BRPI1100700A2

BRPI1100700A2 - Composição sinergistica para supressão/inibição de marcadores pró-inflamatórios, processo para a preparação da mesma, método para supressão/inibição de marcadores pró-inflamatórios, composição para supressão/inibição de pge2, método para supressão/inibição de pge2, e, suplemento alimentar

Info

Publication number: BRPI1100700A2
Application number: BRPI1100700-1A
Authority: BR
Inventors: Muhammed Majeed; Anjali Majeed; Sarang Bani; Beena Bhat
Original assignee: Muhammed Majeed
Priority date: 2010-03-02
Filing date: 2011-02-28
Publication date: 2013-12-17
Also published as: KR20110099618A; AU2011200854A1; TW201130498A; US20110218172A1; EA023717B1; JP2011178773A; AU2011200854B2; TWI434696B; CN102218075A; EA201001254A1; MX2011002161A

Abstract

COMPOSIÇÃO SINERGISTICA PARA SUPRESSÃO/INIBIÇÃO DE MARCADORES PRÓ-INFLAMATÓRIOS, PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DA MESMA, MÉTODO PARA SUPRESSÃO/INIBIÇÃO DE MARCADORES PRÓ-INFLAMATÓRIOS, COMPOSIÇÃO PARA SUPRESSÃO/INIBIÇÃO DE PGE2, MÉTODO PARA SUPRESSÃO/INIBIÇÃO DE PGE2, E, SUPLEMENTO ALIMENTAR A presente invenção proporciona uma composição para supressão de marcadores pró-inflamatórios. A composição compreende fração de ácido boswellico e fração de polissacarídeos obtidos de espécies de Boswellia em concentrações específicas, apresentando melhorias em sua atividade em comparação com fração de ácido boswellico e fração de polissacarídeos sozinhos. A invenção compreende ainda o uso da fração de polissacarídeos individualmente ou em combinação com a fração de ácido boswellico para a inibição da PGE2.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção

Composição Sinergistica para Supressão/Inibição de Marcadores Pró-Inflamatórios, Processo para a Preparação da Mesma, Método para Supressão/Inibição de Marcadores Pró-

inflamatórios, composição para supressão/lnibição de PGE2,

Método para supressão/inibição de PGE2, e, Suplemento

Alimentar

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a uma composição compreendendo

fração de ácido boswellico e fração de polissacarídeos obtidos de espécies de Boswellia. A composição é sinérgica em mostrar bioatividade melhorada, especialmente suprimindo marcadores pró-inflamatórios.

A invenção também diz respeito ao uso da fração de polissacarídeos individual ou em combinação com a fração de ácido boswellico para a inibição da PGE2

Antecedentes da Invenção

A sobrevivência é impossível sem uma regulação precisa do sistema imunológico. A produção de citocinas pró-inflamatórias é um processo fisiológico fundamental para orquestrar respostas imunes e metabólicas durante o desenvolvimento, a regeneração dos tecidos, cicatrização, trauma ou infecção e para proteger nosso corpo contra a hemorragia, isquemia, câncer e sepse. A produção controlada de citocinas pró-inflamatórias, como as interleucinas (ILs), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) provocam respostas inflamatórias benéficas que promovem a coagulação local para limitar a infecção e lesão tecidual (Ulloa e Tracey, 2005). No entanto, a produção irrestrita dessas citocinas é mais perigosa do que o ferimento inicial, sendo essa uma das principais causas de morbidade e mortalidade humana. Um dos exemplos mais dramáticos desse processo é "sepse severa", a principal causa de morte em unidades de terapia intensiva e uma das principais causas de morte nas sociedades desenvolvidas (Martin et al., 2003). A sepse severa é se caracteriza pela produção avassaladora de citocinas pró-inflamatórias que causam uma inflamação sistêmica, disfunção cardiovascular e falência múltipla de órgãos (Van der Poll e Lowry1 1995; Hotchkiss e Karl, 2003; Rice e Bernard, 2005). Este efeito é ilustrado por estudos indicando que a neutralização de citocinas pró-inflamatórias (anticorpos monoclonais anti-TNF e antagonistas de receptor IL-1) provou ser bem sucedida em condições inflamatórias, como artrite reumatóide, doença de Crohn1 espondilite anquilosante e psoríase (Feldmann1 2002; Ulloa e Tracey, 2005; Rutgeerts et al., 2006; Ulloa e Messmer1 2006).

Além de citoquinas, outros mediadores como a histamina, prostaglandinas, Ieucotrienos1 bradicinina, etc também desempenham um papel importante na inflamação. Assim, estes servem como marcadores e são úteis no diagnóstico de condições de doença, especialmente nas condições em que estão presentes em níveis elevados. Portanto, é essencial regular os marcadores para o controle preciso do sistema imunológico.

A resina da goma de Boswellia serrata (N.O. Burseraceae) conhecida como "Dhup", frankincenso indiano ou olíbano indiano tem uma longa história de uso em cerimônias religiosas e nas aplicações de perfumaria. As aplicações em saúde do frankincenso indiano, muito conhecido na tradição Ayurvédica, que entrou em foco no mundo ocidental nos últimos 30 anos, resultou na expansão das aplicações de extratos padronizados dos exsudatos de resina da goma. Tais extratos são usados como ingredientes de suplementos alimentares e cosméticos para apoiar um envelhecimento saudável. A aplicação mais popular em suplementos alimentares é em produtos de apoio a saúde das articulações para suportar as funções e mobilidade normais das articulações.

Cada vez mais provas científicas recentes suportam os efeitos saudáveis de Boswellia serrata. Normalmente, os exsudatos de óleo-resina da goma de Boswellia serrata são relatados por conterem óleos essenciais sesquiterpenóides (8-12% p/p), polissacarídeos (45-60% p/p), e terpenóides superiores (25-35% p/p). Os constituintes de biomarcadores no extrato da resina da goma são um grupo de compostos triterpenos pentacíclicos conhecidos como ácidos boswelicos.

Os ácidos boswellicos foram capazes de inibir a enzima 5-lipoxigenase, a enzima que catalisa a formação de Ieucotrienos pró-inflamatórios do ácido araquidônico. Além deste mecanismo, os ácidos boswellico também diminuem a atividade da enzima, Elastase de Leucócitos Humanos (HLE). Esta ação dupla é exclusiva dos ácidos boswelicos (Safayhi, H et ai, 1997). Como a formação de Ieucotrienos e liberação de HLE são aumentadas simultaneamente pela estimulação de neutrófilos em uma série de inflamações e por doenças humanas com base em hipersensibilidade, se acredita que o bloqueio de duas enzimas pró-inflamatória por ácidos boswellico, e seus efeitos benéficos sobre proteínas do complemento e mastócitos estabilizando a atividade poderia ser a justificativa para os efeitos saudáveis do extrato de Boswellia, documentado em diversos estudos pré-clínicos e clínicos. Os extratos da resina da goma de Boswellia serrata são geralmente resinosos na natureza, e os ácidos boswelicos biomarcadores (compostos lipofílicos) são insolúveis em água.

O documento US 2003/0186932 descreve uma fração bioativa solúvel em água isolada do exsudato da resina da goma de Boswellia serrata. Ele revela ainda que uma combinação da fração e ácidos boswellicos em iguais proporções (1:1) mostrou efeito aditivo e não um efeito sinérgico para a atividade anti-artrítica.

O documento US 7582314 descreve um método de tratamento de um indivíduo afetado por psoríase pela administração de uma composição compreendendo ácidos boswelicos e selênio elementar.

O documento US 2008/0275117 descreve um método de tratamento da artrite pelo uso de composição compreendendo ácidos boswelicos e/ou seus acetatos em quantidade superior a 65%. Também diz que a composição ainda compreende polissacarídeos e acetato de n-octila, incensol, incensol acetato, Iinalol1 borneol, canfeno, elemeno, cariofileno, oxido incensol, acetato de óxido incensol ou suas combinações.

A presente invenção engloba uma composição que compreende fração de ácido boswellico e fração de polissacarídeos obtidos de espécies de Boswellia mostrando melhora na supressão/inibição de marcadores pró- inflamatórios.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a uma composição compreendendo fração de ácido boswellico e fração de polissacarídeos obtidos de espécies de Boswellia para suprimir marcadores pró-inflamatórios, como TNF-α, IL-1 β, óxido nítrico, IFN-γ e LTB4. A fração de ácido boswellico está presente em uma concentração de cerca de 60% e a fração de polissacarídeo em uma concentração de cerca de 40%.

A composição compreendendo fração de ácidos boswellicos e a fração de polissacarídeos mostra melhora em sua atividade em relação às frações individuais.

A invenção ainda diz respeito ao uso da fração de polissacarídeo sozinha ou em combinação com a fração de ácido boswellico para a inibição da PGE2.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 mostra o efeito de múltiplas doses da fração de ácido boswellico obtido de espécies de Boswellia em TNF-α e 1L-1 β extracelular in vivo dosado de soro de camundongos BALB/c tratados. Os valores estão expressos como média ± S.E.; Rolipram: padrão (30 mg/Kg); Valor de ρ * <0,01; ** <0,001.

A figura 2 mostra o efeito de múltiplas doses da fração de polissacarídeo obtido de espécies de Boswellia em TNF-α e IL-1 β extracelular in vivo dosado de soro de camundongos BALB/c tratados. Os valores estão expressos como média ± S.E.; Rolipram: padrão (30 mg/Kg); Valorde ρ * <0,01; ** <0,001. A figura 3 mostra o efeito de múltiplas doses da composição em TNF-α e IL-1 β extracelular in vivo dosado de soro de camundongos BALB/c tratados. Os valores estão expressos como média ± S.E.; Rolipram: padrão (30 mg/Kg); Valor de ρ * <0,01;** <0,001.

A figura 4 mostra o efeito de múltiplas doses da fração de ácido boswellico obtido de espécies de Boswellia em óxido nítrico extracelular in vivo dosado de soro de camundongos BALB/c tratados. Os valores estão expressos como média ± S.E.; Rolipram: padrão (30 mg/Kg); Valor de ρ * <0,01; ** <0,001.

A figura 5 mostra o efeito de múltiplas doses da fração de polissacarídeo obtido de espécies de Boswellia em óxido nítrico extracelular in vivo dosado de soro de camundongos BALB/c tratados. Os valores estão expressos como média ± S.E.; Rolipram: padrão (30 mg/Kg); Valorde ρ * <0,01; ** <0,001.

A figura 6 mostra o efeito de múltiplas doses da fração da composição em óxido nítrico extracelular in vivo dosado de soro de camundongos BALB/c tratados. Os valores estão expressos como média ± S.E.; Rolipram: padrão (30 mg/Kg); Valorde ρ * <0,01; ** <0,001.

A figura 7 mostra um comparativo da atividade anti-artrítica (profilaxia) da fração de ácido boswellico, fração de polissacarídeo e da composição em artrite inflamatória induzida por Mycobacterium tuberculli em ratos (injetado na pata). Valor de ρ * <0,01; ** <0,001; AAS: Ácido acetilsalicílico (padrão)-100 mg/Kg.

A figura 8 mostra a expressão de TNF-alfa no sobrenadante do homogeneizado do tecido de pata artrítica em artrite inflamatória induzida por Mycobacterium tuberculli em ratos tratados com a fração de ácido boswellico, fração de polissacarídeo e da composição em doses graduadas. Valor de ρ * <0,01; ** <0,001; AAS: Ácido acetilsalicílico (padrão)-100 mg/Kg.

A figura 9 mostra a expressão de PGE2 no sobrenadante do homogenato do tecido de pata artrítica em artrite inflamatória induzida por Mycobacterium tuberculli em ratos tratados com a fração de ácido boswellico, fração de polissacarídeo e da composição em doses graduadas. Valor de ρ * <0,01; ** <0,001; AAS: Ácido acetilsalicílico (padrão)-100 mg/Kg.

A figura 10 mostra a expressão de LTB4 no sobrenadante do homogenato do tecido de pata artrítica em artrite inflamatória induzida por Mycobacterium tuberculli em ratos tratados com a fração de ácido boswellico, fração de polissacarídeo e da composição em doses graduadas. Valor de ρ * <0,01; ** <0,001; AAS: Ácido acetilsalicílico (padrão)-100 mg/Kg.

A figura 11 mostra o efeito da fração de ácido boswellico, fração de polissacarídeo e da composição na expressão de IFN-γ intracelulares por citometria de fluxo em esplenócitos de animais com artrite inflamatória induzida por Mycobacterium tuberculli. AAS: Ácido acetilsalicílico (padrão)-100 mg/Kg.

A figura 12 mostra a atividade anti-artrítica (terapêutica) da fração de ácido boswellico, fração de polissacarídeo e da composição (dose efetiva) em artrite inflamatória induzida por Mycobacterium tuberculli em ratos (injetado na pata). Valor de ρ * <0,01; ** <0,001; AAS: Ácido acetilsalicílico (padrão)-100 mg/Kg.

A figura 13 mostra a comparação da solubilidade em água da fração de ácido boswellico e da composição da presente invenção. % de solubilidade em água (1g em 100 mL).

A figura 14 mostra um fluxograma apresentando as etapas de preparação da composição da presente invenção.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção se refere a uma composição sinergistica compreendendo fração de ácido boswellico a uma concentração de cerca de 60% e fração de polissacarídeo em uma concentração de cerca de 40%, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Em outra concretização da presente invenção, a fração de ácido boswellico e a fração de polissacarídeo são obtidas a partir de espécies de Boswellia. Em ainda outra concretização da presente invenção, a fração de ácido boswellico compreende ácido β-boswellico, ácido acetil-P-boswellico, ácido 11- ceto-P-boswellico e ácido acetil-11-ceto-P-boswellico.

Em mais uma concretização da presente invenção, a fração de polissacarídeo compreende galactose, arabinose, ácido D-glucurônico e 4-0- metil-glucuronoarabino-galactano.

Em ainda outra concretização da presente invenção, os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são selecionados a partir do grupo composto por antiaderentes, agentes ligantes, agentes de revestimento, agentes de desintegração, preenchedores e solventes, agentes aromatizantes, corantes, glidantes, lubrificantes, preservativos, absorventes, edulcorantes e suas combinações.

Em ainda outra concretização da presente invenção, a composição é formulada em formas de dosagem selecionadas do grupo composto por líquida, pastilhas, losangos, pó, grânulo, cápsula, comprimido, adesivo, gel, emulsão, creme, loção, dentifrício, gota, suspensão, xaropes, elixires, fitocêuticos e nutracêuticos.

A presente invenção também se refere a um processo para preparar a composição sinergistica compreendendo fração de ácido boswellico em uma concentração de cerca de 60% e fração de polissacarídeo em uma concentração de cerca de 40%, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, o dito processo compreendendo as etapas de:

(i) obter fração de ácido boswellico e fração de polissacarídeo de espécies de Boswellia·,

(ii) combinar a fração de ácido boswellico em uma concentração de cerca de 60% com a fração de polissacarídeos em uma concentração de cerca de 40%, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis para obter a composição.

Em ainda outra concretização da presente invenção, a fração de ácido boswellico compreende ácido β-boswellico, ácido acetil-p-boswellico, ácido 11- ceto-P-boswellico e ácido acetil-11-ceto-p-boswellico. *

Em ainda outra concretização da presente invenção, a fração de polissacarídeo compreende galactose, arabinose, ácido D-glucurônico e 4-0- metil-glucuronoarabino-galactano.

A presente invenção se refere a um método para suprimir/inibir marcadores pró-inflamatórios, o dito método compreendendo a etapa de administrar uma composição que compreende fração de ácido boswellico em uma concentração de cerca de 60% e fração de polissacarídeo em uma concentração de cerca de 40%, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis em um sujeito que dela necessite. Em ainda outra concretização da presente invenção, a fração de ácido

boswellico e a fração de polissacarídeo são obtidas a partir de espécies de Boswellia.

Em ainda outra concretização da presente invenção, o sujeito é animal, incluindo seres humanos. Em ainda outra concretização da presente invenção, os marcadores pró-

inflamatórios são selecionados a partir de um grupo composto por TNF-a, IL-β, IFN-γ, óxido nítrico e LTB4.

A presente invenção se refere a um método para suprimir/inibir PGE2, o dito método compreendendo a etapa de administrar a composição contendo fração de polissacarídeo sozinha ou em combinação com a fração de ácido boswellico, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis em um sujeito que dela necessite.

Em ainda outra concretização da presente invenção, a fração de ácido boswellico e a fração de polissacarídeo são obtidas a partir de espécies de Boswellia.

Em ainda outra concretização da presente invenção, o sujeito é animal, incluindo seres humanos.

A presente invenção também se refere a um suplemento alimentar contendo a composição acima mencionada isoladamente ou em combinação. A invenção em tela representa uma melhoria em relação aos extratos

convencionais de Boswellia existentes proporcionando produções com versões mais solúveis em água com um potencial de apoio à saúde das articulações melhorado. A composição apresenta um exclusivo perfil de liberação para os ingredientes ativos. Além de ácidos boswelicos (os princípios ativos para os quais os extratos de Boswellia são convencionalmente padronizados), a fração de polissacarídeo da resina da goma de Boswellia serrata também tem bioatividade e é solúvel em água. A fração de polissacarídeo reforça o papel na saúde dos ácidos boswelicos no extrato, como revelado em estudo in vitro e in vivo, em níveis além de uma mera expectativa aditiva.

A composição, compreendendo fração de ácido boswellico e fração de polissacarídeo obtidas de espécies de Boswellia, mostra supressão de marcadores pró-inflamatórios. A composição mostra atividade melhorada na supressão de mediadores e citocinas pró-inflamatórias em relação aos componentes individuais da composição e, portanto, é sinergistica em natureza. A fração de polissacarídeo de espécies de Boswellia é um ativo solúvel em água e, consequentemente, aumenta a solubilidade dos ácidos boswellicos (Figura 13), reduz a toxicidade dos ácidos boswellicos em alta concentração e permite ação anti-inflamatória sustentada.

A goma de Boswellia é extraída com etanol e do extrato etanólico é tratado com ácido-base, seguido por lavagem com água para resultar a fração de ácido boswellico. O resíduo de hexano (fração oleosa) obtido no processo é descartado. O bagaço restante após a extração da goma de Boswellia com o etanol é extraído com água destilada e precipitado com álcool para obter a fração de polissacarídeo. A fração de ácido boswellico e a fração de polissacarídeo são combinadas em uma concentração de cerca de 60% e 40%, respectivamente, para chegar à composição da presente invenção (figura 14).

A fração de ácido boswellico compreende ácido β-boswellico, ácido acetil-P-boswellico, ácido 11-ceto-P-boswellico e ácido acetil-H-ceto-β- boswellico. A fração de polissacarídeo compreende galactose, arabinose, ácido D-glucurônico e 4-O-metil-glucuronoarabino-galactano.

A composição pode opcionalmente conter excipientes farmaceuticamente aceitáveis selecionados de um grupo composto por antiaderentes, agentes ligantes, agentes de revestimento, agentes de desintegração, preenchedores e solventes, agentes aromatizantes, corantes, glidantes, lubrificantes, preservativos, absorventes, edulcorantes e suas combinações.

A composição da presente invenção é formulado em diferentes formas farmacêuticas selecionados de um grupo composto por líquida, pastilhas, losangos, pó, grânulo, cápsula, comprimido, adesivo, gel, emulsão, creme, loção, dentifrício, gota, suspensão, xaropes, elixires, fitocêuticos e nutracêuticos.

A composição foi testada para seu potencial de suprimir/inibir os níveis de marcadores pró-inflamatórios como: TNF-a, IL-β, óxido nítrico, IFN-γ, PGE2 e LTB4.

O TNF-a (fator de necrose tumoral alfa) é uma citocina envolvida na inflamação sistêmica e estimula a reação de fase aguda. A regulação da produção de TNF tem sido implicada em uma variedade de doenças humanas, assim como o câncer. Ela desempenha um papel muito importante na patogênese do choque séptico induzido por LPS.

A IL-1 β é um dos mais potentes citocinas pró-inflamatórias envolvidas, tanto em respostas imunofisiológicas e no desenvolvimento de várias desordens imunológicas. A verificação dos níveis de IL-1 β é útil no monitoramento e diagnóstico de várias doenças, incluindo doenças inflamatórias, imunológicas e ósseas.

Níveis adequados de produção de óxido nítrico (NO) são importantes na proteção de um órgão como o fígado de dano isquêmico. Entretanto, níveis sustentados da produção de óxido nítrico resultam em toxicidade tecidual direta e contribuem para o colapso vascular associada ao choque séptico. A expressão crônica de óxido nítrico está associada com vários carcinomas e condições inflamatórias, incluindo a diabetes juvenil, esclerose múltipla, artrite e colite ulcerativa.

Pela supressão/diminuição das citocinas ou outros mediadores, a composição encontra uso potencial no tratamento de várias doenças/distúrbios que apresentam níveis elevados destes, tais como artrite, colite ulcerativa, síndrome de entranhas inflamatório (IBD), Asma (Doenças respiratórias), etc.

A invenção é ainda elaborada com a ajuda dos exemplos a seguir. No entanto, estes exemplos não deve ser interpretados no sentido de limitar o escopo da invenção.

Exemplo 1: Avaliação da Atividade Biológica

Estudo de Segurança em Fase Aguda:

Os estudos de toxicidade oral aguda foram realizados seguindo orientações do OCDE No. 423 [Organisation for Economic Co-operation and Development. OECD guidelines for testing of chemicals. Guideline 423, acute oral toxicity - acute toxicity class method, adopted, March 22, 1996] em camundongos. Os animais foram observados individualmente periodicamente durante as primeiras 24 horas, com especial atenção durante as 4 primeiras horas, e depois diariamente, num total de 14 dias, simultaneamente. Uma única dose de 2000 mg/kg p.o. da composição administrada por via oral a cada grupo de camundongos fêmeas não mostrou nenhuma mudança bruta no comportamento desses animais de laboratório. Uma única dose de 5000 mg/kg p.o. também foi avaliada. Nenhuma mortalidade ou qualquer alteração no comportamento normal quando comparado ao grupo de animais com veículo controlado do experimento foi observada nesta dose oral elevada. Estudos in vitro:

Exemplo 1: TNF-α intracelular in vivo dosado em neutrófilos murinos:

Os materiais de teste foram submetidos a estudo in vitro, pelo qual, estudos em citometria de fluxo foram realizados para determinar o efeito de múltiplas doses de fração de ácidos boswelicos, de fração de polissacarídeo e da composição da invenção na expressão das citocinas TNF-α intracelular nos neutrófilos murinos separados a partir do sangue total por gradiente HISTOPAQUE.

As células foram estimuladas com LPS e incubadas com materiais de teste, em concentrações graduadas (Mg/ml) por 3 horas, em uma incubadora de CO2. A solução permeabilizante foi adicionada às células e, em seguida, estas foram incubadas por 10 min. As células foram então marcadas com anticorpos monoclonais anti-TNF-α conjugados anti-camundongo e ainda incubados por min com duração realizada no escuro. Após a lavagem com solução salina tamponada com fosfato, as amostras foram adquiridas diretamente no citômetro de fluxo BD-CantoII (Beckton-Dickinson Biosciences, CA1 USA). Um disparador de fluorescência foi definido no parâmetro FL1 das populações de neutrófilos em regiões (gated) (10.000 eventos) e compensação de fluorescência, análise dos dados e apresentação dos dados foi realizada utilizando o software Cell Quest Pro. [Clara, B., R. C. Arancha, G. M. Andre's, P. Atanasio1 A. Julia1 and O. Alberto. 2003. A new method for detecting TNF-a- secreting cells using direct immunofluorescence surface membrane stainings. J. Immuno. Methods 264:77-87.][Khurshid A. Bhat, Bhahwal A. Shah1 Kuldeep K. Gupta1 Anjali Pandey1 Sarang Bani1 Subhash C. Taneja. Semi-synthetic analogs of pinitol as potential inhibitors of TNF-a cytokine expression in human neutrophils. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19 2009, 1939-1943]. A partir dos resultados apresentados nas tabelas 1, 2 e 3 (estudos de citometria de fluxo), é evidente que a composição apresentou efeito inibitório máximo sobre a secreção de citocinas TNF-α em neutrófilos murinos isolados em resposta ao estímulo por LPS quando comparados aos da fração de ácido boswellico e fração de polissacarídeo sozinhos. Os neutrófilos tratados in vitro com 25, 50, 100, 200, 400 e 800 pg/mL da fração de ácidos boswelicos, fração de polissacarídeo e da composição apresentaram 30,52%, 29,31% e 59,83% de supressão do TNF-α com a dose de 200 pg/mL, respectivamente. É claramente evidente, a partir dos dados, que a composição na mesma dose apresentou aumento de atividade em suprimir o TNF-α em relação às frações individuais.

TABELA 1: Efeito da dose múltipla de fração de ácido boswellico obtido de espécies de Boswellia na expressão de TNF-α intracelular nos neutrófilos

murinos

No. da Amostra Concentração Média ± S.E. % da expressão Amostra (Mg/mL) do TNF-alfa contra o controle LPS 1 Controle LPS - 2,49 ± 0,02 - 2 Fração de ácido boswellico 25 2,14 ±0,03 14,05| 3 Fração de ácido boswellico 50 2,09 ± 0,04 16,06| 4 Fração de ácido boswellico 100 1,81 ±0,03* 27,304 Fração de ácido boswellico 200 1,73 ±0,01* 30,524 6 Fração de ácido boswellico 400 1,46 ±0,03** 41.36J. 7 Fração de ácido boswellico 800 + + 8 Rolipram (padrão) 100 0,71 ±0,04** 71,484 N 0 de Observações-3; 4 - Diminuição da expressão intracelular de TN F alfa em neutrófilos

murinos;

Valorde ρ * <0,01; ** <0,001; +: a morte celular

TABELA 2: Efeito da dose múltipla de fração de polissacarídeo obtido de espécies de Boswellia na expressão de TNF-α intracelular nos neutrófilos

murinos

No. da Amostra Amostra Concentração (pg/mL) Média ± S.E. % da expressão do TNF-alfa contra o controle LPS 1 Controle LPS - 2,49 ± 0,02 - 2 Fração de polissacarídeo 25 2,19 ±0,05 12,044 3 Fração de polissacarídeo 50 2,05 ± 0,02 17,674 4 Fração de polissacarídeo 100 1,88 ±0,01* 24,494 Fração de polissacarídeo 200 1,76 ± 0,02* 29,314 6 Fração de polissacarídeo 400 1,87 ±0,05* 24,89J, 7 Fração de polissacarídeo 800 1,90 ±0,02 23,694 8 Rolipram (padrão) 100 0,71 ±0,04** 71,484 N 0 de Observações-3; j - Diminuição da expressão intracelular de TN F alfa em neutrófilos

murinos;

Valor de ρ* <0,01; ** <0,001; TABELA 3: Efeito da dose múltipla da composição da presente invenção na expressão de TNF-α intracelular nos neutrófilos murinos

No. da Amostra Amostra Concentração (pg/mL) Média ± S.E. % da expressão do TNF-alfa contra o controle LPS 1 Controle LPS - 2,49 ± 0,02 - 2 Composição 25 1,88 ±0,07 24,494 3 Composição 50 1,85 ±0,02* 25,704 4 Composição 100 1,43 ±0, 03 ** 42,574 Composição 200 1,00 ±0, 01 ** 59,834 6 Composição 400 1,23 ±0,05** 50,604 7 Composição 800 1,51 ±0,01** 39,354 8 Rolipram (padrão) 100 0,71 ±0,04** 71,484 N 0 de Observações-3; 4 - Diminuição da expressão intracelular de TN F alfa em neutrófilos

murinos;

Valor de ρ * <0,01; ** <0,001; Estudos in vivo:

Exemplo 2: TNF-a, IL-Ιβ e óxido nítrico (NO) extracelular in vivo dosado

de soro de camundongos tratados:

Camundongos BALB/c machos com idade entre 6-8 semanas foram mantidos a 22 ± 2 0C em ciclo 12/12 h de claro escuro. Os camundongos receberam tratamento oral de 100, 200, 400 mg/kg dos diferentes materiais de teste (p/v), ou seja, fração de ácido boswellico, fração de polissacarídeo e da composição da presente invenção por seis dias, seguido por injeção intravenosa de 1 mg/kg de LPS de acordo com o método descrito por Brieva et a/. 2001. [Brieva A, Guerrero A, Alonso-Lebrero J L and Pivel JP. 2001. Inmunoferon , a glycoconjugate of natural origin, inhibits LPS-induced TNF-a production and inflammatory responses. International Immunopharmacology 1.1979-1987]. Seis camundongos foram utilizados em cada grupo e os experimentos foram realizados em triplicatas. A produção de TNF-α, IL-1 beta e oxido nítrico foram avaliadas por kits comerciais de ELISA (R&D Systems) no soro de cada grupo experimental de camundongos tratados, 90 min após a injeção de LPS. Rolipram a 30 mg/kg foi utilizada como droga padrão. A coleta de soros e medições revelaram uma redução significativa nos níveis séricos de TNF-α, IL-1 beta e NO, o que sugere uma eficácia in vivo espécie- independente ampla para a fração de ácido boswellico, fração de polissacarídeo e para composição no controle da resposta inflamatória. Juntos, estes dados sugerem um papel regulador da composição em resposta a concentração aumentada de LPS no sangue, não só no nível da produção de TNF-α, mas ainda confirmado pela redução dos níveis de IL-1 beta, outra citocina pró-inflamatória, e NO em camundongos estimulados com LPS, mais significativa do que a observada para a fração de ácido boswellico e fração de polissacarídeo sozinhas (Figuras 1-6). Rolipram em dose de 30 mg/kg foi utilizada como droga padrão para observar a autenticidade e a reprodutibilidade do delineamento experimental.

A fim de demonstrar que a composição funciona em uma condição de doença, o presente estudo foi conduzido. A condição de doença selecionada para o estudo foi a artrite.

Exemplo 3: Desenvolvimento de Artrite Inflamatória Induzida por Adjuvante:

Ratos Wistar, de 12-14 semanas de idade, com 140-160 g de peso corporal em grupos de seis foram utilizados no estudo. Todos os animais foram mantidos em gaiolas plásticas a 22 ± 2 0C, com ciclo claro/escuro de 12h e livre acesso a pelota de comida e água. Os materiais do teste foram administrados por via oral uma vez ao dia durante o período do experimento. Em todos os experimentos, um grupo controle foi mantido (administrando veículo), enquanto o outro grupo recebeu um medicamento padrão de ácido acetilsalicílico (AAS), administrado uma vez por dia para comparação e autenticidade/credibilidade do teste. Todo o estudo foi realizado após aprovação do Comitê de Ética Animal Institucional e todos os animais utilizados no trabalho experimental receberam cuidados humanos. A média e erro padrão (S.E.) da média para cada grupo foi calculada e os resultados foram expressos como % de inibição em comparação ao grupo controle. A significância foi determinada estatisticamente através da aplicação do teste t de Student.

Artrite por adjuvante foi induzida pela injeção sub-plantar de 0,05 ml_ de suspensão recém-preparada (5,0 mg/mL) de Mycobacterium tuberculosis morto por vapor em parafina líquida [Newbould BB. Chemotherapy of arthritis induced in rats by mycobacterial adjuvant. Br J Pharmacol 1963;21:127-36]. O volume da pata injetada foi quantificado antes e no 14° dia após a injeção do adjuvante e foi medido por um medidor diferencial de volume modelo LE 7500N, Panlab1 Espanha.

A fração de ácido boswellico, fração de polissacarídeos, bem como a composição apresentaram inibição dose-dependente do edema na dose de 200 mg/kg por via oral (Figura 7 e Tabela 4). A composição apresentou atividade altamente significativa de 48% de inibição do edema quando comparada ao controle em artrite inflamatória induzida por Mycobacterium tuberculli em ratos. Tabela 4: Comparativo da atividade anti-artrítica (profilaxia) da fração de ácido boswellico, fração de polissacarídeo e da composição da presente invenção em artrite inflamatória induzida por Mycobacterium tuberculli em ratos (injetado na

pata)

Droga/Tratamento Dose (mg/kg) Edema Média ± S.E. (mm) Percentagem da Atividade contra o controle Artrítico Controle Artrítico 2.9 ±0.14 ASS 1.82 ±0.17** 37% I fração de ácido boswellico 50 2.42 ±0.15 17% i 100 2.07 ±0.13 29% I 200 1.87 ±0.17** 36% 1 400 1.92 ±0.26* 34% 1 fração de polissacarfdeo 50 2.37 ±0.15 18% i 100 2.15 ±0.22 26% 1 200 1.95 ±0.17** 33% 1 400 2.04 ±0.11 30% i 50 2.1 ±0.05 28% 1 Composição 100 1.77 ±0.12** 39% I 200 1.5 ±0.14** 48% I 400 1.61 ±0.05** 44% I AAS: ácido acetilsalicí ico (padrão)-100mg/kg; j: % de inibição;

Valor de ρ* <0,01; ** <0,001;

Exemplo 4: Homogeneização do tecido da pata com artrite inflamatória desenvolvida no 14° dia: Antes da homogeneização para cada ensaio, pata congelada contendo

tecido ósseo foi pesada e quebrada em pedaços em gelo seco. Tecidos da pata foram adicionados a 4 mL/g de tampão de extração de tecido contendo 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil, 1 mg/mL de aprotinina, e 0,05% de Tween em solução salina tampão com fosfato. Os tecidos foram homogeneizados em gelo com um polytron e homogeneizado foi centrifugado a 5000g por 15 min. Os sobrenadantes foram armazenados a -80 0C até a análise. [Anjali Pandey , Sarang Bani, Prabhu Dutt, KrishnaAvtar Suri. Modulation of Th1/Th2 cytokines and inflammatory mediators by hydroxychavicol in adjuvant induced arthritic tissues; Cytokine 49 (2010) 114-121]. Quantificação do TNF-α. PGE? e LTB4 no sobrenadante do tecido

homogeneizado:

As amostras no dia 14 dos diferentes grupos de animais foram preparadas para a análise dos mediadores de citocinas como descrito acima. TNF -a, PGE2 e LTB4 foram estimadas utilizando kits comercialmente disponíveis com base em técnica de ELISA competitivo e tipo "sanduíche" (R&D Systems, MN, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Todas as concentrações de citocinas foram realizadas por meio de medição colorimétrica em 450 nm em um leitor de placas de ELISA (Multiskan, Thermo Electron Corporation, MA, EUA), por interpolação de uma curva padrão. [Anjali Pandey , Sarang Bani, Prabhu Dutt, Krishna Avtar Suri. Modulation of Th1/Th2 cytokines and inflammatory mediators by hydroxychavicol in adjuvant induced arthritic tissues; Cytokine 49 (2010) 114—121].[ Magari K, Miyata S, Ohkubo Y, Mutoh S. Inflammatory cytokine leveis in paw tissues during development of rat collagen-induced arthritis: effect of FK506, an inhibitor of T cell activation. Inflamm Res 2004; 53:469-74]. A fração de ácido boswellico apresentou redução significativa do TNF-α e LTB4l mas nenhum efeito sobre PGE2 em animais afetados por artrite. A fração de polissacarídeo mostrou queda moderada nos níveis de TNF-α e PGE2, sem inibição significativa de LTB4l enquanto que a composição diminuiu significativamente os níveis de TNF-α, PGE2 e LTB4 de forma dose-dependente com inibição máxima em uma dose oral de 200 mg/kg (Figura 8, 9 e 10). A verificação de que a fração de polissacarídeo mostrou efeito inibitório

sobre a PGE2 é algo surpreendente da presente invenção e, portanto, é uma novidade. É evidente a partir do presente estudo que a fração de polissacarídeo sozinha ou em combinação com ácidos boswellico é útil na inibição do PGE2 em níveis moderados, ao contrário de outras drogas conhecidas na arte que possuem efeitos colaterais devido aos elevados níveis de inibição da PGE2.

Exemplo 5: Detecção de IFN-γ Intracelular por citometria de fluxo em esplenócitos:

A causa etiológica da artrite não foi claramente delineada, mas a evidência acumulada sugere que reações auto-imunes mediada por células T possuem um papel crítico na patogênese [Panayi GS. T cell-dependent pathways in rheumatoid arthritis. Cur Opin Rheumatol 1977;9:236-40], Para aumentar a especificidade das terapêuticas para a artrite, a ênfase foi deslocada para as citocinas. Células Th1 produtoras de IFN parecem ter um papel central no desenvolvimento da artrite em tanto em modelos humanos e animais [Garra O. Cytokines induce the development of functionally heterogeneous T helper cell subsets. Immunity 1998;8:275-8]. Assim, estratégias terapêuticas recentes centraram-se na modulação da resposta de células Th1. Os estudos de farmacodinâmica indicam a modulação Th1/Th2 como possível mecanismo de ação para a terapia de citocinas em muitas condições de doenças [Lissoni P, Malugani F, Malysheva O. Neuroimmunotherapy of untreatable metastatic solid tumors with subcutaneous low-dose, interleukin-2, melatonin and naltrexone, modulation of interleukin-2- induced antitumor immunity by blocking the opoid system. Neuroendocrinol Lett 2002;23: 341-4.] [Tabata N, Tagami H, Terui T. Dehydroepiandrosterone may be one of the regulators of cytokine production in atopic dermatitis. Arch Dermatol Res 1997;289: 410-4.] Respostas imunes mediadas por células desempenham um papel importante durante o desenvolvimento da artrite [Waksman BH1 Pearson CM, Sharp JT. Studies of arthritis and another Iesions induced in rats by injection of mycobacterial adjuvant-ll: evidence that the disease is a disseminated immunologic response to exogenous antigen. J Immunol 1960;85:403-17] e a inibição dessa resposta, especialmente por IFN-γ produzido por células T CD4+ mostram uma forte correlação da composição com atividade anti-artrítica. A composição produziu uma inibição relacionada à dose de IFN-γ produzido pelas células T CD4+.

O baço foi coletado dos animais de todos os grupos de teste sob condições assépticas, em solução salina balanceada de Hank (HBSS, Sigma) para obter uma suspensão celular homogênea, e as hemácias foram Iisadas com solução de Iise FACS. Após a centrifugação (380g a 4 0C por 10 min), as células peletizadas foram lavadas três vezes em PBS e ressuspendidas em meio completo [RPMI 1640 suplementado com Hepes 12 mM (pH 7,1), com 0,05 mm de 2-mercaptoetanol, 100 UI/mL de penicilina, 100 Ig/mL estreptomicina e 10% FCS]. O número de células foi contado com um hemocitômetro pela técnica de exclusão do azul tripan. A viabilidade celular excedeu 95%. Resumidamente, os esplenócitos foram semeados em placa de microtitulação de 96 poços de fundo plano (Nunc) em 2 χ 106 células/mL. Depois de três dias, os linfócitos esplênicos foram coradas com 5 μΙ_ de anticorpos anti-IFN-γ conjugado anti-camundongo PE e incubado por 30 min a 4 0C na presença de 1 μΙ_ de solução de permeabilização FACS. A análise foi realizada no citômetro de fluxo (BD, LSR), utilizando o software Cell Quest Pro [Anjali Pandey , Sarang Bani , Prabhu Dutt, Krishna Avtar Suri. Modulation of Th1/Th2 cytokines and inflammatory mediators by hydroxychavicol in adjuvant induced arthritic tissues; Cytokine 49 (2010) 114-121], Os esplenócitos foram cultivados com fluorocromos para avaliar o conteúdo de citocinas intracelulares. Previsivelmente, foi observado um percentual elevado de expressão de 26,74% do IFN gama no grupo controle de artrite. Para esclarecer as características do IFN gama relacionadas à subpopulações de linfócitos produtores de citocina, foram examinadas as células produtoras de IFN gama entre as células T CD4+. Notou-se um nível bastante baixo de IFN gama intracelular da fração de ácidos boswelicos, fração de polissacarídeo e da composição para esplenócitos tratados com doses graduadas. A supressão máxima foi observada no grupos tratado com composição em dose de 200 mg/kg p.o. (Figura 11).

Exemplo 6: Artrite Inflamatória Induzida por Adiuvante Estabelecida:

A artrite é induzida pela injeção de Mycobacterium tuberculosis morta em óleo na região sub-plantar da pata esquerda, como mencionado acima. A doença se desenvolve durante os primeiros 14 dias. Nenhum medicamento foi administrado durante este período. A partir do dia 15 a droga é administrada oralmente aos animais até o 28° dia. Este é um teste que mostra o potencial terapêutico do material de teste na artrite estabelecida [Newbould, B. B., 1969. The pharmacology of fenclozic acid 2-(-4-chlorophenyl) theazol-4-ylactic acid: I.C.I. 54,450; Myalex: a new compound with anti-inflammatory, analgesic and anti-pyretic activity, British Journal of Pharmacology. 35,189-197]. A inibição absoluta do edema foi observada nos animais tratados com a fração de ácido boswellico, fração de polissacarídeo e com a composição da presente invenção. No entanto, a composição mostrou o efeito mais significativo (inibição absoluta do edema) em ratos com artrite estabelecida (Figura 12).

Assim, os resultados globais indicam que a composição da presente invenção mostra uma inibição significativa dos alvos maior do que a fração de ácido boswellico e fração de polissacarídeo sozinha. O efeito máximo in vitro foi de 100 e 200 pg/mL e o efeito máximo in vivo foi na dose de 100 e 200 mg/kg de peso corporal dos animais/p.o./dia de tratamento em animais experimentais. A composição é sugerida numa dose de até 500mg, de 2 a 3 vezes ao dia para um indivíduo que dela necessite.

Claims

1. Composição sinergistica, caracterizada por compreender fração de ácido boswellico em uma concentração de cerca de 60% e fração de polissacarídeo em uma concentração de cerca de 40%, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela fração de ácido boswellico e a fração de polissacarídeo serem obtidas a partir de espécies de Boswellia.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela fração de ácido boswellico compreender ácido β-boswellico, ácido acetil-β- boswellico, ácido 11-ceto-P-boswellico e ácido acetil-11-ceto-P-boswellico.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela fração de polissacarídeo compreender galactose, arabinose, ácido D-glucurônico e 4-O-metil-glucuronoarabino-galactano.

5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelos excipientes farmaceuticamente aceitáveis são selecionados a partir do grupo composto por antiaderentes, agentes ligantes, agentes de revestimento, agentes de desintegração, preenchedores e solventes, agentes aromatizantes, corantes, glidantes, lubrificantes, preservativos, absorventes, edulcorantes e suas combinações.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela composição ser formulada em diferentes formas farmacêuticas selecionados o grupo composto por líquida, pastilhas, losangos, pó, grânulo, cápsula, comprimido, adesivo, ge!, emulsão, creme, loção, dentifrício, gota, suspensão, xaropes, elixires, fitocêuticos e nutracêuticos.

7. Processo para a preparação de composição sinergistica compreendendo fração de ácido boswellico em uma concentração de cerca de 60% e fração de polissacarídeo em uma concentração de cerca de 40%, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado pelo dito processo compreender as etapas de: (i) obter fração de ácido boswellico e fração de polissacarídeo de espécies de Boswellia\ (ii) combinar a fração de ácido boswellico em uma concentração de cerca de 60% com a fração de polissacarídeos em uma concentração de cerca de 40%, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis para obter a composição.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela fração de ácido boswellico compreender ácido β-boswellico, ácido acetil-P-boswellico, ácido 11-ceto-P-boswellico e ácido acetil-11-ceto-p-boswellico.

9. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela fração de polissacarídeo compreender galactose, arabinose, ácido D-glucurônico e 4- O-metil-glucuronoarabino-galactano.

10. Método para supressão/inibição de marcadores pró-inflamatórios, caracterizado pelo dito método compreender a etapa de administrar uma composição que compreende fração de ácido boswellico em uma concentração de cerca de 60% e fração de polissacarídeo em uma concentração de cerca de 40%, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis em um sujeito que dela necessite.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela fração de ácido boswellico e a fração de polissacarídeos serem obtidas a partir de espécies de Boswellia.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo sujeito ser animal, incluindo seres humanos.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelos marcadores pró-inflamatórios serem selecionados a partir de um grupo composto por TNF-a, IL-β, IFN-γ, óxido nítrico e LTB4.

14. Composição para supressão/inibição de PGE2, caracterizada por compreender fração de polissacarídeo sozinha ou em combinação com a fração de ácido boswellico, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

15. Método para supressão/inibição de PGE2, caracterizado por compreender a etapa de administrar a composição contendo fração de polissacarídeo sozinha ou em combinação com a fração de ácido boswellico, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis em um sujeito que dela necessite.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela fração de polissacarídeo e fração de ácido boswellico serem obtidas a partir de espécies de Boswellia.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo sujeito ser animal, incluindo seres humanos.

18. Suplemento alimentar, caracterizado por conter composição como definida na reivindicação 1 ou 14.