JP6424007B2

JP6424007B2 - エタノールにより誘発される肝障害の抑制剤

Info

Publication number: JP6424007B2
Application number: JP2014038678A
Authority: JP
Inventors: 柘植　信昭; 信昭柘植; 千晶恵; 浩史笹子; 室山　幸太郎; 幸太郎室山
Original assignee: House Foods Group Inc
Current assignee: House Foods Group Inc
Priority date: 2014-02-28
Filing date: 2014-02-28
Publication date: 2018-11-14
Anticipated expiration: 2034-02-28
Also published as: JP2015160841A

Description

本発明は、天然成分を有効成分とする、エタノールにより誘発される肝細胞の傷害及び肝障害の抑制剤に関する。

ウコンは東南アジアを中心に、世界中の熱帯・亜熱帯地域で栽培されるショウガ科ウコン属の薬用植物である。

ウコンの根茎には３〜５％のクルクミン（黄色色素）が含有される。ウコン抽出物及びクルクミンには様々な有用性が知られている。例えば非特許文献１ではウコン抽出物含有飲料はアルコールと一緒に摂取することにより、アルコール本来の「酔い」を適度に発現させながら、悪酔いを防止する作用を有することが示唆されている。

また、特許文献１にはクルクミンが肝臓疾患の治療のための医薬として有効であると記載されている。

ウコンの根茎に含まれるクルクミン以外の他の成分の有用性の報告は、クルクミンの有用性の報告と比較して少ないものの、例えば特許文献２にはビサボラン型セスキテルペン類が肝臓疾患の治療に有効である旨開示されている。

一方、エタノールの過剰摂取による肝細胞の傷害は多くの肝臓疾患の原因となるため、その抑制が望まれている。しかも食経験が豊富で安全性の高い天然由来の成分を有効成分としてエタノールが誘導する肝細胞の傷害を抑制することが望まれている。

特許文献２ではウコン等に由来するビサボラン型セスキテルペン類によりガラクトサミンに誘発される肝機能の低下が抑制されることが確認されている。しかしながら、この試験系ではエタノールにより誘発される肝細胞の傷害及び肝障害を抑制する効果を確認することはできない。

特開平５−２６２６５９号公報特開２００４−３３１５３９号公報

浜野拓也ら、「ウコン抽出物が健常成人のアルコール代謝に及ぼす影響の検討」、応用薬理、７２（１／２）、３１−３８（２００７）

本発明は、食経験が豊富な安全性の高い食品素材から得られる天然化合物を有効成分とする、エタノールにより誘発される肝細胞の傷害及び肝障害の抑制剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、ウコンに含まれるビサクロン、ar-ターメロン、α-ターメロン、及びβ-ターメロンからなる群から選択される少なくとも1種の化合物が、エタノールにより誘発される肝細胞の傷害を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は以下の発明を包含する：
（１）ビサクロン、ar-ターメロン、α-ターメロン、及びβ-ターメロンからなる群から選択される少なくとも1種の化合物を有効成分として含有する、エタノールにより誘発される肝障害の抑制剤。
（２）ビサクロンを有効成分として含有する、（１）の抑制剤。
（３）ビサクロン、ar-ターメロン、α-ターメロン、及びβ-ターメロンからなる群から選択される少なくとも1種の化合物を有効成分として含有する、エタノールにより誘発される肝細胞の傷害の抑制剤。
（４）ビサクロンを有効成分として含有する、（３）の抑制剤。

なお、本発明において「エタノールにより誘発される肝障害の抑制剤」は、主として、エタノールにより誘発される肝障害を発症する前に、予め対象者が摂取（又は、対象者に投与）することにより、当該肝障害の発症を未然に防ぐための、或いは、後に当該肝障害を発症した場合であってもその程度を未摂取時又は未投与時と比較して軽減させるための、予防的な目的で用いられることができる。

同様に、本発明において「エタノールにより誘発される肝細胞の傷害の抑制剤」は、主として、エタノールにより誘発される肝細胞の傷害が発生する前に、予め対象者が摂取（又は、対象者に投与）することにより、当該肝細胞の傷害の発生を未然に防ぐための、或いは、後に当該肝細胞の傷害が発生した場合であってもその程度を未摂取時又は未投与時と比較して軽減させるための、予防的な目的で用いられることができる。

本発明によれば、天然化合物を有効成分とする、エタノールにより誘発される肝細胞の傷害及び肝障害の抑制剤が提供される。

図１はエタノール投与による細胞生存率変化の一例を示す。図２はクルクミンによるエタノール誘発肝細胞傷害の抑制活性を示す。図３はクルクミン等のクルクミノイドとウコンエキスの、エタノール誘発肝細胞傷害の抑制活性の比較結果を示す。図４はクルクミノイドよりも低極性の画分Ａ〜Ｅ（図８参照）の、エタノール誘発肝細胞傷害の抑制活性の比較結果を示す。図５は画分Ｂを分離した画分Ｂ−１〜Ｂ−５（図８参照）の、エタノール誘発肝細胞傷害の抑制活性の比較結果を示す。図６はクルクミノイドよりも高極性の画分Ｆ〜Ｊ（図８参照）の、エタノール誘発肝細胞傷害の抑制活性の比較結果を示す。図７はａｒ−ターメロン、ビサクロン、クルクミンの単独での、エタノール誘発肝細胞傷害の抑制活性の比較結果を示す。図８は実施例に示す各画分の取得経路の概要を示す図である。

＜有効成分＞
本発明において有効成分として用いられる化合物について説明する。

本発明においてビサクロンとは次式で表される化合物を指す：

本発明においてar-ターメロンとは次式で表される化合物を指す：

本発明においてα-ターメロンとは次式で表される化合物を指す：

本発明においてβ-ターメロンとは次式で表される化合物を指す：

ar-ターメロン、α-ターメロン、β-ターメロンはそれぞれar-ツルメロン、α-ツルメロン、β-ツルメロンとも呼ばれる。

上記の４つの化合物はビサボラン型セスキテルペン類に分類される化合物である。４つの化合物のうち１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。４化合物のうちビサクロンが、エタノールにより誘発される肝細胞傷害を抑制する活性が特に高いことから、本発明の抑制剤は、少なくともビサクロンを有効成分として含有することが好ましい。

ビサクロン、ar-ターメロン、α-ターメロン、又はβ-ターメロンはそれぞれ植物原料から濃縮又は分離したものであってもよいし、人為的に合成されたものであってもよいが、安全性の観点から植物原料から濃縮又は分離したものを用いることが好ましい。

前記植物原料としては、ショウガ科植物が好ましく、特にCurcuma longa（ウコン）、Curcuma aromatica、Curcuma zedoaria、Curcuma phaeocaulis、Curcuma kwangsiensis、Curcuma wenyujin、Curcuma xanthorrhizaが好ましい。植物原料の根茎等の適当な部位を原型のまま、或いは適当な寸法又は形状にカットした形態で、或いは粉砕物の形態で、有効成分の製造のための原料として使用することができる。これらの原料は適宜乾燥されたものであってよい。

植物原料からの有効成分の濃縮又は分離は特に限定されない。例えば、水、エタノール、メタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、ジエチルエーテル、石油エーテル、ヘキサン、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、動植物油脂、又はそれらの溶媒の２種以上の混合物等の、前記有効成分を溶解可能な溶媒を用いて、植物原料から溶媒可溶性成分を抽出し、更に必要に応じて溶媒分画、クロマトグラフィー（カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等）及び／又は再結晶等の分離又は濃縮手段を用いて前記有効成分を分離又は濃縮し、取得することができる。

ビサクロン、ar-ターメロン、α-ターメロン及びβ-ターメロンから選択される少なくとも1種の有効成分は単離精製された形態で用いられる必要はなく、他の成分との混合物として提供されてもよい。好ましくは前記有効成分の含有量が、４種合計で、乾燥物基準で０．２重量％以上、好ましくは０．５重量％以上、より好ましくは１重量％以上、最も好ましくは１０重量％以上である濃縮物又は精製物として提供される。特に、いずれか１つの有効成分の含有量が単独で上記の含有量範囲である濃縮物又は精製物が好ましい。なお、前記の各有効成分は単離精製された形態、例えば、前記有効成分の含有量が、４種合計で、乾燥物基準で８０重量％以上の形態、で用いられてもよい。

＜エタノールにより誘発される肝細胞の傷害の抑制剤、並びにエタノールにより誘発される肝障害の抑制剤＞
本発明において「エタノールにより誘発される肝細胞の傷害」はアルコール飲料の摂取等が原因で生じる。

エタノールにより誘発される肝細胞の傷害は、種々の肝障害、具体的には脂肪肝、肝線維症、アルコール性肝炎、アルコール性肝硬変等の肝障害の原因となることが知られている。

すなわち前記有効成分は、エタノールにより誘発されるこれらの肝障害の抑制剤の有効成分として有用である。

本発明の抑制剤は飲食品、医薬品（医薬部外品に分類されるものも含む。以下同じ）等の形態で用いることができる。特に、飲食品、医薬品等の形態で経口摂取される経口摂取用剤であることが好ましいが、これには限定されず、他の経路、例えば静脈内投与、髄腔内投与、皮下投与、舌下投与、経直腸投与、経腟投与、点眼、経鼻、吸入、経皮投与、経皮的吸収等の経路で投与される剤であってもよい。

本発明の抑制剤は、全体が前記有効成分又はそれを含有する素材（例えば植物から得られた前記有効成分の濃縮物又は精製物）のみからなるものであってもよいし、前記有効成分又はそれを含有する素材と、本発明の目的において許容される他の成分とを含む組成物であってもよい。他の成分は飲食品、医薬品等の最終的な形態において許容される成分である限り特に限定されない。

本発明の抑制剤の形状は特に限定されずに液状、固形状または半固形状であることができる。

本発明の抑制剤は、前記有効成分又はそれを含有する素材と、必要に応じて上記他の成分とを、通常の方法で組み合わせて配合し、製造することができる。

前記飲食品の態様は限定されず、健康食品、栄養補助食品、栄養機能食品、特定保健用食品等の態様であることができる。前記飲食品は、前記有効成分又はそれを含有する素材と、飲食品として許容される他の成分、例えば、果糖ブドウ糖液糖、環状オリゴ糖、酸味料、増粘剤、イノシトール、香料、ナイアシン、酸化防止剤、ビタミン類、甘味料、水等とを含むことができる。飲食品の形態は特に限定されず、飲料、粉末、顆粒、錠剤等の種々の形態であってよい。

前記医薬品の剤形は特に限定されず、例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、注射剤、座薬、貼付剤、軟膏、細粒剤、カプレット、散剤、液剤、トローチなどの剤形が挙げられる。医薬品は、前記有効成分又はそれを含有する素材を、薬剤学的に許容される他の製剤素材、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などと適宜組み合わせて製剤化することにより製造することができる。

本発明の抑制剤が適用される個体は、哺乳動物、特にヒトであることが好ましい。
本発明の抑制剤の摂取量（又は投与量）は特に限定されず、個体が摂取（又は個体に投与）することにより、エタノールにより誘発される肝細胞の傷害を実質的に抑制し得る量の有効成分が摂取（又は投与）可能な量であれば特に限定されない。前記有効成分の有効量の具体的な値は、対象個体の生物学的指標（年齢、性別及び体重等）等に応じて適宜決定すればよい。本発明の抑制剤の摂取（又は投与）は１日に１回ないし数回に分けて行うことができる。

1. エタノール誘発肝細胞傷害抑制活性評価
SDラットを用い、コラゲナーゼ灌流法により肝細胞を分離した。

分離した肝細胞を、William's Medium E（10%FBS、0.1μMインスリン、1μMデキサメタゾン添加）で2×10⁵cells/mLに懸濁し、コラーゲンコートした48 wellプレートに300μL/wellずつ播種した。

37℃、5%CO₂下で4時間培養の後、サンプル（DMSOに溶解、DMSOの終濃度0.1%）を含むWilliam’s Medium E（10%FBS添加）に交換した。
37℃、5％CO₂下で16時間培養の後、1〜4 %（v/v）のエタノールを含むWilliam’s Medium E（1％FBS、25mM HEPES添加）に交換し、プレートを密閉した。
37℃で24時間培養の後、CellQuanti-Blue Cell Viability Assay Kit（BioAssay Systems）を用いて細胞生存率を測定した。

細胞生存率は、サンプル無添加区（DMSOのみ添加）の蛍光強度の平均値を100%とした場合の相対値として示す。

図１に、サンプル無添加区での、エタノール投与による細胞生存率変化の一例を示す。
サンプルによるエタノール誘発肝細胞傷害抑制活性は、2%〜3%(v/v)のエタノールを投与した場合の、サンプル無添加区（Control）の細胞生存率の平均値を100とした場合の相対値として示す。

有意差検定にはDunnetの方法を用い、無添加区（Control）を対照とし、Control＜サンプル添加区を対立仮説として検定した。有意差は**：1%有意、*：5%有意で示した。

（クルクミンの効果）
エタノール誘発肝細胞傷害抑制効果を示す物質として、クルクミンを用いた場合の結果を図２に示す。

クルクミンを終濃度6μM、12μM、24μMで添加したところ、6μM、12μMで細胞傷害抑制活性が見られた。
24μMでは活性が低くなるのは、細胞傷害のためと予測された。

2. 有効成分の同定
2-1．クルクミンとウコンエキス粉末
ウコンエキスの粉末50mgにジメチルスルホキシド（DMSO）を1mL加えて抽出し、15000rpm、5分間遠心した上清を「ウコンエキス粉末」サンプルとした。

クルクミノイド（クルクミン、デメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミンの混合物）2.2mg（ウコンエキス粉末50mgに含まれるクルクミノイド量）にDMSOを1mL加えて溶解したものを「クルクミノイド」サンプルとした。

ウコンエキス粉末とクルクミノイドのエタノール誘発肝細胞傷害抑制活性を1.の方法で評価した。

結果を図３に示す。クルクミノイドよりもウコンエキスの方が肝細胞傷害抑制活性が高く、ウコンエキス中にクルクミノイド以外の有効成分が存在する可能性が示唆された。

2-2．有効成分（ターメロン類）の同定
ウコンエキス粉末10gをメタノール200mLで抽出し、抽出物1.9gを得た。得られた抽出物を、アルコール誘発肝細胞傷害抑制活性を指標に分画を行なった。

抽出物をシリカゲルカラムで酢酸エチル及びn-ヘキサンを用いて溶出させ、クルクミノイドよりも低極性の画分A, B, C, D, Eを得た。アルコール誘発肝細胞傷害抑制活性を評価したところ、画分Bで活性が検出された (図４)。

なお、図4〜6において「L」は、サンプルとして、ウコンエキス粉末50mg分に相当する量の所定画分を用いた「低濃度」の評価試験の結果であり、「H」は、サンプルとして、ウコンエキス粉末50mg分に相当する量の5倍量又は10倍量（画分により倍率は異なる）の所定画分を用いた「高濃度」の評価試験の結果である。

活性のあった画分Bを分取用HPLCカラムを用いてメタノール及び水を用いて分画し、画分B-1, B-2, B-3, B-4, B-5を得た。結果を図５に示す。これらの画分では、画分B-2、B-4で活性が検出された。

活性のあった画分B-2、B-4を分取用HPLCカラムを用いて単一成分まで精製して、NMR分析により構造を決定したところ、画分B-2はar-ターメロンを主成分とし、画分B-4はα-ターメロン、β-ターメロンを主成分とすることが分かった。取得された¹H-NMR及び¹³C-NMR（ただしα-ターメロン、β-ターメロンについては¹H-NMRのみ）のデータを3に示す。

単一成分に精製したar-ターメロン、α-ターメロン、β-ターメロンでも活性があることを確認した。

2-3．有効成分（ビサクロン）の同定
ウコンエキス粉末のメタノール抽出物をシリカゲルカラムでメタノール及びクロロホルムを用いて溶出させ、クルクミノイドよりも高極性の画分F, G, H, I, Jを得た。アルコール誘発肝細胞傷害抑制活性を評価した。結果を図６に示す。画分Ｇで最も強い活性が検出された。

活性のあった画分Ｇを分取用HPLCカラムを用いて単一成分まで精製して、NMR分析により構造を決定したところ、画分Ｇはビサクロンを主成分とすることが分かった。取得されたビサクロンについての¹H-NMR及び¹³C-NMRのデータを3に示す。

2-4．精製した有効成分（ar-ターメロン、ビサクロン）の効果
単一成分に精製したar-ターメロン、ビサクロンと、クルクミン（試薬）の効果を確認した。結果を図７に示す。

1μM処理では、ビサクロンにのみ活性があり、6μMでは、クルクミン、ar-ターメロン、ビサクロン、全てで活性が確認された。

3. 化合物特定データ
ar-ターメロン
¹H-NMR(CDCl₃)δ; 7.10 (4H, m), 6.02 (1H, d, J=1.2 Hz), 3.28 (1H, ddd, J=6.9, 6.9, 16.1 Hz), 2.70 (1H, dd, J=5.7, 15.5 Hz), 2.60 (1H, dd, J=6.9, 16.1 Hz), 2.30 (3H, s), 2.10 (3H, s), 1.85 (3H, s), 1.23 (3H, d, J=6.9 Hz)

α-ターメロン
¹H-NMR(CDCl₃) δ; 6.05 (1H, d, J=1.7 Hz), 5.78 (1H, m), 5.64 (1H, m), 5.43 (1H, m), 2.51 (1H, dd,J=14.8, 4.0 Hz), 2.25-1.97 (5H, m), 2.13 (3H, s), 1.87 (3H, d, J=1.1 Hz), 1.70 (3H, d, J=1.7 Hz), 0.89 (3H, d, J=6.3 Hz).

β-ターメロン
¹H-NMR(CDCl₃) δ; 6.14 (1H, dd, J=9.8, 2.9 Hz), 6.06 (1H, d, J=1.1 Hz), 5.66 (1H, d, J=9.8 Hz), 4.76 (1H, s), 4.74(1H, s), 2.50-2.40 (2H, m), 2.35-2.15 (3H, m), 2.13 (3H, d, J=1.2 Hz), 2.03 (1H, m), 1.88 (3H, d, J=1.2 Hz), 1.72 (1H, m), 1.39 (1H, m), 0.88 (3H, d, J=6.3 Hz).

ビサクロン
¹H-NMR(CDCl₃) δ; 6.07 (1H, dd, J=1.2, 1.2 Hz), 5.64 (2H, s), 3.79 (1H, dd, J=3.2, 7.0 Hz), 2.44 (1H, dd, J=5.2, 14.9 Hz), 2.30 (1H, m), 2.26 (1H, m), 2.20 (1H, m), 2.14 (3H, d, J=1.2 Hz), 1.89 (3H, d, J=1.2 Hz), 1.82 (1H, ddd, J=2.8, 7.4, 10.9 Hz), 1.71 (1H, ddd, J=6.3, 6.3, 12.6 Hz), 1.52 (2H, br s), 1.30 (3H, s), 0.91 (3H, d, J=6.7 Hz).

Claims

ビサクロンを乾燥物基準で０．２重量％以上有効成分として含有する、肝障害の抑制剤。
ビサクロン、ar-ターメロン、α-ターメロン、及びβ-ターメロンからなる群から選択される少なくとも1種の化合物を４種合計で、乾燥物基準で０．２重量％以上有効成分として含有する、エタノールにより誘発される肝障害の抑制剤。
ビサクロンを有効成分として含有する、請求項２に記載の抑制剤。