ANÁLOGO DE GLP-2 DE MAMÍFERO, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção refere-se a peptídeos relacionados com glucagon tendo propriedades de promoção do crescimento de tecidos intestinais e a seu uso terapeuticamente para tratar várias condições médicas resultantes de crescimento prejudicado ou perda deste tecido. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A expressão do gene de glucagon dá uma variedade determinada por tecido de produtos de peptídeos que são processados de produto de proglucagon residual 160. A organização destes peptídeos dentro do precursor de proglucagon foi elucidada pela clonagem molecular de cDNAs de preproglucagon do pâncreas bovino, rato, hamster. Estas análises revelaram que o preproglucagon contém não somente a seqüência de glucagon e glicentina, mas também dois peptídeos semelhantes de glucagon adicionais (GLP-1 e GLP-2), separados de glucagon e cada outro por dois peptídeos espaçadores ou intervenientes (IP-I e IP-II). Estes peptídeos são flanqueados por pares de aminoácidos básicos, características de sítios de clivagem pro-hormônio clássicos, sugerindo que podem ser liberados após o processamento prós-translacinal de proglucagon (Drucker, Pancreas, VI990, (5(4):484).
Análise de peptídeos liberados de proglucagon nas ilhotas pancreáticas de Laurgerhans, por exemplo, sugere que peptídeo pancreático primário liberado é glucagon de 29 meros, enquanto glicentina, oximmomodulina, IP-II e os peptídeos semelhantes a glucagon são mais prevalecentes nos intestinos delgado e grosso. Esta demonstração que os peptídeos semelhantes a glucagon são encontrados no intestino em levado a pesquisas na estrutura precisa e função(s) putativa(s) destes peptídeos no intestino recentemente descobertos. A maior parte dos estudos tem focalizado em GLP-1, porque várias linhas de evidência sugeriríam que GLP-1 pode ser um novo importante peptídeo regulatório. De fato, foi determinado que GLP1 é um dos estímulos peptidérgicos conhecidos mais potentes para liberação de insulina, uma ação mediada em um modo dependente de glicose através da interação com receptores em células β pancreáticas. GLP-1 e seus derivados estão em desenvolvimento para uso no tratamento de diabetes.
Os papéis fisiológicos de glicentina e oximomodulina, as assim chamadas enteroglucagonos estão também sob investigação, particularmente com relação a regulagem de secreção de ácido e o crescimento de células intestinais. Oximomodulina é capaz de inibir a secreção de ácido gástrico estimulada por pentagatrina em um modo dependente da dose. O papel de glicentina na mediação das mudanças de adaptação intestinal e crescimento de mucosa intestinal foi investigado, e o efeito intestinotrófico de glicentina e seu uso terapêutico foram recentemente registrados por Matsuno et al em EP 612.531, publicado em 31 de agosto de 1994.
Em contraste com GLP-1 e outros peptídeos relacionados com glucagon, o papel fisiológico de peptídeo semelhante a glucagon GLP-2 permanece fracamente entendido apesar do isolamento e seqüenciamento de vários homólogos de GLP-2 incluindo humano, rato, bovino, suíno, porquinho da índia, e hamster. Usando anti-soro GLP-2 criado contra versões sintéticas de GLP-2, vários grupos determinaram que GLP-2 está presente primariamente em extratos intestinais em vez de pancreáticos (ver Mojsov et al, J. Biol. Chem., 1986, 261 (25): 11880; Orskov et al in Endocrinology, 1986, 119 (4): 1467 e em Diabetologia, 1987, 30: 874 e em FEBS Letters, 1989, 247 (2): 193; George et al, FEBS Letters, 1985, 192 (2): 275). Com relação a seu papel biológico, Hoosein et al registram (FEBS Letters, 1984, 178 (1): 83) que GLP-2 nem compete com glucagon para ligar a tecidos do cérebro e fígado de ratos, nem estimula a produção de adenilato ciclase em membranas de plasma de fígado, mas enigmaticamente, podem estimular adenilato ciclase em tanto tecido pituitário como hipotalâmico de ratos, em concentrações de 3-50 pM. Uma elucidação do papel fisiológico de GLP-2 deve ser claramente desejável. SUMÁRIO DA INVENÇÃO.
Foram agora descobertos análogos de GLP-2 que promovem o crescimento de tecido do intestino delgado. Conseqüentemente é um objeto geral da presente invenção prover estes análogos de GLP-2 e prover para seu uso terapeuticamente e para fins relacionados.
Em um aspecto da invenção, os análogos de GLP-2 demonstram atividade intestinotrófica e se conformam com a fórmula estrutural 1 (SEQIDNO: 1):
Rl-(Yl) m-Xl-X2-X3-X4-SerS-Phe6-Ser7-Asp8-(Pl)-Leul4Aspl5-Asnl6-Leul7-Alal8-X19-X20-Asp21-Phe22-(P2)-Trp25-Leu26Ile27-Gln28-Thr29-Lys30-(P3)-(Y2)n-R2, em que
XI é His ou Tyr
X2 é Ala ou um aminoácido de substituição de Ala conferindo em referido análogo, resistência a enzima DPP-IV;
X3 é Pro, HPro, Asp ou Glu;
X4 é Gly ou Ala;
PI é Glu-X10-Asn-Thr-Ile ou Tyr-Ser-Lys-Tyr;
XI0 é Met ou um aminoácido de substituição de MET oxidativamente estável;
XI9 éAlaouThr;
X20 é Arg, Lys, His ou Ala;
P2 é Ile-Asn, Ile-Ala ou Val-Gln;
P3 é uma ligação covalente, ou é Ile, Ile-Thr ou Ile-Thr-Asp;
RI é H ou um grupo de bloqueio N-terminal;
R2 é OH um grupo de bloqueio C-terminal;
Y1 é um ou dois aminoácidos básicos selecionados do grupo Arg,
Lys, e His;
Y2 é um ou dois aminoácidos básicos selecionados do grupo Arg, Lys, e His; e men, independentemente, são 0 ou 1; e em que pelo menos um de XI, X2, X3, X4, Pl, ΧΙΟ, X19, X20, P2 e P3 é diferente de um resíduo GLP-2 de mamífero, de tipo selvagem.
Os análogos particularmente preferidos de acordo com a fórmula 1 (SEQ ID NO: 1) são aqueles que são tomados resistentes a divagem por enzima DPP-IV humana por substituição de Ala na posição X2 com um aminoácido alternativo. Outros análogos da invenção são aqueles que substituem oxidativamente o Met na posição X10 com um resíduo de aminoácido que é estável oxidativamente. Deste modo, os peptídeos análogos tem aumentada estabilidade comparada com peptídeos GLP-2, com o resíduo Met de tipo selvagem nesta posição. Ainda outra forma de realização preferida da invenção, é a incorporação na posição X20 de um aminoácido básico selecionado de His ou Lys. Essa substituição é vantajosa quando os análogos de GLP-2 são quimicamente sintetizados. O resíduo Arg que normalmente ocorre nesta posição tende a fortemente ligar solventes usados nos procedimentos de síntese de peptídeos. A substituição de Arg permite uma formulação mais fácil dos análogos de GLP-2 sinteticamente produzidos em composições farmaceuticamente aceitáveis.
Mais particularmente, e de acordo com um aspecto da invenção, são providos análogos de um peptídeo de GLP-2 selecionado dentre uma espécie GLP-2 e formas modificadas terminalmente N e/ou C dos mesmos, os análogos tendo atividade intestinotrófica e incorporando, com relação ao referido peptídeo GLP-2 de mamíferos, pelo menos uma substituição de aminoácidos em uma posição que é conservada no GLP-2 de mamíferos. Em um aspecto preferido, os análogos de GLP-2 incorporam uma substituição selecionada dentre:
1) incorporação na posição 2 ou na posição 3 de um aminoácido de substituição conferindo, no referido análogo, resistência a dipeptidil peptidase IV (a seguir referido como DPP-IV); e
2) incorporação na posição 10 de um aminoácido de substituição Met oxidativamente estável; e
3) incorporação em X20 de uma substituição de aminoácido diferente de Arg.
Em ainda outro de seus aspectos, a invenção provê análogos intestinotróficos de um GLP-2 de mamíferos, preferivelmente GLP-2 de humanos, em que nem o término nem o N e/ou C, é modificado por um grupo de bloqueio, ou aminoácidos adicionais, ou a substituição de um aminoácido modificado ou alternativo. Em ainda outro aspecto, são providos análogos intestinotróficos de GLP-2 de mamíferos, preferivelmente GLP-2 humano, em que as posições XI, X5, X7, X16-X18, X25, X30, ou X33 incorporam uma substituição de aminoácido diferente da encontrada em GLP-2 de mamíferos de ocorrência natural. Opcionalmente, em outro aspecto, a invenção provê análogos intestinotróficos em que de 3 a 8 resíduos são deletados do término C.
Em outro de seus aspectos, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um análogo de GLP-2 da presente invenção em uma quantidade terapeuticamente efetiva, e preferivelmente em uma quantidade intestinotrófica, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em outro aspecto, a invenção provê um processo para promover o crescimento de tecido de intestino delgado em um paciente em necessidade do mesmo, compreendendo a etapa de liberar ao paciente uma quantidade intestinotrófica de um análogo de GLP-2 da presente invenção.
Além de promover o crescimento do intestino, em outro de seus aspectos, a invenção provê um processo para o tratamento de doença gastrointestinal por administração a um paciente sofrendo de doença gastrointestinal uma quantidade terapeuticamente eficaz de análogo de GLP2 da invenção, junto com um veículo farmaceuticamente aceitável, a fim de reduzir o efeito patológico ou sintoma da doença gastrointestinal.
Em ainda outro aspecto da invenção, provê-se um processo utilizável para identificar análogos intestinotróficos de GLP-2, compreendendo as etapas de:
1) obter um análogo de GLP-2 de acordo com a fórmula 1 (SEQ ID NO: 1) representada acima;
2) tratar um mamífero com referido análogo usando um regime capaz de elicitar um efeito intestinotrófico quando usado para GLP-2 de rato, e
3) determinar o efeito do referido análogo em peso de intestino delgado com relação a um mamíferos de controle tratado como imitação, pelo que referido análogo de intestinotrófico de GLP-2 é identificado como um análogo que elicita um aumento no referido peso. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A invenção refere-se a usos terapêuticos e relacionados de análogos de GLP-2, particularmente para promover o crescimento de tecido do intestino delgado. O efeito no crescimento elicitado pelos presentes análogos de GLP-2 se manifesta como um aumento no peso do intestino delgado, com relação ao controle tratado como imitação. Em particular, análogos de GLP-2 são considerados como tendo atividade intestinotrófica se, quando avaliados no modelo de murinos aqui exemplificado, o análogo media um aumento no peso do intestino delgado de pelo menos 10% com relação a um animal de controle recebendo apenas veículo. Particularmente apropriado para uso terapêutico são os análogos que mediam um aumento de pelo menos 20% no peso do intestino delgado, preferidos para uso terapêutico são os que mediam um aumento no peso do intestino delgado de 50% ou mais. A atividade intestinotrófica é notada de modo mais significante com relação ao jejuno incluindo o jejuno distai e particularmente o jejuno proximal, e também é notada no íleo.
Além de demonstrar atividade intestinotrófica como acima definido, os análogos de GLP-2 da presente invenção incorporam uma substituição de aminoácido em um ou mais sítios dentro de um fundo de peptídeo GLP-2, que é ou uma espécie de GLP-2 de mamíferos por si, ou é uma variante de uma espécie de GLP-2 de mamíferos em que o C-término e/ou N-término foi alterado por adição de um ou mais dois resíduos básicos, ou foi modificado para incorporar um grupo de bloqueio do tipo usado convencionalmente na arte de química de peptídeos para proteger os términos de peptídeos de ataque bioquímico indesejado e degradação in vivo. Assim, os presentes peptídeos incorporam uma substituição de aminoácidos no contexto de qualquer espécie de GLP-2 de mamíferos, incluindo mas não são limitados a GLP-2 humano, GLP-2 bovino, GLP-2 de rato, GLP-2 degu, GLP-2 de boi, GLP-2 de suínos, GLP-2 de porquinhos da índia e GLP-2 de hamster, cujas seqüências foram descritas por vários autores, incluindo Buhl et al, J. Biol. Chem., 1988, 263 (18): 8621.
Em um aspecto da invenção, os análogos intestinotróficos de GLP-2 se conformam com a seqüência da fórmula 1 (SEQ ID NO: 1) como a seguir:
Rl-(Yl)m-Xl-X2-X3-X4-Ser5-Phe6-Set7-Asp8-(Pl)-Leul4Asp 15-Asnl 6-Leul 7-Alal 8-X19-X20-Asp21 -Phe22-(P2)-Trp25-Leu26Ile27-Gln-28-Thr29-Lys30-(P3)-(Y2)n-Rz, em que
XI é His ou Tyr
X2 é Ala ou um aminoácido de substituição de Ala conferindo no referido análogo resistência a enzima DPP-IV,
X3 é Pro, HPro, Asp ou Glu;
X4 é Gly ou Ala;
P1 é Glu-Xl O-Asn-Thr-Ile ou Tyr-Ser-Lys-Tyr;
XI0 é Met ou um aminoácido de substituição de Met oxidativamente estável,
XI9 éAlaouThr;
X20 é Arg, Lys, His ou Ala;
P2 é Ile-Asn, Ile-Ala ou Val-Gln;
P3 é uma ligação covalente, ou é Ile, Ile-Thr ou Ile-Thr-Asp;
RI é H ou um grupo de bloqueio N-terminal;
R2 é OH ou um grupo de bloqueio C-terminal;
Y1 é um ou dois aminoácidos básicos selecionados do grupo Arg, Lys, e His;
Y2 é um ou dois aminoácidos básicos selecionados do grupo Arg, Lys, e His; e men, independentemente, são 0 ou 1; e em que pelo menos um de XI, X2, X3, X4, Pl, ΧΙΟ, X19, X20, P2 e P3 é diferente de um resíduo GLP-2 de mamíferos, de tipo selvagem,
Os resíduos de GLP-2 de mamíferos tipo selvagem que ocorrem em uma posição específica são determinados por alinhamento das seqüências de GLP-2's isoladas de diferentes espécies de mamíferos e comparando as seqüências para a seqüência humana (SEQ ID NO: 2), reproduzida abaixo, por conveniência:
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phc-Ser-Asp-GJu-MCT-Asn1 510
Tlir-Ile-Leu-Asp-Asa-lxu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe1520
Ilc-Asn-Trp-Leu-ne-Gln-Thr-Lys-Hc-Thr-Asp 2530
Os resíduos de aminoácido que, para fins deste pedido, são conhecidos como ocorrendo em posições específicas em GLP-2 de mamíferos tipo selvagem, são as seguintes: posição XI3 pode ser lie ou Vai; posição X16 pode ser Asn ou Ser; posição X19 pode ser alanina ou treonina; posição X20 pode ser Arg ou Lys; posição X27 pode ser Ile ou Leu; e posição X28 pode ser Gin ou His.
Os presentes análogos de GLP-2 podem incorporar desejadas substituições de aminoácidos e um fundo que é N-terminalmente ou Cterminalmente modificado de um peptídeo GLP-2 de mamíferos. Estes análogos são representados na fórmula 1 (SEQ ID NO: 1) como os em que RI constitui um grupo de bloqueio N-terminal, e/ou quando m é 1 então Y1 é um ou dois aminoácidos básicos como Arg, ou Lys; e/ou R2 é um grupo de bloqueio C-terminal; e/ou quando n é 1 então Y2 é independentemente, um ou dois aminoácidos básicos como Arg ou Lys.
Em formas de realização preferidas da invenção, o análogo de GLP-2 é um análogo de comprimento completo GLP-2, isto é, GLP-2 (1-33), e P3 é consequentemente a seqüência Ile-Thr-Asp. Alternativamente, os análogos de GLP-2 podem ser truncadas C-terminalmente, para dar as formas GLP-2 (1-32) em que P3 são formas Ile-Thr, ou a forma GLP-2 (1-31) em que P3 é lie, ou GLP-2 (1-30) em que P3 é uma ligação covalente.
(1-30) forma em que P3 é uma ligação covalente.
Os grupos de bloqueio representados por RI e R2 são os grupos químicos que são usados como rotina na arte de química de peptídeos para conferir estabilidade bioquímica e resistência a digestão por exopeptidase. Os grupos de proteção N-terminais apropriados incluem, por exemplo, os grupos de alcanoíla C].5 como acetila. Também apropriados como grupos de proteção N-terminais são análogos de aminoácidos faltando a função amino, por exemplo, desamino-Tyrl. Os grupos de proteção Cterminal apropriados incluem os grupos que formam cetonas ou amidas ao átomo de carbono de carboxila C-terminal, ou os grupos que formam ésteres ao átomo de oxigênio de carboxila. Os grupos alquila incluem os grupos formando cetona e éster, particularmente os grupos alquila Ci_5 ramificados ou não ramificados, por exemplo, os grupos metila, etila e propila, enquanto os grupos formando amida incluem as funções amino como amina primária, ou funções alquilamino, por exemplo, grupos mono-alquilamino C1.5 e dialquilamino C1.5 como metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, metiletilamino e outros. Os análogos de aminoácidos também são apropriados para proteger a terminação C-terminal dos compostos presentes, por exemplo, análogos de aminoácido descarboxilado como agmatina.
As formas de realização da invenção especificamente incluem análogos em que m é 0 e RI é um grupo de bloqueio como acetila; e análogos em que m é 0 e R2 é um grupo de bloqueio C-terminal como uma amida ou uma amina, por exemplo, -NH2.
Em um aspecto preferido da invenção, os análogos de GLP-2 são os análogos de ou GLP-2 humano ou de GLP-2 de rato. GLP-2 humano é aqui referido como de forma interpermutável hGLP-2 (1-33). O GLP-2 de rato tem a seqüência de aminoácido de GLP-2 humano, mas incorpora na posição 19 um resíduo de Thr 19 a em vez de um resíduo Ala. O GLP-2 de rato é conseqüentemente referenciado aqui como rGLP-2 (1-33) ou como Thr19 de GLP-2 humano, isto é, [Thr19] hGLP-2 (1-33).
Em formas de realização particularmente preferidas da invenção, com relação a tanto os análogos de fórmula 1 (SEQ ID NO: 1) como os análogos de GLP-2 de ratos ou humanos mais específicos, os análogos de GLP-2 incorporam uma substituição de aminoácido selecionada dentre:
1) incorporação em X2 e/ou em X3 de um aminoácido de substituição que toma seu análogo resistente a divagem por enzima DPPIV;
2) incorporação em XI0 de um aminoácido de substituição de Met oxidativamente estável; e
3) incorporação em X20 de um aminoácido de substituição diferente de Arg.
Em ainda outro de seus aspectos, a invenção provê análogos intestinotróficos de um GLP-2 de mamíferos, preferivelmente GLP-2 humano, em que o N- e/ou C-término é modificado por um grupo de bloqueio, ou aminoácidos adicionais, ou a substituição de um aminoácido modificado ou alternativo. Em ainda outro aspecto, são providos análogos intestinotróficos de GLP-2 de mamíferos, preferivelmente GLP-2 de humanos, em que as posições XI, X5, X7, X16-X18, X25, X30, ou X33 incorporam uma substituição de aminoácido em vez da encontrada em GLP2's de mamíferos de ocorrência natural. Opcionalmente, em outro aspecto, a invenção provê análogos intestinotróficos em que de 3 a 8 resíduos são deletados do término C.
A classe resistente a DPP-IV de análogos de GLP-2 possui propriedades particularmente vantajosas. Como aqui demonstrado, as espécies GLP-2 de mamíferos foram verificadas como sendo sensíveis a divagem por enzima DPPIV. Também foi verificado que esta sensibilidade a DPP-IV é o resultado de seqüência de reconhecimento Ala2 Asp3 encontrada em todas as formas de mamíferos de GLP-2. E conseqüentemente provida pela presente invenção, uma classe de análogos de GLP-2 que incorpora em X2 e/ou X3 um aminoácido de substituição que confere no análogo de GLP-2 uma resistência relativa a divagem mediada por DPP-IV, como determinado por qualquer técnica de avaliação in vitro ou in vivo conveniente que é capaz de detectar a presença de produtos de digestão de GLP-2. Um análogo de GLP-2 resistente a DPP-IV é relevado como o análogo de GLP-2 que é processado ou degradado em uma taxa que é mensuravelmente menor do que a taxa em que GLP-2 humano é processada ou degradada, sob as mesmas condições.
Um teste apropriado para avaliar a sensibilidade de DPP-IV e resistência é descrito abaixo no exemplo 3, no contexto dos resultados realmente obtidos.
A classe X2 de análogos de GLP-2 é preferida aqui. Estes análogos de GLP-2 substituídos por Ala2 podem incorporar em X2 uma variedade estruturalmente ampla de aminoácidos de substituição de Ala para obter resistência relativa a digestão DPP-IV. Uma variedade similarmente ampla de aminoácidos de substituição de Ala também permitem a retenção pelo análogo de atividade intestinotrófica. Para fins de identificação destes análogos de X2 resistentes a DPP-IV, que podem também reter atividade intestinotrófica, os análogos de X2 mostrando resistência a DPP-IV são triados no teste de atividade intestinotrófica descrito abaixo no exemplo 4.
Em formas de realização da presente invenção, as substituições Ala2 incluem estereoisômeros de aminoácidos que seriam de outra forma substratos para DPP-IV, por exemplo, D-Ala, D-HPr, fAla, tbutil-Gly, L-penicilina, ácido α-aminobutírico, ácido aminoisobutírico, norvalina, L-fenil-Gly, e D-Pro, e aminoácidos de ocorrência natural, por exemplo, Glu, Lys, He, Ser, Asp, Phe, Lys, Met, Asn, Pro, Gin, Thr, Tyr, Gly e Vai. Nas formas de realização específicas da invenção, são providos os seguintes análogos de GLP-2 substituídos por Ala2 : [D-Ala2] rGLP-2 (1-33), [Gly2] rGLP-2 (1-33), [Vai2] rGLP-2 (1-33) [Gly2] hGLP-2 (1-33), [tBuGly2] hGLP-2, [Asp2] hGLP-2 (1-33), [Glu2] hGLP-2 (1-33), [Phe2] hGLP-2 (1-33), [His2] hGLP-2 (1-33), [He2] hGLP-2 (1-33), [Lys2] hGLP-2 (1-33), [Met2] hGLP-2 (1-33), [Asn2] hGLP-2 (1-33), [Pro2] hGLP-2 (1-33), [Gin2] hGLP-2 (1-33), [Ser2] hGLP-2 (1-33), [Thr2] hGLP-2 (1-33), [Vai2] hGLP-2 (1-33), [Tyr2] hGLP-2 (1-33), [D-Ala2] hGLP-2 (1-33), [Pen2] hGLP-2 (1-33), [bAla2] hGLP-2 (1-33), [aAbu2] hGLP-2 (1-33), [Nval2] hGLP-2 (1-33), [PhGly2] hGLP-2 (1-33), e [Aib2] hGLP-2 (1-33).
Os análogos de GLP-2 X2 podem incorporar substituições de aminoácidos em outras posições. Nas formas de realização da invenção, como os análogos incluem os transportando substituições de aminoácidos também em uma ou mais das posições XI, X3, X4, ΧΙΟ, X19, X20 e X24, e assim incluem os que, de acordo com a fórmula 1 (SEQ ID NO: 1), incluem pelo menos uma das seguintes substituições: XI é Tyr; X3 é Glu; X4 é Ala; PI é Glu-X10-Asn-Thr-Ile onde XI0 é diferente de Met õu PI é Tyr-Ser-LysTyr; XI0 é um aminoácido de substituição Met oxidativamente estável; XI9 é Thr; X20 é Lys ou Ala; P2 é Vai-Gin e P3 é uma ligação covalente, Ile, ou Ile-Thr ou Ile-Thr-Asp.
Nas formas de realização da presente invenção, os análogos X2 de GLP-2 incluem os que também incorporam uma das substituições seguintes: XI é Ala; X3 é Ala; X4 é Ala; XI0 é um aminoácido de substituição Met oxidativamente estável como Vai, Ile, Asn, Glx, Tyr, Phe, e preferivelmente Leu, Nle, Ala, Ser, e Gly; e P2 é Ile-Ala. Nas formas de realização específicas da invenção, são providos os seguintes análogos de GLP-2: [D-Ala2Thr19] hGLP-2 (1-33); [Gly2Thr19] hGLP-2 (1-33); [Val2Thr19] hGLP-2 (1-33); [Gly2Ala24] hGLP-2 (1-33); [Gly2Ala10] hGLP-2 (1-33); [Ala'Gly2] hGLP-2 (1-33); [Gly2Ala3] hGLP-2 (1-33) e [Gly2Ala4] hGLP-2 (1-33).
Em uma forma de realização relacionada, os análogos X2 incluem os que incluem as substituições seguintes: GLP-2 [Gly2Ala8] hGLP2; [Gly2Ala11] hGLP2; [Gly2Ala21] hGLP-2; [Gly2Ala9] hGLP-2; [Gly2Ala16] hGLP-2; [Gly2Ala17] hGLP-2; [Gly2Ala28] hGLP-2; [Gly2Ala5] hGLP2;
[Gly2Ala31] hGLP-2; [Gly2Ala27] hGLP-2; [Gly2Ala12] hGLP-2; [Gly2Ala13] hGLP-2; [Gly2Ala7] hGLP-2; [Gly2Ala6] hGLP2; [Ser2, Gin3] hGLP-2 (1-33); [Gly2, Ala25] hGLP-2 (1-33); [Gly2, Ala26] hGLP-2 (1-33); [Gly2, Ala14] hGLP-2 (1-33); [Gly2, Ala23] hGLP-2 (1-33); [Gly2, Ala30] hGLP-2 (1-33); [Tyr1, Gly2] hGLP-2 (1-33); [Gly2, Arg34] hGLP-2 (1-34); e [Gly2, Tyr34] hGLP-2 (1-34);
Altemativamente, no caso onde X2 é Ala, hPr ou Pro, a resistência a DPP-IV pode ser conferida substituindo Asp3 com um aminoácido de substituição Asp, X3 que é Pro ou hPr.
A presente invenção também provê, como outra classe de análogos de GLP-2, os análogos em que XI0 representa aminoácido de substituição Met oxidativamente estável. Verificou-se que a atividade intestinotrófica de GLP-2 de mamíferos é reduzida quando o Met na posição 10 é oxidado, e também que a atividade intestinotrófica é retida quando os aminoácidos de substituição insensíveis a oxidação são substituídos para a substituição Met10. Tais análogos de GLP-2 substituídos por Met10 estão adequadamente mais estáveis durante a síntese, trabalho e armazenagem. Nas formas de realizações da presente invenção, tais análogos de X10 de GLP-2 são análogos de GLP-2 humano. Em formas de realizações específicas, tais análogos incluem: [Ser10] hGLP-2 (1-33); [Nle10] hGLP-2 (1-33); [Ala10] hGLP-2 (1-33); [Leu10, Gly2] rGLP-2 (1-33); [Met(O)10] ratoGLP-2 (1-33); e [Nle10] ratoGLP-2 (1-33).
Os análogos de XI0 podem também incorporam as substituições de aminoácidos em uma ou mais posições diferentes de XI0. Como observado acima, tais análogos incluem, por exemplo, os incorporando as substituições a X2, e os em que PI é Tyr-Ser-Lys-Tyr, assim como, os em que qualquer um dos substituintes X ou os substituintes P representados na Fórmula 1 (SEQ ID NO: 1) são diferentes de resíduos tipo selvagem ou seqüências. Em formas de realizações específicas, os análogos de GLP-2 incluem [Gly2, Ala10] hGLP-2 (1-33) e [Tyr9Ser10LysTyr12desIle13] hGLP-2 (1-33).
Em outras formas de realizações da invenção, os análogos de GLP-2 incorporam as substituições de aminoâcido no contexto dos antecedentes de peptídeos GLP-2 de mamíferos em que os mesmos são introduzidas. Tais análogos incluem, por exemplo, os análogos de GLP-2 mamíferos e particularmente os análogos de GLP-2 humano em que XI é Tyr; X3 é Glu; X4 é Ala; PI é Tyr-Ser-Lys-Tyr (deslle); P2 é Ile-Ala ou ValGln; e P3 é uma ligação covalente, ou é Ile ou Ile-Thr.
Ainda outros análogos de GLP-2 da invenção incorpora alterações do N- ou C-término pela adição dos aminoácidos, grupos de bloqueio, ou por aminoácidos substituídos. São também providos análogos intestinotróficos de GLP-2 de mamífero, preferivelmente GLP-2 humano, em que as posições XI, X5, X7, X16-X18, X25, X30, ou X33 incorporam um aminoâcido de substituição diferente de GLP-2 de mamíferos de ocorrência natural. Opcionalmente, a invenção provê análogos intestinotróficos em que de 3 a 8 resíduos são deletados do C-término. As formas de realizações específicas de tais análogos intestinotróficos incluem: Ac-ratoGLP-2 (1-33); ratoGLP-2 (1-30); ratoGLP-2 (1-25); ratoGLP-2 (1-33) amida; [Arg2, Arg1-] de rato GLP-2 (2-33); [Pro1] hGLP-2 (1-33); [Gin20] hGLP-2 (1-33); [Asp1] hGLP-2 (1-33); [Tyr34] hGLP-2 (1-34); [desNH2Tyr1] hGLP-2 (1-33); [Tnr5] hGLP-2 (1-33); [Ser16, Arg17,Arg18] hGLP-2 (1-33); [Agm34] hGLP-2 (134); [Asg30] hGLP-2 (1-33); [Ala5, Ala7] hGLP-2 (1-33); [Glu33] hGLP-2 (133); [Phe25] hGLP-2 (1-33); e [Tyr25] hGLP-2 (1-33).
Os análogos de GLP-2 presentes podem ser sintetizados usando técnicas padrões da química de peptídeos e podem ser avaliados para a atividade intestinotrófica, todos de acordo com a direção provida aqui. Com relação a síntese, o análogo de GLP-2 selecionado pode ser preparado por uma variedade de técnicas bem conhecidas para gerar produtos de peptídeos.
Os análogos de GLP-2 que incorporam somente os aminoácidos L podem ser produzidos em quantidades comerciais através da aplicação da tecnologia de DNA recombinante. Para este propósito, a codificação de DNA para o análogo de GLP-2 desejado é incorporada em um vetor de expressão e transformada em um hospedeiro microbiano, por exemplo, levedura, ou outro hospedeiro celular, que é então cultivado sob condições apropriadas para a expressão de GLP-2. Uma variedade dos sistemas de expressão de gene foi adaptada para este propósito, e tipicamente dirigem expressão do gene desejado dos elementos regulatórios de expressão usados naturalmente pelo hospedeiro escolhido. Porque GLP-2 não requer pós glicosilação de tradução para esta atividade, a produção pode ser mais convenientemente alcançada em hospedeiros bacterianos, tal como, de E. coli. Para tal produção, a codificação de DNA para o peptídeo GLP-2 selecionado pode ser utilmente colocada sob controles de expressão dos genes lac, tip ou PL de E. coli. Como uma alternativa para expressão da codificação de DNA para o GLP-2 por si, o hospedeiro pode ser adaptado para expressar o peptídeo GLP-2 como uma proteína de fusão em que o GLP-2 é ligado de modo liberável a uma proteína de veículo que facilita o isolamento e a estabilidade do produto de expressão.
Em uma abordagem universalmente aplicável para a produção de um análogo de GLP-2 selecionado, e um usado necessariamente para produzir os análogos de GLP-2 que não incorporam aminoácidos geneticamente codificados e formas derivatizadas N- e C-terminalmente derivatizadas, as técnicas bem estabilizadas de síntese de peptídeo automatizada são empregadas, cujas descrições gerais aparecem, por exemplo, em J. M. Stewart e J. D. Young. Solid Phase Peptide Synthesis, 2a. ed., 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois; e em M. Bodanszky e A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer Verlag, New York; Applied Biosystems 430A Users Manual, 1987, ABI Inc., Foster
City, California. Nestas técnicas, o análogo de GLP-2 é cultivado de seu Ctérmino, o resíduo conjugado de resina pela adição seqüencial de, apropriadamente, aminoácidos protegidos, usando ou os protocolos Fmon ou tBoc, como descrito, por exemplo, por Orskov et. al., 1989, supra.
Para a incorporação de grupos de bloqueio N- e/ou C-, os protocolos convencionais para os processos de síntese de peptídeo de fase sólida também podem ser aplicados. Para incorporação dos grupos de bloqueio C-término, por exemplo, a síntese do peptídeo desejado é tipicamente realizada usando, como fase sólida, uma resina de suporte que foi 10 quimicamente modificada, de forma que a resina resulta em um peptídeo GLP-2 tendo o grupo de bloqueio C-término desejado. Para prover os peptídeos em que o C-término dá um grupo de bloqueio de aminoácido primário, por exemplo, a síntese é realizada usando uma resina de pmetilbenzhidrilamina (MBHA) de forma que quando a síntese de peptídeo é 15 completada, o tratamento com o ácido fluorídrico libera o peptídeo amidado C-terminalmente desejado. Similarmente, a incorporação de um grupo de bloqueio de N-metilamina ao C-término é alcançada usando uma resina DVB derivada de metilaminoetila, que sob o tratamento HF libera o peptídeo dando um C-término N-metilamidatado. A proteção do C-término através da 20 esterificação pode ser também alcançada usando os procedimentos convencionais. Isto acarreta o uso da combinação de grupo de bloqueio / resina que permite liberar do peptídeo protegido de cadeia lateral da resina, para permitir a reação subsequente com o álcool desejado, para formar a função de éster. Os grupos de proteção FMOC, na combinação com a resina 25 DVB derivada com o álcool metoxialcoxibenzila ou ligadores equivalentes, podem ser usados para este propósito, com a divagem do suporte sendo efetuado por TFA no diclorometano. A esterificação da função carboxila apropriadamente ativada, por exemplo, com DCC, pode, então, proceder pela adição do álcool desejado, seguido pela desproteção e isolamento do peptídeo
GLP-2 esterificado.
A incorporação dos grupos de bloqueio N-terminal pode ser obtida enquanto o peptídeo GLP-2 sintetizado está ainda fixado a uma resina, por exemplo, através do tratamento com anidrido e nitrila apropriado. Para incorporar um grupo de bloqueio acetila ao C-término, por exemplo, o peptídeo copulado de resina pode ser tratado com 20% de anidrido acético em acetonitrila. O análogo de GLP-2 N-bloqueado pode, então, ser clivado da resina, desprotegida e subseqüentemente isolado.
Uma vez que o análogo de GLP-2 desejado foi sintetizado, clivado da resina e completamente desprotegido, o peptídeo é então purificado para assegurar a recuperação de um oligopeptídeo único tendo a seqüência de aminoácido selecionado. A purificação pode ser alcançada usando qualquer uma das abordagens padrões, que incluem cromatografia de líquido de pressão elevada de fase reversa (RP-HPLC) em colunas de silicas alquiladas, por exemplo, silica C4-C8, ou C18. Tal fracionamento de coluna é geralmente obtido ciclando os gradientes lineares, por exemplo, 10 -90%, de aumento em % do solvente orgânico, por exemplo, acetonitrila, em tampão aquoso, usualmente contendo uma quantidade pequena (por exemplo, 0,1%) de agente de formação de pares, tais como, TFA e TEA. Altemativamente, HPLC de troca de íons pode ser empregado para separar as espécies de peptídeo nas bases das mesmas características de carga. As frações de colunas são coletadas, e as contendo peptídeo da pureza desejada/requerida são opcionalmente reunidas em poças. Em uma forma de realização da invenção, o análogo de GLP-2 é então tratado na maneira estabilizada para trocar o ácido de divagem (por exemplo, TFA) com um ácido farmaceuticamente aceitável, tais como, acético, clorídrico, fosfórico, maleico, tartárico, succínico e outros, para gerar um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável do peptídeo.
Para administração a pacientes, o análogo de GLP-2 ou o sal é desejavelmente provido em forma farmaceuticamente aceitável, por exemplo, como uma preparação que é estéril, filtrada, por exemplo, por um filtro de 0,22 μ, e substancialmente isento de pirogênio. Desejavelmente, o análogo de GLP-2 a ser formado migra como um pico único ou individualizado em HPLC, exibe a composição de aminoácido uniforme e autêntica e a seqüência sob análise do mesmo, e, por outro lado, atende a padrões especificados por várias autoridades nacionais que regulam qualidade de produtos farmacêuticos.
Para uso terapêutico, o análogo de GLP-2 escolhido é formado com um veículo que é farmaceuticamente aceitável e é apropriado para liberar o peptídeo pela rotina de escolha de administração. Os veículos apropriados farmaceuticamente aceitáveis são os usados convencionalmente com drogas a base em peptídeos, tais como, diluentes, excipientes, e outros. A referência pode ser feita a “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 17a. Ed., Mack Publisting Company, Easton, Penn., 1985, para guia em formulações de droga em geral. Em uma forma de realização da invenção, os compostos são formulados para administração por infusão, por exemplo, quando usados como suplementos nutricionais líquidos para pacientes em terapia de nutrição parenteral total, ou por injeção, por exemplo, subcutaneamente, intramuscularmente ou intravenosamente, e estão adequadamente utilizadas como soluções aquosas em forma estéril e forma isenta de pirogênio e opcionalmente tamponado para o pH fisiologicamente tolerável, por exemplo, um pH ligeiramente ácido ou fisiológico. Assim, os compostos podem ser administrados em um veículo, tal como, água destilada ou, mais desejável, uma solução salina, tamponada com fosfato ou 5% de solução dextrose. A solubilidade de água do análogo de GLP-2 pode ser aumentada, se desejado, incorporando um melhorador de solubilidade, tal como o ácido acético.
O veículo aquoso ou veículo pode ser suplementado para uso como injetáveis com uma quantidade de gelatina que serve para depositar o análogo de GLP-2 ou próximo do local da injeção, para sua liberação lenta do local desejado da ação. As concentrações da gelatina efetivas para alcançar o efeito de depósito são esperadas para estar na faixa de 10-20%. Os agentes de geleifícação alternativos, tal como, ácido hialurônico, podem ser também utilizáveis como agentes de remoção dos recipientes.
Os análogos de GLP-2 da invenção podem ser também formulados como um aparelho de implante de liberação lenta e administração prolongada do análogo de GLP-2. Exemplos de tais formulações de liberação sustentada incluem combinações de polímeros biocompatíveis, tais como, poli (ácido láctico), poli (ácido láctico-co-glicólico), metilcelulose, ácido hialurônico, colágeno, e outros. A estrutura, a seleção e o uso dos polímeros degradáveis em veículos de liberação de drogas foram descritas em várias publicações, incluindo, A. Domb et al., Polymers for Advanced Technologies 3:279-292 (1992). Um guia adicional na seleção e uso de polímeros nas formulações farmacêuticas pode ser encontrado no texto por M. Chasin e R. Langer (eds.), “Biodegradabel Polymers as Drug Delivery Systems”, “Vol. 45 of “Drugs and the Pharmaceutical Sciences,” M. Dekker, New York, 1990.
Os lipossomas podem ser usados para prover para a liberação sustentada de um análogo de GLP-2. Os detalhes com referência ao uso e fabricação de lipossomas de drogas de interesse podem ser encontrados em, entre outros locais, Patente US no. 4.944.948; Patente US no. 5.008.050; Patente U.S. No. 4.921.706; Patente US no. 4.927.637; Patente US no. 4.452.747; Patente US no. 4.016.100; Patente US no. 4.311.712; Patente US no. 4.370.349; Patente US no. 4.372.949; Patente US no. 4.529.561; Patente US no. 5.009.956; Patente US no. 4.725.442; Patente US no. 4.737.323; Patente US no. 4.920.016. Formulações de liberação sustentada são de interesse particular quando é desejável prover uma concentração local elevada de um análogo de GLP-2.
O análogo de GLP-2 pode ser utilizado na forma de um frasco cheio estéril ou arnpola, que contém uma quantidade intestinotrófica do peptídeo, ou em qualquer dose única ou quantidades de dose múltipla. O frasco ou arnpola pode conter o análogo de GLP-2 e o veículo desejado, como uma formulação pronta para administração. Altemativamente, o frasco ou arnpola pode conter o peptídeo GLP-2 em uma forma, tal como a forma liofilizada, apropriada para reconstituição em um veículo apropriado, tal como solução salina tamponada com fosfato.
Como uma alternativa para formulações injetáveis, o análogo de GLP-2 pode ser formulado para administração por outras vias. As formas de dosagem orais, tais como, comprimidos, cápsulas e outros, podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica padrão. De acordo com a presente invenção, o análogo de GLP-2 é administrado para tratar de pacientes que se beneficiariam do crescimento de tecido de intestino delgado. Os efeitos de análogo de GLP-2 neste tecido, como evidenciado pelos resultados exemplificados aqui, é dramático e claramente beneficiará aqueles pacientes sofrendo de doenças ou condições marcadas por anormalidades na mucosa de área intestinal delgada, que inclui úlceras e distúrbios inflamatórios; digestão congênita ou adquirida e distúrbios de absorção incluindo a síndrome de má absorção; e doenças e condições causadas pela perda da função de mucosa de intestino delgado particularmente em pacientes sofrendo de alimentação parenteral prolongada ou que, como um resultado de cirurgia, sofreram resseção do intestino delgado e sofreram a síndrome de intestino encurtado e a síndrome de divertículo. O tratamento terapêutico com análogo de GLP-2 é administrado assim como para reduzir o sintoma da doença e/ou melhorar o estado nutricional nestes pacientes associados com a função mucosal de área intestinal reduzida dos mesmos. Por exemplo, o análogo de GLP-2 é administrado a um paciente com uma condição de intestino inflamatório em uma quantidade suficiente para melhorar o desconforto intestinal e diarréia causada pela condição. Adicionalmente, o análogo de GLP-2 pode ser administrado a pacientes com distúrbios de má absorção, assim como, para melhorar a absorção nutricional e assim melhora do estado nutricional de tais pacientes.
Em geral, os pacientes quem se beneficiariam de massa intestinal delgada aumentada e conseqüentemente a função mucosal de intestino delgado aumentada são candidatos para o tratamento com o análogo de GLP-2. As condições particulares que podem ser tratadas com análogo de GLP-2 incluem as várias formas de psilose incluindo psilose celíaca que resulta de uma reação tóxica para α-gliadina de trigo, e é marcada por uma tremenda perda de vilos do intestino delgado; psilose tropical que resulta da infecção e é marcada por aplainamento parcial dos vilos, psilose hipogamaglobulinêmica que é observada comumente em pacientes com imunodeficiência comum variável ou hipogamaglobulemia e é marcada por aumento significante em altura do vilo. A eficácia terapêutica do tratamento análogo de GLP-2 pode ser monitorada através de biópsia entérica para examinar a morfologia do vilo, através de taxa bioquímica de absorção nutriente, por paciente de ganho de peso, ou pela melhora dos sintomas associadas com estas condições. Outras condições que podem ser tratadas com análogo de GLP-2, ou para o análogo de GLP-2 e podem ser profilaticamente úteis, incluem entente provocada por radiação, infecções ou entente pós-infecção, entente regional (doença de Crohn), devido ao dano intestinal delgado para agentes tóxicos ou outros agentes quimioterapêuticos, e pacientes com a síndrome de intestino curto.
A dosagem terapêutica e o regime mais apropriado para o tratamento de paciente variará, é claro, com a doença ou condição a ser tratada, e de acordo com o peso do paciente e outros parâmetros. Os resultados apresentados aqui embaixo demonstram que uma dose do peptídeo GLP-2 equivalente a cerca de 100 pg/kg (ou menos) administrado duas vezes diariamente mais de 10 dias podem gerar muitos aumentos significantes na massa de intestino delgado. É esperado que as doses muito pequenas, por exemplo, na faixa de gg/kg, e a duração menor ou mais longa ou a freqüência de tratamento, produzirá, também, resultados terapeuticamente úteis, isto é, um aumento particularmente estatisticamente significante na massa de intestino delgado. Também, é antecipado que o regime terapêutico incluirá a administração de doses de manutenção apropriada por inversão da regressão de tecido que ocorre após cessar o tratamento inicial. As medidas de dosagem e regime de dosagem mais apropriados para uso humano são guiadas pelos resultados aqui apresentados, e podem ser confirmadas em tentativas clínicas corretamente projetadas.
Uma dosagem efetiva e o protocolo de tratamento podem ser determinados através de meios convencionais, partindo com uma dose baixa em animais de laboratórios e então aumentando a dosagem enquanto monitorando os efeitos, e sistematicamente variando o regime de dosagem também. Numerosos fatores podem ser feitos em consideração por um clínico quando determinando uma dosagem ótima para um determinado assunto. Primária dentre estes é a quantidade de GLP-2 normalmente circulando no plasma, que é da ordem de 151 pmol/ml no estado restante, subindo para 225 pmol/ml após a ingestão de nutriente para humanos adultos saudáveis. Orskow, C. e Heist, J. J., 1987, Scand. J. Clin. Lav. Invest. 47:165. Fatores adicionais incluem o tamanho do paciente, a idade do paciente, a condição geral do paciente, a doença particular sendo tratada, a severidade da doença, a presença de outras drogas no paciente, a atividade in vivo do análogo de GLP-2 e outros. As dosagens de tentativas podem ser escolhidas após a consideração dos resultados de estudos de animais e a literatura clínica. Seria apreciado por versado na arte que a informação, tal como, constantes de ligação e o Ki derivado de testes de competição de ligação de GLP-2 in vitro que podem ser usados nas dosagens calculadas, assim como a meia vida calculada do análogo de GLP-2 in vivo.
Um dose humana típica de um peptídeo GLP-2 seria de cerca de 10 pg/kg do peso do corpo/dia a cerca de 10 mg/kg/dia, preferivelmente de cerca de 50 pg/kg/dia para cerca de 5 mg/kg/dia, e mais preferivelmente cerca de 100 pg/kg/dia para 1 mg/kg/dia. Como os análogos de GLP-2 da invenção podem estar acima de 10 até mesmo 100 vezes mais potentes do que GLP-2, uma dose típica de tal um análogo de GLP-2 pode ser inferior, por exemplo, de cerca de 100 pg/kg do peso do corpo/dia para 1 mg/kg/dia, preferivelmente de 1 pg/kg/dia a 500 pg/kg/dia, e até mesmo mais preferivelmente de 1 pg/kg/dia a 100 pg/kg/dia.
Similarmente, os análogos de GLP-2 intestinotróficos da invenção são também úteis para tanto aumentar o crescimento de intestino e tratar os distúrbios inflamatórias em animais de estimação e de criação.
Exemplo 1 - Síntese de análogo de GLP-2
A síntese de peptídeo em fase sólida (SPPS) é realizada manualmente em uma recipiente de 300 milímetros (ml) em uma escala de 3 milimoles (mmole) usando 6 gramas (g) da resina clorometila (Merrifield) (para peptídeos isentos de ácido C-terminais) com uma substituição de 0,5 miliequivalentes (meq) por grama. Os aminoácidos são protegidos ao término amino com o grupo t-butiloxicarbonil (tBoc). As cadeias laterais dos aminoácidos trifuncionais são protegidas com os grupos benzila (Bz, para serina e treonina), benziloximetila (BOM, para histidina), 2bromobenziloxicarbonila (2-BrZ, para tirosina), 2-clorobenziloxicarbonila (2C1Z, para lisina), ciclohexila (cHex, para os ácidos aspárticos e glutâmicos), e tosila (Tos, para arginina). O primeiro aminoácido é copulado na resina clorometila por esterificação do aminoácido protegido na presença do fluoreto de potássio (KF). Os peptídeos amida C-terminais são sintetizados em uma resina de 4-metilbenzilhidrilamina (MBHA) em uma escala de 3 mmol usando 6 g de resina com uma substituição de 0,5 meq/g. O primeiro aminoácido é copulado na resina MBHA de acordo com o procedimento descrito para alongamento de peptídeo.
A desproteção de grupo amino é realizada usando 50% de ácido trifluoroacético (TFA) em diclorometano (CH2CI2), seguido por neutralização usando duas lavagens de 10% de trietilamina (Et3N) em CH2CI2. O alongamento de peptídeo é realizado usando ativação de N, Ndiciclohexilcarbodimida/l-hidroxibenzotriazol (DCC/HOBt) em CH2C12/dimetilformamida (DMF). A cadeia peptídeo de crescimento é terminada após cada etapa de alongamento com 20% de AC2O em CH2CI2. A resina de peptídeo é lavada após cada alongamento, terminação e a etapa de desproteção com isopropanol (iPrOH) e metanol (MeOH). As lavagens são repetidas uma vez. Os peptídeos acerila N-terminal são preparados por acetilação do grupo amino terminal com 20% de Ac2O em CH2Q2 após a desproteção e neutralização como descrito. Os produtos de ligação de resina são clivados como rotina por um procedimento inferior-superior usando o fluoreto de hidrogênio (HF) contendo sulfeto de dimetila (DMS) e p-cresol como removedores.
Os peptídeos brutos são purificados através da cromatografia de líquido de pressão elevada preparatória (HPLC) usando um Vydac Cl8, 15-20 pm de poro largo, 5,08 cm x 30,48 cm, coluna de silica de fase reversa usando uma eluição gradiente com 0,1% TFA em água modificada com acetonitrila. A eluição é monitorada a 220 nanômetros (nm). Cada fração coletada é analisada para pureza através da HPLC analítica usando um
Vydac Cl8, 5 pm, 4,6 x 254 milímetros (nm), coluna de silica de fase reversa através da eluição gradiente usando 0,1% TFA em água modificada com acetonitrila, e monitorada a 215 nm. As frações que demonstram mais do que 95% de pureza são combinadas e liofilizadas. Os sais acetato dos peptídeos são preparados dos sais TFA pela dissolução do pó liofilizado em água, com uma adição de acetonitrila para ajudar na dissolução onde necessário. A solução é passada por uma resina de troca de cátions BioRex 70 protonatada. A resina é lavada com 5 volumes de leito de água, e o peptídeo de ligação de resina é eluído com 50% de ácido acético em água. O eluente é diluído com água e liofilizado.
O pó liofilizado final é analisado para pureza por HPLC de fase reversa usando um Vydac Cl 8, 5 pm, 4,6 x 254 mm de coluna de silica de fase reversa. Os dois sistemas de solvente usado são um gradiente de água ajustado ao pH 2,25 com fostato trietilamina, modificados com acetonitrila, e um gradiente de 0,1% de TF A em água, modificado com acetonitrila. A coluna eluente é monitorada a 215 nm. A identidade de cada produto é confirmada através da análise de aminoácidos e através de espectroscopia de massa de electrocópias.
O análogo de GLP-2 são formulados logo como descrito abaixo no Exemplo 2. Cada dos análogos de GLP-2 é completamente solúvel em água a temperatura ambiente, salvo indicado em contrário.
Exemplo 2 - Formulação de análogo de GLP-2
Os análogos de GLP-2 foram formulados para injeção ou em solução salina tamponada com fosfato ou como uma formulação de depósito contendo gelatina. Para as preparações análogas de GLP-2 formuladas de PBS, uma solução PBS de carga 10 X foi primeiro preparada, usando 80 g de NaCl (BDH ACS 783), 2 g KC1 (BDH ACS 645), 11,5 g Na2HOP4 (Anachemia AC-8460), e 2 g de KH2PO4 (Malinckrodt AR7100), que foi levada a um volume final de um litro com água destilada estéril. A solução de trabalho final foi obtida por uma diluição de 10:1 de solução de carga com água destila estéril e ajustada o pH 7,3-7,4 se necessário, usando volumes suficientes de 10N NaOH. A solução de trabalho foi então autoclavada durante 30 minutos. Na solução PBS de trabalho final, as concentrações eram de 137 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 4,3 mM Na2HPO4, 7H2O, e 1,4 m KH2PO4.
O análogo de GLP-2, como peptídeo em pó, é adicionado a uma solução PBS de trabalho como requerido para gerar formulações tendo as concentrações de peptídeo desejado. Por exemplo, para gerar uma solução PBS de análogo de GLP-2 a 130 mg/1, 5,2 mg de análogo de GLP-2 é dissolvido em 40 ml de PBS para dar uma concentração GLP-2 de 130 pg/ml, 0,5 ml é injetada duas vezes diariamente.
Para gerar as formulações de análogo de GLP-2 baseado em gelatina, uma solução de gelatina foi primeiro preparada dissolvendo 12 gramas de gelatina (Sigma, G-8150 Lote &54HO7241 Tipo A de pele de suínos [9000-70-8] -300 florescência) em 10 ml de água destilada. A solução de gelatina foi então autoclavada, aquecida a 37°C, e o peptídeo GLP-2 previamente dissolvida em solução salina tamponada com fosfato como descrito acima foi então adicionada para obter específicas concentrações de peptídeo desejadas. Por exemplo, para gerar uma solução PBS baseada de gelatina do GLP-2 a uma concentração de 130 mg/1, 10 ml de uma solução PBS preparada com 5,2 mg de GLP-2 foi diluída com 30 ml da solução de gelatina de trabalho de 20% como primeiro descrito acima. A solução foi misturada por pipeta suave, para dar uma solução final de 130 mg/1 GLP-2 em PBS/15% de gelatina.
Exemplo 3 - Teste para resistência a dipeptidil peptidase IV
Os seguintes peptídeos foram testados para resistência a dipeptidil peptidase IV (DPP-IV): um peptídeo de controle, rGLP-2; o análogo [D-Ala2]rGLP-2; e o análogo [Gly2]rGLP-2. Para realizar o teste, 2,5 microlitors (μΐ) de uma solução de DPP-IV humano placentário (Calbiochem, La Jolla, CA, cat. # 317624) contendo 0,125 miliunidades (um) de enzima em 50 % de glicerol, 10 mM Tris, pH 7,8, EDTA e 0,02% NaN3 foi adicionado a 50 μΐ de uma solução do teste peptídeo preparado a uma concentração de 0,2 mg/ml em PBS a pH 7,4. A mistura foi incubada a 37°C em um banho de água de circulação durante 24 horas. A incubação foi resfriada bruscamente através de uma adição de 50 μΐ de uma solução de diprotina A preparada a uma concentração de 4 mg/ml em PBS. Cada peptídeo foi testado em duplicata.
Cada amostra foi analisada por HPLC (RP) de fase reversa como a seguir: 90 μΐ da mistura de incubação resfriada bruscamente foi injetada sobre um Rainin Dynamax 300 Â, Cl8, 5 micron, coluna de 4,6 x 250 milímetros. As amostras foram eluídas com 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) em água modificada com 0,1% de acetonitrila usando um gradiente linear e uma taxa de fluxo de 1 ml por minuto. Os componentes de amostra foram detectados a 214 nanômetros (nm). A extensão da clivagem foi medida através de uma integração relativa do pico correspondente a um produto de clivagem comparado ao do peptídeo de origem não digerida restante. O produto de clivagem do peptídeo de controle, rGLP-2 (1-33), que deve ser rGLP-2 (3-33), foi confirmado com sendo um resultado de clivagem entre os resíduos Ala2 e Asp3 através da comparação do tempo de retenção deste componente ao de um padrão de peptídeo sintético, rGLP-2 (3-33), e através de uma coleção do produto do HPLC e análise através de uma espectrometria de massa.
Após 24 horas de incubação, 22% do peptídeo de controle, rGLP-2, foram clivados através de DPP IV. Nenhum produto de clivagem foi detectado para os peptídeos [D-Ala2] rGLP-2 e [Gly2] rGLP-2 após 24 horas. Exemplo 4 - Avaliação do análogo de GLP-2
Os recipientes eram camundongos CD1 obtidos de Charles River Laboratory (Ontário, Canadá). Os camundongos CD1 eram de sexo feminino de envelhecimento casado em momento da injeção (n=3-4 por grupo), 6 semanas de idade, salvo indicado em contrário. Os animais foram deixados um mínimo de 24 horas para aclimatizar nas instalações de laboratório antes da iniciação de cada experiência. Os animais foram identificados através de um furo na orelha. Os camundongos tiveram dieta limitada ou a atividade durante as experiências. O ciclo claro/escuro era de 12 horas, entre 18 horas e 6 horas. Os controles eram de animais de idade e sexo ajustados (n=3-4). Os camundongos foram injetados subcutaneamente, duas vezes por dia (b.l.d.), com 2,5 pg de peptídeo em um volume total de 0,5 cm3 de PBS e foram monitorados diariamente para facilidade de laboratório. Os animais foram sacrificados 10 ou 14 dias após a injeção, e foram presos pelo menos, 20 horas antes do sacrifício.
Os camundongos foram anestesiados com CO2 e exsanguinados por perfuração cardíaca. O sangue foi coletado em 75 μΐ de TED (Trasysol; EDTA (5000 KIU/ml: 1,2 mg/ml; Diprotina-A), e o sangue foi centrifugado a 14 k x g durante 5 minutos e o plasma foi armazenado a 70 antes da análise. O intestino delgado foi removido da cavidade peritoneal, do piloro ao ceco, limpados, pesados e medidos. Para fim comparativo, as seções de cada animal foram obtidas da posição anatômica idêntica. Fragmentos cada medindo 1,5-2,0 cm em comprimento foram obtidos 8±2 cm, 18±2 cm, 32±2 cm de piloro para histomorfometria representando o jejuno proximal, jejuno distai e íleo distai. Cada fragmento de intestino delgado foi aberto longitudinalmente em sua borda antimesentérica em um bloco de tecido e então colocado em 10% de formalina (vol./vol.) durante a noite, então transferido para 70% ETOH.
A mudança percentual em peso do intestino delgado foi calculada por divisão de mudança média em peso do intestino de camundongo tratado com análogo, com relação aos camundongos tratados com veículo apenas, por meio do peso do intestino dos camundongos tratados com só veículo, e multiplicando esta cifra por 100.
Os resultados de taxa de atividade intestinotrófica são mostrados na Tabela 1:
Tabela 1
# |
Análogo de GLP-2 |
% aumento em peso do intestino delgado |
1 |
rGLP-2 |
45 |
2 |
[Tyr1] rGLP-2 |
37 |
3 |
[D-Ala2] rGLP-2 |
86 |
4 |
[Gly2] rGLP-2 |
70 |
5 |
[Vai2] rGLP-2 |
65 |
6 |
[Gly2] hGLP-2 |
59 |
7 |
[Gly2 Ala20] hGLP-2 |
46 |
8 |
[Gly2 Ala10] hGLP-2 |
33 |
9 |
[Ala1 Gly2] hGLP-2 |
23 |
10 |
[Gly2 Ala3] hGLP-2 |
18 |
11 |
[Gly2 Ala4] hGLP-2 |
36 |
12 |
[Glu3] rGLP-2 |
33 |
13 |
[Ala4] rGLP-2 |
30 |
14 |
[Tyr9 Ser10 Lys^Tyr^fdesTle13) hGLP-2 |
33 |
15 |
[Leu10] rGLP-2 |
26 |
16 |
[NLeu10] rGLP-2 |
52 |
17 |
[Met SO2 10] rGLP-2 |
8 |
18 |
[Lys10] rGLP-2 |
62 |
19 |
[Va23] Gin24 hGLP-2 |
36 |
20 |
amidado C-term. |
23 |
21 |
[Gly2 Ala24] hGLP-2 |
67 |
22 |
[Gly2 Ala24] hGLP-2 |
33 |
23 |
[Gly2 Ala11] hGLP-2 |
42 |
24 |
[Gly2 Ala21] hGLP-2 |
35 |
25 |
[Gly2 Ala9] hGLP-2 |
31 |
26 |
[Gly2 Ala16] hGLP-2 |
36 |
27 |
[Gly2 Ala17] hGLP-2 |
36 |
28 |
[Gly2 Ala28] hGLP-2 |
31 |
29 |
[Gly2 Ala5] hGLP-2 |
38 |
30 |
[Gly2 Ala31] hGLP-2 |
28 |
31 |
[Gly2 Ala27] hGLP-2 |
22 |
32 |
[Gly2 Ala12] hGLP-2 |
18 |
33 |
[Gly2 Ala13] hGLP-2 |
18 |
34 |
[Gly2 Ala7] hGLP-2 |
22 |
35 |
[Gly2 Ala6] hGLP-2 |
18 |
Pode ser visto prontamente da tabela acima que os análogos de moléculas GLP-2 de mamíferos podem ter aumentado a atividade intestinotrófica. Além disso, é claro que, dependendo do modo de substituição, vários níveis de atividade intestinotrófica são manifestados. Por exemplo, [Gly2] rGLP-2 tem uma atividade intestinotrófica grandemente aumentada comparada com a molécula de ocorrência natural; [Gly2] hGLP-2 tem uma atividade intestinotrófica substancialmente aumentada comparada com rGLP-2 e [Leu10] rGLP-2 tem menos do que um aumento de 50% em atividade intestinotrófica.
As seguintes experiências foram conduzidas para confirmar que o aumento no peso do intestino visto em animais experimentais tratados com análogos resistentes a DPP-IV de GLP-2, comparado com animais tratados com GLP-2 tipo selvagem, era atribuível em parte à natureza resistente a DPP-IV das moléculas. Esta experiência tomou vantagem da disponibilidade de uma cepa de rato deficiente de DPP-IV, ratos Fisher 334 DPP-IV. O efeito das injeções rGLP-2 no peso do intestino delgado nos ratos de deficiência DPP-IV Fisher foi comparado com o em ratos Sprague-Dawley normais.
Nas seguintes experiências os ratos Sprague-Dawley foram injetados subcutaneamente. duas vezes diariamente com rGLP-2 na formulação de gelatina. Os ratos Fisher foram injetados subcutaneamente. duas vezes diariamente com peptídeos GLP-2 (ambos análogos rGLP-2, e rGLP-2) emPBS.
Os ratos Sprague-Dawley normais tratados com rGLP-2, 2,5 pg b.i.d. ou 25 pg b.i.d., não mostraram nenhuma mudança em porcentagem no peso do intestino delgado comparado a animais de controle que só receberam veículo. Entretanto, ratos Fisher 334 DPP-IV (animais deficientes em DPP-IV) demonstraram aproximadamente um aumento de 40-50% em % de mudança em peso do intestino delgado quando tratados com 20 pg b.i.d..
rGLP-2 comparado com animais tratados com veículo apenas. Além disso, animais deficientes em DPP-IV tratados com 20 pg [Gly2] rGLP-2 mostraram um aumento de 50-60% em mudança % em peso do intestino delgado comparado com animais que receberam vetor apenas. Além disso, ratos tipo selvagem Fisher 344 mostraram 75-85% aumento em peso de intestino delgado, sobre animais de controle que receberam veículo apenas, quando tratados com 20 pg b.i.d. de [Gly2]rGLP-2.
Os resultados acima fortemente indicam que GLP-2 é inativado in vivo em ratos normais por divagem de dois resíduos N-terminais por uma enzima semelhante a DPP-IV. Além disso, estes resultados demonstram que um análogo de GLP-2 modificado de modo a ser resistente a divagem por DPP-IV provocou um aumento substancial no peso do intestino em ratos normais, provavelmente como um resultado de meia-vida GPL-2 aumentado in vivo.
Como o sítio de divagem DPP-IV é conservado em todas as formas de ocorrência natural conhecidas de GLP-2, parece provável que em mamíferos, a divagem DPP-IV é importante, e provavelmente o mecanismo primário pelo que GLP-2 é inativo in vivo. Como importante, os análogos de GLP-2 resistentes a divagem de DPP-IV tem melhorada atividade intestinotrófica em comparação com a forma nativa.
Exemplo 5
As experiências avaliando a atividade indutora de intestino pequeno de vários análogos foram repetidas como descrito acima para exemplo 4. Nestas experiências, a atividade indutora de intestino delgado de cada análogo em camundongos foi calculada com relação à de ratos nativos GLP-2(1-33) (expresso como 100% de atividade). A resistência de análogos a divagem de DPP-IV foi realizada como descrito acima no exemplo 3. Os resultados são tabulados abaixo na tabela 2.
TABELA 2
Identificação |
Descrição de sequencia ALE 0109 |
% atividade Rel.IO rGLP-? |
% clivado por DPP-IV |
raGLP-2()-33) |
Sequencia de rato nativa |
100% |
|
niGLF-2M-33) |
N-3,3 res.N-termlnal removido |
6% |
3Õ /o |
Ac-TarGLP-2(]-33) |
N-Acetil |
44% |
|
peixe-sapo glF-1 |
GLP-1 de peixe-sapo nativo |
7% |
0% |
[Arg-)JratGLP-2(-l-33) |
Arg adicionado a N-término |
11% |
|
ratGLP-2(l-30) |
C-3,3 res.C-terminal removido |
23% |
0% |
ratGLP-2(I-25) |
C-8,8 res.C-terminal removido |
8% |
|
taiGLP-2(l-33)amida |
Amida C -terminal |
56% |
|
(Arg-2, Arg-1 ]raiGLP-2(2-33) |
Arg-Arg Adicionado a N-término |
43% |
0% |
[DAla2)raiGLP-2(l-33) [Gly2)ratGl_P-2(l-33) [Tyrl)rwGLP-2(l-33) (AI»4]fatGLP-2(l-33) (Glu3jrarGLP-2£l-33) (Leu 1O]™GLP-2( 1-33) [Nlri0jniGLP-2(l-33) Íi.ys20JwtGLP-2(l-33) [S«2,Gln3]hGLP-2(l-33) [V«I23,G!n24]hGLP-2(l-33) (Val2]GLP-2(l-35) Dúgu GLP-2 nyrf.so-iíuys] i,iyri2, dcs-llcI3JhGLP-2£l-33) (Gly2^l4«]hGLP-2(l-33) (Gly2Zlall]hGLP-2(l-33) (G1y2Als2ipiGLP-2(]-33) (Gly2Ali24]hGL?-2(]-33) [Gly2A«25]hGU-2(í-33) [GlyMWiGLP-2(l-33) [Gly2,Ali27]hGLP-2£l-33) [G|y2,Als9]hGLP-2U-33) (Gly2Alal0]hGLP-2(l-33) (GlyMU12JhGLP-2(l-33) [GIy2AJi!3JhGLP-2£l-33) fGlyXAlal4]hGLP-2£I-33) (GlyLAW 6]hGLP-2(l -33) (Gly2Ahl7JhGLF-2£t-33) [Gly2^h20}hGLP-2íl-33) [Gly2jUs23]hGLP-2(l-33) (GlyXAU2SJhGLP-2£l-33) (Gly2^1a30]hGLP-2C)-33) (GIy2AWl]LGLP-2(l-33) [Gly2]hGLP-2<)-33) (AUl,GIy2]hGLP-2(l-33) (G|y2,Ab33hGLP-2()-33) [GlyZAU4]hGLP-2(l-33) [GJy2AJa5}hGLP-2(]-33) (G)y2>W]hGLP-2(]-33) IGly2^W)hGLF-2(i-33) [ProlJhGLP^d-SS)
All2->D-AU2 |
2)0% |
0% |
Ala2-X31y2 |
19é% . |
0% |
Hisl->Tyrl |
81% |
100¾ |
Gly4->Alrf |
59% |
72¼ |
Asp3->Glu3 |
65% |
50% |
MctlO->LculO |
5)¾ |
MctlO->NklO |
)OO% |
|
|
120% |
|
Ala2->S«2, Asp3->G|u3 |
11% |
0% |
Ile23->Va!23, Asu24-*Gta24 |
82% |
|
A)a2->VaI2, TPA |
143% |
0% |
sequencia de “degu- nativa |
70% |
Glu9->Tyr9. M«lO->ScrlO, |
94% |
|
AsnlI->LysJ), 1hrJ2->TyrJ2, e de seleção de Ucl3
Ala2->C-iy2, Asp8->Ala8 |
120% |
|
AltZ-XjlyZ, Asq ] J->Alnl l |
150% |
|
Ala2-X31y2, Asp2H>Ala2l |
125% |
|
A|a2->Gly2, Asn24->Ala24 |
139% |
0% |
A)a2-Xàly2, Trp25->Ala25 |
)3% |
. Ala2->Giy2, Lai2^>Ala2fi |
2S% |
|
Al*2->G)y2, IIc27~>A1í27 |
82% |
|
A)a2->Gly2, G)uS->Ala9 |
112% |
|
Aia2->GIy2, MctJ t>->AJal 0 |
82% |
|
Ala2->Gly2, ThrI2-^AU12 |
67% |
|
AÍa2->Gly2, Ilcl3->Ahl3 |
67% |
|
Ali2-»Gly2, Lrul4->AlaI4 |
30% |
|
Ala2->Gly2, Asnlô^Ahlfi |
130% |
|
AIa2->Gly2, Lwl7->Alal7 |
J30% |
|
Ala2->Giy2, ATg20->A)a20 |
105% |
|
Aia2->GlyZ Ilc23->AIa23 |
24% |
|
Ala2-X3!y2, Gfo28-^Aia23 |
130% |
|
Ala2-X3|y2, Lys30->Aia30 |
24% |
|
Ala2->G)y2, Ilc31->Ala3! |
ioc% |
|
Ali2->Gly2 |
300% |
0% |
Hisl-^Alal. A!a2*>GIy2 |
53% |
w zo
0% |
Ala2->G>y2, Aip3->Ala3 |
44% |
0¾ |
Aia2->Gly2, Gly4->Ala4 |
100% |
0¼ |
Ala2-Xjly2, Sa5->Ala5 |
136% |
0% |
Α1λ2-5Ό^2, ?ircâ->Ala6 |
67ϊό |
Ala2->Gly2, Sff7->Ala7 |
82% |
|
Hisl->Prul |
12% |
0% |
(Mex(O)]0)racGI_P-2(l-33) |
Sulfóxido Met 10 |
IS*/. |
[Gln2D]hGJ.F-2Cl-33) |
Arg20->Gln20 |
80% |
|
[Aspl]hGLP-2(l-33) |
His)->ASpl |
60% |
0% |
[tBuGly2]hGLF-2 |
Ala2->T-butyl-Gly2 |
123% |
0% |
[TyrM)hGLP-2(l-34) |
Adição de Tyr C-terminal |
135% |
|
|Asp2JhGLP-2(l-33) |
Ala2->Asp2 |
83% |
0% |
(G!u2]hGl_p-2(l-33) |
Ala2->Glu2 |
93% |
0% |
(Fjje2]hGLP-2(1-33) |
Ala2->Pbe2 |
50% |
0% |
[His2]hGLI>-2(l-33) |
Ala2->His2 |
074 |
044 |
(I|t2JhGLP-2(l-33} |
Ala2->Ik2 |
90% |
0% |
[X.ys2]hGIP-2(l-33) |
Ala2->Lys2 |
90% |
0% |
[Md2]bGLP-2(l-33) |
Ala2->MeG |
170% |
0% |
(A5B2]hGLP-2(1-33) |
Ala2->Asa2 |
á7% |
0% |
fPro2]hGLP-2(l-33) |
Ala2->Pro2 |
50% |
16% |
[Gln2]hGLP-2(l-33) |
Ah2->Gh2 |
100% |
0% |
(Ses2]hGLP-2(l-33) |
Ala2->Scr2 |
157% |
0% |
piu2p>Gl.P-2(l-33) |
Ala2->Thr2 |
117% |
0% |
fV»r2]hGU-2(l-33) |
AJ«2->VaI2 |
180% |
13% |
[Tyr2]hGLP-2U-33) |
Ala2->Tyr2 |
57% |
0% |
[D-Ata2]hGLP-2(l-33J |
Ala2->D-Ala2 |
130% |
0% |
JiGI_F-2(l-33) |
sequencia humana nativa |
100% |
60% |
[dcsNH2TyrI ]N3U-2( 1-33) |
His l->desamin ο-Tyrl |
1.25% |
15% |
nhrf}hGLP-2(l-33) |
Sa5->Tixr5 |
73% |
|
[Scrl6^17^rgU] hGLP-2(l-33) |
Asnl6->Scrl6, Leul7->AxgI7, Alal*->Ai5)8 |
59% |
|
ÍAsu33]hGLP-2(l-33) |
As^33->Asn33 |
91% |
|
[Pra2]hGLP-2(l-33) |
AIa2 > L- penicilamina2 |
58% |
20% |
{bAla2]liGLP-Xl-33) |
Ala2->ii«a-AU2 |
118% |
0% |
(aAbu2]hGLP-2()'33) |
Ala2> ácido alfa- aminobutírico2 34% |
49% |
[Nva!2JhGLP-2(!-33) |
A!z2->NwI2 (norvalina) |
111% |
Cfti |
p%G|y2]hGLP-2(l-33) |
Ala2 >L fenil -Gly2 |
37% |
C% |
(Agxn34]hGLP-2(I-34) |
adição de agmamtina C-terminal 97% (Agm is dcs-COOH Arg) |
|
ÍArg3O]hGLP-2(l-33) |
LyÜG^-AlgSO |
103% |
59% |
[Pro3]hGI_P-2(l-33) - |
A5p3->fTa3 |
140% |
0% |
(AlaS, Ala7]hGLP-2(l-33) |
Scr5->A)a5. Ser7->Ah7 |
108% |
77% |
[Tyrl, Gly2]hGLP-2(l-33) |
Hisl-^Tyrl. AU2->G!y2 |
241% |
0% |
[Glu33JhGLP-2(l-33) |
Asp33->Glu33 |
121% |
55% |
(?tsc25]hGLF-2Cl-33) |
Tip25->Phc25 |
114% |
54% |
[Tyr25|hGLP-2(l-33) |
Trp2S->iyt25 |
64% |
48% |
[G|y2, Tyi34)bGGP-2(l-34) |
Ala2>Gly + Tyr C-terminal |
297% |
0% |
[Aib2]hGLP-2(l-33) |
Ala2 >acido aminoisobutirico 2 |
202% |
0% |
[Gly2, Aig34]hGU>-2(l-34) |
Ala2->G]y2 - Arg C-terminal |
-250% |
0% |
EQUIVALENTES
O acima relatório por escrito é suficiente para permitir ao versado na arte praticar a invenção. De fato, várias modificações dos meios acima mencionados para realizar a invenção que são óbvias para os versados 5 no campo de biologia molecular, química de proteínas, campos da medicina ou relacionados se destinam a estar no escopo das seguintes reivindicações.
Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas de que trata a Resolução INPI 228 de 11/11/2009:
Código de Controle
Campo 1 1I11MIÍIII 629F6A6C11DD99B6
Campo 2
1ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙ1ΙΙΙΙΙίΙΙΙΙΙΙΙΠΙΙίίΙ»ίΙΙΙΙΙ
Outras Informações:
- Nome do Arquivo: 062762e011 .txt
- Data de Geração do Código: 22-07-2011
- Hora de Geração do Código: 08:16:37
- Código de Controle:
- Campo 1: 629F6A6C11DD99B6
- Campo 2: 9BD51077D5EDA476
Gerado pelo Sistema de Listagem de Sequências Biológicas (SisBioList)