7 y P. putida KT2440 mostraron un porcentaje de nacencia bajo. Los mejores porcentajes de nacencia fueron observados para semillas inoculadas con la mezcla de bacterias (inoculante multiespecies), fí. unamae / MTI-6 1 , G. diazotrophicus PAI 5T y Bradyrhizobium sp. MS22. Las semillas inoculadas con Sphingomonas sp. OF178 presentaron un porcentaje de nacencia medio. ; Las plantas fueron regadas periódicamente con agua destilada estéril y no fueron fertilizadas. A los 30 dpi las plantas fueron evaluadas en el peso fresco y seco. Los resultados de los parámetros medidos en el crecimiento de plantas fueron sujetos a la comparación estadística mediante la prueba f-student con el programa sigma plot versión 9.0 de Systat Inc. Software, o mediante análisis de varianza acoplada a la prueba estadística de Tukey mediante el programa sigma plot versión 12 de Handel Sientific. En casos excepcionales se usó la prueba estadística de suma de rangos Mann-Whitney.

A los 30 dpi se observó que el crecimiento de las plantas inoculadas con EMMIM-1 muestran los valores más altos de peso fresco (5.35 g ±1.48) aunque estadísticamente similares a las plantas inoculadas con A. brasilense Sp7 (4.90 g ±0.92) y con B. unamae MTI-64 (5.10 g ±1.77) (Figura 4). Las plantas inoculadas con Bradyr izobium sp. MS22 (4.60 g ±1.07) muestran valores menores al inoculante multiespecies y mayores a controles. Las plantas monoinoculadas con G. diazotrophicus PAI 5, Sphingomonas sp. OF178 y P. pulida KT2440 mostraron los valores más bajos similares estadísticamente a plantas control (3.28 g +0.86). En cuanto al peso seco, a los 30 dpi se observó que las plantas inoculadas con el inoculante multiespecies (760 mg ±230) tienen los valores más altos (Figura 5) y estadísticamente superiores en referencia a plantas control (430 mg ±120). Solo las plantas inoculadas con B. unamae (720 mg ±270) mostraron pesos estadísticamente iguales al de la mezcla. Las plantas inoculadas con los otros tratamientos mostraron valores estadísticamente similares a las plantas control.

Los resultados de los ejemplos 1 y 2 muestran, que independientemente "de la condición experimental, las plantas inoculadas con el inoculante multiespecies fueron las que mayor crecimiento alcanzaron. Solo que las cepas que contribuyeron con el crecimiento de las plantas son diferentes en cada situación, para el ejemplo 1 contribuyeron las cepas A. brasilense, B. unamae, G. diazotrophicus y Sphingomonas. sp. F178. Para el ejemplo 2 contribuyó principalmente 8. unamae MTI-641.

Ejemplo 9. Promoción de crecimiento de maíz en condiciones de campo En este experimento se usaron las variedades maíz Rojo, maíz Amarillo, maíz Pinto (todos criollos de Tlaxcala) y maíz Pozolera (criollo del estado de Guerrero). En todas las variedades se incluyeron tratamientos inoculados y no inoculados que sembraron en bloques 24 x 35 metros aproximadamente. Cinco Kg de maíz de cada variedad se usaron para inocularlos con el inoculante multiespecies sumergiéndolos en una suspensión bacteriana (108 UFC/ml de cada especie) y 5 Kg de maíz solo se sumergieron en agua, durante una hora. Los maíces inoculados y los no inoculados se sembraron en áreas independientes de 12 X 35 m (por cada variedad) en surcos previamente realizados con una distancia de 80 cm de separación. Se colocaron tres semillas a un distanciamiento de 50 cm y las plantas se mantuvieron bajo condiciones de temporal. A los 60 días posteriores a la inoculación a partir de 15 plantas de cada tratamiento tomadas al azar, se registró la altura de la región aérea, el diámetro de tallo y la cantidad relativa de clorofila. La clorofila fue extraída en 500 µ? de etanol absoluto a 4°C durante una semana, a partir de muestras que consistieron en tomar 2 perforaciones de hoja de maíz de 15 plantas independientes de cada tratamiento (T= 0.6 cm); área total de extracción= 0.56 cm2. La absorbancia de clorofila fue determinada a ?= 662 nm. En un espectrofotómetro. En todos los casos las plantas inoculadas con el inoculante multiespecies presentaron valores mayores en referencias a los controles no inoculados (tabla I). En general el contenido de clorofila fue similar entre plantas multiinoculadas y plantas no inoculadas, lo que significa que no hay efecto de dilución de nutrientes a pesar de la estimulación de crecimiento.

Tabla I Las plantas fueron fertilizadas a los 60 dpi con 7.5 g de NPK (nitrógeno, fósforo y potasio, que es una condición muy baja de fertilización). Posterior a la toma de muestras y fertilización se realizó una labranza tanto para plantas inoculadas como para las no inoculadas; que consistió en arar los surcos colocando mayor volumen de suelo al tallo de a las plantas para su mayor soporte. No se realizaron más labranzas. En todos los casos se observó que el crecimiento de las plantas fue mejor para plantas inoculadas con el inoculantemultiespecies en referencia a plantas no inoculadas. Debido a los resultados previos de promoción de crecimiento que se observaron con la variedad Rojo criollo, multi-inoculada bajo condiciones de invernadero, se decidió seguir monitoreando la tendencia de crecimiento de esta variedad. A los 60 dpi se registró la apariencia mediante fotografía (Figura 6) observando mejor tamaño en las plantas inoculadas. A los 160 días posteriores a la inoculación se extrajeron 15 elotes al azar de plantas independientes, tratamientos multiinoculados y no inoculados, con los que se evaluó su longitud, diámetro y pigmentación. La apariencia de las plantas fue registrada mediante fotografía (Figura 7). Se observó que las plantas no inoculadas tenían elotes tiernos de una longitud menor (7.58 cm) (Figura 8) al de plantas inoculadas (12.36 cm) (tabla II). La pigmentación de elotes ocurrió primero para plantas no inoculadas (Figura 8), lo que sugirió que las plantas inoculadas con el inoculante multiespecies seguían creciendo y que fue corroborado en la cosecha (tabla II).

La cosecha se realizó a los 210 dpi, cuando las plantas estaban totalmente secas, la longitud de mazorca, diámetro, peso, número de granos por hilera y el número de hileras por mazorca fue registrado, a partir de 15 mazorcas muestreadas al azar tomadas tanto de plantas no inoculados como de plantas inoculadas. El peso total de mazorca tanto del tratamiento inoculado como del tratamiento no inoculado fue determinado después de la recolección de mazorca (pizca). Los resultados de los parámetros medidos en el crecimiento de plantas fueron sujetos a la comparación estadística mediante la prueba í-student con el programa sigma plot versión 9.0 de Systat Inc. Software. Se observó que las mazorcas de plantas inoculadas con el inoculante multiespecies (16.43 cm ±1.97) son de mayor tamaño al de plantas no inoculadas (7.53 cm ±1.81) (tabla II y Fig. 9); lo cual se avala por la diferencia estadísticamente significativa en la longitud, diámetro, número de granos por hilera y peso de la mazorca, que fueron mayores para el caso de plantas inoculadas en comparación a las mazorcas de plantas no inoculadas. Interesantemente el número de mazorcas obtenido a partir de plantas inoculadas fue constante y de 2 por planta, en cambio en el tratamiento no inoculado tuvo de 0 a 1 mazorca por planta, lo cual se vio reflejado en el rendimiento total de mazorca que es ampliamente mayor para el tratamiento inoculado (771.3 Kg) en referencia al tratamiento no inoculado (144.64 Kg) (tabla II).

Tabla II Ejemplo 0. Efecto del inoculante multiespecies en campo de otra región Se evaluó el porcentaje de nacencia y tamaño de plantas de maíces inoculados con el inoculante multiespecies y no inoculados de la variedad criollo blanco en una zona con características de suelo diferentes (no mostrado) ubicado en Atlangatepec en el estado de Tlaxcala (Latitud 19° 32' 37.6" N, Longitud 98° 9' 46.6"). La evaluación se realizó en transectos de 10 metros en 3 sitios diferentes. Se observó que las plantas inoculadas con el inoculante multiespecies mostraron mejor porcentaje de nacencia (74%) con referencia a las plantas no inoculadas (46%). Además el tamaño de plantas inoculadas con el inoculante multiespecies fue estadísticamente mayor (26.33 cm ±1.36) al de plantas no inoculadas (14.33 cm ±2.87).

Ejemplo 11. Evaluación de la inoculación de inoculante multiespecies en . otras plantas El potencial promotor de crecimiento del inoculante multiespecies fue evaluado en plantas de frijol negro criollo y en papa de la variedad Atlantic, bajo condiciones de invernadero. Para el caso de frijol se observaron resultados del doble de rendimiento en plantas inoculadas con el inoculante multiespecies en relación a plantas no inoculadas bajo condiciones de baja fertilización. Para plantas de papa se observó mayor tamaño de plantas (Figura 10) y mayor cantidad de papas para aquellas inoculadas con el inoculante multiespecies. La adhesión y colonización de bacterias fue evaluada similar al modelo de maíz, observándose adecuada para los dos modelos (no mostrado).

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES
2. Una formulación potenciadora del crecimiento de plantas, caracterizado porque comprende las bacterias i) Burkholderia unamae MTI-641 , ii) Pseudomonas putida KT2440, iii) Bradyrhizobium sp. MS22, iv) Sphingomonas sp. OF178, v) Azospirillum brasilense Sp7, vi) Gluconacetobacter diazotrophicus PAI 5).
3. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque las bacterias están en una concentración seleccionada entre el rango de alrededor de 1 x 102 ufc/ml a alrededor de 1 x 1010 ufc/ml, y puede estar alrededor de 1 x 103 ufc/ml, alrededor de 2.5 x 103 ufc/ml, alrededor de 5 x 103 ufc/ml, alrededor de 1 x 104 ufc/ml, alrededor de 2.5 x 104 ufc/ml, alrededor de 5 x 104 ufc/ml, alrededor de 1 x 105 ufc/ml, alrededor de 2.5 x 105 ufc/ml, alrededor de 5 x 105 ufc/ml, alrededor de 1 x 106 ufc/ml, alrededor de 2.5 x 106 ufc/ml, alrededor de 5 x 106 ufc/ml, alrededor de 1 x 107 ufc/ml, alrededor de 2.5 x 107 ufc/ml, alrededor de 5 x 107 ufc/ml, alrededor de 1 x 108 ufc/ml, alrededor de 2.5 x 108 ufc/ml, alrededor de 5 x 108 ufc/ml, alrededor de 1 x 109 ufc/ml, alrededor de 2.5 x 109 ufc/ml, o alrededor de 5 x 109 ufc/ml. La formulación de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque está adaptada en una forma seleccionada entre el grupo soluciones acuosas y suspensiones acuosas, y concentrados emulsionables. La formulación de conformidad con las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque está adaptada en una forma sólida seleccionada entre el grupo de
4. polvos, gránulos, formas de partículas más grandes y pellets. Los líquidos pueden incluir soluciones acuosas y suspensiones acuosas, y concentrados emulsionables.
5. 5. Un método para potenciar el crecimiento de plantas, caracterizado porque comprende la aplicación a una parte de la planta de la formulación de las reivindicaciones 1-4.
6. 6. Un método para potenciar el crecimiento de plantas, acracterizado porque comprende la aplicación al suelo en el que las plantas están creciendo o para ser cultivadas o en el que las semillas han sido o van a ser sembradas de la formulación de las reivindicaciones 1-4.
7. 7. El método de conformidad con las reivindicaciones 5-6, en donde la planta es seleccionada entre el grupo de plantas de ornato y plantas de cultivo.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, en donde las plantas de cultivo son seleccionadas entre el grupo de tubérculos y vegetales subterráneos, hortalizas, vegetales, frutas, cereales, frutos secos.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, en donde la aplicación se lleva a cabo directamente a la planta, partes de planta, o semillas.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde la aplicación se lleva a cabo mediante una técnica seleccionada entre el grupo vertido, dispersión, pulverización, difusión, remojo de las semillas antes de la siembra, y empapado de semillas o plantas de semillero después de la siembra.